Summary
Голеностопно-подтаранный сустав (ASCJ) является ядром стопы и играет ключевую роль в контроле равновесия в повседневной деятельности. Спортивные травмы часто приводят к нестабильности в этом суставе. В данной работе мы описываем мышиную модель нестабильности ASCJ, вызванной транссекцией связок.
Abstract
Растяжение связок голеностопного сустава является, пожалуй, наиболее распространенной спортивной травмой в повседневной жизни, часто приводящей к нестабильности голеностопно-подтаранного сустава (ASCJ) и в конечном итоге может привести к посттравматическому остеоартриту (PTOA) в долгосрочной перспективе. Однако из-за сложности механизма травмы и клинических проявлений, таких как экхимоз, гематома или болезненность в боковой части стопы, не существует клинического консенсуса по диагностике и лечению нестабильности ASCJ. Поскольку костно-мышечная структура костей и связок задней стопы мыши сопоставима с таковой у человека, животная модель нестабильности ASCJ у мышей была установлена путем рассечения связок вокруг ASCJ. Модель была хорошо валидирована с помощью серии поведенческих тестов и гистологических анализов, включая тест с балансиром, анализ отпечатка ноги (оценка уровня физической нагрузки и способности к равновесию у мышей), оценку тепловой ноцицепции (оценка сенсорной функции стопы у мышей), микрокомпьютерную томографию (КТ) и окрашивание срезов суставного хряща (оценка повреждения и дегенерации суставного хряща у мышей). Успешное создание мышиной модели нестабильности ASCJ предоставит ценный справочник для клинических исследований механизма травмы и приведет к лучшим вариантам лечения растяжения связок голеностопного сустава.
Introduction
Растяжение связок голеностопного сустава является одной из самых распространенных спортивных травм во всем мире. По оценкам, 10 000 человек ежедневно получают травмы в Соединенных Штатах1, из которых 15-45% приходится на травмы, связанные со спортом. Медицинские расходы, связанные с лечением растяжений связок голеностопного сустава в Соединенных Штатах, составляют 4,2 миллиарда долларов в год. Хроническая нестабильность стопы является распространенной проблемой после растяжения связок голеностопного сустава и возникает примерно в 74% случаев растяжения связок голеностопногосустава6, включая нестабильность голеностопного сустава или подтаранного сустава. Однако из-за схожих клинических симптомов и признаков медицинскому персоналу в клинике сложно определить, сопровождается ли хроническая нестабильность голеностопного сустава хронической нестабильностью подтаранного сустава, и, как следствие, хроническую подтаранную нестабильность можно легко пропустить. Таким образом, истинная частота хронической нестабильности голеностопно-подтаранного сустава (ASCJ) (специфический тип хронической нестабильности стопы, который включает в себя как хроническую нестабильность голеностопного сустава, так и хроническую подтаранную нестабильность) может быть выше, чем сообщалось 7,8,9. При отсутствии лечения хроническая нестабильность голеностопно-подтаранного сустава может привести к повторным растяжениям связок голеностопного сустава, что приводит к порочный круг растяжений связок голеностопного сустава и хронической нестабильности голеностопно-подтаранного комплекса. Длительная хроническая нестабильность голеностопно-подтаранного комплекса может привести к дегенерации АСКЖ и посттравматическому остеоартрозу, который в тяжелых случаях может поражать соседние суставы10. Для этих заболеваний в настоящее время клиническое лечение в основном консервативно, в дополнение к хирургическим методам лечения, таким как восстановление связок и реконструкция связок11,12.
ASCJ является основной структурой стопы и поддерживает равновесие тела во время движения13. Проведено обширное исследование строения голеностопного сустава и подтаранного сустава по отдельности14,15,16,17. Тем не менее, исследования всего голеностопно-подтаранного сустава проводятся редко. Около четверти случаев травмы голеностопного сустава связаны с повреждением подтаранного сустава18. Из-за сложного механизма повреждения нестабильности ASCJ не существует единого мнения по поводу диагностики и лечения этого заболевания в клинических условиях. Учитывая современную ситуацию с травмами голеностопного сустава в клинике, необходим более научный метод изучения голеностопного и подтаранного суставов в целом, тем самым обеспечивая новое понимание для изучения заболеваний стопы.
Поскольку анатомическое строение задней стопы мыши на уровне опорно-двигательного аппарата сопоставимо с таковым у стопы человека 19, в нескольких исследованиях уже были реализованы мышиные модели для исследования стопы/голеностопного сустава10,19. Chang et al.19 успешно разработали три различные мышиные модели остеоартрита голеностопного сустава. Вдохновленные успешным установлением нестабильности голеностопного сустава в мышиной модели, мы создали мышиную модель нестабильности голеностопно-подтаранного комплекса, предположив, что рассечение частичных связок в задней части стопы мыши приведет к механической нестабильности ASCJ, что приведет к посттравматическому остеоартриту (PTOA) ASCJ. Животная модель нестабильности ASCJ может быть использована для лечения как нестабильности голеностопного, так и подтаранной нестабильности, что больше соответствует фактической клинической ситуации, чем используемая в настоящее время простая модель нестабильности голеностопного сустава 7,8,9,19. Для проверки этой гипотезы были разработаны две мышиные модели нестабильности ASCJ, индуцированной транссекцией связок. Результаты сенсомоторной функции — тест на равновесие, анализ отпечатков ног и оценка термической ноцицепции — были использованы для оценки осуществимости модели, а микрокомпьютерная томография (КТ) и гистологическое окрашивание были использованы для оценки повреждения и дегенерации суставного хряща мыши. Успешное создание мышиной модели нестабильности ASCJ не только обеспечивает новое понимание для изучения заболеваний стопы, но и предоставляет ценный справочник для клинических исследований механизмов, связанных с травмой, предоставляет лучшие варианты лечения растяжений связок голеностопного сустава и полезен для дальнейших исследований этого заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Сучжоу.
1. Хирургические процедуры
- Разделите 21 6-недельного самца мышей C57BL/6 на три группы: группа поперечной шейной связки и передняя талофибулярная связка, группа поперечной шейной связки и группа дельтовидной связок, а также группа фиктивной хирургии. Убедитесь, что все мыши были выращены в среде, соответствующей определенным стандартам, свободным от патогенов (SPF).
- Акклиматизируйте мышей к новой среде выращивания (цикл свет/темнота 12 ч/12 ч, постоянная температура и влажность 18-22 °C и 40%-70% соответственно) в течение 2 недель до эксперимента. За 1 неделю до эксперимента подвергните мышей тренировке баланса и походки, переходя от одного конца бревна или U-образной трубы к другому концу без остановки.
- В возрасте 8 недель обезболивайте мышь с помощью ингаляций изофлурана, смочив ватный тампон 2 мл изофлурана и поместив его в герметичный контейнер для полного испарения. Следите за активностью мыши и продолжайте ингаляцию до тех пор, пока активность мыши значительно не снизится. Определяйте глубину анестезии, зажимая пальцы мышей, чтобы наблюдать за их реакцией. Вдыхайте испаренный изофлуран (2%) через лицевую маску для поддержания анестезии у мышей во время последующих операций. Используйте ветеринарную глазную мазь во время анестезии, чтобы предотвратить пересыхание глаз.
- После обезболивания удалите бритвой волосы на голеностопном суставе правых задних конечностей мыши и трижды продезинфицируйте открытые участки кожи чередующимися рядами йодных ватных шариков и спиртовых ватных шариков. Вводят 5 мг/кг карпрофена подкожно. Перенесите мышь в операционную микрохирургического животного с помощью стерильной хирургической прокладки.
- Для группы поперечной шейной связки и передней талофибулярной связки (КЛ + АТФЛ) скальпелем на коже над правым голеностопным суставом делают косой продольный разрез длиной 7 мм вниз и прощупывают микроскопическими прямыми щипцами перед голеностопным суставом.
- Обеспечьте обнажение АТФЛ на нижней границе тела таранной кости и малоберцовой кости после зондирования и аккуратно разрежьте ее скальпелем. Разделите длинное и короткое малоберцовые сухожилия и сухожилия разгибателя пальцевого пальца, обнажите КЛ и разрежьте его скальпелем.
- Для группы поперечная КЛ + дельтовидная связка (ДЛ) сделайте вертикальный разрез 8 мм на медиальной коже правого голеностопного сустава и тупо отделите ДЛ от медиальной лодыжки, чтобы окончательно разрезать ее. Затем обрежьте CL, как описано в шаге 1.5.
- В группе симуляции (группа симуляции хирургии) проведите фиктивную операцию на правом голеностопном суставе, но не разрезайте связки.
- Промойте разрез стерильным физиологическим раствором и зашите хирургической нейлоновой нитью 5-0. Наконец, продезинфицируйте зашитый разрез ватным тампоном с йодом.
- Держите мышь под наблюдением до тех пор, пока она не сможет сохранять положение на грудине, и наблюдайте за ней до тех пор, пока она не придет в сознание. Дезинфицируйте разрез голеностопного сустава два раза в день ватным тампоном с йодом и вводите карпрофен (5 мг/кг, подкожная инъекция) один раз в день в течение 1 недели. После операции отдохните в одиночестве и обратите пристальное внимание на послеоперационное состояние мыши.
- Через две недели после операции, когда отек голеностопного сустава уменьшится, начните тренировать мышей в роторном тренажере для мышей в течение 1 часа каждый день.
2. Испытание балансиром
- Зажмите круглый деревянный брус длиной 1 м и диаметром 20 мм, наклоненный под углом 15° с одного конца, зажимом для штатива для фотографии, а другой конец положите на рабочую поверхность, соединенную с закрытой кассетой.
- За 1 неделю до операции проводите тренировку баланса, чтобы мыши плавно переходили от одного конца балки к другому. Считайте, что мышь прошла испытание, если она проходит через луч дважды за 60 с без паузы.
- Выполните два последовательных испытания для каждой мыши и опрыскайте балансир 75% спиртом после каждой попытки, чтобы предотвратить воздействие остаточного запаха предыдущей мыши на следующую.
- Проводите тест баланса перед операцией, через 3 дня, 1 неделю, 4 недели, 8 недель и 12 недель после операции. Запишите среднее время, за которое каждая мышь проходит бревно два раза подряд, и количество раз, когда правая задняя лапа соскальзывает с балки в качестве зависимых переменных.
3. Анализ футпринта
- Поместите на экспериментальный стол-образный пластиковый канал длиной 50 см, шириной 10 см и высотой 10 см и соедините один конец пластикового канала с закрытой кассетой.
- Положите обычную пигментную бумагу в канал, а затем держите мышь обеими руками и равномерно покрасьте ее переднюю и заднюю лапки нетоксичным красным и зеленым пигментом.
- Аккуратно поместите нарисованную мышь на один конец канала и дайте ей переместиться на другой конец кассеты. Возьмите пигментированную бумагу со следами, отметьте ее и положите сушиться на вешалку в проветриваемом и затененном месте.
- После того, как каждая мышь пройдет мимо, опрыскайте U-образный пластиковый канал 75% спиртом, чтобы остаточный запах предыдущей мыши не повлиял на следующую.
- Выберите три последовательных четких следа мыши на каждом листе бумаги и с помощью линейки измерьте длину шага посадочного места правой ноги мыши, а также ширину шага между левым и правым контурами.
4. Оценка тепловой ноцицепции
- Во время эксперимента используйте подошвенную пробу для регистрации времени реакции тепловой ноцицепции лапки мыши и времени реакции мыши во время активности и покоя соответственно. Записывайте данные измерений за считанные секунды.
- Поместите мышь в измерительный прибор, выровняйте прибор по правой ноге и начните нагревать прибор с медленным повышением температуры. Понаблюдайте за реакцией мыши. Когда температура превысит допустимую, мышь быстро отстранится или облизывает правую ногу. Запишите время с помощью прибора и определите время как время реакции во время занятия.
- Чтобы измерить время реакции в состоянии покоя, дайте мыши посидеть в течение 30 минут на столе для отдыха без нагрева, а затем получите данные о времени, как описано в шаге 4.2. Используйте полученные временные данные для последующего анализа.
5. Микро-КТ сканирование
- Усыпляйте 12-недельных мышей углекислым газом после операции, снимайте кожу с их правых лодыжек, а затем разрезайте их среднюю большеберцовую и малоберцовую кости хирургическими ножницами, чтобы получить полные образцы лодыжек. Поместите образцы в маркированные центрифужные пробирки объемом 15 мл, содержащие 10% нейтрального формалина, на 48 ч.
- После фиксации образцы помещают партиями (по четыре образца в партию) в специальный губчатый резервуар для микро-КТ-сканирования. Установите параметры машины следующим образом: напряжение = 50 кВ, ток = 200 мА, фильтр = 0,5 ммАл и разрешение = 9 мкм. Запустите микрокомпьютерный томограф.
- После сканирования используйте программное обеспечение для реконструкции, чтобы очертить диапазон изображения, и выберите конкретное положение угла после настройки оси XYZ очерченного изображения с помощью коммерческого программного обеспечения для анализа данных, как описано в Liu et al.10.
- Используйте программное обеспечение для анализа микро-КТ для выбора непрерывных 10-слойных областей, представляющих интерес на реструктурированных изображениях, скорректированных по осям XYZ, и количественного анализа необходимых суставов для определения объемной доли кости (BV/TV), как описано в Liu et al.10.
- Наконец, используйте программное обеспечение для обработки трехмерных медицинских изображений для выполнения трехмерной компьютерной томографии голеностопных суставов мыши, как описано в Liu et al.10. После реконструкции наблюдают износ и образование остеофитов в ASCJ.
6. Разрезное окрашивание суставного хряща
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы окрашивания выполняются в вытяжном шкафу, а во время процедуры надевается маска.
- Используйте микроскопический пинцет и ножницы, чтобы удалить лишние мягкие ткани вокруг образцов лодыжки, а затем поместите образцы в центрифужную пробирку, содержащую 10% раствор для декальцинации ЭДТА, приготовленный из 44 г NaOH, двух упаковок PBS и 400 г ЭДТА-2Na, с pH, доведенным до 7,35-7,45 соляной кислотой, и отметьте различные группы.
- Затем поместите центрифужную пробирку на встряхивающий стол (скорость установлена на 20 об/мин) для удаления накипи и меняйте раствор для удаления накипи один раз в день. Определите декальцинацию образцов.
- После 1 месяца декальцинации образцы обезвоживают градиентным спиртом, а затем используют н-бутанол в течение 8 ч для очистки. Наконец, очищенные образцы погружают в парафин в корончатом положении для заделки.
- Поместите образцы парафина в холодильник с температурой 4 °C для последующего использования. Перед секционированием достаньте образцы из холодильника с температурой 4 °C и поместите их в морозильную камеру с температурой −20 °C примерно на 10 минут, чтобы облегчить резку всей плоскости.
- Зафиксируйте образцы на микротоме и разрежьте их на толщину 6 мкм. При этом с помощью микроскопа наблюдают, были ли образцы срезаны на ожидаемом уровне – легкого проникновения иглы шприца в костную ткань.
- Заранее отрегулируйте температуру воды в таблеточной машине до 40 °C. Далее отрежьте в ряд две-три полные секции парафина и перенесите их в таблеточную машину для полного раскрытия. Затем удалите парафиновые срезы предметным стеклом и слейте воду. Наконец, отметьте слайды группами и номерами.
7. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
- Поместите срезы в инкубатор при температуре 60 °C таким образом, чтобы под микроскопом можно было разглядеть неповрежденную структуру сустава ASCJ, и выпекайте срезы в течение 40-50 минут. Затем депарафинизируйте срезы ксилолом 3x, пронумерованными как I, II и III для легкой идентификации, в течение 15 минут, 15 минут и 10 минут соответственно.
- Поместите депарафинизированные срезы в 100% этанол 2 раза, пронумерованных как I и II для легкой идентификации, 90% этанола и 80% этанола на 3 мин, 3 мин, 5 мин и 5 мин соответственно. Затем промойте срезы дважды дистиллированной водой (ddH2O) в течение 5 мин.
- После замачивания гематоксилином в течение 1 мин промывают срезыддН2Одо тех пор, пока они не станут бесцветными. Срезы замочить в 1%-ном растворе кислого этанола на 30 с и промыть их 3 раза в течение 1 мин с ddH2O. После этого окрашивают срезы 1% раствором нашатырного спирта в течение 1 мин, а затем промывают 3 раза по 1 мин с ддН2О.
- Затем окрасьте образцы раствором для окрашивания эозином в течение 1 мин, а затем поместите их последовательно в 95% этанол и 100% этанол на 1 мин каждый. Наконец, обработайте срезы ксилолом внутривенно в течение 1 мин.
- Высушите срезы на воздухе, нанесите каплю нейтральной смолы на образцы на предметных стеклах и накройте их покровным листком. Затем сделайте снимки с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа в светлом поле с 5x и 20x.
8. Сафранин О-фаст зеленое окрашивание
- Поместите выбранные секции в инкубатор с температурой 60 °C и запекайте их в течение 40-50 минут. Затем депарафинизируют срезы ксилолом I, II и III в течение 15 мин, 15 мин и 10 мин соответственно.
- Поместите депарафинизированные срезы в 100% этанол I, II, 90% этанол и 80% этанол на 3 мин, 3 мин, 5 мин и 5 мин соответственно. Далее промойте срезы ddH2O в течение 5 мин.
- После замачивания гематоксилином в течение 1 мин промывают срезыддН2Одо тех пор, пока они не станут бесцветными. Срезы замочить в 1%-ном растворе кислого этанола на 30 с и промыть их 3 раза в течение 1 мин с ddH2O. Затем окрасьте срезы 1% раствором нашатырного спирта в течение 1 мин и промойте их 3 раза по 1 минуте с ддН2О.
- Срезы замачивают в 0,05% быстром зеленом растворе в течение 2 мин с последующим замачиванием срезов в 1% растворе уксусной кислоты в течение 30 с и в 0,1% сафранине в течение 5 мин. Поместите окрашенные образцы в 95% этанол и 100% этанол на 1 мин, один за другим.
- Наконец, обработайте срезы ксилолом внутривенно в течение 1 мин. Высушите срезы на воздухе, нанесите каплю нейтральной смолы на образцы на предметных стеклах и накройте их покровным листком. Затем сделайте снимки с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа в светлом поле с 5x и 20x.
9. Иммуногистохимия
- День 1: Поместите выбранные секции в инкубатор при температуре 60 °C, запекайте их в течение 40-50 минут, а затем депарафинизируйте их ксилолом I, II и III в течение 15 минут, 15 минут и 10 минут соответственно. Поместите депарафинизированные срезы в 100% этанол I, II, 90% этанол и 80% этанол на 3 мин, 3 мин, 5 мин и 5 мин соответственно. Затем промойте срезы ddH2O в течение 5 минут, с помощью гистохимической ручки обведите область образца и поместите их в темную коробку.
- Забор антигена: Капните 20-50 мкл 0,25% трипсина в область образца, обведенную кружком, инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 60 минут, а затем промойте образцы 3 раза по 2 минуты каждый PBS. Блокируют эндогенную пероксидазу, добавляя 3%H2O2, инкубируют образцы в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте, а затем промывают их 3 раза по 2 мин каждый PBS. Выполните блокирование сыворотки, добавив 10% козью сыворотку при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем инкубируйте с первичным антителом (мышиный антимышиный коллаген II типа, разбавленный в 1000 раз) при 4 °C в течение ночи.
- День 2: Разогрейте секции при комнатной температуре в течение 30 минут. Восстановите первичные антитела и промойте срезы 3 раза по 2 мин каждый с PBS. Инкубируют со вторичным антителом в течение 40 мин в инкубаторе при 37 °C, а затем промывают срезы 3 раза по 2 мин каждый PBS.
- Проявление цвета DAB: Добавьте 5 мл ddH 2 O, двекапли буфера, четыре капли DAB и две капли H 2 O2 для приготовления реагента DAB. Добавьте 20-50 мкл реагента к срезам, держите образцы защищенными от света в течение 5 минут, а затем промойте срезы в течение 2 минут ddH2O.
- После замачивания гематоксилином в течение 1 мин промывают срезыддН2Одо тех пор, пока они не станут бесцветными. Замочите срезы в 1%-ном растворе кислого этанола в течение 30 с и промойте их 3 раза по 1 мин с ddH 2 O. Окрасьте срезы на 1 мин 1% раствором аммиака, а затем промойте их 3 раза по 1 мин ddH2O.
- Затем поместите секции в 95% этанол и 100% этанол соответственно на 1 минуту каждая. Наконец, инкубируйте срезы в течение 1 минуты с ксилолом внутривенно. Высушите срезы на воздухе, нанесите каплю нейтральной смолы на образцы на предметных стеклах и накройте их покровным листком. Затем сделайте снимки с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа в светлом поле с 5x и 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Статистический анализ корреляционных данных проводился с использованием онлайн-инструментов статистического анализа. Данные, удовлетворяющие двум критериям нормального распределения и однородности дисперсии, были использованы для дальнейшего статистического анализа методом одностороннего дисперсионного анализа. Если данные не соответствовали двум критериям, для статистического анализа использовали критерий Краскела-Уоллиса. Данные выражены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD), а p < 0,05 считалось статистически значимым.
Испытание балансиром
Статистический анализ среднего времени, необходимого каждой мыши для прохождения через балансир дважды на каждом этапе, показал, что статистических различий во времени, необходимом каждой группе мышей для прохождения бревна перед операцией (p = 0,73). Через три дня после операции мышам в группах CL + ATFL и CL + DL потребовалось больше времени для прохождения через балку равновесия по сравнению с мышами в фиктивной группе, и разница была статистически значимой (p < 0,05). Через четыре недели после операции не наблюдалось существенных различий во времени, затрачиваемом мышами в группах CL + ATFL и CL + DL на прохождение бревна по сравнению с мышами в группе симуляции (p > 0,05). Кроме того, через 8 недель и 12 недель после операции мышам в группах CL + ATFL и CL + DL потребовалось больше времени для прохождения бревна по сравнению с мышами в фиктивной группе, и разница была статистически значимой (p < 0,01). Статистически значимых различий во времени, затрачиваемом мышами в группе CL + ATFL на прохождение бревна по сравнению с мышами в группе CL + DL в течение каждого периода испытаний не наблюдалось (p > 0,05; Рисунок 1А).
Количество раз, когда правая задняя лапа мыши проскальзывала через бревно, статистически не отличалось между тремя группами мышей до операции (p = 0,68). Кроме того, не было выявлено существенных различий в количестве отделов правой задней части стопы у мышей в группах CL + ATFL и CL + DL по сравнению с мышами в фиктивной группе через 3 дня после операции. Что касается других периодов послеоперационного периода, то количество срезов в группе рассечения связок было выше по сравнению с мышами в фиктивной группе, и разница была статистически значимой (p < 0,05). Через 8 недель и 12 недель после операции количество соскальзываний правой задней стопы в группе CL + ATFL с бревна было выше, чем у мышей в группе CL + DL, и разница была статистически значимой (p < 0,05; Рисунок 1Б).
Анализ футпринта
Длина шага мышей в каждой группе увеличивалась с возрастом, но разрыв связок мог сократить длину шага. Достоверных различий в длине шага правой задней части стопы между тремя группами мышей до операции не наблюдалось (p > 0,05). В тесте на походку через 12 недель после операции длина шага правой задней части стопы в группе с разрезом связок была короче по сравнению с группой симуляции в тот же период, и разница была статистически значимой (p < 0,01). Однако длина шага правой задней лапы у мышей в группе CL + ATFL достоверно не отличалась от таковой у мышей в группе CL + DL (p > 0,05; Рисунок 2А,Б).
Оценка тепловой ноцицепции
Статистический анализ времени реакции на тепловую ноцицепцию ног мышей во время активности показал, что статистических различий во времени реакции трех групп мышей до операции не выявлено (р > 0,5). При оценке термической ноцицепции после операции время реакции на тепловую ноцицепцию у мышей в группе разреза связок было больше, чем у мышей в группе симуляции в тот же период, и разница была статистически значимой (p < 0,01; Рисунок 3).
Микрокомпьютерная томография
Через двенадцать недель после операции микро-КТ использовали для количественного анализа ASCJ правой задней части стопы у мышей в каждой группе. Трехмерная реконструкция КТ-изображений показала, что ASCJ правой задней части стопы в двух группах с разрывом связок была более грубой, чем в фиктивной группе. Суставная поверхность была вогнутой, выпуклой и плоской, имелись явные следы износа, вокруг суставов образовывались остеофиты, в суставах наблюдались дегенеративные изменения. Кроме того, примерно у 28,6% мышей в группе CL + DL развился таранный вывих (рис. 4A,B)10. Объемная доля костной ткани ASCJ правой задней стопы в группах CL + ATFL и CL + DL была достоверно выше, чем в фиктивной группе, а разница была статистически значимой (р < 0,01; Рисунок 4C,D)10.
Разрезное окрашивание суставного хряща
Окрашивание H&E и Safranin O-fast green показало, что структура ASCJ мышей в фиктивной группе была полной, морфология хряща была интактной, а хондроциты были распределены равномерно. Хрящевой слой ASCJ двух групп мышей с разрывами связок показал явную разрывность, а количество хондроцитов было уменьшено (рис. 5A,B)10. Модифицированная система оценки по шкале Манкина и Международного общества исследования остеоартрита (OARSI) была использована для оценки H&E и Safranin O-fast зеленого окрашивания ASCJ для мышей в каждой группе20,21,22. Модифицированная шкала Манкина определялась структурными характеристиками хряща, количеством и окрашиванием хондроцитов, а оценка OARSI определялась гистопатологической степенью и стадией хряща. Баллы двух групп мышей с ампутацией связок были выше, чем у мышей в фиктивной группе, и разница была статистически значимой (p < 0,05; Рисунок 5C-F)10.
Изображения типичного иммуногистохимического окрашивания коллагена II типа показали, что содержание коллагена II типа в слое суставного хряща ASCJ правой задней стопы в фиктивной группе было более однородным, чем у двух групп мышей с разорванными связками, и не было явной потери коллагена II типа (рис. 6A). Результаты количественного анализа показали, что экспрессия коллагена II типа в ASCJ мышей в фиктивной группе была выше, чем в двух группах мышей с разорванными связками, а разница была статистически значимой (р < 0,05; Рисунок 6Б,В).
Рисунок 1: Поведенческий анализ мышей с помощью теста на балансировку . (A) Время, необходимое мышам для пересечения бревна. (B) Количество скольжений правой ноги при прохождении бревна. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение, n = 7 выборок на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Поведенческий анализ мышей с использованием анализа отпечатков стоп. (А) Сравнение длины правой стопы у мышей в каждой группе до операции. (B) Сравнение длины правой ступни у мышей в каждой группе через 12 недель после операции. Статистически значимые различия обозначены **, где р < 0,01, и ***, где р < 0,001 между указанными группами. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение, n = 7 выборок на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Поведенческий анализ мышей с использованием оценки термической ноцицепции. Время реакции тепловой ноцицепции во время активности у мышей. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение, n = 7 выборок на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Микро-КТ анализ правой стопы мыши. (А) Трехмерная реконструкция таранной кости мыши без вывиха в комплексе голеностопно-подтаранного сустава (боковая проекция, медиальная проекция, передняя проекция). (Б) Трехмерная реконструкция вывихнутой таранной кости мыши в комплексе голеностопно-подтаранный сустав (боковая проекция, медиальная проекция, передняя проекция). (C) Количественный анализ объемной доли костной ткани (BV/TV) голеностопных суставов мышей. (D) Количественный анализ объемной доли костной ткани (BV/TV) подтаранных суставов мышей. Черные стрелки указывают на образование остеофита или вывих таранной кости. Статистически значимые различия обозначены знаком ***, где р < 0,001 между указанными группами. Эта цифра была изменена по сравнению с Liu et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Окрашивание H&E и Safranin O-fast в зеленый цвет и анализ голеностопных суставов. (A) Окрашивание голеностопно-подтаранных суставов мышей H&E. (Б) О-быстрое окрашивание лодыжно-подтаранных суставов мышей сафранином. (C) Модифицированные баллы Манкина для голеностопных суставов мышей. (D) Изменены баллы по шкале Манкина для подтаранных суставов мыши. (E) Оценки Международного общества исследования остеоартрита (OARSI) для голеностопных суставов мышей. (F) Баллы OARSI для подтаранных суставов мыши. Условные обозначения: a = голеностопный сустав; s = подтаранный сустав. Статистически значимые различия обозначены знаком ***, где р < 0,001 между указанными группами. Масштабная линейка = 100 мкм, n = 7 образцов в группе. Эта цифра была изменена по сравнению с Liu et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Иммуногистохимическое окрашивание и анализ голеностопных суставов. (A) Иммуногистохимическое окрашивание коллагеном II типа голеностопного и подтаранного суставов мыши. (B) Процентное соотношение площади коллагена II (+) для голеностопных суставов мышей. (C) Процентное соотношение площади коллагена II (+) для подтаранных суставов мыши. Условные обозначения: a = голеностопный сустав; s = подтаранный сустав. Статистически значимые различия обозначены знаком ***, где р < 0,001 между указанными группами. Масштабная линейка = 100 мкм, n = 7 образцов в группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании две мышиные модели нестабильности ASCJ были успешно построены путем разрезания CL + ATFL или CL + DL. Время, необходимое мышам для прохождения через балку, значительно увеличивалось через 8 недель и 12 недель после операции, что аналогично результатам, полученным командой Хаббарда-Тернера при разрезании латеральной связки голеностопного сустава23,24. В тесте на скольжение правой стопы мы заметили, что время скольжения у двух групп мышей с разорванными связками было значительно выше, чем у мышей в фиктивной группе, и время скольжения достигло максимума через 12 недель после операции, тем самым предполагая, что две группы мышей с разорванными связками, возможно, страдали от нестабильности ASCJ. Тест на походку показал, что, хотя длина шага мышей постепенно увеличивалась с возрастом, 12-недельная длина шага у двух групп мышей с разорванными связками была ниже, чем у фиктивной группы, а длина шага в группе CL + ATFL была на 7,2% меньше, чем в фиктивной группе. Взятые вместе, приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что двигательный уровень и способность к равновесию у двух групп мышей с ампутацией связок были значительно нарушены.
При трехмерной реконструкции КТ-изображений было замечено, что суставная поверхность ASCJ у двух групп мышей с разорванными связками была более шероховатой, чем у мышей в фиктивной группе, вокруг суставов формировались остеофиты, а объемная доля кости сустава была увеличена. Эти результаты свидетельствуют о том, что суставной хрящ ASCJ в группе ампутации связок имел дегенеративные поражения. Окрашивание участков суставного хряща показало дегенерацию хряща, такую как нарушение сплошности поверхности хряща и уменьшение количества хондроцитов, что еще раз подтвердило, что долгосрочная нестабильность ASCJ может развиться в PTOA, что аналогично результатам, описанным Chang et al.18.
В процессе создания модели залогом успешного моделирования является точный поиск соответствующих связок для разреза. В то же время умеренное повышение активности мышей может ускорить развитие у них остеоартроза. В последующем процессе окрашивания решающую роль играет декальцинация тканей голеностопного сустава мыши. Поэтому необходимо часто следить за твердостью ткани и подбирать подходящее время секционирования.
В исследовании для анализа изменений походки мышей до и после операции использовалась бумага о походке, и были получены только изменения в длине шага мышей. Если бы использовался инструмент для анализа походки животных, можно было бы проанализировать больше параметров в соответствии с размером и площадью, положением, динамикой движения и давлением каждого шага мышей для качественного и количественного анализа походки. Кроме того, обнаружение моноволокна Semmes Weinstein признано во всем мире как очень эффективный метод обнаружения сенсорных нарушений при сенсорном давлении25, и лучшие экспериментальные результаты могут быть получены, если этот метод будет использоваться для оценки сенсорной функции ног мышей. Однако из-за ограниченных условий эксперимента и отсутствия приборов для анализа походки животных детекция мононити Semmes Weinstein не использовалась; Поэтому в будущем есть возможности для углубленных исследований с использованием этих экспериментальных методов.
Поскольку ПТА является хроническим дегенеративным заболеванием26, нестабильность суставов и повреждение хряща должны наблюдаться в разные моменты времени, и это заслуживает более долгосрочных и многомоментных исследований в будущем. Кроме того, из-за небольшой структуры ASCJ мыши хондроциты не могли быть извлечены для экспериментов in vitro для оценки изменений факторов воспаления и проверки существования ПТА на клеточном уровне. В будущих исследованиях больше времени и энергии будет потрачено на изучение лежащих в основе молекулярно-биологических механизмов дегенерации ASCJ. Во-вторых, хотя строение задних и лодыжек мышей похоже на человеческое, строго говоря, мыши четвероногие, а люди двуногие, и силы, испытываемые суставами во время движения, не совсем одинаковы.
Тем не менее, успешное создание мышиной модели нестабильности ASCJ расширяет модель простого животного с нестабильностью голеностопного сустава до модели нестабильности ASCJ на животных, что обеспечивает более полное понимание механизма нестабильности стопы и обеспечивает новое понимание для изучения клинических заболеваний стопы, а также животную модель для диагностики и лечения заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у кого из авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано стипендиальной программой правительства провинции Цзянсу и Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
References
- Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
- Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
- Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
- Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
- Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
- Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
- Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
- Mittlmeier, T., Wichelhaus, A.
- Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
- Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
- Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
- Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
- Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
- Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
- Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
- Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
- Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
- Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
- Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
- Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
- Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
- Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
