Summary
롤링 서클 강화 효소 활성 검출 검정을 이용한 토포이소머라제 1 활성의 민감성 및 정량적 검출을 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 이 방법은 정제된 성분 또는 세포/조직 추출물로부터 토포이소머라제 1 활성의 검출을 허용한다. 이 프로토콜은 효소 활성의 검출과 관련된 모든 분야에서 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다.
Abstract
롤링 서클 증폭과 같은 등온 증폭 기반 기술은 핵산, 단백질 양 또는 기타 관련 분자의 검출에 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 방법은 임상 및 연구 응용 분야에서 PCR 또는 ELISA에 대한 실질적인 대안으로 나타났습니다. 더욱이, 단백질 양의 검출 (웨스턴 블롯 또는 면역 조직 화학에 의한)은 종종 암 진단을위한 정보를 제공하기에 불충분 한 반면, 효소 활성의 측정은 가치있는 바이오 마커를 나타낸다. 효소 활성의 측정은 또한 병원체 매개 질병의 진단 및 잠재적 치료를 허용합니다. 모든 진핵생물에서 토포이소머라제는 중요한 세포 과정에서 DNA 토폴로지 상태의 조절에 관여하는 핵심 DNA 결합 효소이며 암 예후 및 치료를 위한 중요한 바이오마커 중 하나입니다.
수년에 걸쳐, 토포이소머라제는 매년 조사되는 천연 및 합성 소분자 화합물의 라이브러리를 통해 구충제 및 항암제의 잠재적 표적으로 실질적으로 조사되었습니다. 여기서, 간단하고 빠르며 겔이 없는 방식으로 토포이소머라제 1(TOP1) 활성의 정량적 측정을 허용하는 롤링 서클 강화 효소 활성 검출(REEAD) 분석이라고 하는 롤링 서클 증폭 방법이 제시됩니다. TOP1은 특별히 설계된 DNA 기질을 절단하고 결찰함으로써 DNA 올리고뉴클레오티드를 닫힌 원으로 변환하여 롤링 서클 증폭을 위한 주형이 되어 ~10~103 직렬 반복 롤링 서클 생성물을 생성합니다. 증폭 중 뉴클레오티드 혼입에 따라 형광에서 화학 발광, 비색에 이르기까지 다양한 판독 방법의 가능성이 있습니다. 각 TOP1 매개 절단 결찰은 하나의 폐쇄 DNA 원을 생성하므로 분석은 매우 민감하고 직접 정량적입니다.
Introduction
토포이소머라제는 DNA 변형 효소 부류에 속하며 이들 중 다수는 인간 질병 1,2,3,4,5,6에 대한 바이오마커로 유용한 것으로 입증되었습니다. TOP1은 DNA 복제, 유전자 전사, 재조합 및 염색체 분리와 같은 세포 과정과 관련된 토폴로지 스트레스를 해결하는데 관여한다7. TOP1은 DNA 8,9에서 일시적인 단일 가닥 절단의 형성을 포함하는 메커니즘에 의해 음극 및 양성 슈퍼 코일을 모두 해결할 수 있습니다. DNA에 결합한 후 TOP1은 활성 부위 티로신(Tyr723)을 위치시켜 포스포디에스테르 골격에 친핵성 공격을 수행합니다. 그런 다음 끊어진 DNA 가닥의 3'-말단에 공유 결합된 효소로 TOP1-DNA 절단 복합체가 생성됩니다. 이것은 절단된 가닥의 5' 끝이 손상되지 않은 가닥 주위를 회전하도록 하여 비틀림 응력을 해제합니다. 마지막으로, 5'-말단의 히드록실기는 3'-포스포티로실 결합에 대해 친핵성 공격을 수행한다. 그 결과, TOP1이 방출되고, DNA 백본이 복원된다(8).
이완 분석(10), 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)11,12, DNA 자살 절단-결찰 분석(13,14) 및 생체내 효소 복합체(ICE) 분석(15)을 포함하여 TOP1 촉매 주기의 단계를 조사하기 위한 여러 분석이 개발되었습니다. . 그러나 이러한 분석은 DNA 삽입제가 필요한 겔 전기영동에 의존하거나 고도로 전문화된 교육 및 장비가 필요하기 때문에 몇 가지 한계가 있습니다. 더욱이, 분석에는 다량의 정제된 TOP1 효소(이완 분석의 경우 1 내지 5 ng, EMSA 및 절단-결찰 분석의 경우 50 내지 200 ng 범위) 또는 적어도 106 세포로부터의 추출물이 최적으로 수행되어야 한다. 따라서, 미정제 생물학적 샘플에서 TOP1 활성의 특이적 검출을 가능하게 하는 및 단일 촉매 이벤트 레벨에서, REEAD 분석이라고 하는 매우 민감한 방법이 개발되었다(16).
여기서, REEAD 분석법16 을 이용한 TOP1 활성의 검출을 위한 프로토콜이 제시된다. 분석의 개략적인 표현이 그림 1에 나와 있습니다. 맞춤 설계된 실리콘 그리드가 기능화된 슬라이드에 부착되어 유리 슬라이드 멀티웰 설정을 생성하며, 다음 페이지에서는 wellmaker라고 합니다(그림 1A). 이어서 5'-아미노 변형된 프라이머를 슬라이드의 웰 내의 기능성 NHS 그룹에 커플링한다(도 1B). TOP1 매개 절단 및 결찰 반응은 특정 DNA 기질을 닫힌 원으로 변환합니다. TOP1 특정 기판(그림 1C)은 이중 가닥 스템과 2개의 단일 가닥 루프를 포함하는 덤벨 모양으로 자발적으로 접힙니다. 루프 중 하나는 표면 고정 프라이머를 보완합니다. 줄기 영역은 3'-말단 및 5'-히드록실 오버행으로부터 상류에 유리한 TOP1 절단 부위 3개의 염기를 함유한다. 기질의 순환화는 세포/조직 추출물(그림 1C) 또는 재조합 정제 TOP1(그림 1D)을 사용하여 달성할 수 있습니다.
기질이 TOP1에 의해 절단되면 효소는 3'-말단에 일시적으로 결합되고 3-염기 단편이 확산되어 5'-오버행이 기질에 어닐링되고 TOP1-매개 결찰을 촉진합니다. 결찰은 기질의 순환을 초래하고 이어서 TOP1의 해리를 초래합니다. 닫힌 원은 표면 고정 프라이머 (그림 1E)에 혼성화되고 ph29 중합 효소에 의해 매개되는 등온 롤링 원 증폭 (RCA)을위한 템플릿으로 사용되며, 이는 가닥 변위로 RCA를 수행하여 10개의 3 직렬 반복 생성물을 생성 할 수 있습니다. RCA 단계 동안, 형광 표지 (도 1F) 또는 비오틴 결합 (도 1G) 뉴클레오티드가 혼입될 수 있다(17). 형광 표지된 뉴클레오티드의 통합은 형광 현미경 또는 형광 스캐너를 사용하여 RCP를 검출할 수 있습니다. 대안적으로, 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 결합 항 비오틴 항체 (그림 1H)는 비오틴 화 된 뉴클레오티드에 결합 할 수 있으므로 강화 된 화학 발광 (ECL)을 사용하거나 3,3',5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)을 검출 가능한 색상으로 전환시킴으로써 압연 된 원형 생성물 (RCP)을 검출 할 수 있습니다. RCA는 선형 반응 동역학을 따르며, 하나의 RCP가 단일 TOP1 매개 절단 결찰 반응을 나타내기 때문에 REEAD 분석을 직접 정량화합니다. 여기에서 이 분석은 정제된 재조합 효소로서 또는 원유 샘플에서 추출된 TOP1 활성을 검출하고 항-TOP1 약물 스크리닝 도구로 사용할 수 있음을 보여줍니다.
Protocol
참고: 재료 표에서 필요한 버퍼 조성, 장비 및 기타 재료 목록을 찾으십시오.
1. 세포 배양
- 바람직한 세포를 적합한 배지에서 배양하고 지침에 따라 성장시킨다. 예를 들어, 20% 태아 소 혈청(FBS), 1% 비필수 아미노산(NEAA), 100단위/mL 페니실린 및 100mg/mL 스트렙토마이신이 보충된 최소 필수 배지(MEM)에서 대장 선암 유래 세포인 Caco100를 성장시킵니다. 세포 배양물을 가습 배양기(37°C에서 5%CO2/95% 공기 분위기)에 보관한다. 세포를 조직 배양 플라스크에 플레이팅하고 3일마다 분할하여 세포를 70% 컨플루언시로 유지합니다.
- 트립신 처리 (0.25 % 트립신, 0.02 % EDTA 용액)에 의해 70 % 합류 플라스크에서 세포를 수확하고 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척한다.
- 세포 펠릿을 PBS에 재현탁하여 세포 농도를 0.5 × 106 cells/tube로 조정합니다. 200 × g 에서 5 분 동안 회전시키고 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오.
알림: REEAD에 사용되는 셀은 신선하게 사용하고 얼음 위에 보관해야 합니다. Caco2 세포로 얻은 결과는 최근17에 발표되었다. 이 분석은 결장, 유방암, 폐암 및 자궁 경부암 유래 세포 18,19,20,21,22,23을 포함한 다양한 세포주로 테스트되었지만 조직, 혈액 및 타액과 같은 TOP1을 포함하는 모든 조잡한 생물학적 샘플과 함께 사용할 수 있습니다.
2. 기능화 된 슬라이드 준비
- 맞춤형 실리콘 아이솔레이터 그리드를 기능화된 슬라이드에 부착하여 웰메이커를 만듭니다. 기포의 형성을 피하기 위해 실리콘을 누르십시오( 그림 1A 참조).
- 1x 프린트 완충액 중 5 μM 5'-아미노 프라이머의 혼합물을 준비한다. 각 웰에 4μL의 혼합물을 추가하고 웰램커를 빛으로부터 보호되는 15°C에서 25°C 사이의 온도에서 포화 NaCl이 있는 혼성화 챔버에 넣습니다.
알림: 혼성화 챔버는 포화 NaCl로 채워진 피펫 팁 상자를 사용하여 쉽게 만들 수 있습니다. 하이브리드화에는 최소 16시간, 최대 72시간이 소요됩니다. 도 1B에서 5'-아미노 프라이머의 서열을 참조한다. 슬라이드는 NHS 그룹으로 기능화되어 아미노-변형된 올리고뉴클레오티드의 결합을 허용한다.
3. 폐쇄 원형 기판의 생성
- 재조합 TOP1 또는 세포 추출물을 이용한 폐쇄 원형 기질의 제조.
- 500μL의 용해 완충액에 0.5 × 106 세포의 세포 펠릿을 용해하여 1,000 cells/μL의 세포 밀도에 도달합니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
- 5 μM TOP1-특이적 기질 2 μL의 원형 혼합물을 제조하고(기질의 서열은 다음과 같다: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT AAA AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CATT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') 및 2 μL의 재조합 TOP1 효소 또는 2 μL의 세포 추출물 (단계 3.1.1 참조) 16 μL의 1x TOP1 반응 완충액.
참고: 사용되는 재조합 TOP1의 농도는 선택한 판독 방법에 따라 다릅니다(그림 2, 그림 3, 그림 4 및 그림 5 참조). 도 1C에서 TOP1 특이적 기판의 서열을 참조한다. - 37 ° C에서 30 분 동안 배양합니다 ( 그림 1C, D 참조).
- 2 μL의 1% SDS를 첨가하여 반응을 중지시킨다.
- 약물의 존재하에 폐쇄 된 원형 기질의 제조
- 1x TOP1 반응 완충액 14μL에 2μL의 5μM TOP1-특이적 기질과 1μL의 100% DMSO 또는 1μL의 1.6mM 캄프토테신(CPT)의 원 혼합물을 준비합니다. 2 μL의 5 ng/μL 재조합 TOP1 효소를 추가합니다.
참고: 다른 소분자 화합물 또는 약물을 사용할 수 있습니다. 이 경우, 화합물의 적정이 이루어져야한다. 화합물이 DMSO 이외의 용매에 용해되는 경우 DMSO 대신 대조군으로 사용해야합니다. - 37°C에서 1분 동안 배양합니다.
- 2 μL의 1% SDS를 첨가하여 반응을 중지시킨다.
- 1x TOP1 반응 완충액 14μL에 2μL의 5μM TOP1-특이적 기질과 1μL의 100% DMSO 또는 1μL의 1.6mM 캄프토테신(CPT)의 원 혼합물을 준비합니다. 2 μL의 5 ng/μL 재조합 TOP1 효소를 추가합니다.
알림: 3단계는 2단계와 병행하여 시작할 수 있으며 원은 4°C에서 밤새 보관할 수 있습니다. 대안적으로, DNA 서클은 단계 4와 동시에 제조되고 즉시 사용될 수 있다. 도 1C에서 TOP1 특이적 기판의 서열을 참조한다. 기판은 바람직한 TOP1 절단 부위 및 2개의 단일 가닥 루프를 포함하는 이중 줄기 영역을 갖는 덤벨 모양으로 접힌다. 열린 덤벨 기질은 TOP1-매개성 절단 및 결찰에 의해 닫힌 원형 기질로 변환되고, 이하에서는 원으로 지칭된다. 과량의 5'-아미노 프라이머가 존재하기 때문에, 개방 및 폐쇄 TOP1-특이적 기질 사이에 경쟁이 없을 것이다.
4. 웰메이커 차단
- 웰메이커를 50°C로 예열된 버퍼 1로 채워진 5cm x 5cm 트레이에 담근다. 피펫을 사용하여 우물 내부에 액체를 밀어 넣어 기포가 없는지 확인하십시오. 50°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 버퍼 1을 제거하고 dH 2 O로2x 1 분 동안 씻으십시오. 손으로 세게 흔듭니다.
- 50°C로 예열된 버퍼 2를 추가합니다. 우물에 기포가 없는지 확인하십시오. 50°C에서 30분 동안 배양합니다.
- dH 2 O로2x 1 분 동안 세척하십시오. 손으로 세게 흔듭니다.
- 70 % EtOH로 1 분 동안 씻으십시오. 손으로 세게 흔든다.
- 웰메이커 설정을 자연 건조시키십시오.
알림: 압축 공기를 사용하여 우물을 말리십시오. 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 공기를 불어 넣을 수 있습니다. 계속하기 전에 우물이 건조한지 확인하십시오.
5. 웰메이커에 대한 원의 혼성화
- 4μL의 원(3단계에서 만든)을 각 해당 웰에 추가합니다.
- 웰메이커를 37°C에서dH2O로 1시간 동안 습도 챔버에 두십시오.
참고: 습도 챔버는dH2O로 채워진 피펫 팁용 상자를 사용하여 만들 수 있습니다. 대안적으로, 혼성화는 습도 챔버에서 25°C에서 밤새 수행될 수 있다.
6. 세탁
- 버퍼 3으로 웰메이커를 세척하십시오.
- 버퍼 3을 제거하고 버퍼 4로 바꿉니다.
- 버퍼 4를 제거하고 70 % EtOH로 세척하십시오.
- EtOH를 제거하고 웰메이커를 건조시키십시오.
알림: 모든 세척 단계는 슬라이드를 완전히 담그고 1cm x 5cm 트레이에서 5분 동안 수행됩니다. 항상 우물 안에 기포가 없는지 확인하십시오.
7. 롤링 서클 증폭
- 형광 판독을 위해 0.2μg/μL BSA, 1단위의 Phi29 중합효소, 0.25mM dNTP 및 0.0125mM ATTO-488-dUTP가 보충된 1x Phi29 반응 완충액의 RCA 혼합물을 준비하거나, 비색/화학발광 판독을 위해 0.1mM dATP, 0.1mM DTTP, 0.1mM dGTP, 0.09mM dCTP 및 0.01mM 비오틴-dCTP를 준비합니다. 각 웰에 4 μL를 추가합니다. 그림 1E를 참조하십시오.
알림: RCA 혼합물의 준비는 얼음 위에서 이루어져야합니다. RCA에 형광 뉴클레오티드를 혼입할 때 형광단을 보호하기 위해 이 단계에서 직사광선을 피하십시오. - 습도 챔버에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 형광 뉴클레오티드를 사용하는 경우 습도 챔버를 어두운 곳에 두십시오. 그림 1F, G를 참조하십시오.
8. 세탁
- 화학발광 또는 비색 판독 프로토콜의 경우 6단계와 같이 웰메이커를 세척한 다음 11단계로 진행합니다.
- 형광 판독 프로토콜의 경우 다음 단계와 같이 세척하기 전에 핀셋을 사용하여 실리콘 그리드를 제거합니다.
- 버퍼 3에서 슬라이드를 10분 동안 세척합니다.
- 버퍼 3을 제거하고 버퍼 4로 바꿉니다. 5 분 동안 씻으십시오.
- 버퍼 4를 제거하고 70% EtOH에서 1분 동안 세척합니다.
- EtOH를 제거하고 웰메이커를 건조시키십시오.
9. 형광 스캐너를 이용한 형광 롤링 서클 제품의 시각화
- 사용된 형광단에 상응하는 필터를 사용하여 형광 스캐너에서 슬라이드를 스캔한다. 채도를주지 않는 가능한 최대 광전자 증배관을 사용하십시오.
참고: 이 프로토콜에서 이미지 획득에 사용되는 형광 스캐너에는 473nm 레이저 및 FAM 필터 여기 490nm, 방출 520nm가 장착되어 있습니다. - 그림을 ImageJ로 가져오고 이미지 유형을 8비트로 변경합니다(이미지 | 타입 | 8비트). 밴드를 개별적으로 측정하려면 도구 모음에서 사각형 그리기 도구를 사용하여 측정 영역을 제한합니다. 원하는 영역을 그리고 강도를 측정합니다 (분석 | 측정). 그런 다음 원래 그려진 영역을 다음 밴드로 이동하고 측정합니다.
- 원하는 소프트웨어에서 데이터를 플로팅합니다. ImageJ로부터 추출된 정량화를 포함한 대표적인 이미지들이 도 2에 도시되어 있다.
10. 형광현미경을 이용한 형광 롤링 서클 제품의 시각화
- EtOH 내성 펜을 사용하여 실리콘 그리드를 제거하기 전에 웰의 위치를 그리고 8.2 단계와 같이 슬라이드를 세척하십시오. 세척 단계 후 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)이 없는 1μL의 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 커버 유리를 추가합니다. 카메라에서 시각화할 수 있도록 슬라이드를 76mm x 26mm 현미경 슬라이드에 붙입니다.
- 60x 오일 이멀젼 대물렌즈와 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용하여 분석합니다. 각 샘플/웰의 12-15개 이미지를 촬영합니다.
- 사진을 ImageJ로 가져 와서 이미지를 쌓습니다 (이미지 | 스택 | 스택할 이미지). 이미지 유형을 8비트로 변경합니다(이미지 | 타입 | 8비트).
- 임계값 설정(이미지 | 조정 | 임계값).
- 임계값을 다음과 같이 설정합니다: 하단 막대를 설정하고 오른쪽 신호만 빨간색이고 배경이 검은색이 되도록 상단 막대를 조정합니다. 실제 신호가 사라지기 전에 임계값이 가능한 한 낮은지 확인하십시오.
- 임계값을 설정하기 전에 개별 이미지를 살펴보고 이미지와 일치하는지 확인합니다. 임계값은 실험마다 변경될 수 있습니다.
- 신호 카운트(분석 | 입자 분석). ImageJ 설정에서 요약된 필드가 선택되어 있는지 확인합니다.
- 추가 데이터 처리를 위해 결과를 스프레드시트 또는 다른 소프트웨어로 내보냅니다. ImageJ로부터 추출된 정량화를 포함한 대표적인 이미지들이 도 3에 도시되어 있다.
11. HRP 접합 항 비오틴 항체와 비오틴 표지 롤링 서클 제품의 결합
- 5% 무지방 탈지유와 5% BSA가 보충된 버퍼 5에 1:300으로 희석한 HRP 접합 항비오틴 항체 4μL를 각 웰에 추가합니다.
- 습도 챔버에서 15-25°C에서 50분 동안 배양합니다( 그림 1H 참조).
- 버퍼 5로 3 x 3 분 동안 세척하십시오.
- 웰메이커를 말리십시오.
12. 비오틴 라벨 롤링 서클 제품의 시각화
- ECL을 사용한 시각화
- 사용 직전에 40μL의 ECL 루미놀과 40μL의H2O2를 혼합합니다. 각 웰에 2 μL를 추가합니다.
- CCD 카메라 또는 X선 필름을 사용하여 슬라이드를 시각화합니다.
- TMB를 사용한 시각화
- 11.4 단계 후에 실리콘 격자를 제거하십시오. 그런 다음 전체 슬라이드 위에 400μL의 TMB를 추가하고 슬라이드를 습도 챔버에 넣습니다. 발색을 위해 ~ 5-10 분 동안 기다리십시오. 발색 후 슬라이드를 70 % EtOH로 씻으십시오.
- 육안으로 발색을 시각화하십시오. 사진 카메라 또는 휴대폰으로 슬라이드 사진을 찍습니다.
- 그림을 ImageJ로 가져오고 이미지 유형을 8비트로 변경합니다(이미지 | 타입 | 8비트). 밴드를 개별적으로 측정하려면 도구 모음에서 사각형 그리기 도구를 사용하여 측정 영역을 제한합니다. 원하는 영역을 그리고 강도를 측정합니다 (분석 | 측정). 그런 다음 원래 그려진 영역을 다음 밴드로 이동하고 측정합니다.
- 원하는 소프트웨어에서 데이터를 플로팅합니다. ImageJ로부터 추출된 정량화를 포함한 대표적인 이미지들이 도 4, 도 5, 및 도 6에 묘사되어 있다.
Representative Results
여기서, REEAD 분석을 이용한 TOP1 활성의 검출을 위한 프로토콜이 제시된다16. 이 프로토콜은 형광 스캐너, 형광 현미경, 화학 발광 및 비색의 네 가지 판독 방법을 사용하여 재조합 TOP1 활성을 검출하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 또한 화학 발광 또는 TMB 판독을 통해 조 추출물의 예로서 Caco2 세포에서 추출한 TOP1의 활성을 검출하는 데 사용되었습니다. 더욱이, 상기 프로토콜은 화학발광 판독법을 사용하여 TOP1 특이적 억제제의 예로서 CPT에 의한 재조합 TOP1 활성의 억제를 검출하기 위해 약물 스크리닝 도구로 사용되었다.
형광 판독을 사용하여 TOP1 활성을 분석할 때 얻은 결과는 그림 2 및 그림 3에 나와 있습니다. 형광 슬라이드의 대표적인 스캔과 정량화된 결과를 도 2에 나타내었다. 정량화에서 알 수 있듯이 이 판독값은 12.5ng의 TOP1 검출 한계를 갖습니다. 형광현미경 판독값을 사용할 때 얻어진 대표 이미지 및 정량화 결과는 도 3에 나타내었다. 이 판독 방법을 사용하면 검출 한계는 TOP1의 0.1ng에 불과합니다. 화학발광 판독값을 사용하여 TOP1 활성을 분석할 때 얻어진 결과는 도 4에 나타내고, 비색 판독으로부터의 결과는 도 5에 도시되어 있다. 이러한 판독 방법의 검출 한계는 6ng의 TOP1 또는 312개의 Caco2 세포에서 추출된 TOP1입니다. 도 6은 약물 스크리닝 적용의 예로서 80 μM CPT 또는 DMSO의 존재 하에서의 TOP1 활성의 측정을 도시한다. 대표적인 이미지와 3개의 독립적인 실험의 결과적인 정량화는 CPT가 예상대로 기질의 TOP1-매개성 순환화를 억제한다는 것을 보여준다(24,25).
그림 1: REEAD 프로토콜의 개략적 표현 . (A,B) 기능화된 슬라이드의 준비. 실리콘 격자는 기능화 된 슬라이드에 부착됩니다. 이어서, 5'-아미노 프라이머가 슬라이드에 결합되어, TOP1 특이적 기질의 증폭을 가능하게 한다. (씨,디) 닫힌 원형 기판의 생성. TOP1-특이적 기질은 이중 가닥 줄기에 바람직한 TOP1 절단 부위가 있고 2개의 단일 가닥 루프 중 하나에서 프라이머 결합 서열을 갖는 덤벨 모양으로 접힌다. (c) TOP1은 세포의 용해시 방출된다. TOP1-매개성 절단 및 결찰시, 기질은 닫힌 원으로 전환되고; (d) 정제된, 재조합 TOP1이 사용된다. (E) 롤링 서클 증폭. 닫힌 원형 기판은 표면 앵커링된 프라이머에 혼성화되고 Phi29 중합효소를 사용하여 RCA에 의해 증폭됩니다. RCA는 F 에서와 같이 형광 뉴클레오티드 또는 G에서와 같이 비오티닐화 뉴클레오티드의 혼입에 의해 달성될 수 있다. 형광 롤링 서클 제품은 형광 현미경 또는 형광 스캐너를 사용하여 시각화됩니다. (h) HRP-접합된 항-비오틴 항체의 커플링. 비오티닐화된 롤링 서클 생성물은 HRP-접합된 항-비오틴 항체와 함께 인큐베이션된다. 신호 발생은 HRP 효소에 의해 매개되며 신호는 ECL에 의해 시각화되고 CCD 카메라를 사용하거나 TMB를 사용하여 비색 시각화를 생성하여 감지됩니다. 약어: REEAD = 롤링 서클 강화 효소 활성 검출; RCA = 롤링 서클 증폭; TOP1 = 토포이소머라제 1; HRP = 양 고추 냉이 퍼 옥시다아제; ECL = 강화 된 화학 발광; TMB = 3,3',5,5'- 테트라 메틸 벤지딘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 형광 스캐너를 사용한 TOP1 활성 측정. 좌측 패널은 형광스캐너 판독프로토콜을 이용하여 3-50 ng의 TOP1의 활성을 분석하였을 때의 슬라이드의 대표 이미지를 나타낸다. 오른쪽 패널은 결과 정량화를 보여줍니다. 웰치 보정을 사용한 t-검정, p = 0.0064, n = 4. 약어 : TOP1 = 토포 이소 머라 제 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 형광 현미경을 사용한 TOP1 활성 측정. 좌측 패널은 형광현미경 판독프로토콜을 이용하여 TOP1의 0.1-12.5ng의 활성을 분석할 때 슬라이드의 대표 이미지를 보여준다. 이미지는 점을 제대로 표시하기 위해 잘린 버전입니다. 이러한 이유로 오른쪽 패널에 표시된 정량화의 신호 수와 유사하지 않습니다. 웰치의 보정을 사용한 t-검정, p = 0.0136, n = 3. 약어 : TOP1 = 토포 이소 머라 제 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 화학발광 판독값을 사용한 TOP1 활성 측정. (a) 좌측 패널은 화학발광 판독 프로토콜을 사용하여 TOP1의 3-50 ng의 활성을 분석하였을 때 슬라이드의 대표 이미지를 나타낸다. 오른쪽 패널은 결과 정량화를 보여줍니다. 웰치 보정을 사용한 t-검정, p < 0.0001, n = 4. (b) 좌측 패널은 화학발광 판독 프로토콜을 이용하여 156-40,000 Caco2 세포로부터 추출된 TOP1의 활성을 분석하였을 때 슬라이드의 대표 이미지를 나타낸다. 오른쪽 패널은 결과 정량화를 보여줍니다. 웰치 보정을 사용한 t-검정, p = 0.0224, n = 3. 약어 : TOP1 = 토포 이소 머라 제 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 비색 판독값을 사용한 TOP1 활동 측정. (A) 왼쪽 패널은 비색 판독 프로토콜을 사용하여 TOP3의 50-1ng을 분석할 때 슬라이드의 대표 이미지를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 결과 정량화를 보여줍니다. 웰치의 보정을 사용한 t-검정, p = 0.0012, n = 4. (b) 좌측 패널은 비색 판독 프로토콜을 이용하여 156-40,000개의 Caco2 세포로부터 추출된 TOP1의 활성을 분석하였을 때 슬라이드의 대표 이미지를 나타낸다. 오른쪽 패널은 결과 정량화를 보여줍니다. 웰치 보정을 사용한 t-검정, p = 0.0117, n = 3. 약어: TOP1 = 토포이소머라제 1; TMB = 3,3',5,5'- 테트라 메틸 벤지딘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 화학발광 판독 프로토콜을 사용한 약물 처리 후 TOP1 활성 측정. 왼쪽 패널은 1분 동안 5% DMSO 또는 80μM CPT의 존재하에 10ng의 TOP1을 분석할 때 슬라이드의 대표 이미지를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 결과 정량화를 보여줍니다. 웰치 보정을 사용한 t-검정, p = 0.0017, n = 3. 약어: TOP1 = 토포이소머라제 1; CPT = 캄프토테신; DMSO = 디메틸술폭시드; 부정 = 음성 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
토포이소머라제는 높은 연구 및 임상적 관심을 끄는 DNA 변형 효소 계열을 나타내며 항암 치료 또는 전염병 퇴치에 잠재적인 효과가 있는 소분자 화합물의 표적입니다. 더욱이, 인간 TOP1의 활성은 암 예후 및 치료18,19,23의 효과적인 바이오마커인 것으로 입증되었다. 화학요법 억제제(26)의 효능에 영향을 미치는 것은 TOP1 활성이지만, 임상 환경에서 평가되는 것은 종종 DNA-RNA의 양 또는 TOP1의 양이다. 이는 모든 실험실 환경에서 토포이소머라제 활성의 정확하고 정밀한 정량화를 제공할 수 있는 빠르고 쉬운 젤 기반 유리 도구가 없기 때문입니다.
여기서, 겔 무함유 방식으로 TOP1 활성의 측정을 허용하는 REEAD 분석을 위한 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜에서 정제된 TOP1 또는 세포로부터의 조 추출물은 TOP1에 의해 매개되는 절단/결찰 시 폐쇄된 원형 분자로 전환되는 특별히 설계된 DNA 덤벨 모양의 기질과 함께 배양됩니다. 그런 다음 원은 유리 표면에 혼성화되고 RCA에 의해 증폭됩니다. 슬라이드에서 일어나는 반응을 쉽게 수행 할 수 있도록 실리콘 그리드가 유리에 부착되어 반응이 일어나는 개별 웰을 만듭니다. 이러한 방식으로 프로토콜은 웰메이커라고 하는 멀티웰 시스템(실리콘 그리드)을 활용합니다.
상기 프로토콜은 일례로서 사용된 결장직장 선암 세포 Caco2로부터 추출된 재조합 TOP1 및 TOP1의 활성을 검출하기 위해 사용되었다. 더욱이, 약물 스크리닝 도구로서 사용되는 REEAD의 예로서, 상기 프로토콜은 잘 알려진 TOP1 억제제 CPT24,25에 의한 TOP1 활성 억제를 검출하기 위해 사용되었다. 이 분석은 높은 감도를 제공하는 형광 현미경과 덜 전문화된 장비와 교육이 필요한 형광 스캐너, 화학발광 또는 비색계와 같은 다양한 판독 방법과 결합되었습니다. 고감도 형광 현미경 판독은 양질의 형광 현미경 설정, 숙련된 인력, 시간 소모적인 이미지 획득 및 분석이 필요하다는 한계가 있습니다.
이러한 이유로, 감도를 희생하더라도 더 빠른 획득 및 분석을 가능하게 하는 형광 스캐너 판독값이 제시된다. 형광 스캐너가 없는 경우 화학발광 및 비색 판독 방법이라는 두 가지 우수한 대안을 고려할 수 있습니다. 두 방법 모두 빠르고 간단하며 값 비싼 장비 나 전문 교육이 필요하지 않습니다. 모든 판독 형식에서 REEAD는 시간이 더 많이 걸리고 겔 기반(삽입제의 요구 사항이 있음)이며 덜 직접적인 정량적인 최첨단 분석에 비해 많은 장점이 있습니다. 그러나 제시된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 약물 스크리닝을 처리할 때 시점, 약물 농도 및 TOP1 양/DNA 기질의 비율은 CPT에 최적화된 설명된 설정과 비교하여 최적화되어야 합니다. 약물은 DNA 기질을 사용한 예비배양 또는 TOP1 효소를 이용한 예비배양을 수행하는 것을 조사할 수 있다. 이것은 분자가 TOP1을 억제하는 능력에 대한 귀중한 정보를 제공하고 약물 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
또한, 신호가 낮거나 없는 경우, 이는 원유 샘플의 비효율적인 용해 또는 프로테아제 억제제의 부적절한 사용으로 인한 추출물의 TOP1 분해 때문일 가능성이 큽니다. 또한, 이는 또한 재조합 TOP1, phi29 중합효소, 뉴클레오티드, 기질 및 프라이머와 같은 중요한 분석 성분의 부적절한 저장 때문일 수 있다. 마지막으로, 올리고뉴클레오티드의 반복적인 동결-해동 주기는 피해야 하는데, 이는 분석 성능에 극적인 영향을 미치기 때문입니다. 조추출물을 사용하는 경우 특정 생물학적 샘플의 추출 효율을 최적화해야 하며 TOP1의 양과 활성은 여기에 보고된 예와 다를 수 있습니다. 이러한 이유로 시험할 모든 미정제 추출물은 특정 샘플을 사용할 때 분석 검출 한계 및 감도 범위를 식별하기 위한 적정이 필요합니다. 이 프로토콜은 인간 TOP1의 검출을 위해 최적화되었습니다. 다른 진핵생물 TOP1의 활성을 측정할 수 있지만 NaCl 농도와 배양 시간은 효소 정제 방법 및 최적의 효소 활성에 따라 최적화해야 할 수 있습니다. 더 많은 순환화된 기질은 장기간의 배양으로 인해 발생하는 반면, 더 적은 순환화된 기질은 짧은 배양으로 인해 발생합니다.
제시된 응용 프로그램 외에도 REEAD는 암 환자18의 소규모 생검으로부터의 조 추출물에서 TOP1 활성의 측정, 암 세포주 20,21,22에서 CPT의 세포 독성 항암 효과의 예측, 심지어 단일 세포에서의 효소 활성의 검출을 허용합니다(20,21) . 또한, 웰메이커를 사용하여 제시된 REEAD 설정은 합성 또는 천연 화합물 라이브러리의 멀티웰 기반 약물 스크리닝을 가능하게 합니다. 이 외에도 REEAD C/L이라고 하는 REEAD 분석의 수정된 버전이 개발되었습니다. 이러한 설정은 TOP1 반응(27)의 절단 및 결찰 단계의 개별 조사를 가능하게 한다. REEAD C/L을 사용하면 소분자 억제제의 작용 메커니즘을 결정하고 잠재적인 구충 효과28가 있는 TOP1 촉매 억제제 또는 항암 치료24,25에 사용되는 TOP1 독극물로 특성화할 수 있습니다. 마지막으로, 다른 TOP1 효소의 다양한 요구 사항(DNA 결합 또는 절단 결찰)과 일치하도록 DNA 기질을 특이적으로 재설계함으로써 REEAD는 감염성 질병(예: 말라리아29를 유발하는 플라스모듐 팔시파룸의 경우) 또는 리슈만편모충 도노바니 및 원숭이두 바이러스(데이터는 표시되지 않음)의 검출에도 사용되었습니다. 또는 항병원성 효과가 있는 소분자 화합물을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 TOP1 분야의 과학자들에게 최적화가 거의 또는 전혀 없이 효소 활성을 검출할 수 있는 쉬운 방법을 제공하며 향후 더 광범위한 응용 분야에 적용할 수 있는 가능성을 제공합니다.
Disclosures
저자 C.T.와 K.M.은 VPCIR 생명과학 ApS의 직원입니다. C.T., B.R.K. 및 M.S.는 주주 및/또는 주식 옵션 보유자입니다. C.T., B.R.K. 및 M.S.는 VPCIR biosciences ApS의 이름으로 출원된 특허 EP2022/057172의 발명자로 지명되었음을 선언합니다. 다른 저자들은 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 Phi29 및 TOP1 효소 정제와 관련된 기술 지원에 대해 오르후스 대학교 분자 생물학 및 유전학과의 실험실 기술자 Noriko Y. Hansen에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
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