Summary
踝距下复合关节 （ASCJ） 是足部的核心，在日常活动中起着关键作用。运动损伤通常会导致该关节不稳定。在这里，我们描述了韧带横断诱导的ASCJ不稳定性的小鼠模型。
Abstract
踝关节扭伤可能是日常生活中最常见的运动损伤，通常会导致踝距下复合关节 （ASCJ） 不稳定，从长远来看，最终会导致创伤后骨关节炎 （PTOA）。然而，由于损伤机制的复杂性和临床表现，如瘀斑、血肿或外侧足压痛，对ASCJ不稳定的诊断和治疗尚无临床共识。由于小鼠后足骨骼和韧带的肌肉骨骼结构与人类相当，因此通过ASCJ周围韧带的横断建立了小鼠ASCJ不稳定的动物模型。该模型通过一系列行为测试和组织学分析得到了充分验证，包括平衡木测试、足迹分析（评估小鼠的运动水平和平衡能力）、热伤害感受评估（评估小鼠的足部感觉功能）、显微计算机断层扫描 （CT） 扫描和关节软骨切片染色（评估小鼠关节软骨损伤和退化）。成功建立ASCJ不稳定小鼠模型将为损伤机制的临床研究提供有价值的参考，并为踝关节扭伤提供更好的治疗选择。
Introduction
踝关节扭伤是全球最常见的运动损伤之一。据估计，美国每天有 10,000 人受伤1，其中运动相关伤害占 15%-45%2。在美国，与治疗踝关节扭伤相关的医疗费用每年达 42 亿美元 3,4,5。慢性足部不稳是踝关节扭伤后的常见问题，约占踝关节扭伤的 74% 6，包括踝关节或距下关节不稳。然而，由于临床症状和体征相似，医务人员在临床上很难区分慢性踝关节不稳是否也伴有距下关节不稳，因此容易漏诊慢性距下关节不稳。因此，慢性踝距下复合关节 （ASCJ） 不稳定（一种特定类型的慢性足部不稳定，包括慢性踝关节不稳定和慢性距下不稳定）的真实发生率可能高于报告的 7,8,9。如果不及时治疗，慢性踝距下复合关节不稳定会导致反复踝关节扭伤，导致踝关节扭伤和慢性踝距下复合关节不稳定的恶性循环。长期慢性踝距下复合体不稳定可导致 ASCJ 退化和创伤后骨关节炎，严重时会影响邻近关节10.对于这些疾病，目前的临床治疗主要是保守治疗，此外还有韧带修复和韧带重建等手术治疗方法11,12。
ASCJ 是足部的核心结构，在运动13 期间保持身体平衡。已经对踝关节和距下关节的结构进行了广泛的研究分别 14,15,16,17。然而，对整个踝距下关节的研究很少见。大约四分之一的踝关节损伤病例与距下关节损伤有关18。由于ASCJ不稳定的损伤机制复杂，临床上对诊断和治疗尚无共识。考虑到目前临床踝关节损伤的现状，需要一种更科学的方法，将踝关节和距下关节作为一个整体进行研究，从而为研究足部疾病提供新的认识。
由于小鼠后足在肌肉骨骼水平上的解剖结构与人足的解剖结构相当19，因此在几项研究中，已经实施了用于足/踝研究的小鼠模型10,19。Chang 等 19 成功开发了三种不同的踝骨关节炎小鼠模型。受小鼠模型中踝关节不稳定性成功建立的启发，我们建立了踝距下复合体不稳定性的小鼠模型，假设小鼠后足部分韧带的横断会导致ASCJ的机械不稳定，从而导致ASCJ的创伤后骨关节炎（PTOA）。ASCJ不稳动物模型可用于踝关节不稳和距下不稳的治疗，比目前使用的单纯踝关节不稳模型7、8、9、19更符合临床实际情况。为了验证这一假设，设计了两个韧带横断诱导的ASCJ不稳定的小鼠模型。采用平衡木试验、足迹分析、热伤害感受评估等感觉运动功能结果评价模型的可行性，采用显微计算机断层扫描（CT）和组织学染色评估小鼠关节软骨损伤和变性。ASCJ不稳定性小鼠模型的成功建立，不仅为研究足部疾病提供了新的认识，也为损伤相关机制的临床研究提供了有价值的参考，为踝关节扭伤提供了更好的治疗选择，有助于进一步研究该疾病。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物研究均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并得到苏州大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 外科手术
- 将21只6周龄的C57BL/6雄性小鼠分为三组：颈横韧带和距腓前韧带组，颈横韧带和三角韧带组，假手术组。确保所有小鼠都是在符合特定无病原体（SPF）标准的环境中饲养的。
- 在实验前2周使小鼠适应新的饲养环境（12小时/ 12小时的光/暗循环，以及18-22°C和40%-70%的恒定温度和湿度）。在实验前 1 周，对小鼠进行平衡木和步态训练，从平衡木或 U 形管的一端不停地走到另一端。
- 在 8 周龄时，通过用 2 mL 异氟烷润湿棉球并将其置于密封容器中以充分挥发，使用异氟烷吸入麻醉小鼠。监测小鼠的活动并继续吸入，直到小鼠的活动显着降低。通过捏住小鼠的脚趾来观察它们的反应，以确定麻醉的深度。通过面罩吸入蒸发的异氟醚（2%），以在随后的手术中维持小鼠的麻醉。麻醉期间使用兽用眼药膏，防止眼睛干燥。
- 麻醉后，用剃须刀去除小鼠右后肢踝关节上的毛发，用碘棉球和酒精棉球交替对裸露的皮肤进行三次消毒。通过皮下注射给予 5 mg/kg 卡洛芬。使用无菌手术垫将小鼠转移到显微外科动物手术室。
- 对于颈椎横韧带和距腓前韧带（CL+ATFL）组，用手术刀在右踝关节上方的皮肤上做一个7mm的斜向下纵向切口，并在踝关节前方用显微镜直镊进行探查。
- 探查后确保距骨体下缘和腓骨的ATFL暴露，并用手术刀轻轻切割。将腓骨长肌腱和腓骨长伸肌腱分开，露出CL，用手术刀切开。
- 对于横向 CL + 三角韧带 （DL） 组，在右踝关节的内侧皮肤上做一个 8 毫米的垂直切口，并将 DL 与内踝钝地分开，最终将其切割。然后，按照步骤 1.5 中的说明切割 CL。
- 对于假手术组（假手术组），对右踝关节进行假手术，但不要切断任何韧带。
- 用无菌生理盐水冲洗切口，并用5-0手术尼龙线缝合。最后，用碘棉球对缝合的切口进行消毒。
- 观察小鼠，直到它能够保持胸骨卧位，并监督它直到它完全清醒。用碘棉球每天两次对踝关节切口进行消毒，并给予卡洛芬（5mg / kg，皮下注射），每天一次，持续1周。术后单独后方，密切注意小鼠术后状况。
- 手术后两周，当踝关节肿胀减轻时，开始每天在小鼠旋转疲劳机中锻炼小鼠1小时。
2.平衡木试验
- 用摄影三脚架夹夹住一根长 1 m、直径 20 mm 的圆形木梁，一端倾斜 15°，另一端放在连接到封闭盒的工作台面上。
- 手术前1周进行平衡木训练，以确保小鼠从平衡木的一端平稳地移动到另一端。假设鼠标在 60 秒内两次穿过光束而不停顿时已通过测试。
- 对每只小鼠进行两次连续试验，并在每次试验后用75%的酒精喷洒平衡木，以防止前一只小鼠的残留气味影响下一只小鼠。
- 术前、术后3天、1周、4周、8周、12周进行平衡木试验。记录每只鼠标连续两次通过平衡木的平均时间和右后脚滑出平衡木的次数作为因变量。
3. 足迹分析
- 在实验台上放置一个长50厘米，宽10厘米，高10厘米的U形塑料通道，并将塑料通道的一端连接到封闭的盒中。
- 将一张普通的颜料纸平放在通道中，然后用双手握住鼠标，用无毒的红色和绿色颜料均匀地涂上前脚和后脚。
- 轻轻地将涂漆的鼠标放在通道的一端，让它们移动到盒的另一端。取出带有脚印的颜料纸，做标记，放在架子上，在通风阴凉处晾干。
- 每只鼠标通过后，用75%的酒精喷洒U形塑料通道，以防止前一只鼠标的残留气味影响下一只鼠标。
- 在每张纸上选择三个连续的透明鼠标脚印，用尺子测量鼠标右脚脚印的步长，以及左右脚印之间的步宽。
4. 热伤害感受评估
- 实验过程中，采用足底试验分别记录小鼠足部的热伤害感受反应时间和小鼠活动和休息期间的反应时间。以秒为单位记录测量数据。
- 将鼠标放在测量仪器中，将仪器与右脚对齐，随着温度的缓慢升高，开始加热仪器。观察鼠标的响应。当温度升高到公差以上时，鼠标会迅速退出或舔右脚。使用仪器记录时间，并将时间定义为活动期间的反应时间。
- 为了测量静止时的反应时间，让鼠标在不加热的情况下在休息台上静置30分钟，然后按照步骤4.2中的说明获得时间数据。使用这些获取的时间数据进行后续分析。
5. 显微CT扫描
- 术后用二氧化碳对12周龄小鼠实施安乐死，剥去其右脚踝的皮肤，然后用手术剪刀剪断其胫骨中段和腓骨，以获得完整的踝关节标本。将标本置于含有10%中性福尔马林的标记15mL离心管中48小时。
- 固定后，将标本分批放置（每批四个标本）放入专用海绵罐中进行显微CT扫描。机器参数设置如下：电压 = 50 kV，电流 = 200 mA，滤波器 = 0.5 mmAl，分辨率 = 9 μm。运行微型 CT 扫描仪。
- 扫描后，使用重建软件勾勒出图像的范围，并使用商业数据分析软件调整所描绘图像的XYZ轴后选择特定的角度位置，如Liu等人10所述。
- 使用显微CT分析软件在XYZ轴调整的重组图像中选择连续的10层感兴趣区域，并定量分析所需的关节以确定骨体积分数（BV / TV），如Liu等人10所述。
- 最后，使用三维医学图像处理软件对小鼠踝关节进行三维CT图像处理，如Liu等人10所述。重建后，观察ASCJ中骨赘的磨损和形成。
6.关节软骨切片染色
注意：所有染色步骤均在通风橱中进行，并在过程中戴上口罩。
- 用显微镊子和剪刀去除脚踝标本周围多余的软组织，然后将标本放入含有10%EDTA脱钙液的离心管中，该溶液由44 g NaOH、两包PBS、400 g EDTA-2Na制备，用盐酸调节pH至7.35-7.45，并标记不同组。
- 接下来，将离心管放在振荡台（速度设置为 20 rpm）上进行脱钙，并每天更换一次脱钙溶液。确定试样的脱钙。
- 脱钙1个月后，用梯度醇使试样脱水，然后使用正丁醇8小时进行澄清。最后，将清除的标本浸入石蜡中的冠状位置进行包埋。
- 将石蜡试样置于4°C冰箱中供后用。切片前，从4°C冰箱中取出试样，并将它们置于-20°C冰箱中约10分钟，以利于切割整个平面。
- 将标本固定在切片机上，并以6μm的厚度切片。同时，使用显微镜观察样品是否在预期的水平上被切割——注射器针头容易穿透骨组织。
- 提前将片机的水温调节到40°C。接下来，连续切割两到三个完整的石蜡部分，并将它们转移到压片机中进行完全膨胀。然后，用载玻片取出石蜡部分并沥干水。最后，用组和数字标记幻灯片。
7. 苏木精和伊红（H&E）染色
- 将切片置于60°C培养箱中，使其可以在显微镜下观察到完整的ASCJ关节结构，并将切片烘烤40-50分钟。然后，分别用二甲苯 3x 脱蜡切片，编号为 I、II 和 III 以便于识别，分别 15 分钟、15 分钟和 10 分钟。
- 将脱蜡切片置于 100% 乙醇 2 次中，编号为 I 和 II，以便于识别、90% 乙醇和 80% 乙醇分别 3 分钟、3 分钟、5 分钟和 5 分钟。接下来，用双蒸水（ddH2O）清洗切片5分钟。
- 用苏木精浸泡1分钟后，用ddH2O洗涤切片，直至它们变得无色。将切片浸泡在1%酸性乙醇分化溶液中30秒，并用ddH2O洗涤3次，持续1分钟。之后，用 1% 氨溶液染色切片 1 分钟，然后用 ddH2O 洗涤 3 次，每次 1 分钟。
- 接下来，用曙红染色液对样品进行染色1分钟，然后将它们分别放入95%乙醇和100%乙醇中连续1分钟。最后，用二甲苯IV处理切片1分钟。
- 风干切片，将一滴中性树脂粘贴到载玻片上的标本上，并用盖玻片盖住它们。然后，用正置荧光显微镜在明场中以 5 倍和 20 倍的速度拍摄图像。
8. 番红O-fast绿染色
- 将选定的切片放入60°C培养箱中，烘烤切片40-50分钟。然后，分别用二甲苯I，II和III脱蜡15分钟，15分钟和10分钟。
- 将脱蜡切片分别置于100%乙醇I，II，90%乙醇和80%乙醇中3分钟，3分钟，5分钟和5分钟。接下来，用ddH2O洗涤切片5分钟。
- 用苏木精浸泡1分钟后，用ddH2O洗涤切片，直至它们变得无色。将切片浸泡在1%酸性乙醇分化溶液中30秒，并用ddH2O洗涤3次，持续1分钟。然后，用 1% 氨溶液染色切片 1 分钟，并用 ddH2O 洗涤 3 次，每次 1 分钟。
- 将切片浸泡在0.05%速绿中2分钟，然后将切片浸泡在1%乙酸溶液中30秒，在0.1%沙夫拉宁中浸泡5分钟。将染色的样品一个接一个地置于95%乙醇和100%乙醇中1分钟。
- 最后，用二甲苯IV处理切片1分钟。风干切片，将一滴中性树脂粘贴到载玻片上的标本上，并用盖玻片盖住它们。然后，用正置荧光显微镜在明场中以 5 倍和 20 倍的速度拍摄图像。
9. 免疫组化
- 第1天：将选定的切片置于60°C培养箱中，烘烤切片40-50分钟，然后用二甲苯I，II和III分别脱蜡15分钟，15分钟和10分钟。将脱蜡切片分别置于100%乙醇I，II，90%乙醇和80%乙醇中3分钟，3分钟，5分钟和5分钟。然后，用ddH2O洗涤切片5分钟，用组织化学笔圈出标本区域，并将它们放入暗盒中。
- 抗原修复：将20-50μL的0.25%胰蛋白酶滴入圈出的标本区域，在37°C培养箱中孵育60分钟，然后用PBS洗涤标本3次，每次2分钟。通过加入3%H 2 O 2来阻断内源性过氧化物酶，将标本在室温下在黑暗中孵育10分钟，然后用PBS洗涤3次，每次2分钟。通过在室温下加入10%山羊血清20分钟进行血清封闭，然后在4°C下与一抗（小鼠抗小鼠II型胶原，稀释1,000倍）孵育过夜。
- 第 2 天：在室温下重新加热切片 30 分钟。回收一抗并用PBS洗涤切片3次，每次2分钟。在37°C的培养箱中与二抗一起孵育40分钟，然后用PBS洗涤切片3次，每次2分钟。
- DAB 显色：加入 5 mL ddH 2 O、2 滴缓冲液、4 滴 DAB 和 2 滴 H 2 O2 以制备 DAB 试剂。向切片中加入 20-50 μL 试剂，将样品避光 5 分钟，然后用 ddH 2 O 洗涤切片2分钟。
- 用苏木精浸泡1分钟后，用ddH2O洗涤切片，直至它们变得无色。将切片浸泡在1%酸性乙醇分化溶液中30秒，并用ddH 2 O洗涤3次，每次1分钟，用1%氨溶液染色切片1分钟，然后用ddH2O洗涤3次，每次1分钟。
- 接下来，将切片分别置于 95% 乙醇和 100% 乙醇中，每次 1 分钟。最后，用二甲苯IV孵育切片1分钟。风干切片，将一滴中性树脂粘贴到载玻片上的标本上，并用盖玻片盖住它们。然后，用正置荧光显微镜在明场中以 5 倍和 20 倍的速度拍摄图像。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
利用在线统计分析工具对相关数据进行统计分析。采用单因素方差分析，将满足正态分布和方差均匀性两个检验的数据用于进一步的统计分析。如果数据不符合两个检验，则采用Kruskal-Wallis检验进行统计分析。数据表示为平均值±标准差 （SD）， p < 0.05 被认为具有统计学意义。
平衡木试验
对每组小鼠在每阶段通过平衡木两次的平均所需时间进行统计分析，结果表明，每组小鼠在手术前通过平衡木所需的时间无统计学差异（p = 0.73）。术后3天，CL+ATFL组和CL+DL组小鼠通过平衡木的时间较假手术组小鼠较长，差异有统计学意义（p < 0.05）。手术后4周，与假手术组小鼠相比，CL + ATFL组和CL + DL组小鼠通过平衡木所需的时间没有观察到显着差异（p > 0.05）。此外，术后8周和12周，CL+ATFL组和CL+DL组小鼠比假手术组小鼠需要更多的时间通过平衡木，差异有统计学意义（p < 0.01）。在每个测试期间，与CL + DL组小鼠相比，CL + ATFL组小鼠通过平衡木所需的时间没有观察到统计学上的显着差异（p > 0.05; 图1A）。
手术前三组小鼠的右后足滑过平衡木的次数在统计学上没有差异（p = 0.68）。此外，与假手术组小鼠相比，CL + ATFL和CL + DL组小鼠的右后足切片数在手术后3天没有观察到显着差异。关于其他术后时间点，韧带横断组的切片数高于假手术组小鼠，差异有统计学意义（p < 0.05）。术后8周和12周，CL+ATFL组右后足滑离平衡木的次数均高于CL+DL组小鼠，差异有统计学意义（p < 0.05; 图1B）。
封装分析
每组小鼠的步幅随着年龄的增长而增加，但韧带切断可以缩短步幅。术前3组小鼠右后足步长差异无统计学意义（p > 0.05）。在术后12周的步态测试中，韧带切割组右后足步长较假手术组短，差异有统计学意义（p < 0.01）。然而，CL+ATFL组小鼠右后足步幅与CL+DL组小鼠右后足步幅差异无统计学意义（p > 0.05;图2A，B）。
热伤害感受评估
活动期间小鼠足部热伤害感受反应时间的统计分析表明，3组小鼠术前反应时间无统计学差异（p > 0.5）。在术后热伤害感受评估中，韧带切割组小鼠的热伤害感受反应时间同期均长于假手术组小鼠，差异有统计学意义（p < 0.01; 图3）。
Micro-CT扫描
术后12周，采用显微CT定量分析各组小鼠右后足ASCJ。CT图像三维重建显示，两组断韧带组右后足ASCJ较假手术组粗糙。关节面凹凸平，有明显的磨损痕迹，关节周围产生骨赘，关节呈现退行性改变。此外，CL + DL组中约28.6%的小鼠发生距骨脱位（图4A，B）10。CL+ATFL组和CL+DL组右后足ASCJ骨体积分数显著高于假手术组，差异有统计学意义（p < 0.01;图4C，D）10。
关节软骨切片染色
H&E和赛峰红O-fast绿染色结果显示，假手术组小鼠ASCJ结构完整，软骨形态完整，软骨细胞分布均匀。两组韧带切割小鼠的ASCJ软骨层表现出明显的不连续性，软骨细胞数量减少（图5A，B）10。使用改良的曼金和骨关节炎国际研究学会（OARSI）评分系统对每组小鼠20,21,22的ASCJ的H&E和Safranin O-fast绿色染色进行评分。改良的Mankin评分由软骨结构特征和软骨细胞的数量和染色确定，OARSI评分由软骨的组织病理学分级和分期确定。两组韧带截肢小鼠评分均高于假手术组小鼠，差异有统计学意义（p < 0.05;图 5C-F）10.
典型II.型胶原免疫组化染色图像显示，假手术组右后足ASCJ关节软骨层II.型胶原含量较断韧带的两组小鼠更均匀，II.型胶原无明显丢失（图6A）。定量分析结果显示，假手术组小鼠ASCJ中II.型胶原蛋白的表达高于两组韧带切断的小鼠，差异有统计学意义（p < 0.05;图6B，C）。
图1：使用平衡木测试对小鼠进行行为分析 。 （A） 小鼠越过平衡木所需的时间。（B）右脚在横穿平衡木时的滑行次数。数据表示平均值±标准差，n = 每组 7 个样本。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：使用足迹分析对小鼠进行行为分析。 （A）比较每组小鼠手术前右步的长度。（B）比较每组小鼠术后12周右步的长度。统计学上的显著差异用 ** 表示，其中 p < 0.01，而 ***，其中 p < 0.001。数据表示平均值±标准差，n = 每组 7 个样本。请点击这里查看此图的较大版本.
图3：使用热伤害感受评估对小鼠进行行为分析。 小鼠活动期间的热伤害感受反应时间。数据表示平均值±标准差，n = 每组 7 个样本。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：小鼠右脚的 Micro-CT 分析。 （A）踝距下关节复合体无脱位的小鼠距骨三维重建（侧视图、内侧视图、前视图）。（B）踝距下关节复合体中脱位小鼠距骨的三维重建（侧视图、内侧视图、前视图）。（C） 小鼠踝关节骨体积分数 （BV/TV） 的定量分析。（D） 小鼠距下关节骨体积分数 （BV/TV） 的定量分析。黑色箭头表示骨赘形成或距骨脱位。统计学上的显着差异用 *** 表示，其中 p < 0.001 指示组之间。该图已根据Liu等人[10]修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：H&E和Safranin O-fast绿色染色和踝关节分析 。 （A） 小鼠踝距下关节的 H&E 染色。（B）小鼠踝距下关节的番红O-fast染色。（C） 小鼠踝关节的改良曼金评分。（D） 小鼠距下关节的改良曼金评分。（E） 国际骨关节炎研究学会 （OARSI） 对小鼠踝关节的评分。（F） 小鼠距下关节的 OARSI 评分。符号：a = 踝关节;s = 距下关节。统计学上的显着差异用 *** 表示，其中 p < 0.001 指示组之间。比例尺 = 100 μm，n = 每组 7 个样品。该图已根据Liu等人[10]修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
图6：踝关节的免疫组化染色和分析 。 （A）小鼠踝关节和距下关节的II型胶原免疫组织化学染色。（B） 小鼠踝关节的胶原蛋白 II （+） 面积比百分比。（C） 小鼠距下关节的胶原 II （+） 面积比百分比。符号：a = 踝关节;s = 距下关节。统计学上的显着差异用 *** 表示，其中 p < 0.001 指示组之间。比例尺 = 100 μm，n = 每组 7 个样品。 请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究通过横断CL+ATFL或CL+DL成功构建了2个ASCJ不稳定性小鼠模型。小鼠通过平衡木的时间在手术后8周和12周显着增加，这与Hubbard-Turner团队通过切割踝关节外侧韧带获得的结果相似23,24。在右足滑动试验中，我们观察到两组断韧带小鼠的滑行次数明显高于假韧带组小鼠，并且在手术后12周滑动次数达到最大值，从而提示两组断韧带小鼠可能患有ASCJ不稳定。步态试验结果显示，虽然小鼠步长随年龄增长逐渐增加，但两组断韧带小鼠的12周步长均低于假手术组，CL+ATFL组的步长比假手术组小7.2%。综上所述，上述结果表明，两组韧带截肢小鼠的运动水平和平衡能力均明显受损。
在CT图像的三维重建中，观察到两组断韧带小鼠的ASCJ关节面比假手术组小鼠更粗糙，关节周围形成骨赘，关节骨体积分数增加。这些结果提示韧带截肢组的ASCJ关节软骨存在退行性病变。关节软骨切片染色显示软骨变性，如软骨表面不连续、软骨细胞减少等，进一步证实了长期ASCJ不稳定可能发展为PTOA，这与Chang等18描述的结果相似。
在模型建立过程中，成功建模的关键是准确找到相应的韧带进行切割。同时，适度增加小鼠的活动可以加速其骨关节炎的发展。在随后的染色过程中，小鼠踝关节组织的脱钙起着决定性的作用。因此，有必要经常观察组织的硬度，选择合适的切片时间。
在这项研究中，使用步态纸分析了小鼠术前后步态的变化，仅获得了小鼠步长的变化。如果使用动物步态分析仪器，可以根据小鼠每个步骤的大小和面积、位置、运动动态和压力来分析更多的参数，以对步态进行定性和定量分析。此外，Semmes Weinstein单丝检测是国际公认的检测触摸压力感觉障碍的一种非常有效的方法25，如果使用这种方法来评估小鼠脚的感觉功能，可能会获得更好的实验结果。然而，由于实验条件有限，动物步态分析仪器不可用，因此没有使用Semmes Weinstein单丝检测;因此，未来有机会使用这些实验技术进行深入研究。
由于PTOA是一种慢性退行性疾病26，因此应在不同的时间点观察到关节不稳定和软骨损伤，这值得未来进行更多的长期和多时间点研究。此外，由于小鼠ASCJ的结构较小，无法提取软骨细胞进行 体外 实验，以评估炎症因子的变化并在细胞水平上验证PTOA的存在。在未来的研究中，将花费更多的时间和精力来研究ASCJ变性的潜在分子生物学机制。其次，虽然小鼠后足和脚踝的结构与人类相似，但严格来说，小鼠是四足动物，而人类是两足动物，关节在运动过程中所受的力并不完全相同。
然而，ASCJ不稳定小鼠模型的成功建立，将单纯的踝关节不稳动物模型扩展到ASCJ不稳定动物模型，为足部不稳定的机制提供了更全面的认识，为临床足部疾病的研究提供了新的认识，也为疾病的诊断和治疗提供了动物模型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
所有作者都没有任何利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了江苏省政府奖学金项目和江苏省高等学校学术项目发展项目（PAPD）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
References
- Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
- Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
- Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
- Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
- Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
- Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
- Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
- Mittlmeier, T., Wichelhaus, A.
- Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
- Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
- Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
- Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
- Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
- Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
- Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
- Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
- Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
- Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
- Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
- Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
- Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
- Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
