Summary
Het enkel-subtalair complex gewricht (ASCJ) is de kern van de voet en speelt een sleutelrol bij evenwichtscontrole bij dagelijkse activiteiten. Sportblessures leiden vaak tot instabiliteit in dit gewricht. Hier beschrijven we een muismodel van door ligamenten geïnduceerde instabiliteit van de ASCJ.
Abstract
Enkelverstuikingen zijn misschien wel de meest voorkomende sportblessures in het dagelijks leven, vaak resulterend in instabiliteit van het enkel-subtalair complex gewricht (ASCJ), en kunnen uiteindelijk leiden tot posttraumatische artrose (PTOA) op de lange termijn. Vanwege de complexiteit van het letselmechanisme en de klinische manifestaties, zoals ecchymose, hematoom of gevoeligheid in de laterale voet, is er echter geen klinische consensus over het diagnosticeren en behandelen van ASCJ-instabiliteit. Aangezien de musculoskeletale structuur van de botten en ligamenten van de achtervoet van de muis vergelijkbaar is met die van mensen, werd een diermodel van ASCJ-instabiliteit bij muizen vastgesteld door de doorsnede van ligamenten rond de ASCJ. Het model werd goed gevalideerd door middel van een reeks gedragstests en histologische analyses, waaronder een evenwichtsbalktest, een voetafdrukanalyse (een beoordeling van het inspanningsniveau en het evenwichtsvermogen bij muizen), een thermische nociceptiebeoordeling (een beoordeling van de sensorische functie van de voet bij muizen), microcomputertomografie (CT) scannen en sectiekleuring van het gewrichtskraakbeen (een beoordeling van gewrichtskraakbeenbeschadiging en degeneratie bij muizen). De succesvolle oprichting van een muismodel van ASCJ-instabiliteit zal een waardevolle referentie zijn voor klinisch onderzoek naar het letselmechanisme en resulteren in betere behandelingsopties voor enkelverstuiking.
Introduction
Enkelverstuikingen zijn wereldwijd een van de meest voorkomende sportblessures. Naar schatting raken er dagelijks 10.000 mensen gewond in de VerenigdeStaten1, waarvan sportgerelateerde blessures goed zijn voor 15%-45%2. De medische kosten in verband met de behandeling van enkelverstuikingen in de Verenigde Staten bedragen $ 4.2 miljard per jaar 3,4,5. Chronische voetinstabiliteit is een veelvoorkomend probleem na enkelverstuikingen en komt voor bij ongeveer 74%van de enkelverstuikingen6, inclusief enkel- of subtalaire instabiliteit. Vanwege de vergelijkbare klinische symptomen en tekenen is het echter moeilijk voor medisch personeel om te onderscheiden of chronische enkelinstabiliteit ook gepaard gaat met chronische subtalaire gewrichtsinstabiliteit in de kliniek, en als gevolg daarvan kan chronische subtalaire instabiliteit gemakkelijk worden gemist. Daarom kan de werkelijke incidentie van chronische instabiliteit van het enkel-subtalair complex (ASCJ) (een specifiek type chronische voetinstabiliteit dat zowel chronische enkelinstabiliteit als chronische subtalaire instabiliteit omvat) hoger zijn dan gerapporteerd 7,8,9. Indien onbehandeld, kan chronische instabiliteit van het enkel-subtalair complex herhaalde enkelverstuikingen veroorzaken, wat leidt tot een vicieuze cirkel van enkelverstuikingen en chronische instabiliteit van het enkel-subtalair complex. Langdurige chronische instabiliteit van het enkel-subtalair complex kan leiden tot degeneratie van de ASCJ en posttraumatische artrose, die in ernstige gevallen de aangrenzende gewrichten kan aantasten10. Voor deze ziekten is de huidige klinische behandeling voornamelijk conservatief, naast chirurgische behandelmethoden zoals ligamentherstel en ligamentreconstructie11,12.
ASCJ is de kernstructuur van de voet en handhaaft het evenwicht van het lichaam tijdens beweging13. Er is uitgebreid onderzoek gedaan naar de structuur van het enkelgewricht en het subtalaire gewricht afzonderlijk14,15,16,17. Onderzoek naar het hele enkel-subtalaire gewricht is echter zeldzaam. Ongeveer een kwart van de gevallen van enkelletsel wordt geassocieerd met subtalair gewrichtsletsel18. Vanwege het complexe letselmechanisme van ASCJ-instabiliteit is er geen consensus over het diagnosticeren en behandelen ervan in de klinische setting. Gezien de huidige situatie van enkelblessures in de kliniek, is een meer wetenschappelijke methode nodig om het enkel- en subtalaire gewricht als geheel te bestuderen, waardoor een nieuw begrip wordt verkregen voor het bestuderen van voetaandoeningen.
Aangezien de anatomische structuur van de achtervoet van de muis op musculoskeletaal niveau vergelijkbaar is met die van de menselijke voet 19, zijn in verschillende onderzoeken al muismodellen voor voet/enkelonderzoek geïmplementeerd10,19. Chang et al.19 ontwikkelden met succes drie verschillende muismodellen van enkelartrose. Geïnspireerd door de succesvolle vaststelling van enkelinstabiliteit in het muismodel, hebben we een muismodel opgesteld voor instabiliteit van het enkel-subtalair complex, waarbij we veronderstellen dat de doorsnede van de partiële ligamenten in de achtervoet van de muis zou resulteren in mechanische instabiliteit van de ASCJ, wat zou leiden tot posttraumatische artrose (PTOA) van de ASCJ. Het ASCJ-instabiliteitsdiermodel zou kunnen worden gebruikt voor de behandeling van zowel enkelinstabiliteit als subtalaire instabiliteit, wat meer in overeenstemming is met de werkelijke klinische situatie dan het momenteel gebruikte eenvoudige enkelinstabiliteitsmodel 7,8,9,19. Om deze hypothese te testen, werden twee muismodellen van door ligamenten geïnduceerde instabiliteit van de ASCJ ontworpen. De resultaten voor de sensomotorische functie - de evenwichtsstraaltest, voetafdrukanalyse en thermische nociceptiebeoordeling - werden gebruikt om de haalbaarheid van het model te evalueren, en microcomputertomografie (CT) en histologische kleuring werden gebruikt om de schade en degeneratie van het gewrichtskraakbeen van de muis te evalueren. De succesvolle oprichting van een muismodel van ASCJ-instabiliteit biedt niet alleen een nieuw inzicht in het bestuderen van voetziekten, maar biedt ook een waardevolle referentie voor klinisch onderzoek naar de letselgerelateerde mechanismen, biedt betere behandelingsopties voor enkelverstuikingen en is nuttig voor verdere studies over de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierstudies zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Soochow University.
1. Chirurgische ingrepen
- Verdeel 21, 6 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen in drie groepen: het transversale cervicale ligament en de voorste talofibulaire ligamentgroep, de transversale cervicale ligament en deltaspierligamentgroep, en de schijnoperatiegroep. Zorg ervoor dat alle muizen zijn grootgebracht in een omgeving die voldoet aan specifieke pathogeenvrije (SPF) normen.
- Laat de muizen 2 weken voor het experiment wennen aan de nieuwe kweekomgeving (een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur en een constante temperatuur en vochtigheid van respectievelijk 18-22 °C en 40%-70%). Onderwerp de muizen aan evenwichtsbalk- en looptraining, waarbij ze 1 week voor het experiment van het ene uiteinde van een evenwichtsbalk of U-vormige pijp naar het andere uiteinde gaan zonder te stoppen.
- Verdoof de muis op de leeftijd van 8 weken met behulp van isofluraaninhalatie door een watje nat te maken met 2 ml isofluraan en het in een luchtdichte verpakking te plaatsen voor volledige vervluchtiging. Houd de activiteit van de muis in de gaten en ga door met inademen totdat de activiteit van de muis aanzienlijk is verminderd. Bepaal de diepte van de anesthesie door in de tenen van de muizen te knijpen om hun reacties te observeren. Inhaleer verdampte isofluraan (2%) via een gezichtsmasker om de anesthesie bij muizen tijdens volgende operaties te behouden. Gebruik veterinaire oogzalf tijdens anesthesie om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
- Verwijder na het verdoven het haar op het enkelgewricht van de rechter achterpoten van de muis met een scheerapparaat en desinfecteer de blootgestelde huid drie keer met afwisselende rondes jodiumwattenbolletjes en alcoholwattenbolletjes. Dien 5 mg/kg carprofen toe via subcutane injectie. Breng de muis over naar de operatiekamer voor microchirurgie met behulp van een steriel operatiekussen.
- Maak voor de groep transversale cervicale ligament en anterieure talofibulaire ligament (CL + ATFL) een schuine neerwaartse longitudinale incisie van 7 mm met een scalpel op de huid boven het rechter enkelgewricht en sonde met een microscopisch kleine rechte pincet voor het enkelgewricht.
- Zorg ervoor dat de ATFL na het sonderen aan de onderrand van het taluslichaam en het kuitbeen wordt blootgesteld en snijd het voorzichtig door met een scalpel. Scheid de lange en korte fibulaire pezen en de extensor digitorum longuspezen, leg de CL bloot en snijd deze door met een scalpel.
- Maak voor de transversale CL + deltoïde ligament (DL)-groep een verticale incisie van 8 mm op de mediale huid van het rechterenkelgewricht en scheid de DL botweg van de mediale malleolus om deze uiteindelijk door te snijden. Snijd vervolgens de CL zoals beschreven in stap 1.5.
- Voer voor de schijngroep (schijnoperatiegroep) een schijnoperatie uit aan het rechterenkelgewricht, maar snijd geen ligamenten door.
- Spoel de incisie met steriele normale zoutoplossing en hecht deze met 5-0 chirurgisch nylondraad. Desinfecteer ten slotte de gehechte incisie met een jodiumwatje.
- Houd de muis onder observatie totdat hij sternale lighouding kan behouden en houd toezicht totdat hij volledig bij bewustzijn is. Desinfecteer de enkelincisie tweemaal daags met een jodiumwatje en dien carprofen (5 mg/kg, subcutane injectie) toe, eenmaal per dag gedurende 1 week. Achterkant alleen na de operatie en let goed op de postoperatieve toestand van de muis.
- Twee weken na de operatie en wanneer de zwelling van het enkelgewricht is verminderd, begint u de muizen elke dag 1 uur te trainen in de roterende vermoeidheidsmachine van de muis.
2. Evenwichtsbalk test
- Klem een ronde houten balk met een lengte van 1 m en een diameter van 20 mm, schuin in een hoek van 15° aan het ene uiteinde, met een fotostatiefclip, en plaats het andere uiteinde op een werkoppervlak dat is aangesloten op een gesloten cassette.
- Voer 1 week voor de operatie een evenwichtsbalktraining uit om ervoor te zorgen dat de muizen soepel van het ene uiteinde van de balk naar het andere gaan. Beschouw een muis als geslaagd voor de test wanneer hij twee keer in 60 seconden door de straal gaat zonder te pauzeren.
- Voer twee opeenvolgende proeven uit voor elke muis en spuit de evenwichtsbalk na elke proef met 75% alcohol om te voorkomen dat de restgeur van de vorige muis de volgende muis aantast.
- Voer de evenwichtsbalktest preoperatief uit, 3 dagen, 1 week, 4 weken, 8 weken en 12 weken na de operatie. Noteer de gemiddelde tijd dat elke muis twee keer achter elkaar de evenwichtsbalk passeert en het aantal keren dat de rechterachtervoet van de balk glijdt als afhankelijke variabelen.
3. Analyse van de voetafdruk
- Plaats een U-vormig plastic kanaal met een lengte van 50 cm, een breedte van 10 cm en een hoogte van 10 cm op de proeftafel en sluit het ene uiteinde van het plastic kanaal aan op een gesloten cassette.
- Leg een gewoon pigmentpapier plat in het kanaal en houd de muis vervolgens met beide handen vast en schilder hun voor- en achterpoten gelijkmatig met niet-giftig rood en groen pigment.
- Plaats de geverfde muis voorzichtig aan het ene uiteinde van het kanaal en laat ze naar het andere uiteinde van de cassette gaan. Neem het gepigmenteerde papier met de voetafdrukken eruit, markeer het en leg het op een rek om te drogen op een geventileerde en schaduwrijke plaats.
- Nadat elke muis is gepasseerd, besproeit u het U-vormige plastic kanaal met 75% alcohol om te voorkomen dat de restgeur van de vorige muis de volgende muis aantast.
- Selecteer drie opeenvolgende doorzichtige muisvoetafdrukken op elk papier en gebruik een liniaal om de staplengte van de voetafdruk van de rechtervoet van de muis te meten, evenals de stapbreedte tussen de linker- en rechtervoetafdruk.
4. Beoordeling van thermische nociceptie
- Gebruik tijdens het experiment de plantaire test om de thermische nociceptiereactietijd van de muisvoet en de reactietijd van de muis tijdens respectievelijk activiteit en rust vast te leggen. Registreer de meetgegevens in seconden.
- Plaats de muis in het meetinstrument, lijn het instrument uit met de rechtervoet en begin het instrument te verwarmen terwijl de temperatuur langzaam stijgt. Observeer de reactie van de muis. Wanneer de temperatuur boven de tolerantie stijgt, zal de muis zich snel terugtrekken of zijn rechtervoet likken. Noteer de tijd met behulp van het instrument en definieer de tijd als de reactietijd tijdens de activiteit.
- Om de reactietijd in rust te meten, laat u de muis 30 minuten op de rusttafel zitten zonder te verwarmen en verkrijgt u vervolgens de tijdgegevens zoals uitgelegd in stap 4.2. Gebruik deze verkregen temporele gegevens voor latere analyse.
5. Micro-CT-scannen
- Euthanaseer 12 weken oude muizen postoperatief met kooldioxide, pel de huid van hun rechterenkels af en knip vervolgens hun middelste scheenbeen en kuitbeen af met een chirurgische schaar om volledige enkelmonsters te verkrijgen. Plaats de monsters gedurende 48 uur in gemarkeerde centrifugebuisjes van 15 ml met 10% neutrale formaline.
- Plaats de monsters na fixatie in batches (vier samples per batch) in een speciale sponstank voor micro-CT-scanning. Stel de machineparameters als volgt in: spanning = 50 kV, stroom = 200 mA, filter = 0,5 mmAl en resolutie = 9 μm. Voer de micro-CT-scanner uit.
- Gebruik na het scannen de reconstructiesoftware om het bereik van het beeld af te bakenen en selecteer een specifieke hoekpositie na het aanpassen van de XYZ-as van het afgebakende beeld met behulp van commerciële data-analysesoftware, zoals beschreven in Liu et al.10.
- Gebruik micro-CT-analysesoftware om continue 10-laagse interessegebieden te selecteren in de geherstructureerde beelden aangepast door de XYZ-assen, en analyseer kwantitatief de vereiste gewrichten om de botvolumefractie (BV/TV) te bepalen, zoals beschreven in Liu et al.10.
- Gebruik ten slotte driedimensionale medische beeldverwerkingssoftware om driedimensionale CT-beeldverwerking van de enkelgewrichten van de muis uit te voeren, zoals beschreven in Liu et al.10. Let na reconstructie op de slijtage en de vorming van osteofyten in de ASCJ.
6. Sectiekleuring van gewrichtskraakbeen
NOTITIE: Alle kleuringsstappen worden uitgevoerd in een zuurkast en tijdens de procedure wordt een masker gedragen.
- Gebruik een microscopisch pincet en schaar om overtollig zacht weefsel rond de enkelmonsters te verwijderen en plaats de monsters vervolgens in een centrifugebuis met 10% EDTA-ontkalkingsoplossing bereid met 44 g NaOH, twee verpakkingen PBS en 400 g EDTA-2Na, met de pH aangepast aan 7.35-7.45 met zoutzuur, en markeer de verschillende groepen.
- Plaats vervolgens de centrifugebuis op een schudtafel (snelheid ingesteld op 20 rpm) voor ontkalking en ververs de ontkalkingsoplossing eenmaal per dag. Bepaal de ontkalking van de monsters.
- Na 1 maand ontkalking de monsters uitdrogen met gradiëntalcohol en vervolgens gedurende 8 uur n-butanol gebruiken voor klaringsdoeleinden. Dompel ten slotte de geklaarde monsters onder in paraffine in een coronale positie om in te bedden.
- Plaats de paraffinemonsters in een koelkast van 4 °C voor later gebruik. Neem de monsters uit de koelkast van 4 °C en plaats ze ongeveer 10 minuten in een vriezer van -20 °C om het snijden van het volledige vlak te vergemakkelijken.
- Bevestig de monsters op de microtoom en snijd ze in een dikte van 6 μm. Gebruik tegelijkertijd een microscoop om te observeren of de monsters op het verwachte niveau zijn gesneden - gemakkelijke penetratie van een spuitnaald in het botweefsel.
- Stel de watertemperatuur van het tabletapparaat van tevoren in op 40 °C. Snijd vervolgens twee tot drie volledige paraffinesecties op een rij en breng ze over naar de tabletmachine voor volledige expansie. Verwijder vervolgens de paraffinesecties met een glasplaatje en laat het water weglopen. Markeer ten slotte de dia's met groepen en nummers.
7. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring
- Plaats de secties in een incubator van 60 °C op een zodanige manier dat de intacte ASCJ-voegstructuur onder de microscoop kan worden waargenomen en bak de secties gedurende 40-50 min. Dewax vervolgens de secties 3x met xyleen, genummerd als I, II en III voor gemakkelijke identificatie, gedurende respectievelijk 15 min, 15 min en 10 min.
- Plaats de ontwaxte secties 2x in 100% ethanol, genummerd als I en II voor gemakkelijke identificatie, 90% ethanol en 80% ethanol gedurende respectievelijk 3 min, 3 min, 5 min en 5 min. Was vervolgens de secties met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) gedurende 5 min.
- Na 1 minuut weken met hematoxyline, was je de secties met ddH2O totdat ze kleurloos worden. Week de secties 30 s in 1% zure ethanoldifferentiatieoplossing en was ze 3x gedurende 1 min met ddH2O. Kleurt daarna de secties gedurende 1 minuut met 1% ammoniakoplossing en was vervolgens 3x gedurende 1 minuut elk met ddH2O.
- Kleurt de monsters vervolgens gedurende 1 minuut met een eosinekleuringsoplossing en doe ze vervolgens achtereenvolgens 1 minuut in 95% ethanol en 100% ethanol. Behandel ten slotte de secties gedurende 1 minuut met xyleen IV.
- Laat de secties aan de lucht drogen, plak een druppel neutrale hars op de preparaten op de objectglaasjes en dek ze af met een dekglaasje. Maak vervolgens foto's met een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop in helderveld bij 5x en 20x.
8. Safranin O-fast groene kleuring
- Plaats de geselecteerde secties in een incubator van 60 °C en bak de secties 40-50 min. Dewax vervolgens de secties met xyleen I, II en III gedurende respectievelijk 15 min, 15 min en 10 min.
- Plaats de van was ontdane secties in 100% ethanol I, II, 90% ethanol en 80% ethanol gedurende respectievelijk 3 min, 3 min, 5 min en 5 min. Was vervolgens de secties met ddH2O gedurende 5 min.
- Na 1 minuut weken met hematoxyline, was je de secties met ddH2O totdat ze kleurloos worden. Week de secties 30 s in 1% zure ethanoldifferentiatieoplossing en was ze 3x gedurende 1 min met ddH2O. Kleur de secties vervolgens gedurende 1 minuut met 1% ammoniakoplossing en was ze 3x gedurende 1 minuut met ddH2O.
- Week de coupes gedurende 2 minuten in 0,05% fast green, gevolgd door de secties gedurende 30 s te laten weken in 1% azijnzuuroplossing en gedurende 5 minuten in 0,1% safranine. Plaats de gekleurde monsters in 95% ethanol en 100% ethanol gedurende 1 minuut, de een na de ander.
- Behandel ten slotte de secties gedurende 1 minuut met xyleen IV. Laat de secties aan de lucht drogen, plak een druppel neutrale hars op de preparaten op de objectglaasjes en dek ze af met een dekglaasje. Maak vervolgens foto's met een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop in helderveld bij 5x en 20x.
9. Immunohistochemie
- Dag 1: Plaats de geselecteerde secties in een incubator van 60 °C, bak de secties gedurende 40-50 minuten en ontwas ze vervolgens met xyleen I, II en III gedurende respectievelijk 15 min, 15 min en 10 min. Plaats de van was ontdane secties in 100% ethanol I, II, 90% ethanol en 80% ethanol gedurende respectievelijk 3 min, 3 min, 5 min en 5 min. Was vervolgens de secties met ddH2O gedurende 5 minuten, gebruik een histochemische pen om het gebied van het monster te omcirkelen en plaats ze in een donkere doos.
- Antigeen ophalen: Laat 20-50 μL 0,25% trypsine in het omcirkelde monstergebied vallen, incubeer gedurende 60 minuten in een incubator van 37 °C en was de monsters vervolgens 3x gedurende 2 minuten elk met PBS. Blokkeer endogene peroxidase door 3% H 2 O 2 toe te voegen, incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker en was ze vervolgens 3x gedurende elk2minuten met PBS. Voer serumblokkering uit door 10% geitenserum gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur toe te voegen en vervolgens gedurende een nacht te incuberen met het primaire antilichaam (muisanti-muis type II collageen, 1.000 keer verdund) bij 4 °C.
- Dag 2: Verwarm de secties 30 minuten op kamertemperatuur. Herstel het primaire antilichaam en was de secties 3x gedurende 2 minuten elk met PBS. Incubeer met het secundaire antilichaam gedurende 40 minuten in een incubator bij 37 °C en was de secties vervolgens 3x gedurende 2 minuten elk met PBS.
- DAB-kleurontwikkeling: Voeg 5 ml ddH 2 O, twee druppels buffer, vier druppels DAB en twee druppels H 2 O2toe om het DAB-reagens te bereiden. Voeg 20-50 μL reagens toe aan de secties, houd de monsters gedurende 5 minuten beschermd tegen licht en was de secties vervolgens gedurende 2 minuten met ddH2O.
- Na 1 minuut weken met hematoxyline, was je de secties met ddH2O totdat ze kleurloos worden. Week de secties gedurende 30 s in 1% zure ethanoldifferentiatieoplossing en was ze 3x gedurende 1 minuut elk met ddH 2 O.Kleur de secties gedurende 1 minuut met 1% ammoniakoplossing en was ze vervolgens 3x gedurende 1 minuut elk met ddH2O.
- Plaats vervolgens de secties in respectievelijk 95% ethanol en 100% ethanol gedurende 1 minuut. Incubeer ten slotte de secties gedurende 1 minuut met xyleen IV. Laat de secties aan de lucht drogen, plak een druppel neutrale hars op de preparaten op de objectglaasjes en dek ze af met een dekglaasje. Maak vervolgens foto's met een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop in helderveld bij 5x en 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De statistische analyse van de correlatiegegevens werd uitgevoerd met behulp van online statistische analysetools. De gegevens die voldeden aan de twee tests van normale verdeling en homogeniteit van variantie werden gebruikt voor verdere statistische analyse door middel van eenrichtingsanalyse van variantie. Als de gegevens niet aan de twee tests voldeden, werd de Kruskal-Wallis-test gebruikt voor de statistische analyse. De gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Evenwichtsbalk test
De statistische analyse van de gemiddelde tijd die elke muis nodig had om in elke fase twee keer door de evenwichtsbalk te gaan, toonde aan dat er geen statistische verschillen waren in de tijd die elke groep muizen nodig had om de evenwichtsbalk te passeren vóór de operatie (p = 0,73). Drie dagen na de operatie hadden de muizen in de CL + ATFL- en CL + DL-groepen meer tijd nodig om door de evenwichtsbalk te gaan in vergelijking met de muizen in de schijngroep, en het verschil was statistisch significant (p < 0,05). Vier weken na de operatie werden geen significante verschillen waargenomen in de tijd die muizen in de CL + ATFL- en CL + DL-groepen nodig hadden om de evenwichtsbalk te passeren in vergelijking met de muizen in de schijngroep (p > 0,05). Bovendien hadden de muizen in de CL + ATFL- en CL + DL-groepen 8 weken en 12 weken na de operatie meer tijd nodig om de evenwichtsbalk te passeren in vergelijking met de muizen in de schijngroep, en het verschil was statistisch significant (p < 0,01). Er werden geen statistisch significante verschillen waargenomen in de tijd die de muizen in de CL + ATFL-groep nodig hadden om de evenwichtsbalk te passeren in vergelijking met de muizen in de CL + DL-groep tijdens elke testperiode (p > 0,05; Figuur 1A).
Het aantal keren dat de rechterachtervoet van de muis door de evenwichtsbalk gleed, was niet statistisch verschillend tussen de drie groepen muizen vóór de operatie (p = 0,68). Bovendien werden er geen significante verschillen waargenomen in het aantal secties van de rechter achtervoet voor de muizen in de CL + ATFL en CL + DL groepen in vergelijking met muizen in de schijngroep 3 dagen na de operatie. Wat betreft andere postoperatieve tijdstippen was het aantal secties in de ligamentdoorsnedegroep hoger in vergelijking met dat van de muizen in de schijngroep, en het verschil was statistisch significant (p < 0,05). 8 weken en 12 weken na de operatie was het aantal keren dat de rechter achtervoet in de CL + ATFL-groep van de evenwichtsbalk gleed hoger dan dat van de muizen in de CL + DL-groep, en het verschil was statistisch significant (p < 0,05; Figuur 1B).
Analyse van de voetafdruk
De paslengte van de muizen in elke groep nam toe met de leeftijd, maar het doorsnijden van ligamenten kon de paslengte verkorten. Er werden geen significante verschillen waargenomen in de staplengte van de rechter achtervoet tussen de drie groepen muizen vóór de operatie (p > 0,05). In de looptest 12 weken na de operatie was de staplengte van de rechter achtervoet in de ligamentgesneden groep korter in vergelijking met in de schijngroep in dezelfde periode, en het verschil was statistisch significant (p < 0,01). De paslengte van de rechter achtervoet voor de muizen in de CL + ATFL-groep verschilde echter niet significant van die voor de muizen in de CL + DL-groep (p > 0,05; Figuur 2A,B).
Thermische nociceptie beoordeling
De statistische analyse van de thermische nociceptieresponstijd van de voeten van de muizen tijdens activiteit toonde aan dat er geen statistische verschillen waren in de reactietijden van de drie groepen muizen vóór de operatie (p > 0,5). Bij de beoordeling van de thermische nociceptie na de operatie waren de responstijden voor thermische nociceptie van de muizen in de ligamentgroep langer dan die van de muizen in de schijngroep in dezelfde periode, en het verschil was statistisch significant (p < 0,01; Figuur 3).
Micro-CT-scannen
Twaalf weken na de operatie werd micro-CT gebruikt om de ASCJ van de rechter achtervoet kwantitatief te analyseren voor de muizen in elke groep. Driedimensionale reconstructie van de CT-beelden toonde aan dat de ASCJ van de rechter achtervoet in de twee groepen met doorgesneden ligamenten ruwer was dan die in de schijngroep. Het gewrichtsoppervlak was concaaf, convex en vlak, er waren duidelijke slijtagesporen, osteofyten werden rond de gewrichten gegenereerd en de gewrichten vertoonden degeneratieve veranderingen. Bovendien ontwikkelde ongeveer 28,6% van de muizen in de CL + DL-groep talusdislocatie (Figuur 4A,B)10. De botvolumefractie van de ASCJ van de rechter achtervoet in de CL + ATFL- en CL + DL-groepen was significant hoger dan in de schijngroep, en het verschil was statistisch significant (p < 0,01; Figuur 4C,D)10.
Sectiekleuring van het gewrichtskraakbeen
H&E en Safranin O-fast groene kleuring toonden aan dat de structuur van de ASCJ van de muizen in de schijngroep compleet was, de morfologie van het kraakbeen intact was en de chondrocyten gelijkmatig verdeeld waren. De kraakbeenlaag van de ASCJ van de twee groepen muizen met ligamentsneden vertoonde duidelijke discontinuïteit en het aantal chondrocyten was afgenomen (Figuur 5A,B)10. Het gemodificeerde Mankin and Osteoarthritis Research Society International (OARSI) scoresysteem werd gebruikt om de H&E en Safranin O-fast groene kleuring van de ASCJ voor de muizen in elke groep te scorenop 20,21,22. De gemodificeerde Mankin-score werd bepaald door de structurele kenmerken van het kraakbeen en het aantal en de kleuring van de chondrocyten, en de OARSI-score werd bepaald door de histopathologische graad en het stadium van het kraakbeen. De scores van de twee groepen muizen met ligamentamputatie waren hoger dan die van de muizen in de schijngroep, en het verschil was statistisch significant (p < 0,05; Figuur 5C-F)10.
Beelden van typische type II collageen immunohistochemische kleuring toonden aan dat het gehalte aan type II collageen in de ASCJ gewrichtskraakbeenlaag van de rechter achtervoet in de schijngroep uniformer was dan dat van de twee groepen muizen met doorgesneden ligamenten, en er was geen duidelijk verlies van type II collageen (Figuur 6A). De resultaten van de kwantitatieve analyse toonden aan dat de expressie van collageen type II in de ASCJ van de muizen in de schijngroep hoger was dan die van de twee groepen muizen met doorgesneden ligamenten, en het verschil was statistisch significant (p < 0,05; Figuur 6B,C).
Figuur 1: Gedragsanalyse van de muizen met behulp van de evenwichtsbalktest. (A) Tijd die de muizen nodig hebben om de evenwichtsbalk te passeren. (B) Het aantal uitglijders van de rechtervoet bij het passeren van de evenwichtsbalk. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± de standaarddeviatie, n = 7 monsters per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gedragsanalyse van de muizen met behulp van voetafdrukanalyse. (A) Vergelijking van de lengte van de rechtervoetstap voor de muizen in elke groep vóór de operatie. (B) Vergelijking van de lengte van de rechtervoetstap voor de muizen in elke groep 12 weken na de operatie. Statistisch significante verschillen worden aangegeven met **, waarbij p 0,01 <, en ***, waarbij p 0,001 < tussen de aangegeven groepen. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± de standaarddeviatie, n = 7 monsters per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gedragsanalyse van de muizen met behulp van de thermische nociceptiebeoordeling. Thermische nociceptie responstijden tijdens activiteit bij muizen. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± de standaarddeviatie, n = 7 monsters per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Micro-CT analyse van de rechtervoet van een muis. (A) Driedimensionale reconstructie van de talus van de muis zonder dislocatie in het enkel-subtalaire gewrichtscomplex (zijaanzicht, mediaal aanzicht, vooraanzicht). (B) Driedimensionale reconstructie van de ontwrichte muizentalus in het enkel-subtalaire gewrichtscomplex (zijaanzicht, mediaal aanzicht, vooraanzicht). (C) Kwantitatieve analyse van de botvolumefractie (BV/TV) van de enkelgewrichten van de muis. (D) Kwantitatieve analyse van de botvolumefractie (BV/TV) van de subtalaire gewrichten van de muis. De zwarte pijlen duiden op osteofytenvorming of talusdislocatie. Statistisch significante verschillen worden aangegeven met ***, waarbij p < 0,001 tussen de aangegeven groepen. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Liu et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: H&E en Safranin O-fast groene kleuring en analyse van de enkelgewrichten. (A) H&E kleuring van de enkel-subtalaire gewrichten van de muis. (B) Safranine O-snelle kleuring van de enkel-subtalaire gewrichten van de muis. (C) Gemodificeerde Mankin-scores voor de enkelgewrichten van de muis. (D) Gemodificeerde Mankin-scores voor de subtalaire gewrichten van de muis. (E) Osteoarthritis Research Society International (OARSI) scoort voor de enkelgewrichten van muizen. (F) OARSI-scores voor de subtalaire gewrichten van de muis. Symbolen: a = enkelgewricht; s = subtalair gewricht. Statistisch significante verschillen worden aangegeven met ***, waarbij p 0,001 < tussen de aangegeven groepen. Schaalbalk = 100 μm, n = 7 monsters per groep. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Liu et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Immunohistochemische kleuring en analyse van de enkelgewrichten. (A) Type II collageen immunohistochemische kleuring van de enkel- en subtalaire gewrichten van de muis. (B) Collageen II (+) oppervlakteverhoudingspercentage voor de enkelgewrichten van de muis. (C) Collageen II (+) oppervlakteverhoudingspercentage voor de subtalaire gewrichten van de muis. Symbolen: a = enkelgewricht; s = subtalair gewricht. Statistisch significante verschillen worden aangegeven met ***, waarbij p < 0,001 tussen de aangegeven groepen. Schaalbalk = 100 μm, n = 7 monsters per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werden twee muismodellen van ASCJ-instabiliteit met succes geconstrueerd door CL + ATFL of CL + DL te transecteren. De tijd die de muizen nodig hadden om door de evenwichtsbalk te gaan, nam significant toe na 8 weken en 12 weken na de operatie, wat vergelijkbaar is met de resultaten die het Hubbard-Turner-team behaalde door het laterale ligament van het enkelgewricht door te snijden23,24. In de rechtervoetglijtest zagen we dat de glijtijden van de twee groepen muizen met doorgesneden ligamenten significant hoger waren dan die van muizen in de schijngroep, en de glijtijden bereikten een maximum 12 weken na de operatie, wat suggereert dat de twee groepen muizen met doorgesneden ligamenten mogelijk last hadden van instabiliteit van de ASCJ. De looptest toonde aan dat, hoewel de staplengte van de muizen geleidelijk toenam met de leeftijd, de staplengtes van 12 weken van de twee groepen muizen met doorgesneden ligamenten lager waren dan die van de schijngroep, en de staplengte van de CL + ATFL-groep was 7,2% minder dan die van de schijngroep. Alles bij elkaar genomen suggereren de bovenstaande resultaten dat het motorische niveau en het evenwichtsvermogen van de twee groepen muizen met ligamentamputatie aanzienlijk waren aangetast.
In de driedimensionale reconstructie van de CT-beelden werd waargenomen dat het ASCJ-gewrichtsoppervlak in de twee groepen muizen met doorgesneden ligamenten ruwer was dan dat van de muizen in de schijngroep, osteofyten werden gevormd rond de gewrichten en de botvolumefractie van het gewricht was verhoogd. Deze resultaten suggereren dat het ASCJ-gewrichtskraakbeen in de ligamentamputatiegroep degeneratieve laesies had. De kleuring van de gewrichtskraakbeensecties vertoonde kraakbeendegeneratie, zoals discontinuïteit van het kraakbeenoppervlak en een vermindering van chondrocyten, wat verder bevestigde dat ASCJ-instabiliteit op lange termijn zich zou kunnen ontwikkelen tot PTOA, wat vergelijkbaar is met de resultaten beschreven door Chang et al.18.
In het proces van modelvorming is de sleutel tot succesvolle modellering het nauwkeurig vinden van de overeenkomstige ligamenten om te snijden. Tegelijkertijd kan het matig verhogen van de activiteit van de muizen hun ontwikkeling van artrose versnellen. In het daaropvolgende kleuringsproces speelt ontkalking van het enkelgewrichtsweefsel van de muis een doorslaggevende rol. Daarom is het noodzakelijk om regelmatig de hardheid van het weefsel te observeren en een geschikte sectietijd te kiezen.
In de studie werd een looppapier gebruikt om de veranderingen in het looppatroon van de muizen voor en na de operatie te analyseren, en alleen veranderingen in de staplengte van de muizen werden verkregen. Als een instrument voor het analyseren van het looppatroon van dieren zou worden gebruikt, zouden meer parameters kunnen worden geanalyseerd op basis van de grootte en het gebied, de positie, de bewegingsdynamiek en de druk van elke stap van de muizen voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van het gangpatroon. Bovendien wordt de monofilamentdetectie van Semmes Weinstein internationaal erkend als een zeer effectieve methode voor het detecteren van sensorische stoornissen van de aanraakdruk25, en betere experimentele resultaten kunnen worden verkregen als deze methode wordt gebruikt om de sensorische functie van de voeten van de muizen te evalueren. Vanwege de beperkte experimentele omstandigheden en het ontbreken van instrumenten voor loopanalyse van dieren, werd de monofilamentdetectie van Semmes Weinstein echter niet gebruikt; Daarom zijn er in de toekomst mogelijkheden voor diepgaande studies met behulp van deze experimentele technieken.
Aangezien PTOA een chronische degeneratieve ziekte is26, moeten gewrichtsinstabiliteit en kraakbeenschade op verschillende tijdstippen worden waargenomen, en dit is in de toekomst meer langetermijn- en meervoudige studies waard. Bovendien konden de chondrocyten, vanwege de kleine structuur van de ASCJ van de muis, niet worden geëxtraheerd voor in-vitro-experimenten om de veranderingen in ontstekingsfactoren te evalueren en om het bestaan van PTOA op cellulair niveau te verifiëren. In toekomstige studies zal meer tijd en energie worden besteed aan het bestuderen van de onderliggende moleculair biologische mechanismen van ASCJ-degeneratie. Ten tweede, hoewel de structuur van de achtervoeten en enkels van muizen vergelijkbaar is met die van mensen, zijn muizen strikt genomen viervoeters, terwijl mensen tweevoeters zijn, en de krachten die de gewrichten ervaren tijdens beweging zijn niet precies hetzelfde.
De succesvolle oprichting van het ASCJ-instabiliteitsmuismodel breidt echter het eenvoudige diermodel voor enkelinstabiliteit uit naar het ASCJ-instabiliteitsdiermodel, dat een uitgebreider begrip biedt van het mechanisme van voetinstabiliteit en een nieuw begrip biedt voor de studie van klinische voetziekten, evenals een diermodel voor de diagnose en behandeling van de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het beurzenprogramma van de provinciale overheid van Jiangsu en de Priority Academic Program Development van Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
References
- Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
- Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
- Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
- Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
- Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
- Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
- Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
- Mittlmeier, T., Wichelhaus, A.
- Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
- Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
- Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
- Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
- Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
- Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
- Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
- Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
- Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
- Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
- Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
- Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
- Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
- Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
