Summary
Das Knöchel-Subtalar-Komplex-Gelenk (ASCJ) ist der Kern des Fußes und spielt eine Schlüsselrolle bei der Gleichgewichtskontrolle bei täglichen Aktivitäten. Sportverletzungen führen häufig zu einer Instabilität in diesem Gelenk. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Mausmodell der Banddurchtrennungs-induzierten Instabilität des ASCJ.
Abstract
Knöchelverstauchungen sind vielleicht die häufigsten Sportverletzungen im täglichen Leben, die häufig zu einer Instabilität des Knöchel-Subtalar-Komplex-Gelenks (ASCJ) führen und langfristig zu einer posttraumatischen Arthrose (PTOA) führen können. Aufgrund der Komplexität des Verletzungsmechanismus und der klinischen Manifestationen wie Ekchymose, Hämatom oder Druckempfindlichkeit im Seitenfuß gibt es jedoch keinen klinischen Konsens über die Diagnose und Behandlung der ASCJ-Instabilität. Da die muskuloskelettale Struktur der Knochen und Bänder des Mausrückfußes mit der des Menschen vergleichbar ist, wurde durch die Durchtrennung der Bänder um den ASCJ ein Tiermodell der ASCJ-Instabilität bei Mäusen etabliert. Das Modell wurde durch eine Reihe von Verhaltenstests und histologischen Analysen gut validiert, darunter ein Schwebebalkentest, eine Fußabdruckanalyse (eine Bewertung des Trainingsniveaus und der Gleichgewichtsfähigkeit bei Mäusen), eine thermische Nozizeptionsbewertung (eine Bewertung der sensorischen Funktion des Fußes bei Mäusen), eine Mikro-Computertomographie (CT) und eine Schnittfärbung des Gelenkknorpels (eine Bewertung der Schädigung und Degeneration des Gelenkknorpels bei Mäusen). Die erfolgreiche Etablierung eines Mausmodells der ASCJ-Instabilität wird eine wertvolle Referenz für die klinische Forschung zum Verletzungsmechanismus darstellen und zu besseren Behandlungsmöglichkeiten bei Knöchelverstauchungen führen.
Introduction
Knöchelverstauchungen gehören zu den häufigsten Sportverletzungen weltweit. Es wird geschätzt, dass in denVereinigten Staaten täglich 10.000 Menschen verletzt werden1, von denen 15 % bis 45 % auf sportbedingte Verletzungen zurückzuführen sind2. Die medizinischen Kosten für die Behandlung von Knöchelverstauchungen in den Vereinigten Staaten belaufen sich auf 4,2 Milliarden US-Dollar pro Jahr 3,4,5. Chronische Fußinstabilität ist ein häufiges Problem nach Knöchelverstauchungen und tritt bei etwa 74 % der Knöchelverstauchungenauf 6, einschließlich Knöchel- oder subtalarer Instabilität. Aufgrund der ähnlichen klinischen Symptome und Anzeichen ist es für das medizinische Personal jedoch schwierig zu unterscheiden, ob eine chronische Sprunggelenkinstabilität in der Klinik auch mit einer chronischen subtalaren Gelenkinstabilität einhergeht und daher eine chronische subtalare Instabilität leicht übersehen werden kann. Daher kann die tatsächliche Inzidenz der chronischen Knöchel-Subtalar-Komplex-Instabilität (ASCJ) (eine spezifische Form der chronischen Fußinstabilität, die sowohl die chronische Knöchelinstabilität als auch die chronische subtalare Instabilität umfasst) höher sein als berichtet 7,8,9. Unbehandelt kann die chronische Gelenkinstabilität des Sprunggelenks-Subtalar-Komplexes zu wiederholten Knöchelverstauchungen führen, was zu einem Teufelskreis aus Knöchelverstauchungen und chronischer Knöchel-Subtalar-Komplex-Instabilität führt. Eine langfristige chronische Instabilität des knöchel-subtalaren Komplexes kann zu einer Degeneration des ASCJ und einer posttraumatischen Arthrose führen, die in schweren Fällen die angrenzenden Gelenke betreffen kann10. Bei diesen Erkrankungen ist die derzeitige klinische Behandlung neben chirurgischen Behandlungsmethoden wie Bänderreparatur und Bandrekonstruktion überwiegend konservativ11,12.
ASCJ ist die Kernstruktur des Fußes und hält das Gleichgewicht des Körpers während der Bewegungaufrecht 13. Die Struktur des Sprunggelenks und des Subtalargelenks wurde separat umfassend erforscht14,15,16,17. Untersuchungen am gesamten Sprunggelenk sind jedoch selten. Etwa ein Viertel der Fälle von Sprunggelenksverletzungen sind mit einer Verletzung des Subtalargelenks assoziiert18. Aufgrund des komplexen Verletzungsmechanismus der ASCJ-Instabilität gibt es keinen Konsens über die Diagnose und Behandlung im klinischen Umfeld. In Anbetracht der aktuellen Situation von Sprunggelenksverletzungen in der Klinik ist eine wissenschaftlichere Methode erforderlich, um das Sprunggelenk und das Subtalargelenk als Ganzes zu untersuchen und damit ein neues Verständnis für die Untersuchung von Fußerkrankungen zu liefern.
Da der anatomische Aufbau des Mausrückfußes auf muskuloskelettaler Ebene mit dem des menschlichen Fußes vergleichbar ist 19, wurden in mehreren Studien bereits Mausmodelle für die Fuß-/Knöchelforschung eingesetzt10,19. Chang et al.19 entwickelten erfolgreich drei verschiedene Mausmodelle für Sprunggelenksarthrose. Angeregt durch die erfolgreiche Etablierung der Knöchelinstabilität im Mausmodell etablierten wir ein Mausmodell für die Instabilität des knöchelsubtalaren Komplexes und stellten die Hypothese auf, dass die Durchtrennung der partiellen Bänder im Rückfuß der Maus zu einer mechanischen Instabilität des ASCJ führen würde, die zu einer posttraumatischen Arthrose (PTOA) des ASCJ führen würde. Das ASCJ-Instabilitätstiermodell könnte sowohl für die Behandlung der Sprunggelenkinstabilität als auch der subtalaren Instabilität verwendet werden, was der tatsächlichen klinischen Situation besser entspricht als das derzeit verwendete einfache Sprunggelenksinstabilitätsmodell 7,8,9,19. Um diese Hypothese zu testen, wurden zwei Mausmodelle für die durch Banddurchtrennung induzierte Instabilität des ASCJ entworfen. Die Ergebnisse für die sensomotorische Funktion - der Waagebalkentest, die Fußabdruckanalyse und die Bewertung der thermischen Nozizeption - wurden verwendet, um die Machbarkeit des Modells zu bewerten, und Mikrocomputertomographie (CT) und histologische Färbung wurden verwendet, um die Schädigung und Degeneration des Gelenkknorpels der Maus zu bewerten. Die erfolgreiche Etablierung eines Mausmodells der ASCJ-Instabilität liefert nicht nur ein neues Verständnis für die Untersuchung von Fußerkrankungen, sondern auch eine wertvolle Referenz für die klinische Forschung zu den verletzungsbedingten Mechanismen, bietet bessere Behandlungsmöglichkeiten für Knöchelverstauchungen und ist hilfreich für weitere Studien zur Erkrankung.
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Protocol
Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Soochow University genehmigt.
1. Chirurgische Eingriffe
- Unterteilen Sie 21 6 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse in drei Gruppen: die Gruppe des transversalen zervikalen Bandes und des vorderen talofibulären Bandes, die Gruppe des transversalen Halsbandes und des Deltabandes sowie die Gruppe der Scheinchirurgie. Stellen Sie sicher, dass alle Mäuse in einer Umgebung aufgezogen wurden, die bestimmte Standards für pathogenfreie Mäuse (SPF) erfüllt.
- Akklimatisieren Sie die Mäuse 2 Wochen vor dem Experiment an die neue Aufzuchtumgebung (ein Hell/Dunkel-Zyklus von 12 h/12 h und eine konstante Temperatur und Luftfeuchtigkeit von 18-22 °C bzw. 40%-70%). Unterziehen Sie die Mäuse 1 Woche vor dem Experiment einem Schwebebalken- und Gangtraining, indem Sie von einem Ende eines Schwebebalkens oder eines U-förmigen Rohrs zum anderen Ende gehen, ohne anzuhalten.
- Im Alter von 8 Wochen wird die Maus mit einer Isofluran-Inhalation betäubt, indem ein Wattebausch mit 2 ml Isofluran benetzt und zur vollständigen Verflüchtigung in einen luftdichten Behälter gelegt wird. Überwachen Sie die Aktivität der Maus und setzen Sie die Inhalation fort, bis die Aktivität der Maus deutlich nachgelassen hat. Bestimmen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen der Mäuse zusammenkneifen, um ihre Reaktionen zu beobachten. Inhalieren Sie verdampftes Isofluran (2%) durch eine Gesichtsmaske, um die Anästhesie bei Mäusen während nachfolgender Operationen aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie während der Narkose eine tierärztliche Augensalbe, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
- Entfernen Sie nach der Betäubung die Haare am Knöchelgelenk der rechten Hintergliedmaßen der Maus mit einem Rasierer und desinfizieren Sie die freiliegende Haut dreimal abwechselnd mit Jodwattebäuschen und Alkoholwattebäuschen. Verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen durch subkutane Injektion. Übertragen Sie die Maus mit einem sterilen OP-Pad in den Tieroperationssaal der Mikrochirurgie.
- Für die Gruppe des transversalen Halsbandes und des vorderen talofibulären Bandes (CL + ATFL) wird mit einem Skalpell ein 7 mm schräger Längsschnitt nach unten auf der Haut oberhalb des rechten Sprunggelenks vorgenommen und mit einer mikroskopisch kleinen geraden Pinzette vor dem Sprunggelenk sondiert.
- Stellen Sie sicher, dass die ATFL nach der Sondierung am unteren Rand des Taluskörpers und des Wadenbeins freigelegt und vorsichtig mit einem Skalpell geschnitten wird. Trennen Sie die langen und kurzen Fibulasehnen und die Sehnen des Extensor digitorum longus, legen Sie die CL frei und schneiden Sie sie mit einem Skalpell durch.
- Für die Gruppe CL + Ligamentum deltoideus quer (DL) machen Sie einen 8 mm langen vertikalen Schnitt auf der medialen Haut des rechten Sprunggelenks und trennen Sie den DL stumpf vom medialen Knöchel, um ihn schließlich zu durchtrennen. Schneiden Sie dann die CL wie in Schritt 1.5 beschrieben ab.
- In der Scheingruppe (Schein-OP-Gruppe) wird eine Scheinoperation am rechten Sprunggelenk durchgeführt, aber keine Bänder durchtrennt.
- Spülen Sie den Einschnitt mit steriler normaler Kochsalzlösung und vernähen Sie ihn mit 5-0 chirurgischem Nylonfaden. Zum Schluss desinfizieren Sie den vernähten Schnitt mit einem Jodwattebausch.
- Halten Sie die Maus unter Beobachtung, bis sie das Brustbein behalten kann, und beaufsichtigen Sie, bis sie bei vollem Bewusstsein ist. Desinfizieren Sie den Knöchelschnitt zweimal täglich mit einem Jodwattebausch und verabreichen Sie Carprofen (5 mg/kg, subkutane Injektion), einmal täglich für 1 Woche. Kehren Sie nach der Operation allein zurück und achten Sie genau auf den postoperativen Zustand der Maus.
- Zwei Wochen nach der Operation und wenn die Schwellung des Sprunggelenks zurückgegangen ist, beginnen Sie, die Mäuse täglich 1 Stunde lang in der Maus-Rotationsermüdungsmaschine zu trainieren.
2. Schwebebalken-Test
- Klemmen Sie einen kreisförmigen Holzbalken mit einer Länge von 1 m und einem Durchmesser von 20 mm, der an einem Ende um 15° geneigt ist, mit einem Fotostativclip und legen Sie das andere Ende auf eine Arbeitsfläche, die mit einer geschlossenen Kassette verbunden ist.
- Führen Sie 1 Woche vor der Operation ein Schwebebalkentraining durch, um sicherzustellen, dass sich die Mäuse reibungslos von einem Ende des Balkens zum anderen bewegen. Stellen Sie sich vor, dass eine Maus den Test bestanden hat, wenn sie den Strahl zweimal in 60 s ohne Pause durchläuft.
- Führen Sie zwei aufeinanderfolgende Versuche für jede Maus durch und besprühen Sie den Schwebebalken nach jedem Versuch mit 75%igem Alkohol, um zu verhindern, dass der Restgeruch der vorherigen Maus die nächste Maus beeinträchtigt.
- Führen Sie den Schwebebalkentest präoperativ, 3 Tage, 1 Woche, 4 Wochen, 8 Wochen und 12 Wochen nach der Operation durch. Notieren Sie die durchschnittliche Zeit, die jede Maus zweimal hintereinander am Schwebebalken passiert, und die Häufigkeit, mit der der rechte Rückfuß vom Balken rutscht, als abhängige Variablen.
3. Analyse des Fußabdrucks
- Legen Sie einen U-förmigen Kunststoffkanal mit einer Länge von 50 cm, einer Breite von 10 cm und einer Höhe von 10 cm auf den Versuchstisch und verbinden Sie ein Ende des Kunststoffkanals mit einer geschlossenen Kassette.
- Legen Sie ein einfaches Pigmentpapier flach in den Kanal, halten Sie die Maus dann mit beiden Händen fest und bemalen Sie ihre Vorder- und Hinterfüße gleichmäßig mit ungiftigem rotem und grünem Pigment.
- Platzieren Sie die bemalte Maus vorsichtig an einem Ende des Kanals und lassen Sie sie zum anderen Ende der Kassette wandern. Nehmen Sie das pigmentierte Papier mit den Fußabdrücken heraus, markieren Sie es und legen Sie es zum Trocknen an einem belüfteten und schattigen Ort auf ein Gestell.
- Besprühen Sie nach jeder Maus den U-förmigen Kunststoffkanal mit 75%igem Alkohol, um zu verhindern, dass der Restgeruch der vorherigen Maus die nächste Maus beeinträchtigt.
- Wählen Sie auf jedem Papier drei aufeinanderfolgende durchsichtige Mausabdrücke aus, und messen Sie mit einem Lineal die Schrittlänge des Fußabdrucks des rechten Fußes der Maus sowie die Schrittbreite zwischen dem linken und rechten Fußabdruck.
4. Beurteilung der thermischen Nozizeption
- Verwenden Sie während des Experiments den Plantartest, um die thermische Nozizeptionsreaktionszeit des Mausfußes und die Reaktionszeit der Maus während der Aktivität bzw. im Ruhezustand aufzuzeichnen. Zeichnen Sie die Messdaten in Sekundenschnelle auf.
- Setzen Sie die Maus in das Messgerät, richten Sie das Gerät mit dem rechten Fuß aus und beginnen Sie, das Gerät mit langsam steigender Temperatur zu erhitzen. Beobachte die Reaktion der Maus. Wenn die Temperatur über die Toleranz steigt, zieht sich die Maus schnell zurück oder leckt sich den rechten Fuß. Erfassen Sie die Zeit mit dem Gerät und definieren Sie die Zeit als Reaktionszeit während der Aktivität.
- Um die Reaktionszeit im Ruhezustand zu messen, lassen Sie die Maus 30 Minuten lang ohne Erwärmung auf dem Ruhetisch sitzen und erhalten Sie dann die Zeitdaten, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Verwenden Sie diese erfassten Zeitdaten für die anschließende Analyse.
5. Mikro-CT-Scans
- 12 Wochen alte Mäuse postoperativ mit Kohlendioxid einschläfern, die Haut ihrer rechten Knöchel abziehen und dann das mittlere Schien- und Wadenbein mit einer chirurgischen Schere durchtrennen, um vollständige Knöchelproben zu erhalten. Die Proben werden 48 Stunden lang in markierte 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 % neutralem Formalin gegeben.
- Nach der Fixierung werden die Proben in Chargen (vier Proben pro Charge) in einen speziellen Schwammtank für die Mikro-CT-Untersuchung gelegt. Stellen Sie die Maschinenparameter wie folgt ein: Spannung = 50 kV, Strom = 200 mA, Filter = 0,5 mmAl und Auflösung = 9 μm. Führen Sie den Mikro-CT-Scanner aus.
- Verwenden Sie nach dem Scannen die Rekonstruktionssoftware, um den Bereich des Bildes abzugrenzen, und wählen Sie eine bestimmte Winkelposition, nachdem Sie die XYZ-Achse des abgegrenzten Bildes mit kommerzieller Datenanalysesoftware angepasst haben, wie in Liu et al.10 beschrieben.
- Verwenden Sie eine Mikro-CT-Analysesoftware, um kontinuierliche 10-Schicht-Regionen von Interesse in den restrukturierten Bildern auszuwählen, die durch die XYZ-Achsen angepasst wurden, und analysieren Sie quantitativ die erforderlichen Gelenke, um den Knochenvolumenanteil (BV/TV) zu bestimmen, wie in Liu et al.10 beschrieben.
- Verwenden Sie schließlich eine dreidimensionale medizinische Bildverarbeitungssoftware, um eine dreidimensionale CT-Bildverarbeitung der Mausknöchelgelenke durchzuführen, wie in Liu et al.10 beschrieben. Beobachten Sie nach der Rekonstruktion den Verschleiß und die Bildung von Osteophyten im ASCJ.
6. Schnittfärbung des Gelenkknorpels
HINWEIS: Alle Färbeschritte werden in einem Abzug durchgeführt, und während des Eingriffs wird eine Maske getragen.
- Verwenden Sie eine mikroskopisch kleine Pinzette und Schere, um überschüssiges Weichgewebe um die Knöchelproben herum zu entfernen, und legen Sie die Proben dann in ein Zentrifugenröhrchen mit 10%iger EDTA-Entkalkungslösung, die mit 44 g NaOH, zwei Packungen PBS und 400 g EDTA-2Na hergestellt wurde, wobei der pH-Wert mit Salzsäure auf 7,35-7,45 eingestellt wurde, und markieren Sie die verschiedenen Gruppen.
- Als nächstes stellen Sie das Zentrifugenröhrchen zur Entkalkung auf einen Rütteltisch (Drehzahl auf 20 U/min) und wechseln die Entkalkungslösung einmal täglich. Bestimmen Sie die Entkalkung der Proben.
- Nach 1 Monat Entkalkung werden die Proben mit Gradientenalkohol dehydriert und anschließend 8 h lang n-Butanol zur Reinigung verwendet. Zum Schluss werden die gereinigten Proben zum Einbetten in koronaler Position in Paraffin getaucht.
- Legen Sie die Paraffinproben für die spätere Verwendung in einen 4 °C heißen Kühlschrank. Nehmen Sie die Proben vor dem Schneiden aus dem 4 °C-Kühlschrank und legen Sie sie für ca. 10 min in einen Gefrierschrank bei −20 °C, um das Schneiden der gesamten Ebene zu erleichtern.
- Fixieren Sie die Proben auf dem Mikrotom und schneiden Sie sie mit einer Dicke von 6 μm. Beobachten Sie gleichzeitig mit einem Mikroskop, ob die Proben mit dem erwarteten leichten Eindringen einer Spritzennadel in das Knochengewebe geschnitten wurden.
- Stellen Sie die Wassertemperatur der Tablettenmaschine vorab auf 40 °C ein. Als nächstes schneiden Sie zwei bis drei vollständige Paraffinabschnitte hintereinander und geben Sie sie zur vollständigen Ausdehnung in die Tablettenmaschine. Anschließend die Paraffinabschnitte mit einem Objektträger entfernen und das Wasser abgießen. Markieren Sie abschließend die Folien mit Gruppen und Nummern.
7. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)
- Legen Sie die Schnitte in einen 60 °C warmen Inkubator so, dass die intakte ASCJ-Gelenkstruktur unter dem Mikroskop betrachtet werden kann, und backen Sie die Schnitte für 40-50 min. Entwachsen Sie dann die Abschnitte mit Xylol 3x, nummeriert als I, II und III zur einfachen Identifizierung, für 15 min, 15 min bzw. 10 min.
- Legen Sie die entwachsten Abschnitte 2x in 100 % Ethanol, nummeriert als I und II, 90 % Ethanol und 80 % Ethanol für 3 Minuten, 3 Minuten, 5 Minuten bzw. 5 Minuten. Anschließend waschen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O).
- Nach dem Einweichen mit Hämatoxylin für 1 Minute die Abschnitte mit ddH2O waschen, bis sie farblos werden. Weichen Sie die Abschnitte 30 s lang in 1%iger saurer Ethanol-Differenzierungslösung ein und waschen Sie sie 3x für 1 min mitddH2O. Danach färben Sie die Schnitte 1 min lang mit 1%iger Ammoniaklösung und waschen Sie sie dann 3x für je 1 min mit ddH2O.
- Als nächstes färben Sie die Proben 1 Minute lang mit Eosin-Färbelösung und legen sie dann nacheinander für jeweils 1 Minute in 95%iges Ethanol und 100%iges Ethanol. Zum Schluss behandeln Sie die Schnitte 1 Minute lang mit Xylol IV.
- Trocknen Sie die Abschnitte an der Luft, geben Sie einen Tropfen Neutralharz auf die Proben auf den Objektträgern und decken Sie sie mit einem Deckglas ab. Nehmen Sie dann Bilder mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop im Hellfeld bei 5x und 20x auf.
8. Safranin O-fast grüne Färbung
- Die ausgewählten Abschnitte in einen 60 °C warmen Inkubator geben und die Abschnitte 40-50 Minuten backen. Dann entwachsen Sie die Schnitte mit Xylol I, II und III für 15 min, 15 min bzw. 10 min.
- Legen Sie die entwachsten Abschnitte für 3 Minuten, 3 Minuten, 5 Minuten und 5 Minuten in 100 % Ethanol I, II, 90 % Ethanol und 80 % Ethanol. Anschließend waschen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit ddH2O.
- Nach dem Einweichen mit Hämatoxylin für 1 Minute die Abschnitte mit ddH2O waschen, bis sie farblos werden. Weichen Sie die Abschnitte 30 s lang in 1%iger saurer Ethanol-Differenzierungslösung ein und waschen Sie sie 3x für 1 min mitddH2O. Anschließend färben Sie die Abschnitte 1 min lang mit 1%iger Ammoniaklösung und waschen sie 3x für jeweils 1 min mit ddH2O.
- Weichen Sie die Abschnitte 2 Minuten lang in 0,05 % schnellem Grün ein, dann weichen Sie die Abschnitte 30 Sekunden lang in 1 %iger Essigsäurelösung und 5 Minuten lang in 0,1 % Safranin ein. Die gefärbten Proben werden nacheinander für 1 Minute in 95 % Ethanol und 100 % Ethanol gelegt.
- Zum Schluss behandeln Sie die Schnitte 1 Minute lang mit Xylol IV. Trocknen Sie die Abschnitte an der Luft, geben Sie einen Tropfen Neutralharz auf die Proben auf den Objektträgern und decken Sie sie mit einem Deckglas ab. Nehmen Sie dann Bilder mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop im Hellfeld bei 5x und 20x auf.
9. Immunhistochemie
- Tag 1: Geben Sie die ausgewählten Abschnitte in einen 60 °C warmen Inkubator, backen Sie die Abschnitte 40-50 Minuten lang und entwachsen Sie sie dann mit Xylol I, II und III für jeweils 15 Minuten, 15 Minuten und 10 Minuten. Legen Sie die entwachsten Abschnitte für 3 Minuten, 3 Minuten, 5 Minuten und 5 Minuten in 100 % Ethanol I, II, 90 % Ethanol und 80 % Ethanol. Waschen Sie dann die Abschnitte 5 Minuten lang mit ddH2O, verwenden Sie einen histochemischen Stift, um den Bereich der Probe zu umkreisen, und legen Sie sie in eine dunkle Box.
- Antigengewinnung: Geben Sie 20-50 μl 0,25%iges Trypsin in den eingekreisten Probenbereich, inkubieren Sie 60 Minuten lang in einem 37 °C warmen Inkubator und waschen Sie die Proben dann 3x für jeweils 2 Minuten mit PBS. Blockieren Sie die endogene Peroxidase durch Zugabe von 3%H2O2, inkubieren Sie die Proben 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln und waschen Sie sie dann 3x für jeweils 2 min mit PBS. Führen Sie eine Serumblockierung durch, indem Sie 20 Minuten lang 10 % Ziegenserum bei Raumtemperatur hinzufügen und dann mit dem primären Antikörper (Maus-Anti-Maus-Typ-II-Kollagen, 1.000-fach verdünnt) bei 4 °C über Nacht inkubieren.
- Tag 2: Erwärmen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Gewinnen Sie den primären Antikörper zurück und waschen Sie die Abschnitte 3x für jeweils 2 min mit PBS. Mit dem Sekundärantikörper 40 min in einem Inkubator bei 37 °C inkubieren und dann die Schnitte 3x für je 2 min mit PBS waschen.
- DAB-Farbentwicklung: Fügen Sie 5 ml ddH2O, zwei Tropfen Puffer, vier Tropfen DAB und zwei TropfenH2O2hinzu, um dasDAB-Reagenz herzustellen. Geben Sie 20-50 μl Reagenz zu den Abschnitten, bewahren Sie die Proben 5 Minuten lang vor Licht geschützt auf und waschen Sie die Abschnitte dann 2 Minuten lang mit ddH2O.
- Nach dem Einweichen mit Hämatoxylin für 1 Minute die Abschnitte mit ddH2O waschen, bis sie farblos werden. Weichen Sie die Abschnitte 30 s lang in 1%iger saurer Ethanol-Differenzierungslösung ein und waschen Sie sie 3x für jeweils 1 min mit ddH2O. Färben Sie die Abschnitte für 1 min mit 1%iger Ammoniaklösung und waschen Sie sie dann 3x für jeweils 1 min mitddH2O.
- Als nächstes legen Sie die Abschnitte für jeweils 1 Minute in 95%iges Ethanol bzw. 100%iges Ethanol. Zum Schluss werden die Abschnitte 1 min lang mit Xylol IV inkubiert. Trocknen Sie die Abschnitte an der Luft, geben Sie einen Tropfen Neutralharz auf die Proben auf den Objektträgern und decken Sie sie mit einem Deckglas ab. Nehmen Sie dann Bilder mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop im Hellfeld bei 5x und 20x auf.
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Representative Results
Die statistische Auswertung der Korrelationsdaten erfolgte mit Hilfe statistischer Online-Analysetools. Die Daten, die die beiden Tests der Normalverteilung und der Varianzhomogenität erfüllten, wurden für die weitere statistische Analyse durch einseitige Varianzanalyse verwendet. Wenn die Daten die beiden Tests nicht erfüllten, wurde der Kruskal-Wallis-Test für die statistische Analyse verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt, und p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Schwebebalken-Test
Die statistische Analyse der durchschnittlichen Zeit, die jede Maus benötigte, um den Schwebebalken zweimal in jeder Phase zu passieren, zeigte, dass es keine statistischen Unterschiede in der Zeit gab, die jede Gruppe von Mäusen benötigte, um den Schwebebalken vor der Operation zu passieren (p = 0,73). Drei Tage nach der Operation benötigten die Mäuse in den Gruppen CL + ATFL und CL + DL im Vergleich zu den Mäusen in der Scheingruppe eine längere Zeit, um den Schwebebalken zu passieren, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,05). Vier Wochen nach der Operation wurden keine signifikanten Unterschiede in der Zeit beobachtet, die die Mäuse in den Gruppen CL + ATFL und CL + DL benötigten, um den Schwebebalken zu passieren, im Vergleich zu den Mäusen in der Scheingruppe (p > 0,05). Darüber hinaus benötigten die Mäuse in den Gruppen CL + ATFL und CL + DL 8 Wochen und 12 Wochen nach der Operation mehr Zeit, um den Schwebebalken zu passieren, als die Mäuse in der Scheingruppe, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,01). Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Zeit beobachtet, die die Mäuse in der CL + ATFL-Gruppe benötigten, um den Schwebebalken zu passieren, verglichen mit den Mäusen in der CL + DL-Gruppe während der einzelnen Testperioden (p > 0,05; Abbildung 1A).
Die Häufigkeit, mit der der rechte Rückfuß der Maus durch den Schwebebalken rutschte, unterschied sich statistisch nicht zwischen den drei Mäusegruppen vor der Operation (p = 0,68). Darüber hinaus wurden bei den Mäusen in den Gruppen CL + ATFL und CL + DL 3 Tage nach der Operation keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Abschnitte des rechten Rückfußes im Vergleich zu Mäusen in der Scheingruppe beobachtet. In Bezug auf andere postoperative Zeitpunkte war die Anzahl der Schnitte in der Banddurchtrennungsgruppe höher als bei den Mäusen in der Scheingruppe, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,05). 8 Wochen und 12 Wochen nach der Operation war die Häufigkeit, mit der der rechte Rückfuß in der CL + ATFL-Gruppe vom Schwebebalken rutschte, höher als bei den Mäusen in der CL + DL-Gruppe, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,05; Abbildung 1B).
Analyse des Fußabdrucks
Die Schrittlänge der Mäuse in jeder Gruppe nahm mit zunehmendem Alter zu, aber das Durchtrennen von Bändern könnte die Schrittlänge verkürzen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Schrittlänge des rechten Rückfußes zwischen den drei Mäusegruppen vor der Operation beobachtet (p > 0,05). Im Gangtest 12 Wochen nach der Operation war die Schrittlänge des rechten Rückfußes in der Bandschnittgruppe im Vergleich zur Scheingruppe im gleichen Zeitraum kürzer und der Unterschied statistisch signifikant (p < 0,01). Die Schrittlänge des rechten Rückfußes unterschied sich jedoch bei den Mäusen in der CL + ATFL-Gruppe nicht signifikant von der der Mäuse in der CL + DL-Gruppe (p > 0,05; Abbildung 2A,B).
Beurteilung der thermischen Nozizeption
Die statistische Analyse der thermischen Nozizeptionsreaktionszeit der Mäusefüße während der Aktivität zeigte, dass es keine statistischen Unterschiede in den Reaktionszeiten der drei Gruppen von Mäusen vor der Operation gab (p > 0,5). In der thermischen Nozizeptionsbeurteilung nach der Operation waren die thermischen Nozizeptionsreaktionszeiten der Mäuse in der Gruppe mit den Bändern länger als die der Mäuse in der Scheingruppe im gleichen Zeitraum, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,01; Abbildung 3).
Mikro-CT-Scans
Zwölf Wochen nach der Operation wurde der ASCJ des rechten Rückfußes bei den Mäusen in jeder Gruppe mittels Mikro-CT quantitativ analysiert. Die dreidimensionale Rekonstruktion der CT-Bilder zeigte, dass der ASCJ des rechten Rückfußes in den beiden Gruppen mit durchtrennten Bändern rauer war als in der Scheingruppe. Die Gelenkoberfläche war konkav, konvex und flach, es gab offensichtliche Verschleißspuren, Osteophyten bildeten sich um die Gelenke herum und die Gelenke zeigten degenerative Veränderungen. Darüber hinaus entwickelten etwa 28,6 % der Mäuse in der CL + DL-Gruppe eine Talusluxation (Abbildung 4A,B)10. Der Knochenvolumenanteil des ASCJ des rechten Rückfußes war in den Gruppen CL + ATFL und CL + DL signifikant höher als in der Scheingruppe, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,01; Abbildung 4C,D)10.
Schnittfärbung des Gelenkknorpels
Die grüne Färbung von H&E und Safranin O-fast zeigte, dass die Struktur des ASCJ der Mäuse in der Scheingruppe vollständig war, die Morphologie des Knorpels intakt war und die Chondrozyten gleichmäßig verteilt waren. Die Knorpelschicht des ASCJ der beiden Gruppen von Mäusen mit Bandschnitten zeigte eine offensichtliche Diskontinuität, und die Anzahl der Chondrozyten war verringert (Abbildung 5A,B)10. Das modifizierte Scoring-System der Mankin and Osteoarthritis Research Society International (OARSI) wurde verwendet, um die H&E- und Safranin-O-fast-Grünfärbung des ASCJ für die Mäuse in jeder Gruppe zu bewerten20,21,22. Der modifizierte Mankin-Score wurde durch die knorpelstrukturellen Merkmale und die Anzahl und Färbung der Chondrozyten bestimmt, und der OARSI-Score wurde durch den histopathologischen Grad und das Stadium des Knorpels bestimmt. Die Werte der beiden Gruppen von Mäusen mit Bänderamputation waren höher als die der Mäuse in der Scheingruppe, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,05; Abbildung 5C-F)10.
Bilder der typischen immunhistochemischen Typ-II-Kollagenfärbung zeigten, dass der Gehalt an Typ-II-Kollagen in der ASCJ-Gelenkknorpelschicht des rechten Rückfußes in der Scheingruppe gleichmäßiger war als der der beiden Gruppen von Mäusen mit durchtrennten Bändern, und es gab keinen offensichtlichen Verlust von Typ-II-Kollagen (Abbildung 6A). Die Ergebnisse der quantitativen Analyse zeigten, dass die Expression von Kollagen Typ II im ASCJ der Mäuse der Scheingruppe höher war als die der beiden Mäusegruppen mit durchtrennten Bändern, und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,05; Abbildung 6B,C).
Abbildung 1: Verhaltensanalyse der Mäuse mit Hilfe des Schwebebalkentests. (A) Zeit, die die Mäuse benötigen, um den Schwebebalken zu überqueren. (B) Die Anzahl der Ausrutscher des rechten Fußes beim Überqueren des Schwebebalkens. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar, n = 7 Proben pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Verhaltensanalyse der Mäuse mittels Fußabdruckanalyse. (A) Vergleich der Länge des rechten Schrittes für die Mäuse in jeder Gruppe vor der Operation. (B) Vergleich der Länge des rechten Schrittes für die Mäuse in jeder Gruppe 12 Wochen nach der Operation. Statistisch signifikante Unterschiede werden durch ** angezeigt, wobei p 0,01 <, und ***, wobei p 0,001 zwischen den angegebenen Gruppen <. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar, n = 7 Proben pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Verhaltensanalyse der Mäuse mit Hilfe des thermischen Nozizeptions-Assessments. Thermische Nozizeptionsreaktionszeiten während der Aktivität bei Mäusen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar, n = 7 Proben pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mikro-CT-Analyse des rechten Fußes einer Maus. (A) Dreidimensionale Rekonstruktion des Maustalus ohne Luxation im Knöchel-Subtalar-Gelenkkomplex (Seitenansicht, mediale Ansicht, anteriore Ansicht). (B) Dreidimensionale Rekonstruktion des dislozierten Maustalus im Knöchel-Subtalar-Gelenkkomplex (Seitenansicht, mediale Ansicht, anteriore Ansicht). (C) Quantitative Analyse der Knochenvolumenfraktion (BV/TV) der Mausknöchelgelenke. (D) Quantitative Analyse der Knochenvolumenfraktion (BV/TV) der subtalaren Mausgelenke. Die schwarzen Pfeile zeigen eine Osteophytenbildung oder Talusverrenkung an. Statistisch signifikante Unterschiede werden durch *** angezeigt, wobei p 0,001 zwischen den angegebenen Gruppen <. Diese Abbildung wurde von Liu et al.10 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: H&E und Safranin O-fast Grünfärbung und Analyse der Sprunggelenke. (A) H&E-Färbung der Maus-Sprunggelenk-subtalaren Gelenke. (B) Safranin-O-fast-Färbung der Sprunggelenke der Maus. (C) Modifizierte Mankin-Scores für die Maus-Knöchelgelenke. (D) Modifizierte Mankin-Scores für die subtalaren Gelenke der Maus. (E) Die Osteoarthritis Research Society International (OARSI) bewertet die Knöchelgelenke der Maus. (F) OARSI-Scores für die subtalaren Gelenke der Maus. Symbole: a = Sprunggelenk; s = subtalares Gelenk. Statistisch signifikante Unterschiede werden durch *** angezeigt, wobei p 0,001 zwischen den angegebenen Gruppen <. Maßstabsbalken = 100 μm, n = 7 Proben pro Gruppe. Diese Abbildung wurde von Liu et al.10 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Immunhistochemische Färbung und Analyse der Sprunggelenke. (A) Typ II Kollagen immunhistochemische Färbung des Mausknöchels und der subtalaren Gelenke. (B) Prozentsatz des Kollagen-II-Flächenverhältnisses (+) für die Knöchelgelenke der Maus. (C) Prozentsatz des Kollagen-II-Flächenverhältnisses (+) für die subtalaren Gelenke der Maus. Symbole: a = Sprunggelenk; s = subtalares Gelenk. Statistisch signifikante Unterschiede werden durch *** angezeigt, wobei p 0,001 zwischen den angegebenen Gruppen <. Maßstabsbalken = 100 μm, n = 7 Proben pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In dieser Studie wurden zwei Mausmodelle der ASCJ-Instabilität erfolgreich durch Transektion von CL + ATFL oder CL + DL konstruiert. Die Zeit, die die Mäuse benötigten, um den Schwebebalken zu passieren, erhöhte sich 8 Wochen und 12 Wochen nach der Operation signifikant, was den Ergebnissen ähnelt, die das Hubbard-Turner-Team durch Durchtrennen des seitlichen Bandes des Sprunggelenks erzielte23,24. Im Gleittest des rechten Fußes beobachteten wir, dass die Gleitzeiten der beiden Gruppen von Mäusen mit durchtrennten Bändern signifikant höher waren als die der Mäuse in der Scheingruppe, und die Gleitzeiten erreichten 12 Wochen nach der Operation ein Maximum, was darauf hindeutet, dass die beiden Gruppen von Mäusen mit durchtrennten Bändern an einer Instabilität des ASCJ gelitten haben könnten. Der Gangtest zeigte, dass, obwohl die Schrittlänge der Mäuse mit zunehmendem Alter allmählich zunahm, die 12-wöchigen Schrittlängen der beiden Gruppen von Mäusen mit durchtrennten Bändern niedriger waren als die der Scheingruppe und die Schrittlänge der CL + ATFL-Gruppe um 7,2 % geringer war als die der Scheingruppe. Zusammengenommen deuten die oben genannten Ergebnisse darauf hin, dass das motorische Niveau und die Gleichgewichtsfähigkeit der beiden Gruppen von Mäusen mit Bandamputation signifikant beeinträchtigt waren.
In der dreidimensionalen Rekonstruktion der CT-Bilder wurde beobachtet, dass die ASCJ-Gelenkoberfläche in den beiden Gruppen von Mäusen mit durchtrennten Bändern rauer war als die der Mäuse in der Scheingruppe, Osteophyten um die Gelenke herum gebildet wurden und der Knochenvolumenanteil des Gelenks erhöht war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der ASCJ-Gelenkknorpel in der Bandamputationsgruppe degenerative Läsionen aufwies. Die Färbung der Gelenkknorpelabschnitte zeigte eine Knorpeldegeneration, wie z.B. eine Diskontinuität der Knorpeloberfläche und eine Reduktion der Chondrozyten, was weiter bestätigte, dass sich eine langfristige ASCJ-Instabilität zu einer PTOA entwickeln könnte, was den von Chang et al.18 beschriebenen Ergebnissen ähnelt.
Bei der Etablierung des Modells liegt der Schlüssel zu einer erfolgreichen Modellierung darin, die entsprechenden Bänder zum Schneiden genau zu finden. Gleichzeitig kann eine moderate Steigerung der Aktivität der Mäuse die Entwicklung von Arthrose beschleunigen. Bei der anschließenden Färbung spielt die Entkalkung des Maus-Sprunggelenksgewebes eine entscheidende Rolle. Daher ist es notwendig, die Härte des Gewebes häufig zu beobachten und einen geeigneten Schnittzeitpunkt zu wählen.
In der Studie wurde ein Gangpapier verwendet, um die Veränderungen im Gang der Mäuse vor und nach der Operation zu analysieren, und es wurden nur Veränderungen in der Schrittlänge der Mäuse erzielt. Wenn ein tierisches Ganganalysegerät verwendet würde, könnten mehr Parameter entsprechend der Größe und Fläche, der Position, der Bewegungsdynamik und des Drucks jedes Schrittes der Mäuse analysiert werden, um den Gang qualitativ und quantitativ zu analysieren. Darüber hinaus ist die monofile Detektion von Semmes Weinstein international als eine sehr effektive Methode zur Erkennung von sensorischen Störungen des Berührungsdrucksanerkannt 25, und bessere experimentelle Ergebnisse können erzielt werden, wenn diese Methode verwendet wird, um die sensorische Funktion der Füße der Mäuse zu bewerten. Aufgrund der begrenzten Versuchsbedingungen und der Nichtverfügbarkeit von Instrumenten zur Ganganalyse von Tieren wurde die monofile Detektion von Semmes Weinstein jedoch nicht verwendet. Daher gibt es in Zukunft die Möglichkeit, diese experimentellen Techniken eingehend zu untersuchen.
Da es sich bei der PTOA um eine chronisch degenerative Erkrankung handelt26, sollten Gelenkinstabilität und Knorpelschäden zu unterschiedlichen Zeitpunkten beobachtet werden, was in Zukunft weitere Langzeit- und Mehrzeitstudien wert ist. Darüber hinaus konnten die Chondrozyten aufgrund der geringen Struktur des Maus-ASCJ nicht für In-vitro-Experimente extrahiert werden, um die Veränderungen der Entzündungsfaktoren zu bewerten und die Existenz von PTOA auf zellulärer Ebene zu überprüfen. In zukünftigen Studien wird mehr Zeit und Energie darauf verwendet, die zugrundeliegenden molekularbiologischen Mechanismen der ASCJ-Degeneration zu untersuchen. Zweitens, obwohl die Struktur der Hinterfüße und Knöchel von Mäusen der des Menschen ähnelt, sind Mäuse streng genommen Vierbeiner, während Menschen Zweibeiner sind, und die Kräfte, denen die Gelenke während der Bewegung ausgesetzt sind, sind nicht genau die gleichen.
Die erfolgreiche Etablierung des ASCJ-Instabilitäts-Mausmodells erweitert jedoch das einfache Sprunggelenkinstabilitäts-Tiermodell auf das ASCJ-Instabilitäts-Tiermodell, das ein umfassenderes Verständnis des Mechanismus der Fußinstabilität liefert und ein neues Verständnis für die Untersuchung klinischer Fußerkrankungen sowie ein Tiermodell für die Diagnose und Behandlung der Erkrankung liefert.
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Disclosures
Keiner der Autoren hat gegensätzliche Interessen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch das Stipendienprogramm der Provinzregierung von Jiangsu und die Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
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