Summary
Ankel-subtalar kompleksledd (ASCJ) er kjernen i foten og spiller en nøkkelrolle i balansekontroll i daglige aktiviteter. Idrettsskader fører ofte til ustabilitet i dette leddet. Her beskriver vi en musemodell av ligamenttranseksjon-indusert ustabilitet av ASCJ.
Abstract
Ankelforstuinger er kanskje de vanligste idrettsskadene i dagliglivet, noe som ofte resulterer i ustabilitet i ankelsubtalar kompleksledd (ASCJ), og kan til slutt føre til posttraumatisk slitasjegikt (PTOA) på lang sikt. På grunn av kompleksiteten i skademekanismen og de kliniske manifestasjonene, som ekkymose, hematom eller ømhet i sidefoten, er det imidlertid ingen klinisk konsensus om diagnostisering og behandling av ASCJ-ustabilitet. Siden muskel- og skjelettstrukturen til bein og leddbånd i musebakfoten er sammenlignbar med menneskers, ble en dyremodell av ASCJ-ustabilitet hos mus etablert ved transeksjon av leddbånd rundt ASCJ. Modellen ble godt validert gjennom en rekke atferdstester og histologiske analyser, inkludert en balansestråletest, en fotavtrykksanalyse (en vurdering av treningsnivå og balanseevne hos mus), en termisk nociceptionvurdering (en vurdering av fotsensorisk funksjon hos mus), mikrocomputertomografi (CT) skanning og seksjonsfarging av leddbrusk (en vurdering av leddbruskskader og degenerasjon hos mus). Den vellykkede etableringen av en musemodell av ASCJ-ustabilitet vil gi en verdifull referanse for klinisk forskning på skademekanismen og resultere i bedre behandlingsalternativer for ankelforstuing.
Introduction
Ankelforstuinger er en av de vanligste idrettsskadene over hele verden. Det er anslått at 10.000 mennesker blir skadet daglig i USA1, hvorav sportsrelaterte skader står for 15% -45%2. De medisinske kostnadene forbundet med behandling av ankelforstuinger i USA utgjør $ 4.2 milliarder årlig 3,4,5. Kronisk fotinstabilitet er et vanlig problem etter ankelforstuinger og forekommer i omtrent 74% av ankelforstuinger6, inkludert ankel- eller subtalar ustabilitet. På grunn av de lignende kliniske symptomene og tegnene er det imidlertid vanskelig for medisinsk personale å skille om kronisk ankelstabilitet også ledsages av kronisk subtalar leddstabilitet i klinikken, og som et resultat kan kronisk subtalar ustabilitet lett bli savnet. Derfor kan den sanne forekomsten av kronisk ankel-subtalar kompleks ledd (ASCJ) ustabilitet (en spesifikk type kronisk fotinstabilitet som inkluderer både kronisk ankelinstabilitet og kronisk subtalar ustabilitet) være høyere enn rapportert 7,8,9. Hvis venstre ubehandlet, kan kronisk ankel-subtalar kompleks leddstabilitet forårsake gjentatte ankelforstuinger, noe som fører til en ond sirkel av ankelforstuinger og kronisk ankel-subtalar kompleks ustabilitet. Langvarig kronisk ankel-subtalar kompleks ustabilitet kan føre til degenerasjon av ASCJ og posttraumatisk slitasjegikt, noe som kan påvirke tilstøtende ledd i alvorlige tilfeller10. For disse sykdommene er dagens kliniske behandling hovedsakelig konservativ, i tillegg til kirurgiske behandlingsmetoder som ligamentreparasjon og ligamentrekonstruksjon11,12.
ASCJ er kjernestrukturen i foten og opprettholder balansen i kroppen under bevegelse13. Det er utført omfattende forskning på strukturen i ankelleddet og subtalærleddetseparat 14,15,16,17. Imidlertid er forskning på hele ankel-subtalar ledd sjelden. Omtrent en fjerdedel av tilfellene av ankelskade er assosiert med subtalar leddskade18. På grunn av den komplekse skademekanismen for ASCJ-ustabilitet, er det ingen konsensus om å diagnostisere og behandle den i klinisk setting. Med tanke på den nåværende situasjonen for ankelskader i klinikken, er det behov for en mer vitenskapelig metode for å studere ankel- og subtalærleddet som helhet, og dermed gi en ny forståelse for å studere fotsykdommer.
Siden den anatomiske strukturen til musens bakfot på muskel- og skjelettnivå er sammenlignbar med den menneskelige foten 19, har musemodeller for fot-/ankelforskning allerede blitt implementert i flere studier10,19. Chang et al.19 utviklet tre forskjellige musemodeller av ankelartrose. Inspirert av den vellykkede etableringen av ankelinstabilitet i musemodellen, etablerte vi en musemodell for ankel-subtalar kompleks ustabilitet, hypoteser om at transeksjonen av de partielle leddbåndene i musens bakfot ville resultere i mekanisk ustabilitet av ASCJ, noe som ville føre til posttraumatisk slitasjegikt (PTOA) av ASCJ. ASCJ-dyremodellen for ustabilitet kan brukes til behandling av både ankelinstabilitet og subtalar instabilitet, som er mer i tråd med den faktiske kliniske situasjonen enn den for tiden brukte enkle ankelinstabilitetsmodellen 7,8,9,19. For å teste denne hypotesen ble to musemodeller av ligamenttranseksjon-indusert ustabilitet av ASCJ designet. Resultatene for sensorisk-motorisk funksjon - balansestråletesten, fotavtrykksanalysen og vurderingen av termisk nociception - ble brukt til å evaluere modellens gjennomførbarhet, og mikrocomputertomografi (CT) og histologisk farging ble brukt til å evaluere skaden og degenerasjonen av museleddbrusk. Den vellykkede etableringen av en musemodell av ASCJ-ustabilitet gir ikke bare en ny forståelse for å studere fotsykdommer, men gir også en verdifull referanse for klinisk forskning på skaderelaterte mekanismer, gir bedre behandlingsmuligheter for ankelforstuinger, og er nyttig for videre studier av sykdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene for pleie og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Soochow University.
1. Kirurgiske prosedyrer
- Del 21, 6 uker gamle C57BL/6 hannmus inn i tre grupper: det tverrgående cervikale ligamentet og den fremre talofibular ligamentgruppen, den tverrgående cervikale ligament- og deltoidligamentgruppen og sham kirurgigruppen. Sørg for at alle musene ble oppdratt i et miljø som oppfyller spesifikke patogenfrie (SPF) standarder.
- Akklimatiser musene til det nye oppdrettsmiljøet (en lys / mørk syklus på 12 t / 12 timer, og en konstant temperatur og fuktighet på henholdsvis 18-22 ° C og 40% -70%) i 2 uker før eksperimentet. Utsett musene for balansestråle- og gangtrening, gå fra den ene enden av en balansebjelke eller U-formet rør til den andre enden uten å stoppe, 1 uke før forsøket.
- I en alder av 8 uker, bedøv musen ved hjelp av isofluran inhalasjon ved å fukte en bomullsdott med 2 ml isofluran og plassere den i en lufttett beholder for full fordampning. Overvåk musens aktivitet og fortsett innåndingen til musens aktivitet er betydelig redusert. Bestem dybden av anestesi ved å klemme tærne til musene for å observere deres reaksjoner. Inhaler fordampet isofluran (2 %) gjennom en ansiktsmaske for å opprettholde anestesi hos mus under påfølgende operasjoner. Bruk veterinær øyesalve under anestesi for å forhindre at øynene tørker.
- Etter bedøvelse, fjern håret på ankelleddet på musens høyre bakre lemmer med en barbermaskin, og desinfiser den eksponerte huden tre ganger med vekslende runder med jodbomullsballer og alkoholbomullsballer. Administrer 5 mg/kg karprofen ved subkutan injeksjon. Overfør musen til mikrokirurgi dyr operasjonsstue ved hjelp av en steril kirurgisk pute.
- For den tverrgående cervikale ligament- og fremre talofibularligamentgruppen (CL + ATFL), lag et 7 mm skrått nedadgående lengdesnitt med en skalpell på huden over høyre ankelledd, og sonde med mikroskopiske rette tang foran ankelleddet.
- Sørg for eksponering av ATFL ved den nedre grensen til taluslegemet og fibulaen etter sondering og kutt den forsiktig med en skalpell. Skill de lange og korte fibulære senene og extensor digitorum longus senene, utsett CL, og kutt den med en skalpell.
- For den tverrgående CL + deltoid ligament (DL) gruppen, gjør et 8 mm vertikalt snitt på mediale huden på høyre ankelledd og skille DL fra mediale malleolus for endelig å kutte den. Deretter kutter du CL som beskrevet i trinn 1.5.
- For sham gruppen (sham kirurgi gruppe), utføre sham kirurgi på høyre ankel ledd, men ikke kutte noen leddbånd.
- Skyll snittet med sterilt normalt saltvann og sutur det med 5-0 kirurgisk nylontråd. Til slutt, desinfiser det suturerte snittet med en jod bomullsdboll.
- Hold musen under observasjon til den kan opprettholde sternal recumbency, og overvåke til den er fullt bevisst. Desinfiser ankelsnittet to ganger daglig med en jodbomullsdott og administrer carprofen (5 mg/kg, subkutan injeksjon), en gang daglig i 1 uke. Bak alene etter operasjonen, og vær nøye med musens postoperative tilstand.
- To uker etter operasjonen og når hevelsen i ankelleddet er redusert, begynn å trene musene i musens roterende tretthetsmaskin i 1 time hver dag.
2. Test av balansestråle
- Klem en sirkulær trebjelke med en lengde på 1 m og en diameter på 20 mm, skrått ved 15 ° i den ene enden, med en fotograferingsstativklipp, og plasser den andre enden på en arbeidsflate koblet til en lukket kassett.
- Utfør balansestråletrening 1 uke før operasjonen for å sikre at musene jevnt beveger seg fra den ene enden av strålen til den andre. Tenk deg at en mus har bestått testen når den passerer gjennom strålen to ganger på 60 s uten å stoppe.
- Utfør to påfølgende forsøk for hver mus og spray balansestrålen med 75% alkohol etter hvert forsøk for å forhindre at gjenværende lukt fra den forrige musen påvirker neste mus.
- Utfør balansestråletesten preoperativt, 3 dager, 1 uke, 4 uker, 8 uker og 12 uker etter operasjonen. Registrer gjennomsnittstiden for hver mus som passerer balansestrålen to ganger på rad, og antall ganger høyre bakfot glir av strålen som avhengige variabler.
3. Analyse av fotavtrykk
- Plasser en U-formet plastkanal med en lengde på 50 cm, en bredde på 10 cm og en høyde på 10 cm på eksperimentbordet og koble den ene enden av plastkanalen til en lukket kassett.
- Plasser et vanlig pigmentpapir flatt i kanalen, og hold musen med begge hender og mal for- og bakføttene jevnt med giftfritt rødt og grønt pigment.
- Plasser den malte musen forsiktig i den ene enden av kanalen og la dem bevege seg til den andre enden av kassetten. Ta det pigmenterte papiret med fotavtrykkene ut, merk det og legg det på en rist for å tørke på et ventilert og skyggefullt sted.
- Etter at hver mus har passert, spray den U-formede plastkanalen med 75% alkohol for å forhindre at den forrige musens gjenværende lukt påvirker neste mus.
- Velg tre påfølgende klare musefotavtrykk på hvert papir, og bruk en linjal til å måle trinnlengden på fotavtrykket til musens høyre fot, samt trinnbredden mellom venstre og høyre fotavtrykk.
4. Vurdering av termisk nociception
- Under forsøket, bruk plantartesten til å registrere den termiske nociceptionreaksjonstiden til musefoten og musens reaksjonstid under henholdsvis aktivitet og hvile. Registrer måledataene i løpet av sekunder.
- Plasser musen i måleinstrumentet, juster instrumentet med høyre fot, og begynn å varme opp instrumentet mens temperaturen øker sakte. Vær oppmerksom på musens respons. Når temperaturen øker over toleransen, vil musen raskt trekke seg ut eller slikke høyre fot. Registrer tiden ved hjelp av instrumentet og definer tiden som reaksjonstiden under aktiviteten.
- For å måle reaksjonstiden i hvile, la musen sitte i 30 minutter på hvilebordet uten oppvarming, og hent deretter tidsdataene som forklart i trinn 4.2. Bruk disse innhentede tidsmessige dataene for senere analyse.
5. Micro-CT-skanning
- Avlive 12 uker gamle mus med karbondioksid postoperativt, skrell av huden på høyre ankler, og kutt deretter midtre tibia og fibula med kirurgisk saks for å få komplette ankelprøver. Plasser prøvene i merkede 15 ml sentrifugerør inneholdende 10% nøytral formalin i 48 timer.
- Etter fiksering, plasser prøvene i grupper (fire prøver per batch) i en spesiell svamptank for mikro-CT-skanning. Still maskinens parametere som følger: spenning = 50 kV, strøm = 200 mA, filter = 0,5 mmAl, og oppløsning = 9 μm. Kjør micro-CT-skanneren.
- Etter skanning, bruk rekonstruksjonsprogramvaren til å avgrense bildeområdet, og velg en bestemt vinkelposisjon etter å ha justert XYZ-aksen til det avgrensede bildet ved hjelp av kommersiell dataanalyseprogramvare, som beskrevet i Liu et al.10.
- Bruk mikro-CT-analyseprogramvare til å velge kontinuerlige 10-lags regioner av interesse i de omstrukturerte bildene justert av XYZ-aksene, og kvantitativt analysere de nødvendige leddene for å bestemme beinvolumfraksjonen (BV / TV), som beskrevet i Liu et al.10.
- Til slutt, bruk tredimensjonal medisinsk bildebehandlingsprogramvare for å utføre tredimensjonal CT-bildebehandling av musens ankelledd, som beskrevet i Liu et al.10. Etter rekonstruksjon, observer slitasje og dannelse av osteofytter i ASCJ.
6. Seksjonsfarging av leddbrusk
NOTAT: Alle fargetrinnene utføres i en avtrekkshette, og en maske brukes under prosedyren.
- Bruk mikroskopisk pinsett og saks for å fjerne overflødig bløtvev rundt ankelprøvene, og legg deretter prøvene i et sentrifugerør som inneholder 10% EDTA-avkalkningsløsning fremstilt med 44 g NaOH, to pakker PBS og 400 g EDTA-2Na, med pH justert til 7,35-7,45 med saltsyre, og merk de forskjellige gruppene.
- Deretter plasserer du sentrifugerøret på et ristebord (hastighet satt til 20 o / min) for avkalking og endrer avkalkningsløsningen en gang per dag. Bestem avkalkningen av prøvene.
- Etter 1 måned med avkalkning, dehydrer prøvene med gradientalkohol og bruk deretter n-butanol i 8 timer for clearing. Til slutt, senk de ryddede prøvene i parafin i en koronal stilling for innebygging.
- Legg parafinprøvene i et kjøleskap på 4 °C for senere bruk. Før snitt, ta prøvene fra 4 °C kjøleskap og legg dem i en fryser på -20 °C i ca. 10 minutter for å lette skjæringen av hele planet.
- Fest prøvene på mikrotomen og seksjon dem med en tykkelse på 6 μm. Bruk samtidig et mikroskop for å observere om prøvene er kuttet på forventet nivå-lett penetrasjon av en sprøytenål i beinvevet.
- Juster vanntemperaturen på nettbrettmaskinen til 40 °C på forhånd. Deretter kutter du to til tre komplette parafinseksjoner på rad og overfører dem til nettbrettmaskinen for full utvidelse. Fjern deretter parafinseksjonene med en glasssklie og tøm vannet. Til slutt merker du lysbildene med grupper og tall.
7. Hematoksylin og eosin (H &E) farging
- Plasser seksjonene i en 60 ° C inkubator på en slik måte at den intakte ASCJ-leddstrukturen kan observeres under mikroskopet og bake seksjonene i 40-50 minutter. Deretter avvoks seksjonene med xylen 3x, nummerert som I, II og III for enkel identifisering, i henholdsvis 15 minutter, 15 minutter og 10 minutter.
- Plasser de avvokstede seksjonene i 100% etanol 2x, nummerert som I og II for enkel identifisering, 90% etanol og 80% etanol i henholdsvis 3 minutter, 3 minutter, 5 minutter og 5 minutter. Vask deretter seksjonene med dobbeltdestillert vann (ddH2O) i 5 minutter.
- Etter bløtlegging med hematoksylin i 1 min, vask seksjonene med ddH2O til de blir fargeløse. Bløtlegg seksjonene i 1% syreetanoldifferensieringsløsning i 30 s og vask dem 3x i 1 min med ddH2O. Deretter flekker du seksjonene med 1% ammoniakkløsning i 1 min, og vasker deretter 3x i 1 min hver med ddH2O.
- Deretter flekker du prøvene med eosinfargeløsning i 1 min, og legger dem deretter i 95% etanol og 100% etanol i 1 min hver etter hverandre. Til slutt, behandle seksjonene med xylen IV i 1 min.
- Lufttørk seksjonene, lim en dråpe nøytral harpiks på prøvene på lysbildene, og dekk dem med et deksel. Ta deretter bilder med et oppreist fluorescensmikroskop i lysfelt ved 5x og 20x.
8. Safranin O-rask grønn farging
- Legg de valgte seksjonene i en 60 °C inkubator og stek seksjonene i 40-50 min. Deretter smøres seksjonene med xylen I, II og III i henholdsvis 15 minutter, 15 minutter og 10 minutter.
- Plasser de avvokstede seksjonene i 100% etanol I, II, 90% etanol og 80% etanol i henholdsvis 3 minutter, 3 minutter, 5 minutter og 5 minutter. Vask deretter seksjonene med ddH2O i 5 minutter.
- Etter bløtlegging med hematoksylin i 1 min, vask seksjonene med ddH2O til de blir fargeløse. Bløtlegg seksjonene i 1% syreetanoldifferensieringsløsning i 30 s og vask dem 3x i 1 min med ddH2O. Beis deretter seksjonene med 1% ammoniakkløsning i 1 min, og vask dem 3x i 1 min hver med ddH2O.
- Bløtlegg seksjonene i 0,05% rask grønn i 2 minutter, etterfulgt av bløtlegging av seksjonene i 1% eddiksyreoppløsning i 30 s og i 0,1% safranin i 5 minutter. Legg de fargede prøvene i 95% etanol og 100% etanol i 1 min, den ene etter den andre.
- Til slutt, behandle seksjonene med xylen IV i 1 min. Lufttørk seksjonene, lim en dråpe nøytral harpiks på prøvene på lysbildene, og dekk dem med et deksel. Ta deretter bilder med et oppreist fluorescensmikroskop i lysfelt ved 5x og 20x.
9. Immunhistokjemi
- Dag 1: Plasser de valgte seksjonene i en inkubator på 60 °C, stek seksjonene i 40-50 minutter, og smør dem deretter med xylen I, II og III i henholdsvis 15 minutter, 15 minutter og 10 minutter. Plasser de avvokstede seksjonene i 100% etanol I, II, 90% etanol og 80% etanol i henholdsvis 3 minutter, 3 minutter, 5 minutter og 5 minutter. Vask deretter seksjonene med ddH2O i 5 minutter, bruk en histokjemisk penn til å sirkle området av prøven, og legg dem i en mørk boks.
- Antigenuthenting: Slipp 20-50 μL 0,25% trypsin inn i det sirklede prøveområdet, inkuber i en 37 ° C inkubator i 60 minutter, og vask deretter prøvene 3x i 2 minutter hver med PBS. Blokker endogen peroksidase ved å tilsette 3% H 2 O 2, inkuber prøvene i 10 minutter ved romtemperatur i mørket, og vask dem deretter 3x i2minutter hver med PBS. Utfør serumblokkering ved å tilsette 10 % geiteserum ved romtemperatur i 20 minutter, og inkuber deretter med det primære antistoffet (mus anti-mus type II kollagen, fortynnet 1000 ganger) ved 4 °C over natten.
- Dag 2: Varm opp seksjonene i romtemperatur i 30 min. Gjenvinn det primære antistoffet og vask seksjonene 3x i 2 minutter hver med PBS. Inkuber med sekundært antistoff i 40 minutter i en inkubator ved 37 °C, og vask deretter seksjonene 3x i 2 minutter hver med PBS.
- DAB-fargeutvikling: Tilsett 5 ml ddH 2 O,to dråper buffer, fire dråper DAB og to dråper H 2 O2for å forberede DAB-reagenset. Tilsett 20-50 μL reagens i seksjonene, hold prøvene beskyttet mot lys i 5 minutter, og vask deretter seksjonene i 2 minutter med ddH2O.
- Etter bløtlegging med hematoksylin i 1 min, vask seksjonene med ddH2O til de blir fargeløse. Bløtlegg seksjonene i 1% syreetanoldifferensieringsløsning i 30 s og vask dem 3x i 1 min hver med ddH2 O. Beis seksjonene i 1 min med 1% ammoniakkløsning, og vask dem deretter 3x i 1 min hver med ddH2O.
- Deretter plasserer du seksjonene i henholdsvis 95% etanol og 100% etanol i 1 min hver. Til slutt, inkuber seksjonene i 1 min med xylen IV. Lufttørk seksjonene, lim en dråpe nøytral harpiks på prøvene på lysbildene, og dekk dem med et deksel. Ta deretter bilder med et oppreist fluorescensmikroskop i lysfelt ved 5x og 20x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den statistiske analysen av korrelasjonsdataene ble utført ved hjelp av nettbaserte statistiske analyseverktøy. Dataene som oppfylte de to testene for normalfordeling og homogenitet av varians ble brukt til videre statistisk analyse ved enveis variansanalyse. Hvis dataene ikke oppfylte de to testene, ble Kruskal-Wallis-testen brukt til statistisk analyse. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), og p < 0,05 ble vurdert som statistisk signifikant.
Test av balansestråle
Den statistiske analysen av gjennomsnittlig tid som kreves for at hver mus skal passere gjennom balansestrålen to ganger i hvert trinn, viste at det ikke var statistiske forskjeller i tiden det tok for hver gruppe mus å passere balansestrålen før kirurgi (p = 0,73). Tre dager etter operasjonen krevde musene i CL + ATFL- og CL + DL-gruppene lengre tid for å passere gjennom balansestrålen sammenlignet med musene i humbuggruppen, og forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,05). Fire uker etter operasjonen ble det ikke observert noen signifikante forskjeller i tiden mus i CL + ATFL- og CL + DL-gruppene brukte på å passere balansestrålen sammenlignet med musene i narregruppen (p > 0,05). Videre, 8 uker og 12 uker etter operasjonen, trengte musene i CL + ATFL- og CL + DL-gruppene mer tid for å passere balansestrålen sammenlignet med musene i shamgruppen, og forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,01). Ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert i tiden musene i CL + ATFL-gruppen brukte på å passere balansestrålen sammenlignet med musene i CL + DL-gruppen i hver testperiode (p > 0,05; Figur 1A).
Antall ganger musens høyre bakfot gled gjennom balansebjelken var ikke statistisk forskjellig mellom de tre musegruppene før operasjonen (p = 0,68). Videre ble det ikke observert signifikante forskjeller i antall seksjoner av høyre bakfot for musene i CL + ATFL- og CL + DL-gruppene sammenlignet med mus i narregruppen 3 dager etter operasjonen. Når det gjelder andre postoperative tidspunkter, var antall seksjoner i ligamenttranseksjonsgruppen høyere sammenlignet med musene i narregruppen, og forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,05). 8 uker og 12 uker etter operasjonen var antall ganger høyre bakfot i CL + ATFL-gruppen gled av balansebjelken høyere enn hos musene i CL + DL-gruppen, og forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,05; Figur 1B).
Analyse av fotavtrykk
Skrittlengden til musene i hver gruppe økte med alderen, men ligamentavbrudd kunne forkorte skrittlengden. Det ble ikke observert signifikante forskjeller i skrittlengden på høyre bakfot mellom de tre musegruppene før kirurgi (p > 0,05). Ved gangtest 12 uker etter operasjon var skrittlengden på høyre bakfot i ligamentkuttgruppen kortere sammenliknet med i narregruppen i samme periode, og forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,01). Skrittlengden på høyre bakfot for musene i CL + ATFL-gruppen var imidlertid ikke signifikant forskjellig fra musene i CL + DL-gruppen (p > 0,05; Figur 2A,B).
Vurdering av termisk nociception
Den statistiske analysen av responstiden for termisk nociception for musens føtter under aktivitet viste at det ikke var statistiske forskjeller i reaksjonstidene til de tre gruppene mus før kirurgi (p > 0,5). I vurderingen av termisk nociception etter operasjonen var responstidene for termisk nociception hos musene i ligamentkuttgruppen lengre enn hos musene i narregruppen i samme periode, og forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,01; Figur 3).
Micro-CT-skanning
Tolv uker etter operasjonen ble mikro-CT brukt til å kvantitativt analysere ASCJ av høyre bakfot for musene i hver gruppe. Tredimensjonal rekonstruksjon av CT-bildene viste at ASCJ av høyre bakfot i de to gruppene med avkuttede leddbånd var grovere enn i narregruppen. Leddoverflaten var konkav, konveks og flat, det var tydelige slitemerker, osteofytter ble generert rundt leddene, og leddene viste degenerative forandringer. I tillegg utviklet ca. 28,6 % av musene i CL + DL-gruppen talusdislokasjon (figur 4A,B)10. Benvolumfraksjonen av ASCJ av høyre bakfot i CL + ATFL- og CL+DL-gruppene var signifikant høyere enn i narregruppen, og forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,01; Figur 4C,D)10.
Seksjonsfarging av leddbrusk
H&E og Safranin O-fast grønn farging viste at strukturen til ASCJ av musene i skamgruppen var fullført, bruskens morfologi var intakt, og kondrocyttene var jevnt fordelt. Brusklaget i ASCJ hos de to gruppene mus med ligamentkutt viste tydelig diskontinuitet, og antall kondrocytter ble redusert (figur 5A,B)10. Det modifiserte Mankin and Osteoarthritis Research Society International (OARSI) scoring systemet ble brukt til å score H &E og Safranin O-rask grønn farging av ASCJ for musene i hver gruppe20,21,22. Den modifiserte Mankin-skåren ble bestemt av bruskstrukturelle egenskaper og antall og farging av kondrocyttene, og OARSI-skår ble bestemt av den histopatologiske karakteren og stadiet av brusk. Skårene til de to gruppene mus med ligamentamputasjon var høyere enn hos musene i narregruppen, og forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,05; Figur 5C-F)10.
Bilder av typisk type II kollagen immunhistokjemisk farging viste at innholdet av type II kollagen i ASCJ-leddbrusklaget i høyre bakfot i narregruppen var mer ensartet enn for de to gruppene mus med avkuttede leddbånd, og det var ikke noe åpenbart tap av type II kollagen (figur 6A). Resultatene av den kvantitative analysen viste at ekspresjonen av kollagen type II i ASCJ av musene i humbuggruppen var høyere enn for de to gruppene mus med avskårne leddbånd, og forskjellen var statistisk signifikant (p < 0,05; Figur 6B,C).
Figur 1: Atferdsanalyse av musene ved hjelp av balansestråletesten . (A) Tid som kreves for musene å krysse balansestrålen. (B) Antall glipper på høyre fot når du krysser balansebjelken. Dataene representerer gjennomsnittet ± standardavvik, n = 7 utvalg per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Atferdsanalyse av musene ved hjelp av fotavtrykksanalyse. (A) Sammenligning av lengden på høyre fottrinn for musene i hver gruppe før kirurgi. (B) Sammenligning av lengden på høyre fottrinn for musene i hver gruppe 12 uker etter operasjonen. Statistisk signifikante forskjeller er angitt med **, hvor p < 0,01 og ***, hvor p < 0,001 mellom de angitte gruppene. Dataene representerer gjennomsnittet ± standardavvik, n = 7 utvalg per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Atferdsanalyse av musene ved hjelp av termisk nociceptionvurdering. Responstider for termisk nociception under aktivitet hos mus. Dataene representerer gjennomsnittet ± standardavvik, n = 7 utvalg per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mikro-CT-analyse av musens høyre fot. (A) Tredimensjonal rekonstruksjon av musetalus uten dislokasjon i ankel-subtalar leddkompleks (lateral visning, medialt syn, fremre syn). (B) Tredimensjonal rekonstruksjon av dislosert musetalus i ankel-subtalar leddkompleks (lateral visning, medialt syn, fremre syn). (C) Kvantitativ analyse av benvolumfraksjonen (BV/TV) i museankelleddene. (D) Kvantitativ analyse av benvolumfraksjonen (BV/TV) av subtalære ledd i mus. De svarte pilene indikerer osteofyttdannelse eller talusdislokasjon. Statistisk signifikante forskjeller er angitt med ***, hvor p < 0,001 mellom de angitte gruppene. Denne figuren er modifisert fra Liu et al.10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: H&E og Safranin O-fast grønn farging og analyse av ankelleddene. (A) H&E-farging av musens ankel-subtalære ledd. (B) Safranin O-rask farging av musens ankel-subtalære ledd. (C) Modifiserte Mankin-poeng for musens ankelledd. (D) Modifiserte Mankin-poeng for musens subtalære ledd. (E) Osteoarthritis Research Society International (OARSI) score for musens ankelledd. (F) OARSI-skår for musens subtalære ledd. Symboler: a = ankelleddet; s = subtalar ledd. Statistisk signifikante forskjeller er angitt med ***, hvor p < 0,001 mellom de angitte gruppene. Skalalinje = 100 μm, n = 7 prøver per gruppe. Denne figuren er modifisert fra Liu et al.10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 Immunhistokjemifarging og analyse av ankelleddene. (A) Type II kollagen immunhistokjemisk farging av musens ankel og subtalære ledd. (B) Kollagen II (+) arealforhold prosentandel for musens ankelledd. (C) Kollagen II (+) arealforhold prosentandel for musens subtalære ledd. Symboler: a = ankelleddet; s = subtalar ledd. Statistisk signifikante forskjeller er angitt med ***, hvor p < 0,001 mellom de angitte gruppene. Skalalinje = 100 μm, n = 7 prøver per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble to musemodeller av ASCJ-ustabilitet vellykket konstruert ved å transektere CL + ATFL eller CL + DL. Tiden for musene å passere gjennom balansestrålen økte betydelig etter 8 uker og 12 uker etter operasjonen, noe som ligner resultatene oppnådd av Hubbard-Turner-teamet ved å kutte det laterale ligamentet i ankelleddet23,24. I glidetesten for høyre fot observerte vi at glidetidene til de to gruppene mus med avskårne leddbånd var signifikant høyere enn hos mus i skamgruppen, og glidetidene nådde maksimalt 12 uker etter operasjonen, noe som tyder på at de to gruppene mus med avskårne leddbånd kan ha lidd av ustabilitet i ASCJ. Gangtesten viste at selv om trinnlengden til musene gradvis økte med alderen, var 12-ukers trinnlengdene til de to gruppene mus med avskårne leddbånd lavere enn i sham-gruppen, og trinnlengden til CL + ATFL-gruppen var 7,2% mindre enn for sham-gruppen. Samlet sett antyder resultatene ovenfor at motornivået og balanseevnen til de to gruppene mus med ligamentamputasjon var signifikant svekket.
I den tredimensjonale rekonstruksjonen av CT-bildene ble det observert at ASCJ-leddflaten i de to gruppene av mus med avskårne leddbånd var grovere enn musene i humbuggruppen, osteofytter ble dannet rundt leddene, og benvolumfraksjonen av leddet ble økt. Disse resultatene tyder på at ASCJ-leddbrusk i ligamentamputasjonsgruppen hadde degenerative lesjoner. Fargingen av leddbruskseksjonene viste bruskdegenerasjon, som diskontinuitet i bruskoverflaten og en reduksjon av kondrocytter, noe som videre bekreftet at langsiktig ASCJ-ustabilitet kunne utvikle seg til PTOA, som ligner resultatene beskrevet av Chang et al.18.
I prosessen med modelletablering er nøkkelen til vellykket modellering å nøyaktig finne de tilsvarende leddbåndene for kutting. Samtidig kan moderat økning av musens aktivitet akselerere utviklingen av slitasjegikt. I den etterfølgende fargeprosessen spiller avkalkning av musens ankelleddvev en avgjørende rolle. Derfor er det nødvendig å ofte observere hardheten til vevet og velge en passende seksjoneringstid.
I studien ble et gangpapir brukt til å analysere endringene i musens gang før og etter operasjonen, og bare endringer i musens trinnlengde ble oppnådd. Hvis et analyseinstrument for dyregang ble brukt, kunne flere parametere analyseres i henhold til størrelse og areal, posisjon, bevegelsesdynamikk og trykk for hvert trinn av musene for kvalitativ og kvantitativ analyse av gangen. I tillegg er Semmes Weinstein monofilamentdeteksjon internasjonalt anerkjent som en svært effektiv metode for å oppdage berøringstrykksensoriske forstyrrelser25, og bedre eksperimentelle resultater kan oppnås hvis denne metoden brukes til å evaluere sensorisk funksjon av musens føtter. På grunn av de begrensede eksperimentelle forholdene og utilgjengeligheten av analyseinstrumenter for dyregang, ble Semmes Weinstein-monofilamentdeteksjon imidlertid ikke brukt; Derfor er det muligheter for grundige studier ved hjelp av disse eksperimentelle teknikkene i fremtiden.
Siden PTOA er en kronisk degenerativ sykdom26, bør leddinstabilitet og bruskskade observeres på forskjellige tidspunkter, og dette er verdig flere langsiktige og flertidspunktstudier i fremtiden. I tillegg, på grunn av den lille strukturen til musen ASCJ, kunne kondrocytene ikke ekstraheres for in vitro-eksperimenter for å evaluere endringene i inflammatoriske faktorer og for å verifisere eksistensen av PTOA på mobilnivå. I fremtidige studier vil mer tid og energi bli brukt på å studere de underliggende molekylærbiologiske mekanismene for ASCJ-degenerasjon. For det andre, selv om strukturen til musens bakføtter og ankler ligner på mennesker, er mus strengt tatt quadrupeds, mens mennesker er bipeder, og kreftene som oppleves av leddene under bevegelse er ikke akkurat det samme.
Den vellykkede etableringen av ASCJ-musemodellen for ustabilitet utvider imidlertid den enkle dyremodellen for ankelustabilitet til ASCJ-dyremodellen for ustabilitet, som gir en mer omfattende forståelse av mekanismen for fotinstabilitet og gir en ny forståelse for studiet av kliniske fotsykdommer, samt en dyremodell for diagnostisering og behandling av sykdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har motstridende interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Jiangsu provinsielle regjeringsstipendprogram og Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Surgical Nylon Suture | Ningbo Medical Needle Co., Ltd. | 191104 | |
| Acidic ethanol differentiation solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20778 | |
| Adhesive slides | Jiangsu Shitai Company | ||
| Ammonia solution (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20788 | |
| Anhydrous ethanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Aqueous acetic acid (1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20773 | |
| Black cube cassette | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Centrifuge tube 15ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0476 | |
| Centrifuge tube 50ml | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | YA0472 | |
| Cover glass | Jiangsu Shitai Company | ||
| CTAn software | Blue scientific | micro-CT analysis software | |
| Dataview software | AEMC instruments | commercial data analysing software | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na) | Beijing Soleibo Technology Co., Ltd. | E8490 | |
| Electric incubator | Suzhou Huamei Equipment Factory | ||
| Embedding paraffin | Leica, Germany | 39001006 | |
| Eosin staining solution (alcohol soluble, 1%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R30117 | |
| Fast green staining solution | Sigma-Aldrich, USA | F7275 | |
| Gait paper | Baoding Huarong Paper Factory | ||
| GraphPad Prism 8.0 | Graphpad software | online statistical analysis tools | |
| Iodophor cotton balls | Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd. | ||
| Leica 818 blade | Leica, Germany | ||
| Micro-CT | Skyscan, Belgium | SkyScan 1176 | |
| Micromanipulation microscope | Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd. | ||
| Mimics software | Materialise | 3D medical image processing software | |
| Modified Harris Hematoxylin Stain | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R20566 | |
| Mouse anti-mouse type II collagen | American Abcam Company | ||
| NaOH | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| N-butanol | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Neutral formalin fixative (10%) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Neutral resin | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Nrecon reconstrcution software | Micro Photonics Inc. | ||
| Oaks hair clipper | Oaks Group Co., Ltd. | ||
| Paraffin Embedding Machine | Leica, Germany | ||
| PH meter | Shanghai Leitz Company | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | American Biosharp | ||
| Physiological saline (for mammals, sterile) | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. | R22172 | |
| Safranin O-staining solution | Sigma-Aldrich, USA | HT90432 | |
| Saline (0.9%) | Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd. | 309107 | |
| Shaker | Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd. | 2008779 | |
| SPSS 23 | IBM | online statistical analysis tools | |
| Tablet machine | Leica, Germany | ||
| Tissue slicer | Leica, Germany | ||
| Ugo Basile | Ugo Basile Biological Research Company | ||
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axiovert, Germany | ||
| U-shaped plastic channel | Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd. | ||
| Veterinary eye ointment | Pfizer | ||
| Xylene | Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| YLS-10B Wheel Fatigue Tester | Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd. |
References
- Waterman, B. R., Belmont, P. J. Jr, Cameron, K. L., Deberardino, T. M., Owens, B. D. Epidemiology of ankle sprain at the United States Military Academy. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 797-803 (2010).
- Fong, D. T., Chan, Y. Y., Mok, K. M., Yung, P. S., Chan, K. M. Understanding acute ankle ligamentous sprain injury in sports. Sports Medicine Arthroscopy Rehabilitation Therapy & Technology. 1 (1), 14 (2009).
- Herzog, M. M., Kerr, Z. Y., Marshall, S. W., Wikstrom, E. A. Epidemiology of ankle sprains and chronic ankle instability. Journal of Athletic Training. 54 (6), 603-610 (2019).
- Medina McKeon, J. M., Hoch, M. C. The ankle-joint complex: A kinesiologic approach to lateral ankle sprains. Journal of Athletic Training. 54 (6), 589-602 (2019).
- Jones, M. H., Amendola, A. S. Acute treatment of inversion ankle sprains: immobilization versus functional treatment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 455 (463), 169-172 (2007).
- Anandacoomarasamy, A., Barnsley, L. Long term outcomes of inversion ankle injuries. British Association of Sport and Medicine. 39 (3), 14 (2005).
- Ringleb, S. I., Dhakal, A., Anderson, C. D., Bawab, S., Paranjape, R. Effects of lateral ligament sectioning on the stability of the ankle and subtalar joint. Journal of Orthopaedic Research. 29 (10), 1459-1464 (2011).
- Mittlmeier, T., Wichelhaus, A.
- Barg, A., et al. Subtalar instability: Diagnosis and treatment. Foot & Ankle International. 33 (02), 151-160 (2012).
- Liu, P., et al. A mouse model of ankle-subtalar joint complex instability induced post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 16 (1), 541 (2021).
- Lui, T. H. Modified arthroscopic Brostrom procedure with bone tunnels. Arthroscopy Techniques. 5 (4), 775-780 (2016).
- Wang, W., Xu, G. H. Allograft tendon reconstruction of the anterior talofibular ligament and calcaneofibular Ligament in the treatment of chronic ankle instability. BMC Musculoskeletal Disorders. 18 (1), 150 (2017).
- Yang, N., Waddington, G., Adams, R., Han, J. Age-related changes in proprioception of the ankle complex across the lifespan. Journal of Sport and Health Science. 8 (6), 548-554 (2019).
- Michels, F., et al. Searching for consensus in the approach to patients with chronic lateral ankle instability: Ask the expert. Knee Surgery Sports Traumatology Arthroscopy. 26 (7), 2095-2102 (2017).
- Kamada, K., Watanabe, S., Yamamoto, H. Chronic subtalar instability due to insufficiency of the calcaneofibular ligament: A case report. Foot & Ankle International. 23 (12), 1135-1137 (2002).
- Kato, T. The diagnosis and treatment of instability of the subtalar joint. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77 (3), 400-406 (1995).
- Meyer, J. M., Garcia, J., Hoffmeyer, P., Fritschy, D. The subtalar sprain. A roentgenographic study. Clinical Orthopaedics and Related Research. (226), 169-173 (1988).
- Mittlmeier, T., Rammelt, S. Update on subtalar joint instability. Foot and Ankle Clinics. 23 (3), 397-413 (2018).
- Chang, S. H., et al. Comparison of mouse and human ankles and establishment of mouse ankle osteoarthritis models by surgically-induced instability. Osteoarthritis & Cartilage. 24 (4), 688-697 (2016).
- Naito, K., et al. Evaluation of the effect of glucosamine on an experimental rat osteoarthritis model. Life Sciences. 86 (13-14), 538-543 (2010).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Glasson, S. S., et al. The OARSI histopathology initiative - Recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. Acute ankle sprain in a mouse model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).
- Wikstrom, E. A., Hubbard-Turner, T., Guderian, S., Turner, M. J. Lateral ankle sprain in a mouse model: Lifelong sensorimotor dysfunction. Journal of Athletic Training. 53 (3), 249-254 (2018).
- Bell-Krotoski, J. A., Fess, E. E., Figarola, J. H., Hiltz, D.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
