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Biology

टखने-सबटालर कॉम्प्लेक्स संयुक्त अस्थिरता का एक माउस मॉडल

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64481
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Orthopaedic Institute, Soochow University
* These authors contributed equally

Summary

टखने-सबटालर कॉम्प्लेक्स जोड़ (एएससीजे) पैर का मूल है और दैनिक गतिविधियों में संतुलन नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। खेल की चोटें अक्सर इस जोड़ में अस्थिरता का कारण बनती हैं। यहां, हम एएससीजे के लिगामेंट ट्रांससेक्शन-प्रेरित अस्थिरता के एक माउस मॉडल का वर्णन करते हैं।

Abstract

टखने की मोच शायद दैनिक जीवन में सबसे आम खेल चोटें हैं, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर टखने-सबटालर कॉम्प्लेक्स संयुक्त (एएससीजे) की अस्थिरता होती है, और अंततः लंबी अवधि में पोस्ट-ट्रॉमैटिक ऑस्टियोआर्थराइटिस (पीटीओए) हो सकता है। हालांकि, चोट तंत्र की जटिलता और नैदानिक अभिव्यक्तियों के कारण, जैसे कि एक्चिमोसिस, हेमेटोमा, या पार्श्व पैर में कोमलता, एएससीजे अस्थिरता के निदान और उपचार पर कोई नैदानिक सहमति नहीं है। चूंकि माउस हिंदफुट की हड्डियों और स्नायुबंधन की मस्कुलोस्केलेटल संरचना मनुष्यों की तुलना में है, इसलिए चूहों में एएससीजे अस्थिरता का एक पशु मॉडल एएससीजे के आसपास स्नायुबंधन के ट्रांससेक्शन द्वारा स्थापित किया गया था। मॉडल को व्यवहार परीक्षणों और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषणों की एक श्रृंखला के माध्यम से अच्छी तरह से मान्य किया गया था, जिसमें बैलेंस बीम टेस्ट, एक पदचिह्न विश्लेषण (चूहों में व्यायाम स्तर और संतुलन क्षमता का आकलन), एक थर्मल नोसिसेप्शन मूल्यांकन (चूहों में पैर संवेदी कार्य का आकलन), माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) स्कैनिंग, और आर्टिकुलर कार्टिलेज का सेक्शन धुंधला हो जाना (चूहों में आर्टिकुलर कार्टिलेज क्षति और अध: पतन का आकलन)। एएससीजे अस्थिरता के माउस मॉडल की सफल स्थापना चोट तंत्र पर नैदानिक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संदर्भ प्रदान करेगी और इसके परिणामस्वरूप टखने की मोच के लिए बेहतर उपचार विकल्प होंगे।

Introduction

टखने की मोच दुनिया भर में सबसे आम खेल चोटों में से एक है। यह अनुमान लगाया गया है कि संयुक्त राज्य अमेरिका1 में प्रतिदिन 10,000 लोग घायल होते हैं, जिनमें से खेल-संबंधी चोटें 15% -45% 2 हैं। संयुक्त राज्य अमेरिका में टखने की मोच के इलाज से जुड़ी चिकित्सा लागत सालाना $ 4.2 बिलियन 3,4,5 है। टखने की मोच के बाद क्रोनिक पैर की अस्थिरता एक आम समस्या है और टखने की मोचके लगभग 74% में होती है, जिसमें टखने या सबटालर अस्थिरता शामिल है। हालांकि, समान नैदानिक लक्षणों और संकेतों के कारण, चिकित्सा कर्मचारियों के लिए यह भेद करना मुश्किल है कि क्या पुरानी टखने की अस्थिरता क्लिनिक में पुरानी सबटालर संयुक्त अस्थिरता के साथ भी है, और इसके परिणामस्वरूप, पुरानी सबटालर अस्थिरता को आसानी से याद किया जा सकता है। इसलिए, पुरानी टखने-सबटालर कॉम्प्लेक्स संयुक्त (एएससीजे) अस्थिरता (एक विशिष्ट प्रकार की पुरानी पैर अस्थिरता जिसमें पुरानी टखने की अस्थिरता और पुरानी सबटालर अस्थिरता दोनों शामिल हैं) की वास्तविकघटना रिपोर्ट 7,8,9 से अधिक हो सकती है। यदि अनुपचारित छोड़ दिया जाता है, तो पुरानी टखने-सबटालर जटिल संयुक्त अस्थिरता बार-बार टखने की मोच का कारण बन सकती है, जिससे टखने की मोच और पुरानी टखने-सबटालर जटिल अस्थिरता का एक दुष्चक्र हो सकता है। लंबे समय तक पुरानी टखने-subtalar जटिल अस्थिरता ASCJ और अभिघातजन्य पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के अध: पतन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो गंभीर मामलों10 में आसन्न जोड़ों को प्रभावित कर सकते हैं. इन रोगों के लिए, वर्तमान नैदानिक उपचार मुख्य रूप से रूढ़िवादी है, इस तरह के लिगामेंट की मरम्मत और लिगामेंट पुनर्निर्माण11,12 जैसे शल्य चिकित्सा उपचार विधियों के अलावा.

एएससीजे पैर की मुख्य संरचना है और आंदोलन13 के दौरान शरीर के संतुलन को बनाए रखता है। टखने के जोड़ और सबटालर संयुक्त की संरचना पर अलग-अलग14,15,16,17 व्यापक शोध किया गया है। हालांकि, पूरे टखने-सबटालर संयुक्त पर शोध दुर्लभ है। टखने की चोट के लगभग एक-चौथाई मामले सबटलर संयुक्त चोट18 से जुड़े हैं। एएससीजे अस्थिरता के जटिल चोट तंत्र के कारण, नैदानिक सेटिंग में इसका निदान और उपचार करने पर कोई सहमति नहीं है। क्लिनिक में टखने की चोटों की वर्तमान स्थिति को ध्यान में रखते हुए, टखने और सबटलर जोड़ का समग्र रूप से अध्ययन करने के लिए एक अधिक वैज्ञानिक पद्धति की आवश्यकता होती है, जिससे पैर की बीमारियों का अध्ययन करने के लिए एक नई समझ प्रदान की जाती है।

चूंकि मस्कुलोस्केलेटल स्तर पर माउस हिंदफुट की शारीरिक संरचना मानव पैर 19 की तुलना में है, कई अध्ययनों में, पैर / टखने अनुसंधान के लिए माउस मॉडल पहले से ही10,19 लागू किए गए हैं। चांग एट अल 19 ने टखने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के तीन अलग-अलग माउस मॉडल सफलतापूर्वक विकसित किए। माउस मॉडल में टखने की अस्थिरता की सफल स्थापना से प्रेरित होकर, हमने टखने-सबटालर जटिल अस्थिरता के लिए एक माउस मॉडल स्थापित किया, यह अनुमान लगाते हुए कि माउस हिंदफुट में आंशिक स्नायुबंधन के ट्रांससेक्शन के परिणामस्वरूप एएससीजे की यांत्रिक अस्थिरता होगी, जिससे एएससीजे के पोस्ट-ट्रॉमैटिक ऑस्टियोआर्थराइटिस (पीटीओए) हो जाएगा। ASCJ अस्थिरता पशु मॉडल का उपयोग टखने की अस्थिरता और subtalar अस्थिरता दोनों के उपचार के लिए किया जा सकता है, जो वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले सरल टखने की अस्थिरता मॉडल 7,8,9,19 की तुलना में वास्तविक नैदानिक स्थिति के अनुरूप है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, एएससीजे के लिगामेंट ट्रांससेक्शन-प्रेरित अस्थिरता के दो माउस मॉडल डिजाइन किए गए थे। संवेदी-मोटर फ़ंक्शन के परिणाम-बैलेंस बीम परीक्षण, पदचिह्न विश्लेषण, और थर्मल नोसिसेप्शन मूल्यांकन-मॉडल की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए गए थे, और माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) और हिस्टोलॉजिकल धुंधला माउस आर्टिकुलर उपास्थि के नुकसान और अध: पतन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया था। एएससीजे अस्थिरता के माउस मॉडल की सफल स्थापना न केवल पैर रोगों का अध्ययन करने के लिए एक नई समझ प्रदान करती है, बल्कि चोट से संबंधित तंत्र पर नैदानिक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संदर्भ भी प्रदान करती है, टखने की मोच के लिए बेहतर उपचार विकल्प प्रदान करती है, और आगे के अध्ययन के लिए सहायक होती है रोग।

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Protocol

सभी जानवरों के अध्ययन प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे और सूचो विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

1. सर्जिकल प्रक्रियाएं

  1. 21, 6 सप्ताह पुराने C57BL/6 नर चूहों को तीन समूहों में विभाजित करें: अनुप्रस्थ ग्रीवा लिगामेंट और पूर्वकाल टैलोफिबुलर लिगामेंट समूह, अनुप्रस्थ ग्रीवा लिगामेंट और डेल्टॉइड लिगामेंट समूह, और शम सर्जरी समूह। सुनिश्चित करें कि सभी चूहों को ऐसे वातावरण में उठाया गया था जो विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) मानकों को पूरा करता है।
  2. प्रयोग से पहले 2 सप्ताह के लिए नए पालन वातावरण (12 एच/12 घंटे का प्रकाश/अंधेरा चक्र, और क्रमशः 18-22 डिग्री सेल्सियस और 40% -70% की निरंतर तापमान और आर्द्रता) के लिए चूहों को अनुकूलित करें। प्रयोग से 1 सप्ताह पहले, बिना रुके संतुलन बीम या यू आकार के पाइप के एक छोर से दूसरे छोर तक जाने के लिए बीम और चाल प्रशिक्षण को संतुलित करने के लिए चूहों को विषय दें।
  3. 8 सप्ताह की उम्र में, isoflurane के 2 एमएल के साथ एक कपास की गेंद गीला और पूर्ण volatilization के लिए एक airtight कंटेनर में रखकर isoflurane साँस लेना का उपयोग माउस anesthetize. माउस की गतिविधि की निगरानी करें और साँस लेना जारी रखें जब तक कि माउस की गतिविधि काफी कम न हो जाए। उनकी प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करने के लिए चूहों के पैर की उंगलियों को चुटकी करके संज्ञाहरण की गहराई निर्धारित करें। बाद के ऑपरेशन के दौरान चूहों में संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए एक फेसमास्क के माध्यम से वाष्पीकृत आइसोफ्लुरेन (2%) को श्वास लें। आंखों को सूखने से रोकने के लिए एनेस्थीसिया के दौरान पशु चिकित्सा नेत्र मरहम का उपयोग करें।
  4. एनेस्थेटाइजिंग के बाद, एक शेवर के साथ माउस के दाहिने हिंद अंगों के टखने के जोड़ पर बालों को हटा दें, और आयोडीन कपास गेंदों और शराब कपास गेंदों के वैकल्पिक दौर के साथ उजागर त्वचा को तीन बार कीटाणुरहित करें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा 5 मिलीग्राम / किग्रा कार्प्रोफेन का प्रशासन करें। एक बाँझ शल्य चिकित्सा पैड का उपयोग कर microsurgery पशु ऑपरेटिंग कमरे में माउस स्थानांतरण.
  5. अनुप्रस्थ ग्रीवा लिगामेंट और पूर्वकाल टैलोफिबुलर लिगामेंट (सीएल + एटीएफएल) समूह के लिए, दाहिने टखने के जोड़ के ऊपर त्वचा पर एक स्केलपेल के साथ 7 मिमी तिरछा नीचे अनुदैर्ध्य चीरा बनाएं, और टखने के जोड़ के सामने सूक्ष्म सीधे संदंश के साथ जांच करें।
  6. जांच के बाद ताल शरीर और फाइबुला की निचली सीमा पर एटीएफएल के जोखिम को सुनिश्चित करें और इसे स्केलपेल के साथ धीरे से काटें। लंबे और छोटे फाइबुलर टेंडन और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस टेंडन को अलग करें, सीएल को बेनकाब करें, और इसे स्केलपेल से काट लें।
  7. अनुप्रस्थ सीएल + डेल्टॉइड लिगामेंट (डीएल) समूह के लिए, दाहिने टखने के जोड़ की औसत दर्जे की त्वचा पर 8 मिमी ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं और अंत में इसे काटने के लिए डीएल को औसत दर्जे का मैलेलेलस से अलग करें। फिर, सीएल के रूप में चरण 1.5 में वर्णित कटौती.
  8. शम ग्रुप (शम सर्जरी ग्रुप) के लिए, दाहिने टखने के जोड़ पर शम सर्जरी करें लेकिन किसी भी स्नायुबंधन को न काटें।
  9. बाँझ सामान्य खारा के साथ चीरा फ्लश और 5-0 सर्जिकल नायलॉन धागा के साथ सीवन. अंत में, एक आयोडीन कपास की गेंद के साथ sutured चीरा कीटाणुरहित.
  10. माउस को अवलोकन के तहत रखें जब तक कि यह स्टर्नल रिकम्बेंसी को बनाए रख सकता है, और जब तक यह पूरी तरह से सचेत न हो तब तक पर्यवेक्षण करें। आयोडीन कॉटन बॉल के साथ प्रति दिन दो बार टखने के चीरे को कीटाणुरहित करें और 1 सप्ताह के लिए दिन में एक बार कार्प्रोफेन (5 मिलीग्राम/किग्रा, चमड़े के नीचे इंजेक्शन) का प्रशासन करें। ऑपरेशन के बाद अकेले रियर, और माउस की पश्चात की स्थिति पर पूरा ध्यान दें।
  11. सर्जरी के दो सप्ताह बाद और जब टखने के जोड़ की सूजन कम हो गई है, तो हर दिन 1 घंटे के लिए माउस रोटरी थकान मशीन में चूहों का व्यायाम शुरू करें।

2. बैलेंस बीम टेस्ट

  1. 1 मीटर की लंबाई और 20 मिमी के व्यास के साथ एक गोलाकार लकड़ी के बीम को दबाएं, एक छोर पर 15 डिग्री पर झुका हुआ, एक फोटोग्राफी तिपाई क्लिप के साथ, और दूसरे छोर को एक बंद कैसेट से जुड़ी काम की सतह पर रखें।
  2. सर्जरी से 1 सप्ताह पहले बैलेंस बीम प्रशिक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि चूहे आसानी से बीम के एक छोर से दूसरे छोर तक चले जाएं। एक माउस पर विचार करें कि उसने परीक्षण पास कर लिया है जब वह बिना रुके 60 s में दो बार बीम से गुजरता है।
  3. प्रत्येक माउस के लिए लगातार दो परीक्षण करें और अगले माउस को प्रभावित करने से पिछले माउस के अवशिष्ट गंध को रोकने के लिए प्रत्येक परीक्षण के बाद 75% अल्कोहल के साथ बैलेंस बीम स्प्रे करें।
  4. सर्जरी के 3 दिन, 1 सप्ताह, 4 सप्ताह, 8 सप्ताह और 12 सप्ताह बाद बैलेंस बीम परीक्षण प्रीऑपरेटिव रूप से करें। एक पंक्ति में दो बार संतुलन बीम गुजर प्रत्येक माउस के औसत समय रिकॉर्ड और बार सही हिंद फुट निर्भर चर के रूप में बीम से फिसल जाता है की संख्या.

3. पदचिह्न विश्लेषण

  1. प्रयोगात्मक मेज पर 50 सेमी की लंबाई, 10 सेमी की चौड़ाई, और 10 सेमी की ऊंचाई के साथ एक यू-आकार का प्लास्टिक चैनल रखें और प्लास्टिक चैनल के एक छोर को एक बंद कैसेट से कनेक्ट करें।
  2. चैनल में एक सादे वर्णक कागज फ्लैट रखें, और फिर दोनों हाथों से माउस पकड़ और गैर विषैले लाल और हरे रंग वर्णक के साथ समान रूप से उनके सामने और पीछे के पैर पेंट.
  3. चैनल के एक छोर पर धीरे चित्रित माउस प्लेस और उन्हें कैसेट के दूसरे छोर पर ले जाने दो. पिगमेंटेड पेपर को पैरों के निशान के साथ बाहर निकालें, इसे चिह्नित करें, और इसे हवादार और छायांकित जगह में सूखने के लिए रैक पर रखें।
  4. प्रत्येक माउस पारित होने के बाद, 75% अल्कोहल के साथ यू के आकार के प्लास्टिक चैनल को स्प्रे करें ताकि पिछले माउस की अवशिष्ट गंध को अगले माउस को प्रभावित करने से रोका जा सके।
  5. प्रत्येक कागज पर तीन लगातार स्पष्ट माउस पैरों के निशान का चयन करें, और माउस के दाहिने पैर के पदचिह्न के कदम लंबाई को मापने के लिए एक शासक का उपयोग करें, साथ ही साथ बाएं और दाएं पैरों के निशान के बीच कदम चौड़ाई.

4. थर्मल नोसिसेप्शन मूल्यांकन

  1. प्रयोग के दौरान, क्रमशः गतिविधि और आराम के दौरान माउस पैर के थर्मल नोसिसेप्शन प्रतिक्रिया समय और माउस की प्रतिक्रिया समय रिकॉर्ड करने के लिए तल परीक्षण का उपयोग करें। सेकंड में माप डेटा रिकॉर्ड करें।
  2. मापने के उपकरण में माउस रखें, अपने दाहिने पैर के साथ साधन संरेखित करें, और धीरे-धीरे बढ़ते तापमान के साथ उपकरण को गर्म करना शुरू करें। माउस की प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें। जब तापमान सहिष्णुता से ऊपर बढ़ जाता है, माउस जल्दी से वापस ले लिया या अपने दाहिने पैर चाटना होगा. उपकरण का उपयोग करके समय रिकॉर्ड करें और गतिविधि के दौरान प्रतिक्रिया समय के रूप में समय को परिभाषित करें।
  3. आराम से प्रतिक्रिया समय को मापने के लिए, माउस हीटिंग के बिना बाकी मेज पर 30 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर चरण 4.2 में समझाया के रूप में समय डेटा प्राप्त. बाद के विश्लेषण के लिए इन अधिग्रहीत अस्थायी डेटा का उपयोग करें।

5. माइक्रो-सीटी स्कैनिंग

  1. कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 12 सप्ताह के चूहों को पोस्टऑपरेटिव रूप से इच्छामृत्यु दें, उनके दाहिने टखनों की त्वचा को छील दें, और फिर पूर्ण टखने के नमूने प्राप्त करने के लिए सर्जिकल कैंची के साथ अपने मध्य टिबिया और फाइबुला को काट लें। 48 घंटे के लिए 10% तटस्थ फॉर्मेलिन युक्त चिह्नित 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में नमूनों को रखें।
  2. निर्धारण के बाद, माइक्रो-सीटी स्कैनिंग के लिए एक विशेष स्पंज टैंक में नमूनों को बैचों (प्रति बैच चार नमूने) में रखें। मशीन पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: वोल्टेज = 50 केवी, करंट = 200 एमए, फिल्टर = 0.5 एमएमएएल, और रिज़ॉल्यूशन = 9 माइक्रोन। माइक्रो-सीटी स्कैनर चलाएं।
  3. स्कैनिंग के बाद, छवि की सीमा को चित्रित करने के लिए पुनर्निर्माण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें, और वाणिज्यिक डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके चित्रित छवि के XYZ अक्ष को समायोजित करने के बाद एक विशिष्ट कोण स्थिति का चयन करें, जैसा कि लियू एट अल.10 में वर्णित है।
  4. XYZ अक्षों द्वारा समायोजित पुनर्गठित छवियों में रुचि के निरंतर 10-परत क्षेत्रों का चयन करने के लिए माइक्रो-सीटी विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें, और हड्डी की मात्रा अंश (BV/TV) निर्धारित करने के लिए आवश्यक जोड़ों का मात्रात्मक विश्लेषण करें, जैसा कि लियू एट अल.10में वर्णित है।
  5. अंत में, माउस टखने जोड़ों के त्रि-आयामी सीटी छवि प्रसंस्करण करने के लिए त्रि-आयामी चिकित्सा छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, जैसा कि लियू एट अल.10में वर्णित है। पुनर्निर्माण के बाद, ASCJ में पहनने और ओस्टियोफाइट्स के गठन का निरीक्षण करें।

6. आर्टिकुलर उपास्थि की धारा धुंधला हो जाना

नोट: सभी धुंधला कदम एक धूआं हुड में किया जाता है, और प्रक्रिया के दौरान एक मुखौटा पहना जाता है।

  1. टखने के नमूनों के आसपास अतिरिक्त नरम ऊतक को हटाने के लिए सूक्ष्म चिमटी और कैंची का उपयोग करें, और फिर नमूनों को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें जिसमें 10% ईडीटीए डिकैल्सीफिकेशन समाधान 44 ग्राम NaOH के साथ तैयार किया गया है, पीबीएस के दो पैक, और EDTA-2Na के 400 ग्राम, पीएच के साथ हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ 7.35-7.45 पर समायोजित किया गया है, और विभिन्न समूहों को चिह्नित करें।
  2. अगला, अपकेंद्रित्र ट्यूब को डीकैल्सीफिकेशन के लिए एक मिलाते हुए टेबल (20 आरपीएम पर सेट गति) पर रखें और प्रति दिन एक बार डीकैल्सीफिकेशन समाधान बदलें। नमूनों के डीकैल्सीफिकेशन का निर्धारण करें।
  3. decalcification के 1 महीने के बाद, ढाल शराब के साथ नमूनों निर्जलीकरण और फिर समाशोधन प्रयोजनों के लिए 8 घंटे के लिए एन-butanol का उपयोग करें. अंत में, एम्बेडिंग के लिए एक कोरोनल स्थिति में पैराफिन में साफ नमूनों को विसर्जित करें।
  4. बाद में उपयोग के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में पैराफिन नमूनों रखें. सेक्शनिंग से पहले, 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से नमूने लें और उन्हें पूरे विमान को काटने की सुविधा के लिए लगभग 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
  5. माइक्रोटोम पर नमूनों को ठीक करें और उन्हें 6 माइक्रोन की मोटाई पर अनुभाग करें। उसी समय, यह देखने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें कि क्या नमूने हड्डी के ऊतकों में एक सिरिंज सुई के अपेक्षित स्तर-आसान प्रवेश पर काटे गए हैं।
  6. टैबलेट मशीन के पानी के तापमान को पहले से 40 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें। अगला, एक पंक्ति में दो से तीन पूर्ण पैराफिन वर्गों को काटें और उन्हें पूर्ण विस्तार के लिए टैबलेट मशीन में स्थानांतरित करें। फिर, एक गिलास स्लाइड के साथ पैराफिन वर्गों को हटा दें और पानी नाली. अंत में, स्लाइड्स को समूहों और संख्याओं के साथ चिह्नित करें।

7. हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) धुंधला हो जाना

  1. वर्गों को 60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इस तरह से रखें कि बरकरार एएससीजे संयुक्त संरचना को माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है और 40-50 मिनट के लिए वर्गों को सेंकना कर सकता है। फिर, xylene 3x के साथ वर्गों dewax, मैं, द्वितीय, और आसान पहचान के लिए तृतीय के रूप में गिने हुए, क्रमशः 15 मिनट, 15 मिनट, और 10 मिनट, के लिए.
  2. dewaxed वर्गों 100% इथेनॉल 2x में रखें, आसान पहचान के लिए मैं और द्वितीय के रूप में गिने हुए, 90% इथेनॉल, और 3 मिनट, 3 मिनट, 5 मिनट, और 5 मिनट, क्रमशः के लिए 80% इथेनॉल. अगला, 5 मिनट के लिए डबल आसुत जल (डीडीएच2हे) के साथ वर्गों धो लें.
  3. 1 मिनट के लिए hematoxylin के साथ भिगोने के बाद, ddH2हे के साथ वर्गों धो लें जब तक वे रंगहीन हो जाते हैं. 30 एस के लिए 1% एसिड इथेनॉल भेदभाव समाधान में वर्गों को भिगोएँ और उन्हें डीडीएच2ओ के साथ 1 मिनट के लिए 3x धो लें। उसके बाद, 1 मिनट के लिए 1% अमोनिया समाधान के साथ वर्गों दाग, और फिर ddH2ओ के साथ प्रत्येक 1 मिनट के लिए 3x धो लें.
  4. अगला, 1 मिनट के लिए eosin धुंधला समाधान के साथ नमूने दाग, और फिर उन्हें 95% इथेनॉल और 100% इथेनॉल में डाल दिया उत्तराधिकार में प्रत्येक 1 मिनट के लिए. अंत में, 1 मिनट के लिए xylene चतुर्थ के साथ वर्गों का इलाज.
  5. अनुभागों को हवा में सुखाएं, स्लाइड पर नमूनों पर तटस्थ राल की एक बूंद चिपकाएं, और उन्हें कवर पर्ची के साथ कवर करें। फिर, 5x और 20x पर brightfield में एक ईमानदार प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ छवियों ले.

8. Safranin O-फास्ट हरी धुंधला हो जाना

  1. चयनित वर्गों को 60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और 40-50 मिनट के लिए वर्गों को सेंकना। फिर, क्रमशः 15 मिनट, 15 मिनट, और 10 मिनट के लिए xylene मैं, द्वितीय, और III के साथ वर्गों dewax.
  2. क्रमशः 3 मिनट, 3 मिनट, 5 मिनट, और 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल मैं, द्वितीय, 90% इथेनॉल, और 80% इथेनॉल में dewaxed वर्गों रखें. अगला, 5 मिनट के लिए डीडीएच2ओ के साथ वर्गों को धो लें।
  3. 1 मिनट के लिए hematoxylin के साथ भिगोने के बाद, ddH2हे के साथ वर्गों धो लें जब तक वे रंगहीन हो जाते हैं. 30 एस के लिए 1% एसिड इथेनॉल भेदभाव समाधान में वर्गों को भिगोएँ और उन्हें डीडीएच2ओ के साथ 1 मिनट के लिए 3x धो लें। फिर, 1 मिनट के लिए 1% अमोनिया समाधान के साथ वर्गों दाग, और उन्हें ddH2ओ के साथ प्रत्येक 1 मिनट के लिए 3x धो लें.
  4. 2 मिनट के लिए 0.05% तेजी से हरे रंग में वर्गों भिगोएँ, 30 एस के लिए 1% एसिटिक एसिड समाधान में वर्गों भिगोने के बाद और 5 मिनट के लिए 0.1% safranine में. 1 मिनट के लिए 95% इथेनॉल और 100% इथेनॉल में दाग नमूनों रखें, एक के बाद एक.
  5. अंत में, 1 मिनट के लिए xylene चतुर्थ के साथ वर्गों का इलाज. अनुभागों को हवा में सुखाएं, स्लाइड पर नमूनों पर तटस्थ राल की एक बूंद चिपकाएं, और उन्हें कवर पर्ची के साथ कवर करें। फिर, 5x और 20x पर brightfield में एक ईमानदार प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ छवियों ले.

9. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. दिन 1: चयनित वर्गों को 60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें, 40-50 मिनट के लिए वर्गों को सेंकना, और फिर उन्हें क्रमशः 15 मिनट, 15 मिनट और 10 मिनट के लिए xylene I, II और III के साथ डीवैक्स करें। क्रमशः 3 मिनट, 3 मिनट, 5 मिनट, और 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल मैं, द्वितीय, 90% इथेनॉल, और 80% इथेनॉल में dewaxed वर्गों रखें. फिर, 5 मिनट के लिए डीडीएच2ओ के साथ वर्गों को धो लें, नमूना के क्षेत्र को घेरने के लिए एक हिस्टोकेमिकल पेन का उपयोग करें, और उन्हें एक अंधेरे बॉक्स में रखें।
  2. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति: परिक्रमा नमूना क्षेत्र में 0.25% ट्रिप्सिन के 20-50 माइक्रोन ड्रॉप करें, 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें, और फिर पीबीएस के साथ प्रत्येक 2 मिन के लिए नमूनों को 3x धोएं। 3% एच 2 ओ 2 जोड़कर अंतर्जात पेरोक्सीडेज को ब्लॉक करें, अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिन के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें, और फिर उन्हें पीबीएस के साथ प्रत्येक2मिन के लिए 3x धोएं। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10% बकरी सीरम जोड़कर सीरम अवरुद्ध प्रदर्शन करें, और फिर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस एंटी-माउस प्रकार II कोलेजन, 1,000 बार पतला) के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. दिन 2: 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर वर्गों को फिर से गरम करें। प्राथमिक एंटीबॉडी पुनर्प्राप्त करें और पीबीएस के साथ प्रत्येक 2 मिनट के लिए वर्गों 3x धो लें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 40 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं, और फिर पीबीएस के साथ प्रत्येक 2 मिनट के लिए वर्गों 3x धो लें.
  4. डीएबी रंग विकास: डीएबी अभिकर्मक तैयार करने के लिए डीडीएच 2 ओ के 5 एमएल, बफर की दो बूंदें, डीएबी की चार बूंदें और एच 2 ओ2की दो बूंदें जोड़ें। वर्गों में अभिकर्मक के 20-50 माइक्रोन जोड़ें, नमूनों को 5 मिनट के लिए प्रकाश से सुरक्षित रखें, और फिर डीडीएच 2 ओ के साथ2मिन के लिए वर्गों को धो लें।
  5. 1 मिनट के लिए hematoxylin के साथ भिगोने के बाद, ddH2हे के साथ वर्गों धो लें जब तक वे रंगहीन हो जाते हैं. 30 एस के लिए 1% एसिड इथेनॉल भेदभाव समाधान में वर्गों को भिगोएँ और उन्हें डीडीएच 2 ओ के साथ प्रत्येक 1 मिनट के लिए 3x धो लें, 1% अमोनिया समाधान के साथ 1 मिनट के लिए वर्गों को दाग दें, और फिर उन्हें डीडीएच2ओ के साथ प्रत्येक 1 मिनट के लिए 3x धो लें।
  6. अगला, वर्गों में जगह 95% इथेनॉल और 100% इथेनॉल, क्रमशः, 1 मिनट प्रत्येक के लिए. अंत में, xylene चतुर्थ के साथ 1 मिनट के लिए वर्गों सेते हैं. अनुभागों को हवा में सुखाएं, स्लाइड पर नमूनों पर तटस्थ राल की एक बूंद चिपकाएं, और उन्हें कवर पर्ची के साथ कवर करें। फिर, 5x और 20x पर brightfield में एक ईमानदार प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ छवियों ले.

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Representative Results

सहसंबंध डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण ऑनलाइन सांख्यिकीय विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके किया गया था। सामान्य वितरण और विचरण की एकरूपता के दो परीक्षणों को पूरा करने वाले डेटा का उपयोग विचरण के एकतरफा विश्लेषण द्वारा आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया गया था। यदि डेटा दो परीक्षणों को पूरा नहीं करता है, तो सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग किया गया था। डेटा को मानक विचलन (एसडी) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है, और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

बैलेंस बीम परीक्षण
प्रत्येक चरण में दो बार संतुलन बीम के माध्यम से पारित करने के लिए प्रत्येक माउस के लिए आवश्यक औसत समय के सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि चूहों के प्रत्येक समूह के लिए सर्जरी से पहले संतुलन बीम पारित करने के लिए आवश्यक समय में कोई सांख्यिकीय मतभेद थे (पी = 0.73). सर्जरी के तीन दिन बाद, सीएल + एटीएफएल और सीएल + डीएल समूहों में चूहों को शम समूह में चूहों की तुलना में बैलेंस बीम से गुजरने के लिए लंबे समय तक आवश्यकता होती है, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.05)। सर्जरी के चार सप्ताह बाद, सीएल + एटीएफएल और सीएल + डीएल समूहों में चूहों द्वारा लिए गए समय में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया ताकि शम समूह में चूहों की तुलना में बैलेंस बीम पास किया जा सके (पी > 0.05)। इसके अलावा, सर्जरी के 8 सप्ताह और 12 सप्ताह बाद, सीएल + एटीएफएल और सीएल + डीएल समूहों में चूहों को शम समूह में चूहों की तुलना में बैलेंस बीम पास करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.01)। सीएल + एटीएफएल समूह में चूहों द्वारा लिए गए समय में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था ताकि प्रत्येक परीक्षण अवधि के दौरान सीएल + डीएल समूह में चूहों की तुलना में संतुलन बीम पास किया जा सके (पी > 0.05; चित्रा 1 ए)।

बैलेंस बीम के माध्यम से माउस का दाहिना हिंदफुट फिसलने की संख्या सर्जरी से पहले चूहों के तीन समूहों (पी = 0.68) के बीच सांख्यिकीय रूप से भिन्न नहीं थी। इसके अलावा, सर्जरी के 3 दिन बाद शम समूह में चूहों की तुलना में सीएल + एटीएफएल और सीएल + डीएल समूहों में चूहों के लिए दाहिने हिंदफुट के वर्गों की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। अन्य पश्चात के समय बिंदुओं के बारे में, लिगामेंट ट्रांससेक्शन समूह में वर्गों की संख्या शम समूह में चूहों की तुलना में अधिक थी, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.05)। सर्जरी के 8 सप्ताह और 12 सप्ताह बाद, सीएल + एटीएफएल समूह में दाहिने हिंदफुट की संख्या बैलेंस बीम से फिसल गई, सीएल + डीएल समूह में चूहों की तुलना में अधिक थी, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.05; चित्रा 1 बी)।

पदचिह्न विश्लेषण
प्रत्येक समूह में चूहों की स्ट्राइड लंबाई उम्र के साथ बढ़ी, लेकिन लिगामेंट विच्छेद स्ट्राइड लंबाई को छोटा कर सकता है। सर्जरी से पहले चूहों के तीन समूहों के बीच दाहिने हिंद पैर की चरण लंबाई में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया (पी > 0.05)। सर्जरी के 12 सप्ताह बाद चाल परीक्षण में, लिगामेंट कट समूह में दाहिने हिंदफुट की चरण लंबाई उसी अवधि में शम समूह की तुलना में कम थी, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.01)। हालांकि, सीएल + एटीएफएल समूह में चूहों के लिए दाहिने हिंदफुट की स्ट्राइड लंबाई सीएल + डीएल समूह (पी > 0.05; चित्रा 2 ए, बी)।

थर्मल नोसिसेप्शन मूल्यांकन
गतिविधि के दौरान चूहों के पैरों के थर्मल नोसिसेप्शन प्रतिक्रिया समय के सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि सर्जरी से पहले चूहों के तीन समूहों की प्रतिक्रिया समय में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं था (पी > 0.5)। सर्जरी के बाद थर्मल नोसिसेप्शन मूल्यांकन में, लिगामेंट कट समूह में चूहों के थर्मल नोसिसेप्शन प्रतिक्रिया समय उसी अवधि में शम समूह में चूहों की तुलना में लंबे समय तक थे, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.01; चित्र 3)।

माइक्रो-सीटी स्कैनिंग
सर्जरी के बारह सप्ताह बाद, माइक्रो-सीटी का उपयोग मात्रात्मक रूप से प्रत्येक समूह में चूहों के लिए दाहिने हिंदफुट के एएससीजे का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। सीटी छवियों के त्रि-आयामी पुनर्निर्माण से पता चला है कि कटे हुए स्नायुबंधन वाले दो समूहों में दाहिने हिंदफुट का एएससीजे शम समूह की तुलना में मोटा था। संयुक्त सतह अवतल, उत्तल और सपाट थी, स्पष्ट पहनने के निशान थे, जोड़ों के चारों ओर ओस्टियोफाइट्स उत्पन्न हुए थे, और जोड़ों ने अपक्षयी परिवर्तन दिखाए। इसके अलावा, सीएल + डीएल समूह में चूहों के लगभग 28.6% ने ताल अव्यवस्था(चित्रा 4ए,बी)10विकसित की। सीएल + एटीएफएल और सीएल + डीएल समूहों में दाहिने हिंदफुट के एएससीजे की हड्डी की मात्रा का अंश शम समूह की तुलना में काफी अधिक था, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.01; चित्रा 4 सी, डी) 10.

आर्टिकुलर उपास्थि का अनुभाग धुंधला हो जाना
एच एंड ई और सफ्रानिन ओ-फास्ट ग्रीन धुंधला से पता चला कि शम समूह में चूहों के एएससीजे की संरचना पूरी हो गई थी, उपास्थि की आकृति विज्ञान बरकरार था, और चोंड्रोसाइट्स समान रूप से वितरित किए गए थे। लिगामेंट कटौती के साथ चूहों के दो समूहों के एएससीजे की उपास्थि परत ने स्पष्ट असंतोष दिखाया, और चोंड्रोसाइट्स की संख्या कम हो गई(चित्रा 5ए,बी)10. संशोधित मैनकिन और ऑस्टियोआर्थराइटिस रिसर्च सोसाइटी इंटरनेशनल (OARSI) स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग प्रत्येक समूह20,21,22 में चूहों के लिए ASCJ के H&E और Safranin O-Fast Green Staining को स्कोर करने के लिए किया गया था। संशोधित मैनकिन स्कोर उपास्थि संरचनात्मक विशेषताओं और चोंड्रोसाइट्स की संख्या और धुंधला होने से निर्धारित किया गया था, और ओएआरएसआई स्कोर उपास्थि के हिस्टोपैथोलॉजिकल ग्रेड और चरण द्वारा निर्धारित किया गया था। लिगामेंट विच्छेदन के साथ चूहों के दो समूहों के स्कोर शम समूह में चूहों की तुलना में अधिक थे, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.05; चित्र 5C-F)10.

ठेठ प्रकार द्वितीय कोलेजन immunohistochemical धुंधला की छवियों से पता चला है कि नकली समूह में सही हिंद पैर के ASCJ articj articular उपास्थि परत में प्रकार द्वितीय कोलेजन की सामग्री कटे हुए स्नायुबंधन के साथ चूहों के दो समूहों की तुलना में अधिक समान था, और प्रकार द्वितीय कोलेजन (चित्रा 6A) का कोई स्पष्ट नुकसान नहीं था. मात्रात्मक विश्लेषण के परिणामों से पता चला है कि शम समूह में चूहों के एएससीजे में कोलेजन प्रकार II की अभिव्यक्ति गंभीर स्नायुबंधन वाले चूहों के दो समूहों की तुलना में अधिक थी, और अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.05; चित्रा 6 बी, सी)।

Figure 1
चित्रा 1: बैलेंस बीम परीक्षण का उपयोग कर चूहों के व्यवहार विश्लेषण . (ए) संतुलन बीम पार करने के लिए चूहों के लिए आवश्यक समय. (बी) बैलेंस बीम को पार करते समय दाहिने पैर की पर्चियों की संख्या। डेटा माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है, n = प्रति समूह 7 नमूने। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पदचिह्न विश्लेषण का उपयोग चूहों के व्यवहार विश्लेषण. (ए) सर्जरी से पहले प्रत्येक समूह में चूहों के लिए सही कदम की लंबाई की तुलना। (बी) सर्जरी के 12 सप्ताह बाद प्रत्येक समूह में चूहों के लिए सही कदम की लंबाई की तुलना। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर ** द्वारा इंगित किए जाते हैं, जहां p < 0.01, और ***, जहां p संकेतित समूहों के बीच 0.001 <। डेटा माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है, n = प्रति समूह 7 नमूने। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: थर्मल नोसिसेप्शन मूल्यांकन का उपयोग करके चूहों का व्यवहार विश्लेषण। चूहों में गतिविधि के दौरान थर्मल नोसिसेप्शन प्रतिक्रिया समय। डेटा माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है, n = प्रति समूह 7 नमूने। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माउस के दाहिने पैर का माइक्रो-सीटी विश्लेषण । (ए) टखने-सबटालर संयुक्त परिसर (पार्श्व दृश्य, औसत दर्जे का दृश्य, पूर्वकाल दृश्य) में अव्यवस्था के बिना माउस तालस का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण। (बी) टखने-सबटालर संयुक्त परिसर (पार्श्व दृश्य, औसत दर्जे का दृश्य, पूर्वकाल दृश्य) में अव्यवस्थित माउस ताल का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण। (सी) माउस टखने के जोड़ों की हड्डी की मात्रा अंश (बीवी / टीवी) का मात्रात्मक विश्लेषण। (डी) माउस सबटालर जोड़ों के हड्डी वॉल्यूम अंश (बीवी / टीवी) का मात्रात्मक विश्लेषण। काले तीर ऑस्टियोफाइट गठन या तालस अव्यवस्था का संकेत देते हैं। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर *** द्वारा इंगित किए जाते हैं, जहां संकेतित समूहों के बीच p < 0.001 है। यह आंकड़ा लियू एट अल 10 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एच एंड ई और सैफ्रानिन ओ-फास्ट ग्रीन धुंधला हो जाना और टखने के जोड़ों का विश्लेषण। (ए) माउस टखने-सबटालर जोड़ों के एच एंड ई धुंधला हो जाना। (बी) माउस टखने-सबटालर जोड़ों के सैफरैनिन ओ-फास्ट धुंधला। (सी) माउस टखने जोड़ों के लिए संशोधित मैनकिन स्कोर। (डी)माउस subtalar जोड़ों के लिए संशोधित Mankin स्कोर. (ई) ऑस्टियोआर्थराइटिस रिसर्च सोसाइटी इंटरनेशनल (OARSI) माउस टखने जोड़ों के लिए स्कोर। (एफ) माउस subtalar जोड़ों के लिए OARSI स्कोर. प्रतीक: ए = टखने का जोड़; एस = सबटालर संयुक्त। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर *** द्वारा इंगित किए जाते हैं, जहां संकेतित समूहों के बीच p < 0.001 है। स्केल बार = 100 माइक्रोन, एन = 7 नमूने प्रति समूह। यह आंकड़ा लियू एट अल 10 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला हो जाना और टखने के जोड़ों का विश्लेषण। (ए) टाइप II कोलेजन इम्यूनोहिस्टोकेमिकल माउस टखने और सबटालर जोड़ों का धुंधला हो जाना। (बी) कोलेजन द्वितीय (+) माउस टखने जोड़ों के लिए क्षेत्र अनुपात प्रतिशत. (सी)कोलेजन द्वितीय (+) माउस subtalar जोड़ों के लिए क्षेत्र अनुपात प्रतिशत. प्रतीक: ए = टखने का जोड़; एस = सबटालर संयुक्त। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर *** द्वारा इंगित किए जाते हैं, जहां संकेतित समूहों के बीच पी < 0.001 है। स्केल बार = 100 माइक्रोन, एन = 7 नमूने प्रति समूह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में, एएससीजे अस्थिरता के दो माउस मॉडल सीएल + एटीएफएल या सीएल + डीएल को स्थानांतरित करके सफलतापूर्वक निर्माण किए गए थे। चूहों के लिए बैलेंस बीम से गुजरने का समय सर्जरी के बाद 8 सप्ताह और 12 सप्ताह में काफी बढ़ गया, जो हबर्ड-टर्नर टीम द्वारा टखने के जोड़23,24 के पार्श्व लिगामेंट को काटकर प्राप्त परिणामों के समान है। दाहिने पैर के स्लाइडिंग परीक्षण में, हमने देखा कि कटे हुए स्नायुबंधन वाले चूहों के दो समूहों के फिसलने का समय शम समूह में चूहों की तुलना में काफी अधिक था, और स्लाइडिंग समय सर्जरी के 12 सप्ताह बाद अधिकतम तक पहुंच गया, जिससे यह सुझाव मिलता है कि गंभीर स्नायुबंधन वाले चूहों के दो समूह एएससीजे की अस्थिरता से पीड़ित हो सकते हैं। चाल परीक्षण से पता चला है कि, हालांकि चूहों की चरण लंबाई धीरे-धीरे उम्र के साथ बढ़ी, कटे हुए स्नायुबंधन वाले चूहों के दो समूहों की 12 सप्ताह की चरण लंबाई शम समूह की तुलना में कम थी, और सीएल + एटीएफएल समूह की चरण लंबाई शम समूह की तुलना में 7.2% कम थी। एक साथ लिया गया, उपरोक्त परिणाम बताते हैं कि लिगामेंट विच्छेदन के साथ चूहों के दो समूहों के मोटर स्तर और संतुलन क्षमता काफी बिगड़ा हुआ था।

सीटी छवियों के त्रि-आयामी पुनर्निर्माण में, यह देखा गया कि कटे हुए स्नायुबंधन वाले चूहों के दो समूहों में एएससीजे आर्टिकुलर सतह शम समूह में चूहों की तुलना में खुरदरी थी, जोड़ों के चारों ओर ओस्टियोफाइट्स का गठन किया गया था, और संयुक्त की हड्डी की मात्रा अंश में वृद्धि हुई थी। इन परिणामों से पता चलता है कि लिगामेंट विच्छेदन समूह में एएससीजे आर्टिकुलर उपास्थि में अपक्षयी घाव थे। आर्टिकुलर कार्टिलेज वर्गों के धुंधला होने से उपास्थि का अध: पतन दिखाई दिया, जैसे उपास्थि की सतह की विच्छेदन और चोंड्रोसाइट्स की कमी, जिसने आगे सत्यापित किया कि दीर्घकालिक एएससीजे अस्थिरता पीटीओए में विकसित हो सकती है, जो चांग एट अल 18 द्वारा वर्णित परिणामों के समान है।

मॉडल स्थापना की प्रक्रिया में, सफल मॉडलिंग की कुंजी काटने के लिए संबंधित स्नायुबंधन को सटीक रूप से ढूंढना है। इसी समय, चूहों की गतिविधि में मामूली वृद्धि पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के उनके विकास में तेजी ला सकती है। बाद धुंधला प्रक्रिया में, माउस टखने संयुक्त ऊतक के decalcification एक निर्णायक भूमिका निभाता है. इसलिए, अक्सर ऊतक की कठोरता का निरीक्षण करना और एक उपयुक्त सेक्शनिंग समय का चयन करना आवश्यक है।

अध्ययन में, सर्जरी से पहले और बाद में चूहों की चाल में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक गैट पेपर का उपयोग किया गया था, और केवल चूहों की चरण लंबाई में परिवर्तन प्राप्त किए गए थे। यदि एक पशु चाल विश्लेषण उपकरण का उपयोग किया गया था, तो चाल के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए चूहों के प्रत्येक चरण के आकार और क्षेत्र, स्थिति, आंदोलन की गतिशीलता और दबाव के अनुसार अधिक मापदंडों का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, Semmes Weinstein monofilament का पता लगाने अंतरराष्ट्रीय स्तर पर स्पर्श दबाव संवेदी गड़बड़ी25 का पता लगाने के लिए एक बहुत प्रभावी विधि के रूप में मान्यता प्राप्त है, और बेहतर प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त किया जा सकता है अगर इस विधि चूहों के पैरों के संवेदी समारोह का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, सीमित प्रयोगात्मक स्थितियों और पशु चाल विश्लेषण उपकरणों की अनुपलब्धता के कारण, सेम्स वेनस्टीन मोनोफिलामेंट डिटेक्शन का उपयोग नहीं किया गया था; इसलिए, भविष्य में इन प्रयोगात्मक तकनीकों का उपयोग करके गहन अध्ययन के अवसर हैं।

पीटीओए एक पुरानी अपक्षयी बीमारी26 के रूप में, संयुक्त अस्थिरता और उपास्थि क्षति अलग अलग समय अंक पर मनाया जाना चाहिए, और यह भविष्य में अधिक दीर्घकालिक और बहु समय बिंदु अध्ययन के योग्य है. इसके अलावा, माउस ASCJ की छोटी संरचना के कारण, भड़काऊ कारकों में परिवर्तन का मूल्यांकन करने और सेलुलर स्तर पर पीटीओए के अस्तित्व को सत्यापित करने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में चोंड्रोसाइट्स को निकाला नहीं जा सका। भविष्य के अध्ययनों में, एएससीजे अध: पतन के अंतर्निहित आणविक जैविक तंत्र का अध्ययन करने पर अधिक समय और ऊर्जा खर्च की जाएगी। दूसरा, हालांकि माउस हिंडफीट और टखनों की संरचना मनुष्यों के समान है, कड़ाई से बोलते हुए, चूहों को चौगुनी कर दिया जाता है, जबकि मनुष्य द्विपाद होते हैं, और आंदोलन के दौरान जोड़ों द्वारा अनुभव किए जाने वाले बल बिल्कुल समान नहीं होते हैं।

हालांकि, ASCJ अस्थिरता माउस मॉडल की सफल स्थापना सरल टखने अस्थिरता पशु मॉडल को ASCJ अस्थिरता पशु मॉडल तक बढ़ाती है, जो पैर अस्थिरता के तंत्र की अधिक व्यापक समझ प्रदान करती है और नैदानिक पैर रोगों के अध्ययन के लिए एक नई समझ प्रदान करती है, साथ ही रोग के निदान और उपचार के लिए एक पशु मॉडल।

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Disclosures

किसी भी लेखक के कोई परस्पर विरोधी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जिआंगसु प्रांतीय सरकारी छात्रवृत्ति कार्यक्रम और जिआंगसु उच्च शिक्षा संस्थानों (पीएपीडी) के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-0 Surgical Nylon Suture Ningbo Medical Needle Co., Ltd. 191104
Acidic ethanol differentiation solution (1%) Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. R20778
Adhesive slides Jiangsu Shitai Company
Ammonia solution (1%) Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. R20788
Anhydrous ethanol Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Aqueous acetic acid (1%) Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. R20773
Black cube cassette Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Centrifuge tube 15ml Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. YA0476
Centrifuge tube 50ml Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. YA0472
Cover glass Jiangsu Shitai Company
CTAn software Blue scientific micro-CT analysis software
Dataview software AEMC instruments commercial data analysing software
Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. E8490
Electric incubator Suzhou Huamei Equipment Factory
Embedding paraffin Leica, Germany 39001006
Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. R30117
Fast green staining solution Sigma-Aldrich, USA F7275
Gait paper Baoding Huarong Paper Factory
GraphPad Prism 8.0 Graphpad software online statistical analysis tools
Iodophor cotton balls Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.
Leica 818 blade Leica, Germany
Micro-CT Skyscan, Belgium SkyScan 1176
Micromanipulation microscope Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.
Mimics software Materialise  3D medical image processing software 
Modified Harris Hematoxylin Stain Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. R20566
Mouse anti-mouse type II collagen American Abcam Company
NaOH Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
N-butanol Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Neutral formalin fixative (10%) Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.
Neutral resin Sigma-Aldrich, USA
Nrecon reconstrcution software  Micro Photonics Inc.
Oaks hair clipper Oaks Group Co., Ltd.
Paraffin Embedding Machine Leica, Germany
PH meter Shanghai Leitz Company
Phosphate Buffered Saline (PBS) American Biosharp
Physiological saline (for mammals, sterile) Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. R22172
Safranin O-staining solution Sigma-Aldrich, USA HT90432
Saline (0.9%) Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. 309107
Shaker Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. 2008779
SPSS 23 IBM online statistical analysis tools
Tablet machine Leica, Germany
Tissue slicer Leica, Germany
Ugo Basile Ugo Basile Biological Research Company
Upright fluorescence microscope Zeiss Axiovert, Germany
U-shaped plastic channel Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.
Veterinary eye ointment Pfizer
Xylene Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.
YLS-10B Wheel Fatigue Tester Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.

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Wang, S., Liu, P., Hua, C., Zhang, H., Yu, J. A Mouse Model of Ankle-Subtalar Complex Joint Instability. J. Vis. Exp. (188), e64481, doi:10.3791/64481 (2022).

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