Summary
Ankel-subtalar komplekset led (ASCJ) er kernen i foden og spiller en central rolle i balancekontrol i daglige aktiviteter. Sportsskader fører ofte til ustabilitet i dette led. Her beskriver vi en musemodel af ligamenttranssektionsinduceret ustabilitet af ASCJ.
Abstract
Ankelforstuvninger er måske de mest almindelige sportsskader i dagligdagen, hvilket ofte resulterer i ustabilitet i ankel-subtalar komplekst led (ASCJ) og kan i sidste ende føre til posttraumatisk slidgigt (PTOA) på lang sigt. På grund af skademekanismens kompleksitet og de kliniske manifestationer, såsom ekkymose, hæmatom eller ømhed i sidefoden, er der imidlertid ingen klinisk konsensus om diagnosticering og behandling af ASCJ-ustabilitet. Da muskuloskeletalstrukturen af knogler og ledbånd i musens bagfod er sammenlignelig med menneskers, blev en dyremodel af ASCJ-ustabilitet hos mus etableret ved transsektion af ledbånd omkring ASCJ. Modellen blev godt valideret gennem en række adfærdsmæssige tests og histologiske analyser, herunder en balancestråletest, en fodaftryksanalyse (en vurdering af træningsniveau og balanceevne hos mus), en termisk nociceptionsvurdering (en vurdering af fodsensorisk funktion hos mus), mikrocomputertomografi (CT) scanning og sektionsfarvning af ledbrusk (en vurdering af ledbruskskader og degeneration hos mus). Den vellykkede etablering af en musemodel for ASCJ-ustabilitet vil give en værdifuld reference til klinisk forskning i skademekanismen og resultere i bedre behandlingsmuligheder for ankelforstuvning.
Introduction
Ankelforstuvninger er en af de mest almindelige sportsskader på verdensplan. Det anslås, at 10.000 mennesker kommer til skade dagligt i USA1, hvoraf sportsrelaterede skader tegner sig for 15%-45%2. De medicinske omkostninger forbundet med behandling af ankelforstuvninger i USA beløber sig til 4,2 milliarder dollars årligt 3,4,5. Kronisk fod ustabilitet er et almindeligt problem efter ankel forstuvninger og forekommer i ca. 74% af ankel forstuvninger6, herunder ankel eller subtalar ustabilitet. På grund af de lignende kliniske symptomer og tegn er det imidlertid vanskeligt for medicinsk personale at skelne mellem, om kronisk ankelstabilitet også ledsages af kronisk subtalar ledstabilitet i klinikken, og som følge heraf kan kronisk subtalar ustabilitet let gå glip af. Derfor kan den sande forekomst af kronisk ustabilitet i ankel-subtalar komplekst led (ASCJ) (en specifik type kronisk fodstabilitet, der omfatter både kronisk ankelstabilitet og kronisk subtalar ustabilitet) være højere end rapporteret 7,8,9. Hvis venstre ubehandlet, kronisk ankel-subtalar kompleks fælles ustabilitet kan forårsage gentagne ankel forstuvninger, hvilket fører til en ond cirkel af ankel forstuvninger og kronisk ankel-subtalar kompleks ustabilitet. Langvarig kronisk ankel-subtalar kompleks ustabilitet kan føre til degeneration af ASCJ og posttraumatisk slidgigt, som kan påvirke de tilstødende led i alvorlige tilfælde10. For disse sygdomme er den nuværende kliniske behandling hovedsageligt konservativ ud over kirurgiske behandlingsmetoder såsom ligamentreparation og ligamentrekonstruktion11,12.
ASCJ er fodens kernestruktur og opretholder kroppens balance under bevægelse13. Omfattende forskning er blevet udført på strukturen af ankelleddet og det subtalære led separat14,15,16,17. Forskning på hele ankel-subtalar leddet er imidlertid sjælden. Omkring en fjerdedel af tilfældene af ankelskade er forbundet med subtalar ledskade18. På grund af den komplekse skademekanisme ved ASCJ-ustabilitet er der ingen konsensus om diagnosticering og behandling af det i den kliniske indstilling. I betragtning af den nuværende situation med ankelskader i klinikken er der behov for en mere videnskabelig metode til at studere ankel- og subtalarleddet som helhed og derved give en ny forståelse for at studere fodsygdomme.
Da den anatomiske struktur af musens bagfod på muskuloskeletalniveau er sammenlignelig med den menneskelige fods 19, er musemodeller til fod-/ankelforskning allerede blevet implementeret i flere undersøgelser10,19. Chang et al.19 udviklede med succes tre forskellige musemodeller af ankelartrose. Inspireret af den vellykkede etablering af ankelstabilitet i musemodellen etablerede vi en musemodel for ankel-subtalar kompleks ustabilitet, idet vi antog, at transsektionen af de partielle ledbånd i musens bagfod ville resultere i mekanisk ustabilitet af ASCJ, hvilket ville føre til posttraumatisk slidgigt (PTOA) i ASCJ. ASCJ ustabilitet dyremodellen kunne bruges til behandling af både ankel ustabilitet og subtalar ustabilitet, hvilket er mere i overensstemmelse med den faktiske kliniske situation end den aktuelt anvendte simple ankel ustabilitet model 7,8,9,19. For at teste denne hypotese blev to musemodeller af ligamenttranssektionsinduceret ustabilitet af ASCJ designet. Resultaterne for sensorisk motorisk funktion - balancestråletesten, fodaftryksanalyse og termisk nociceptionsvurdering - blev brugt til at evaluere modelens gennemførlighed, og mikrocomputertomografi (CT) og histologisk farvning blev brugt til at evaluere skaden og degenerationen af museledbrusk. Den vellykkede etablering af en musemodel af ASCJ-ustabilitet giver ikke kun en ny forståelse for at studere fodsygdomme, men giver også en værdifuld reference til klinisk forskning i de skaderelaterede mekanismer, giver bedre behandlingsmuligheder for ankelforstuvninger og er nyttig til yderligere undersøgelser af sygdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Soochow University.
1. Kirurgiske procedurer
- Opdel 21, 6 uger gamle C57BL/6 hanmus i tre grupper: det tværgående cervikale ledbånd og den forreste talofibulære ligamentgruppe, det tværgående cervikale ledbånd og deltoidledbåndsgruppen og den falske kirurgigruppe. Sørg for, at alle musene blev opdrættet i et miljø, der opfylder specifikke patogenfrie (SPF) standarder.
- Akklimatisere musene til det nye opdrætsmiljø (en lys/mørk cyklus på 12 timer/12 timer og en konstant temperatur og fugtighed på henholdsvis 18-22 °C og 40%-70%) i 2 uger før forsøget. Udsæt musene for balancestråle- og gangtræning, der går fra den ene ende af en balancebjælke eller U-formet rør til den anden ende uden at stoppe, 1 uge før eksperimentet.
- I en alder af 8 uger bedøves musen ved hjælp af isofluranindånding ved at fugte en vatronkugle med 2 ml isofluran og placere den i en lufttæt beholder for fuld fordampning. Overvåg musens aktivitet og fortsæt indåndingen, indtil musens aktivitet er reduceret betydeligt. Bestem dybden af anæstesi ved at klemme musenes tæer for at observere deres reaktioner. Indånd fordampet isofluran (2%) gennem en ansigtsmaske for at opretholde anæstesi hos mus under efterfølgende operationer. Brug veterinær øjensalve under anæstesi for at forhindre øjnene i at tørre.
- Efter bedøvelse skal du fjerne håret på ankelleddet på musens højre bagben med en barbermaskine og desinficere den udsatte hud tre gange med skiftevis runder af jodbomuldskugler og alkoholbomuldskugler. Administrer 5 mg/kg carprofen ved subkutan injektion. Overfør musen til mikrokirurgisk operationsstue ved hjælp af en steril kirurgisk pude.
- For det tværgående cervikale ledbånd og forreste talofibulære ledbånd (CL + ATFL) gruppe, lav et 7 mm skråt nedadgående langsgående snit med en skalpel på huden over højre ankelled og sonde med mikroskopiske lige tang foran ankelleddet.
- Sørg for eksponering af ATFL ved den nedre kant af taluslegemet og fibula efter sondering og skær det forsigtigt med en skalpel. Adskil de lange og korte fibulære sener og extensor digitorum longus sener, udsæt CL og skær den med en skalpel.
- For den tværgående CL + deltoide ligamentgruppe (DL) skal du lave et 8 mm lodret snit på den mediale hud på højre ankelled og direkte adskille DL fra den mediale malleolus for endelig at skære den. Klip derefter CL som beskrevet i trin 1.5.
- For sham-gruppen (skinkirurgigruppe) skal du udføre skinkirurgi på højre ankelled, men ikke skære nogen ledbånd.
- Skyl snittet med sterilt normalt saltvand og sutur det med 5-0 kirurgisk nylontråd. Til sidst desinficeres det suturerede snit med en jodbomuldskugle.
- Hold musen under observation, indtil den kan opretholde brystliggende, og overvåg, indtil den er fuldt bevidst. Desinficer ankelsnittet to gange dagligt med en jodvatkugle og administrer carprofen (5 mg/kg, subkutan injektion) en gang dagligt i 1 uge. Bageste alene efter operationen, og vær meget opmærksom på musens postoperative tilstand.
- To uger efter operationen, og når hævelsen af ankelleddet er reduceret, skal du begynde at træne musene i musens roterende træthedsmaskine i 1 time hver dag.
2. Test af balancebom
- Klem en cirkulær træbjælke med en længde på 1 m og en diameter på 20 mm, skrånende 15° i den ene ende, med en fotostativclips, og placer den anden ende på en arbejdsflade, der er forbundet med en lukket kassette.
- Udfør balancestråletræning 1 uge før operationen for at sikre, at musene bevæger sig jævnt fra den ene ende af strålen til den anden. Overvej en mus at have bestået testen, når den passerer gennem strålen to gange på 60 s uden pause.
- Udfør to på hinanden følgende forsøg for hver mus, og sprøjt balancestrålen med 75% alkohol efter hvert forsøg for at forhindre, at den resterende lugt fra den forrige mus påvirker den næste mus.
- Udfør balancestråletesten præoperativt, 3 dage, 1 uge, 4 uger, 8 uger og 12 uger efter operationen. Registrer den gennemsnitlige tid for hver mus, der passerer balancebjælken to gange i træk, og antallet af gange, højre bagfod glider af strålen som afhængige variabler.
3. Analyse af fodaftryk
- Placer en U-formet plastkanal med en længde på 50 cm, en bredde på 10 cm og en højde på 10 cm på forsøgsbordet, og tilslut den ene ende af plastkanalen til en lukket kassette.
- Placer et almindeligt pigmentpapir fladt i kanalen, og hold derefter musen med begge hænder og mal deres for- og bagfødder jævnt med giftfrit rødt og grønt pigment.
- Placer den malede mus forsigtigt i den ene ende af kanalen, og lad dem bevæge sig til den anden ende af kassetten. Tag det pigmenterede papir med fodsporene ud, markér det, og læg det på en rist for at tørre på et ventileret og skyggefuldt sted.
- Når hver mus er gået, sprøjtes den U-formede plastkanal med 75% alkohol for at forhindre, at den forrige mus' resterende lugt påvirker den næste mus.
- Vælg tre på hinanden følgende tydelige musefodspor på hvert papir, og brug en lineal til at måle trinlængden af fodaftrykket på musens højre fod samt trinbredden mellem venstre og højre fodaftryk.
4. Vurdering af termisk nociception
- Under eksperimentet skal du bruge plantartesten til at registrere musefodens termiske nociceptionsreaktionstid og musens reaktionstid under henholdsvis aktivitet og hvile. Registrer måledataene på få sekunder.
- Placer musen i måleinstrumentet, juster instrumentet med dets højre fod, og begynd at opvarme instrumentet, mens temperaturen stiger langsomt. Overhold musens reaktion. Når temperaturen stiger over tolerancen, vil musen hurtigt trække sig tilbage eller slikke sin højre fod. Registrer tiden ved hjælp af instrumentet, og definer tiden som reaktionstiden under aktiviteten.
- For at måle reaktionstiden i hvile skal du lade musen sidde i 30 minutter på hvilebordet uden opvarmning og derefter hente tidsdataene som forklaret i trin 4.2. Brug disse erhvervede tidsmæssige data til efterfølgende analyse.
5. Mikro-CT-scanning
- Aflive 12 uger gamle mus med kuldioxid postoperativt, skræl huden på deres højre ankler af, og skær derefter deres midterste skinneben og fibula med kirurgisk saks for at opnå komplette ankelprøver. Prøverne anbringes i mærkede 15 ml centrifugeglas indeholdende 10% neutralt formalin i 48 timer.
- Efter fiksering placeres prøverne i batches (fire prøver pr. Batch) i en speciel svampetank til mikro-CT-scanning. Indstil maskinparametrene som følger: spænding = 50 kV, strøm = 200 mA, filter = 0,5 mmAl og opløsning = 9 μm. Kør mikro-CT-scanneren.
- Efter scanning skal du bruge rekonstruktionssoftwaren til at afgrænse billedets rækkevidde og vælge en bestemt vinkelposition efter justering af XYZ-aksen for det afgrænsede billede ved hjælp af kommerciel dataanalysesoftware som beskrevet i Liu et al.10.
- Brug mikro-CT-analysesoftware til at vælge kontinuerlige 10-lags regioner af interesse i de omstrukturerede billeder justeret af XYZ-akserne og kvantitativt analysere de nødvendige led for at bestemme knoglevolumenfraktionen (BV / TV), som beskrevet i Liu et al.10.
- Endelig skal du bruge tredimensionel medicinsk billedbehandlingssoftware til at udføre tredimensionel CT-billedbehandling af musens ankelled, som beskrevet i Liu et al.10. Efter genopbygning skal du observere slid og dannelse af osteofytter i ASCJ.
6. Sektionfarvning af ledbrusk
BEMÆRK: Alle farvningstrin udføres i en stinkhætte, og der bæres en maske under proceduren.
- Brug mikroskopisk pincet og saks til at fjerne overskydende blødt væv omkring ankelprøverne, og anbring derefter prøverne i et centrifugerør indeholdende 10% EDTA-afkalkningsopløsning fremstillet med 44 g NaOH, to pakninger PBS og 400 g EDTA-2Na, med pH justeret til 7,35-7,45 med saltsyre, og marker de forskellige grupper.
- Derefter anbringes centrifugerøret på et rystebord (hastighed indstillet til 20 o / min) til afkalkning, og afkalkningsopløsningen skiftes en gang dagligt. Bestem afkalkningen af prøverne.
- Efter 1 måneds afkalkning dehydreres prøverne med gradientalkohol, og derefter anvendes n-butanol i 8 timer til rydningsformål. Til sidst nedsænkes de ryddede prøver i paraffin i koronal position til indlejring.
- Paraffinprøverne anbringes i køleskab ved 4 °C til senere brug. Før sektionering tages prøverne fra køleskabet på 4 °C og anbringes i en fryser til -20 °C i ca. 10 minutter for at lette skæringen af hele planet.
- Fastgør prøverne på mikrotomet og skær dem i en tykkelse på 6 μm. Brug samtidig et mikroskop til at observere, om prøverne er skåret på det forventede niveau - let indtrængning af en sprøjtenål i knoglevævet.
- Juster tabletmaskinens vandtemperatur til 40 °C på forhånd. Skær derefter to til tre komplette paraffinsektioner i træk og overfør dem til tabletmaskinen for fuld ekspansion. Fjern derefter paraffinsektionerne med et glasglas og dræn vandet. Til sidst skal du markere diasene med grupper og tal.
7. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning
- Sektionerne anbringes i en 60 °C inkubator på en sådan måde, at den intakte ASCJ-ledstruktur kan observeres under mikroskopet, og sektionerne bages i 40-50 min. Derefter afvokses sektionerne med xylen 3x, nummereret som I, II og III for nem identifikation, i henholdsvis 15 min, 15 min og 10 min.
- Placer de afvoksede sektioner i 100% ethanol 2x, nummereret som I og II for nem identifikation, 90% ethanol og 80% ethanol i henholdsvis 3 min, 3 min, 5 min og 5 min. Derefter vaskes sektionerne med dobbeltdestilleret vand (ddH2O) i 5 min.
- Efter blødning med hæmatoxylin i 1 min, vask sektionerne med ddH2O, indtil de bliver farveløse. Blødgør sektionerne i 1% syreethanoldifferentieringsopløsning i 30 s og vask dem 3x i 1 min med ddH2O. Derefter plettes sektionerne med 1% ammoniakopløsning i 1 min, og vask derefter 3x i 1 min hver med ddH2O.
- Plet derefter prøverne med eosinfarvningsopløsning i 1 min, og kom dem derefter i 95% ethanol og 100% ethanol i 1 min hver efter hinanden. Til sidst behandles sektionerne med xylen IV i 1 min.
- Lufttør sektionerne, indsæt en dråbe neutral harpiks på prøverne på diasene, og dæk dem med en dækseddel. Tag derefter billeder med et opretstående fluorescensmikroskop i brightfield ved 5x og 20x.
8. Safranin O-hurtig grøn farvning
- Placer de udvalgte sektioner i en 60 °C inkubator og bag sektionerne i 40-50 min. Derefter afvokses sektionerne med xylen I, II og III i henholdsvis 15 min, 15 min og 10 min.
- Placer de afvoksede sektioner i 100% ethanol I, II, 90% ethanol og 80% ethanol i henholdsvis 3 min, 3 min, 5 min og 5 min. Vask derefter sektionerne med ddH2O i 5 min.
- Efter blødning med hæmatoxylin i 1 min, vask sektionerne med ddH2O, indtil de bliver farveløse. Blødgør sektionerne i 1% syreethanoldifferentieringsopløsning i 30 s og vask dem 3x i 1 min med ddH2O. Plet derefter sektionerne med 1% ammoniakopløsning i 1 min, og vask dem 3x i 1 min hver med ddH2O.
- Blødgør sektionerne i 0,05% fast green i 2 min, efterfulgt af blødgøring af sektionerne i 1% eddikesyreopløsning i 30 s og i 0,1% safranin i 5 min. Anbring de farvede prøver i 95% ethanol og 100% ethanol i 1 min, den ene efter den anden.
- Til sidst behandles sektionerne med xylen IV i 1 min. Lufttør sektionerne, indsæt en dråbe neutral harpiks på prøverne på diasene, og dæk dem med en dækseddel. Tag derefter billeder med et opretstående fluorescensmikroskop i brightfield ved 5x og 20x.
9. Immunhistokemi
- Dag 1: Placer de udvalgte sektioner i en 60 °C inkubator, bag sektionerne i 40-50 min, og voks dem derefter med xylen I, II og III i henholdsvis 15 min, 15 min og 10 min. Placer de afvoksede sektioner i 100% ethanol I, II, 90% ethanol og 80% ethanol i henholdsvis 3 min, 3 min, 5 min og 5 min. Derefter vaskes sektionerne med ddH2O i 5 minutter, brug en histokemisk pen til at cirkulere prøveområdet, og læg dem i en mørk kasse.
- Antigenudtagning: Drop 20-50 μL 0,25% trypsin i det cirklede prøveområde, inkuber i en 37 °C inkubator i 60 min, og vask derefter prøverne 3x i 2 minutter hver med PBS. Bloker endogen peroxidase ved at tilsætte 3%H2O2, inkuber prøverne i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke, og vask dem derefter 3x i 2 minutter hver med PBS. Udfør serumblokering ved at tilsætte 10% gedeserum ved stuetemperatur i 20 minutter, og inkuber derefter med det primære antistof (museanti-mus type II kollagen, fortyndet 1.000 gange) ved 4 °C natten over.
- Dag 2: Opvarm sektionerne igen ved stuetemperatur i 30 min. Genvind det primære antistof og vask sektionerne 3x i 2 minutter hver med PBS. Inkuber med det sekundære antistof i 40 minutter i en inkubator ved 37 °C, og vask derefter sektionerne 3x i 2 minutter hver med PBS.
- DAB-farveudvikling: Tilsæt 5 ml ddH 2 O,to dråber buffer, fire dråber DAB og to dråber H2O2 for at forberede DAB-reagenset. Tilsæt 20-50 μL reagens til sektionerne, hold prøverne beskyttet mod lys i 5 min, og vask derefter sektionerne i 2 minutter med ddH2O.
- Efter blødning med hæmatoxylin i 1 min, vask sektionerne med ddH2O, indtil de bliver farveløse. Blødgør sektionerne i 1% syreethanoldifferentieringsopløsning i 30 s og vask dem 3x i 1 min hver med ddH 2 O. Pletsektionerne i 1 min med 1% ammoniakopløsning, og vask dem derefter 3x i 1 min hver med ddH2O.
- Placer derefter sektionerne i henholdsvis 95% ethanol og 100% ethanol i 1 min hver. Til sidst inkuberes sektionerne i 1 min med xylen IV. Lufttør sektionerne, indsæt en dråbe neutral harpiks på prøverne på diasene, og dæk dem med en dækseddel. Tag derefter billeder med et opretstående fluorescensmikroskop i brightfield ved 5x og 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den statistiske analyse af korrelationsdataene blev udført ved hjælp af online statistiske analyseværktøjer. De data, der opfyldte de to test af normalfordeling og varianshomogenitet, blev brugt til yderligere statistisk analyse ved envejsanalyse af varians. Hvis dataene ikke opfyldte de to tests, blev Kruskal-Wallis-testen brugt til den statistiske analyse. Dataene udtrykkes som gennemsnittet ± standardafvigelse (SD), og p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Test af balancebom
Den statistiske analyse af den gennemsnitlige tid, det tager for hver mus at passere balancebjælken to gange i hvert trin, viste, at der ikke var nogen statistiske forskelle i den tid, det tog for hver gruppe mus at passere balancebjælken før operationen (p = 0,73). Tre dage efter operationen krævede musene i CL + ATFL- og CL + DL-grupperne længere tid at passere gennem balancebjælken sammenlignet med musene i sham-gruppen, og forskellen var statistisk signifikant (p < 0,05). Fire uger efter operationen blev der ikke observeret signifikante forskelle i den tid, det tog mus i CL + ATFL- og CL + DL-grupperne at passere balancebjælken sammenlignet med musene i sham-gruppen (p > 0,05). Desuden krævede musene i CL + ATFL- og CL + DL-grupperne 8 uger og 12 uger efter operationen mere tid til at passere balancebjælken sammenlignet med musene i sham-gruppen, og forskellen var statistisk signifikant (p < 0,01). Der blev ikke observeret statistisk signifikante forskelle i den tid, det tog musene i CL + ATFL-gruppen at passere balancebjælken sammenlignet med musene i CL + DL-gruppen i hver testperiode (p > 0,05; Figur 1A).
Antallet af gange, musens højre bagfod gled gennem balancebjælken, var ikke statistisk forskelligt mellem de tre grupper af mus før operationen (p = 0,68). Desuden blev der ikke observeret signifikante forskelle i antallet af sektioner af højre bagfod for musene i CL + ATFL og CL + DL grupperne sammenlignet med mus i sham-gruppen 3 dage efter operationen. Med hensyn til andre postoperative tidspunkter var antallet af sektioner i ligamenttransektionsgruppen højere sammenlignet med musene i skingruppen, og forskellen var statistisk signifikant (p < 0,05). 8 uger og 12 uger efter operationen var antallet af gange, højre bagfod i CL + ATFL-gruppen gled af balancebjælken, højere end for musene i CL + DL-gruppen, og forskellen var statistisk signifikant (p < 0,05; Figur 1B).
Analyse af fodaftryk
Skridtlængden hos musene i hver gruppe steg med alderen, men ledbåndsskæring kunne forkorte skridtlængden. Der blev ikke observeret signifikante forskelle i trinlængden af højre bagfod mellem de tre grupper mus før operationen (p > 0,05). I gangprøven 12 uger efter operationen var trinlængden på højre bagfod i ledbåndssnitgruppen kortere sammenlignet med i skingruppen i samme periode, og forskellen var statistisk signifikant (p < 0,01). Skridtlængden af højre bagfod for musene i CL + ATFL-gruppen var imidlertid ikke signifikant forskellig fra den for musene i CL + DL-gruppen (p > 0,05; Figur 2A,B).
Vurdering af termisk nociception
Den statistiske analyse af den termiske nociceptionsresponstid for musenes fødder under aktivitet viste, at der ikke var nogen statistiske forskelle i reaktionstiderne for de tre grupper mus før operationen (p > 0,5). I den termiske nociceptionsvurdering efter operationen var responstiderne for termisk nociception for musene i ledbåndssnitgruppen længere end for musene i skingruppen i samme periode, og forskellen var statistisk signifikant (p < 0,01; Figur 3).
Mikro-CT-scanning
Tolv uger efter operationen blev mikro-CT brugt til kvantitativt at analysere ASCJ i højre bagfod for musene i hver gruppe. Tredimensionel rekonstruktion af CT-billederne viste, at ASCJ i højre bagfod i de to grupper med afskårne ledbånd var grovere end i sham-gruppen. Samlingsoverfladen var konkav, konveks og flad, der var tydelige slidmærker, osteofytter blev genereret omkring leddene, og leddene viste degenerative ændringer. Derudover udviklede ca. 28,6% af musene i CL + DL-gruppen talusdislokation (figur 4A, B)10. Knoglevolumenfraktionen af ASCJ i højre bagfod i CL + ATFL- og CL + DL-grupperne var signifikant højere end i skingruppen, og forskellen var statistisk signifikant (p < 0,01; Figur 4C,D)10.
Sektion farvning af ledbrusk
H&E og Safranin O-hurtig grøn farvning viste, at strukturen af ASCJ hos musene i shamgruppen var komplet, bruskens morfologi var intakt, og chondrocytterne var jævnt fordelt. Brusklaget i ASCJ hos de to grupper mus med ledbåndssnit viste tydelig diskontinuitet, og antallet af kondrocytter blev reduceret (figur 5A, B) 10. Det modificerede Mankin and Osteoarthritis Research Society International (OARSI) scoringssystem blev brugt til at score H&E og Safranin O-hurtig grøn farvning af ASCJ for musene i hver gruppe20,21,22. Den modificerede Mankin-score blev bestemt af bruskstrukturegenskaberne og antallet og farvningen af chondrocytterne, og OARSI-scoren blev bestemt af bruskens histopatologiske grad og stadium. Scorerne for de to grupper af mus med ledbåndamputation var højere end for musene i sham-gruppen, og forskellen var statistisk signifikant (p < 0,05; Figur 5C-F)10.
Billeder af typisk type II kollagen immunohistokemisk farvning viste, at indholdet af type II kollagen i ASCJ ledbrusklaget i højre bagfod i shamgruppen var mere ensartet end indholdet af de to grupper af mus med afskårne ledbånd, og der var ikke noget tydeligt tab af type II kollagen (figur 6A). Resultaterne af den kvantitative analyse viste, at ekspressionen af kollagen type II i ASCJ hos musene i sham-gruppen var højere end for de to grupper af mus med afskårne ledbånd, og forskellen var statistisk signifikant (p < 0,05; Figur 6B,C).
Figur 1: Adfærdsanalyse af musene ved hjælp af balancebomtesten . (A) Den tid, det tager musene at krydse balancebjælken. (B) Antallet af glidninger af højre fod ved passage af balancebommen. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige ± standardafvigelse, n = 7 prøver pr. gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Adfærdsanalyse af musene ved hjælp af fodaftryksanalyse. (A) Sammenligning af længden af højre fodtrin for musene i hver gruppe før operation. (B) Sammenligning af længden af højre fodtrin for musene i hver gruppe 12 uger efter operationen. Statistisk signifikante forskelle er angivet med **, hvor p < 0,01, og ***, hvor p < 0,001 mellem de angivne grupper. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige ± standardafvigelse, n = 7 prøver pr. gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Adfærdsanalyse af musene ved hjælp af termisk nociceptionsvurdering. Termisk nociception responstider under aktivitet hos mus. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige ± standardafvigelse, n = 7 prøver pr. gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Mikro-CT-analyse af en mus' højre fod. (A) Tredimensionel rekonstruktion af musetalus uden forskydning i ankel-subtalar ledkomplekset (lateral visning, medial visning, anterior visning). (B) Tredimensionel rekonstruktion af den forskudte musetalus i ankel-subtalarledskomplekset (lateral visning, medial visning, anterior visning). (C) Kvantitativ analyse af knoglevolumenfraktionen (BV/TV) i museankelleddene. (D) Kvantitativ analyse af knoglevolumenfraktionen (BV/TV) i musesubtalære led. De sorte pile angiver osteofytdannelse eller talusforskydning. Statistisk signifikante forskelle er angivet med ***, hvor p < 0,001 mellem de angivne grupper. Dette tal er ændret fra Liu et al.10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: H&E og Safranin O-hurtig grøn farvning og analyse af ankelleddene. (A) H&E-farvning af musens ankel-subtalære led. (B) Safranin O-hurtig farvning af musens ankel-subtalære led. (C) Modificerede Mankin-scorer for musens ankelled. (D) Modificerede Mankin-scorer for musens subtalære led. (E) Osteoarthritis Research Society International (OARSI) scorer for musens ankelled. (F) OARSI-score for musens subtalære led. Symboler: a = ankelled; s = subtalar led. Statistisk signifikante forskelle er angivet med ***, hvor p < 0,001 mellem de angivne grupper. Skalabjælke = 100 μm, n = 7 prøver pr. Gruppe. Dette tal er ændret fra Liu et al.10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Immunohistokemisk farvning og analyse af ankelleddene. A) Type II kollagen immunohistokemisk farvning af musens ankel og subtalære led. (B) Kollagen II (+) arealforhold procent for musens ankelled. (C) Kollagen II (+) arealforhold procent for musens subtalære led. Symboler: a = ankelled; s = subtalar led. Statistisk signifikante forskelle er angivet med ***, hvor p < 0,001 mellem de angivne grupper. Skalabjælke = 100 μm, n = 7 prøver pr. Gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev to musemodeller af ASCJ-ustabilitet konstrueret med succes ved at transektere CL + ATFL eller CL + DL. Musenes tid til at passere gennem balancebjælken steg signifikant 8 uger og 12 uger efter operationen, hvilket svarer til de resultater, Hubbard-Turner-teamet opnåede ved at skære det laterale ledbånd i ankelleddet23,24. I højre fodglidetest observerede vi, at glidetiderne for de to grupper mus med afskårne ledbånd var signifikant højere end for mus i sham-gruppen, og glidetiderne nåede maksimalt 12 uger efter operationen, hvilket tyder på, at de to grupper mus med afskårne ledbånd kan have lidt af ustabilitet i ASCJ. Gangtesten viste, at selvom musenes trinlængde gradvist steg med alderen, var de 12 ugers trinlængder for de to grupper mus med afskårne ledbånd lavere end for sham-gruppen, og trinlængden for CL + ATFL-gruppen var 7,2% mindre end for sham-gruppen. Samlet set tyder ovenstående resultater på, at motorniveauet og balanceevnen hos de to grupper mus med ledbåndamputation var signifikant nedsat.
I den tredimensionelle rekonstruktion af CT-billederne blev det observeret, at ASCJ-ledoverfladen i de to grupper af mus med afskårne ledbånd var grovere end musene i skingruppen, osteofytter blev dannet omkring leddene, og knoglevolumenfraktionen af leddet blev øget. Disse resultater tyder på, at ASCJ ledbrusk i ledbåndamputationsgruppen havde degenerative læsioner. Farvningen af ledbrusksektionerne viste bruskdegeneration, såsom diskontinuitet af bruskoverfladen og en reduktion af chondrocytter, hvilket yderligere verificerede, at langvarig ASCJ-ustabilitet kunne udvikle sig til PTOA, hvilket svarer til resultaterne beskrevet af Chang et al.18.
I processen med modeletablering er nøglen til vellykket modellering nøjagtigt at finde de tilsvarende ledbånd til skæring. Samtidig kan moderat forøgelse af musenes aktivitet fremskynde deres udvikling af slidgigt. I den efterfølgende farvningsproces spiller afkalkning af musens ankelvæv en afgørende rolle. Derfor er det nødvendigt ofte at observere vævets hårdhed og vælge en passende sektionstid.
I undersøgelsen blev et gangpapir brugt til at analysere ændringerne i musenes gang før og efter operationen, og der blev kun opnået ændringer i musenes trinlængde. Hvis der blev anvendt et instrument til analyse af dyregang, kunne flere parametre analyseres i henhold til størrelse og areal, position, bevægelsesdynamik og tryk for hvert trin i musene til kvalitativ og kvantitativ analyse af gangen. Derudover er Semmes Weinsteins monofilamentdetektion internationalt anerkendt som en meget effektiv metode til påvisning af sensoriske forstyrrelser ved berøringstryk25, og der kan opnås bedre eksperimentelle resultater, hvis denne metode anvendes til at evaluere musenes fødders sensoriske funktion. På grund af de begrænsede forsøgsbetingelser og manglende tilgængelighed af instrumenter til analyse af dyrenes gangarter blev Semmes Weinstein-monofilamentdetektionen imidlertid ikke brugt; Derfor er der muligheder for dybtgående undersøgelser ved hjælp af disse eksperimentelle teknikker i fremtiden.
Da PTOA er en kronisk degenerativ sygdom26, bør ledstabilitet og bruskskader observeres på forskellige tidspunkter, og dette er værd at foretage flere langsigtede og multi-time point undersøgelser i fremtiden. På grund af den lille struktur af musens ASCJ kunne chondrocytterne desuden ikke ekstraheres til in vitro-forsøg for at evaluere ændringerne i inflammatoriske faktorer og for at verificere eksistensen af PTOA på cellulært niveau. I fremtidige studier vil der blive brugt mere tid og energi på at studere de underliggende molekylærbiologiske mekanismer bag ASCJ-degeneration. For det andet, selvom strukturen af musens bagfødder og ankler ligner den hos mennesker, er mus strengt taget firbenede, mens mennesker er tobenede, og de kræfter, som leddene oplever under bevægelse, er ikke nøjagtigt de samme.
Den vellykkede etablering af ASCJ instability musemodellen udvider imidlertid den simple ankel ustabilitet dyremodel til ASCJ ustabilitet dyremodel, som giver en mere omfattende forståelse af mekanismen for fod ustabilitet og giver en ny forståelse for studiet af kliniske fodsygdomme samt en dyremodel til diagnose og behandling af sygdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har modstridende interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Jiangsu provinsregeringens stipendieprogram og Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
References
- Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
- Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
- Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
- Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
- Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
- Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
- Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
- Mittlmeier, T., Wichelhaus, A.
- Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
- Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
- Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
- Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
- Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
- Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
- Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
- Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
- Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
- Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
- Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
- Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
- Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
- Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
