Summary
En protokol for følsom og kvantitativ påvisning af topoisomerase 1-aktivitet ved hjælp af den rullende cirkelforbedrede enzymaktivitetsdetektionsanalyse er beskrevet. Metoden gør det muligt at påvise topoisomerase 1-aktivitet fra oprensede komponenter eller celle-/vævsekstrakter. Denne protokol har vidtrækkende anvendelser på ethvert område, der involverer påvisning af enzymatisk aktivitet.
Abstract
Isotermiske forstærkningsbaserede teknikker såsom den rullende cirkelforstærkning er med succes blevet anvendt til påvisning af nukleinsyrer, proteinmængder eller andre relevante molekyler. Disse metoder har vist sig at være væsentlige alternativer til PCR eller ELISA til kliniske og forskningsmæssige anvendelser. Desuden er påvisning af proteinmængde (ved Western blot eller immunohistokemi) ofte utilstrækkelig til at give information til kræftdiagnose, mens måling af enzymaktivitet repræsenterer en værdifuld biomarkør. Måling af enzymaktivitet giver også mulighed for diagnose og potentiel behandling af patogenbårne sygdomme. I alle eukaryoter er topoisomeraser de vigtigste DNA-bindende enzymer, der er involveret i kontrollen af DNA-topologisk tilstand under vigtige cellulære processer og er blandt de vigtige biomarkører for kræftprognose og behandling.
I årenes løb er topoisomeraser blevet væsentligt undersøgt som et potentielt mål for antiparasitiske og kræftbekæmpende lægemidler med biblioteker af naturlige og syntetiske småmolekyleforbindelser, der undersøges hvert år. Her præsenteres den rullende cirkelforstærkningsmetode, kaldet rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay, der giver mulighed for kvantitativ måling af topoisomerase 1 (TOP1) aktivitet på en enkel, hurtig og gelfri måde. Ved at spalte og ligere et specielt designet DNA-substrat omdanner TOP1 et DNA-oligonukleotid til en lukket cirkel, som bliver skabelonen til rullende cirkelforstærkning, hvilket giver ~ 103 tandem gentagne rullende cirkelprodukter. Afhængigt af nukleotidinkorporeringen under amplifikationen er der mulighed for forskellige udlæsningsmetoder, fra fluorescens til kemiluminescens til kolorimetrisk. Da hver TOP1-medieret spaltningsligation genererer en lukket DNA-cirkel, er analysen meget følsom og direkte kvantitativ.
Introduction
Topoisomeraser tilhører klassen af DNA-modificerende enzymer, og mange af disse har vist sig nyttige som biomarkører for humane sygdomme 1,2,3,4,5,6. TOP1 er involveret i at løse den topologiske stress forbundet med cellulære processer såsom DNA-replikation, gentranskription, rekombination og kromosomal adskillelse7. TOP1 kan løse både negative og positive superspoler ved hjælp af en mekanisme, der involverer dannelsen af et forbigående enkeltstrenget brud i DNA 8,9. Efter binding til DNA placerer TOP1 det aktive sted tyrosin (Tyr723) for at udføre et nukleofilt angreb på phosphodiester-rygraden. Et TOP1-DNA-spaltningskompleks genereres derefter med enzymet kovalent bundet til 3'-enden af den ødelagte DNA-streng. Dette frigiver vridningsspænding ved at lade 5'-enden af den spaltede streng dreje rundt om den intakte streng. Endelig udfører hydroxylgruppen i 5'-enden et nukleofilt angreb på 3'-phosphotyrosylbindingen. Som et resultat frigives TOP1, og DNA-rygraden gendannes8.
Flere assays er blevet udviklet til at undersøge trinene i TOP1-katalytisk cyklus, herunder afslapningsassay10, det elektroforetiske mobilitetsskiftassay (EMSA) 11,12, DNA-selvmordsspaltnings-ligationsassays 13,14 og in vivo-komplekset af enzymer (ICE) assay 15 . Disse assays har imidlertid flere begrænsninger, da de er afhængige af gelelektroforese, som kræver DNA-interkalerende midler, eller de kræver højt specialiseret træning og udstyr. Desuden kræver assays store mængder oprenset TOP1-enzym (fra 1 til 5 ng til afslapningsanalysen og 50 til 200 ng til EMSA og spaltningsligationsanalysen) eller ekstrakter fra mindst 106 celler for at fungere optimalt. Derfor er der udviklet en meget følsom metode, der muliggør specifik påvisning af TOP1-aktivitet i rå biologiske prøver og på det enkelte katalytiske hændelsesniveau, kaldet REEAD-analysen,16.
Her præsenteres en protokol til påvisning af TOP1-aktivitet ved hjælp af REEAD-assay16 . En skematisk gengivelse af analysen er afbildet i figur 1. Et specialdesignet silikonegitter er fastgjort til et funktionaliseret dias for at skabe en glas-slide multiwell-opsætning, kaldet wellmaker i det følgende (figur 1A). Dette efterfølges af kobling af en 5'-aminomodificeret primer til de funktionelle NHS-grupper i lysbilledlets brønde (figur 1B). TOP1-medieret spaltning og ligeringsreaktion konverterer et specifikt DNA-substrat til en lukket cirkel. Det TOP1-specifikke substrat (figur 1C) foldes spontant ind i en håndvægtsform indeholdende en dobbeltstrenget stilk og to enkeltstrengede løkker. En af løkkerne er komplementær til den overfladeforankrede primer. Stængelområdet indeholder et yndet TOP1-spaltningssted tre baser opstrøms fra 3'-enden og et 5'-hydroxyludhæng. Cirkularisering af substratet kan opnås ved hjælp af enten celle-/vævsekstrakt (figur 1C) eller rekombinant, renset TOP1 (figur 1D).
Når substratet spaltes af TOP1, bliver enzymet forbigående bundet til 3'-enden, og tre-basefragmentet diffunderer, hvilket gør det muligt for 5'-udhænget at gløde til substratet og lette TOP1-medieret ligering. Ligeringen resulterer i cirkularisering af substratet og efterfølgende dissociation af TOP1. Den lukkede cirkel hybridiseres til den overfladeforankrede primer (figur 1E) og bruges som en skabelon til isotermisk rullende cirkelforstærkning (RCA) medieret af phi29-polymerasen, som kan udføre RCA med strengforskydning, hvilket giver 103 tandem gentagelsesprodukter. Under RCA-trinnet kan fluorescerende mærkede (figur 1F) eller biotinkoblede (figur 1G) nukleotider inkorporeres17. Inkorporering af fluorescerende mærkede nukleotider gør det muligt at detektere RCP'erne enten ved hjælp af et fluorescensmikroskop eller en fluorescensscanner. Alternativt kan et peberrodsperoxidase (HRP)-koblet antibiotinantistof (figur 1H) binde de biotinylerede nukleotider, hvilket muliggør påvisning af rullecirkelprodukterne (RCP'er) ved hjælp af enten forbedret kemiluminescens (ECL) eller ved omdannelse af 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) til en påviselig farve. RCA følger en lineær reaktionskinetik, hvilket gør REEAD-analysen direkte kvantitativ, da en RCP repræsenterer en enkelt TOP1-medieret spaltnings-ligeringsreaktion. Her er det vist, at dette assay kan bruges til at detektere TOP1-aktivitet som et oprenset rekombinant enzym eller ekstraheret fra råprøver og som et anti-TOP1-lægemiddelscreeningsværktøj.
Protocol
BEMÆRK: Find en liste over buffersammensætninger, udstyr og andre materialer, der kræves i Materialetabel.
1. Cellekultur
- Kultur de foretrukne celler i passende medium og dyrk dem i henhold til instruktionerne. Som et eksempel vokser Caco2, kolorektal adenocarcinomafledte celler, i Minimal Essential Medium (MEM) suppleret med 20% føtalt bovint serum (FBS), 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 100 enheder / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin. Cellekulturerne opretholdes i en befugtet inkubator (5% CO2/95% luftatmosfære ved 37 °C). Plade cellerne i vævskulturkolber og opdel hver 3. dag for at opretholde cellerne ved 70% sammenløb.
- Høst cellerne fra en 70% sammenflydende kolbe ved trypsinbehandling (0,25% trypsin, 0,02% EDTA-opløsning) og vask med fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Resuspender cellepelleten i PBS for at justere cellekoncentrationen til 0,5 × 106 celler/rør. Drej ved 200 × g i 5 min og opsug forsigtigt supernatanten.
BEMÆRK: Celler, der anvendes til REEAD, skal anvendes friske og opbevares på is. Resultaterne opnået med Caco2-celler er for nylig blevet offentliggjort17. Analysen er blevet testet med en række cellelinjer, herunder tyktarms-, bryst-, lunge- og livmoderhalskræftafledte celler 18,19,20,21,22,23, men det kan bruges med alle rå biologiske prøver indeholdende TOP1, såsom væv, blod og spyt.
2. Forberedelse af funktionaliserede dias
- Fastgør det specialdesignede silikoneisolatorgitter til det funktionaliserede dias, hvorved brøndproducenten fremstilles. Tryk på silikonen for at undgå dannelse af luftbobler (se figur 1A).
- Forbered en blanding af 5 μM 5'-amino primer i 1x printbuffer. Der tilsættes 4 μL af blandingen til hver brønd, og wellamkeren anbringes i et hybridiseringskammer med mættet NaCl ved temperaturer mellem 15 °C og 25 °C, beskyttet mod lys.
BEMÆRK: Et hybridiseringskammer kan let fremstilles ved hjælp af en pipettespidsboks fyldt med mættet NaCl. Hybridiseringen tager mindst 16 timer og højst 72 timer. Se sekvensen af 5'-amino primeren i figur 1B. Diasene funktionaliseres med NHS-grupper for at muliggøre binding af aminomodificerede oligonukleotider.
3. Generering af lukkede cirkulære substrater
- Fremstilling af lukkede cirkulære substrater med rekombinant TOP1 eller celleekstrakt.
- Lys en cellepellet på 0,5 × 106 celler i 500 μL lysisbuffer for at nå en celletæthed på 1.000 celler / μL. Inkuberes i 10 minutter på is.
- Der fremstilles en cirkelblanding af 2 μL af 5 μM TOP1-specifikt substrat (substratets sekvens er som følger: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CTC TCT AAA AGA CTT AGA-3') og 2 μL rekombinant TOP1-enzym eller 2 μL celleekstrakt (se trin 3.1.1) i 16 μL af 1x TOP1 reaktionsbuffer.
BEMÆRK: Koncentrationen af rekombinant TOP1, der anvendes, afhænger af den valgte udlæsningsmetode (se figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5). Se sekvensen af det TOP1-specifikke substrat i figur 1C. - Inkuberes i 30 minutter ved 37 °C (se figur 1C,D).
- Stop reaktionen ved at tilføje 2 μL 1% SDS.
- Fremstilling af lukkede cirkulære substrater i nærværelse af lægemidler
- Der fremstilles en cirkelblanding af 2 μL af 5 μM TOP1-specifikt substrat og 1 μL 100% DMSO eller 1 μL 1,6 mM camptothecin (CPT) i 14 μL 1x TOP1 reaktionsbuffer. Tilsæt 2 μL 5 ng/μL rekombinant TOP1 enzym.
BEMÆRK: Andre små molekyleforbindelser eller lægemidler kan anvendes. I så fald skal der foretages en titrering af forbindelsen. Hvis forbindelsen opløses i et andet opløsningsmiddel end DMSO, skal dette anvendes som en kontrol i stedet for DMSO. - Inkuberes i 1 minut ved 37 °C.
- Stop reaktionen ved at tilføje 2 μL 1% SDS.
- Der fremstilles en cirkelblanding af 2 μL af 5 μM TOP1-specifikt substrat og 1 μL 100% DMSO eller 1 μL 1,6 mM camptothecin (CPT) i 14 μL 1x TOP1 reaktionsbuffer. Tilsæt 2 μL 5 ng/μL rekombinant TOP1 enzym.
BEMÆRK: Trin 3 kan startes parallelt med trin 2, og cirklerne kan opbevares ved 4 °C natten over. Alternativt kan DNA-cirklerne fremstilles samtidig med trin 4 og bruges med det samme. Se sekvensen af det TOP1-specifikke substrat i figur 1C. Underlaget foldes ind i en håndvægtsform med et dobbelt stilkområde, der indeholder et foretrukket TOP1-spaltningssted og to enkeltstrengede sløjfer. Det åbne håndvægtssubstrat omdannes til et lukket cirkulært substrat ved TOP1-medieret spaltning og ligering og benævnes herefter en cirkel. Da der er et overskud af 5'-amino primeren, vil der ikke være nogen konkurrence mellem åbne og lukkede TOP1-specifikke substrater.
4. Blokering af brøndproducenten
- Nedsænk brøndproducenten i en bakke på 5 cm x 5 cm fyldt med buffer 1, der blev forvarmet til 50 °C. Ved at bruge en pipette skal du skubbe væsken inde i brøndene for at sikre, at der ikke er luftbobler. Inkuberes i 30 minutter ved 50 °C.
- Fjern buffer 1 og vask 2 x 1 min med dH2O. Ryst kraftigt i hånden.
- Tilsæt buffer 2, der er forvarmet til 50 °C. Sørg for, at der ikke er luftbobler i brøndene. Inkuberes i 30 minutter ved 50 °C.
- Vask 2 x 1 min med dH2O. Ryst kraftigt i hånden.
- Vask med 70% EtOH i 1 min. Ryst kraftigt i hånden.
- Lad brøndmageren sætte lufttørre.
BEMÆRK: Brug trykluft til at tørre brøndene. Alternativt er det muligt at blæse luft ved hjælp af en Pasteur-pipette. Sørg for, at brøndene er tørre, før du fortsætter.
5. Hybridisering af cirklerne til brøndmageren
- Tilføj 4 μL cirkler (lavet i trin 3) til hver tilsvarende brønd.
- Brøndproducenten anbringes i et fugtighedskammer i 1 time med dH2O ved 37 °C.
BEMÆRK: Et fugtighedskammer kan fremstilles ved hjælp af en kasse til pipettespidser fyldt med dH2O. Alternativt kan hybridiseringen udføres natten over ved 25 ° C i fugtighedskammeret.
6. Vask
- Vask brøndproducenten med buffer 3.
- Fjern buffer 3, og erstat med buffer 4.
- Fjern buffer 4 og vask med 70% EtOH.
- Fjern EtOH og lad brøndproducenten tørre.
BEMÆRK: Alle vasketrin udføres i 1 minut i en 5 cm x 5 cm bakke ved at nedsænke diaset helt. Sørg altid for, at der ikke er luftbobler inde i brøndene.
7. Forstærkning af rullende cirkel
- Forbered en RCA-blanding af 1x Phi29-reaktionsbuffer suppleret med 0,2 μg/μL BSA, 1 enhed Phi29-polymerase og enten 0,25 mM dNTP og 0,0125 mM ATTO-488-dUTP til fluorescensudlæsning eller 0,1 mM dATP, 0,1 mM DTTP, 0,1 mM dGTP, 0,09 mM dCTP og 0,01 mM Biotin-dCTP til kolorimetrisk / kemiluminescensaflæsning. Tilsæt 4 μL til hvert hul. Se figur 1E.
BEMÆRK: Fremstilling af RCA-blandingen skal ske på is. Når du inkorporerer fluorescerende nukleotider i RCA, skal du undgå direkte lys fra dette trin for at beskytte fluorophorerne. - Der inkuberes i 2 timer ved 37 °C i fugtighedskammeret. I tilfælde af fluorescerende nukleotider, der anvendes, skal du indstille fugtighedskammeret i mørke. Se figur 1F,G.
8. Vask
- For kemiluminescens- eller kolorimetriske udlæsningsprotokoller skal du vaske brøndproducenten som i trin 6 og derefter fortsætte til trin 11.
- For fluorescensudlæsningsprotokollen skal du fjerne silikonegitteret ved hjælp af pincet inden vask som i de følgende trin.
- Vask rutsjebanen i 10 min i buffer 3.
- Fjern buffer 3, og erstat med buffer 4. Vask i 5 min.
- Fjern buffer 4 og vask i 1 min i 70% EtOH.
- Fjern EtOH og lad brøndproducenten tørre.
9. Visualisering af fluorescerende rullecirkelprodukter ved hjælp af en fluorescensscanner
- Scan diaset i en fluorescensscanner ved hjælp af filtrene svarende til den anvendte fluorofor. Brug den maksimale fotomultiplier muligt, der ikke giver mætning.
BEMÆRK: Den fluorescerende scanner, der bruges til billedoptagelse i denne protokol, er udstyret med en 473 nm laser og en FAM filter-excitation 490 nm, emission 520 nm. - Importer billedet til ImageJ, og skift billedtypen til 8-bit (Billede | Skriv | 8-bit). Hvis du vil måle båndene separat, skal du begrænse det målte område ved hjælp af rektangeltegningsværktøjet fra værktøjslinjen. Tegn det ønskede område og mål intensiteten (Analyser | måle). Flyt derefter det oprindeligt tegnede område til det næste bånd og mål.
- Afbild dataene i den ønskede software. Repræsentative billeder, herunder kvantificering udtrukket fra ImageJ, er afbildet i figur 2.
10. Visualisering af fluorescerende rullende cirkelprodukter ved hjælp af et fluorescensmikroskop
- Med en EtOH-resistent pen tegnes brøndenes position, før silikonegitteret fjernes, og diaset vaskes som i trin 8.2. Efter vasketrinnene monteres glideren med 1 μL monteringsmedium uden 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og tilsæt et dækglas. For at muliggøre visualisering i kameraet skal du lime diaset på et 76 mm x 26 mm mikroskopglas.
- Analyser ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med et 60x olienedsænkningsmål og et kamera. Tag 12-15 billeder af hver prøve/brønd.
- Importer billederne til ImageJ og stak billederne (Billede | Stakke | Billede til stak). Skift billedtype til 8-bit (Billede | Skriv | 8-bit).
- Indstil tærsklen (Billede | Juster | Tærskel).
- Indstil tærsklen som følger: Indstil den nederste bjælke, og juster den øverste bjælke, så kun de rigtige signaler er røde, og baggrunden er sort. Sørg for, at tærsklen er så lav som muligt, før de virkelige signaler begynder at forsvinde.
- Fej gennem de enkelte billeder, og sørg for, at de svarer til billederne, før du indstiller tærsklen. Bemærk, at tærsklen kan ændre sig fra eksperiment til eksperiment.
- Tæl signalerne (Analyser | Analyser partikler). Sørg for, at det opsummerede felt i ImageJ-indstillingerne er markeret.
- Eksporter resultaterne til et regneark eller anden software til videre databehandling. Repræsentative billeder, herunder kvantificering udtrukket fra ImageJ, er afbildet i figur 3.
11. Kobling af HRP-konjugeret antibiotinantistof til de biotinmærkede rullecirkelprodukter
- Der tilsættes 4 μL HRP-konjugeret antibiotinantistof fortyndet 1:300 i buffer 5 suppleret med 5 % fedtfri skummetmælk og 5 % BSA til hver brønd.
- Der inkuberes i 50 minutter ved 15-25 °C i fugtighedskammeret (se figur 1H).
- Vask 3 x 3 min med Buffer 5.
- Tør brøndmageren.
12. Visualisering af de biotinmærkede rullecirkelprodukter
- Visualisering med ECL
- Bland 40 μL ECL Luminol og 40 μL H2O2 umiddelbart før brug. Tilsæt 2 μL til hvert hul.
- Visualiser diaset ved hjælp af et CCD-kamera eller på røntgenfilm.
- Visualisering med TMB
- Efter trin 11.4 skal du fjerne silikonegitteret. Tilføj derefter 400 μL TMB oven på hele diaset og læg diaset i et fugtighedskammer. Vent i ~ 5-10 minutter for farveudvikling. Efter farveudviklingen vaskes diaset med 70% EtOH.
- Visualiser farveudviklingen med det blotte øje. Tag et billede af diaset med et fotokamera eller en mobiltelefon.
- Importer billedet til ImageJ, og skift billedtypen til 8-bit (Billede | Skriv | 8-bit). Hvis du vil måle båndene separat, skal du begrænse det målte område ved hjælp af rektangeltegningsværktøjet fra værktøjslinjen. Tegn det ønskede område og mål intensiteten (Analyser | måle). Flyt derefter det oprindeligt tegnede område til det næste bånd og mål.
- Afbild dataene i den ønskede software. Repræsentative billeder, herunder kvantificering udtrukket fra ImageJ, er afbildet i figur 4, figur 5 og figur 6.
Representative Results
Her præsenteres en protokol til påvisning af TOP1-aktivitet ved hjælp af REEAD-analysen16. Protokollen blev brugt til at detektere rekombinant TOP1-aktivitet ved hjælp af fire forskellige udlæsningsmetoder: fluorescensscanner, fluorescensmikroskop, kemiluminescens og kolorimetrisk. Protokollen blev også brugt til at detektere aktiviteten af TOP1 ekstraheret fra Caco2-celler, som et eksempel på råekstrakt, med kemiluminescens eller TMB-udlæsning. Desuden blev protokollen brugt som et lægemiddelscreeningsværktøj til at detektere hæmning af rekombinant TOP1-aktivitet ved CPT som et eksempel på en TOP1-specifik hæmmer ved hjælp af kemiluminescensaflæsningsmetoden.
Resultaterne opnået ved analyse af TOP1-aktiviteten ved hjælp af fluorescensaflæsningen er afbildet i figur 2 og figur 3. En repræsentativ scanning af fluorescerende dias og den deraf følgende kvantificering er vist i figur 2. Som det fremgår af kvantificeringen, har denne udlæsning en detektionsgrænse på 12,5 ng TOP1. Repræsentative billeder og den deraf følgende kvantificering opnået ved anvendelse af fluorescerende mikroskopudlæsning er vist i figur 3. Ved hjælp af denne udlæsningsmetode er detektionsgrænsen så lidt som 0,1 ng TOP1. De resultater, der opnås ved analyse af TOP1-aktiviteten ved hjælp af kemiluminescensaflæsningen, er afbildet i figur 4, og resultaterne fra den kolorimetriske udlæsning er afbildet i figur 5. Detektionsgrænsen for disse udlæsningsmetoder er ved 6 ng TOP1 eller som TOP1 ekstraheret fra 312 Caco2-celler. Figur 6 viser målingerne af TOP1-aktiviteten i nærværelse af 80 μM CPT eller DMSO som et eksempel på anvendelse af lægemiddelscreening. Det repræsentative billede og den resulterende kvantificering af tre uafhængige eksperimenter viser, at CPT hæmmer TOP1-medieret cirkularisering af substratet som forventet24,25.
Figur 1: Skematisk gengivelse af REEAD-protokollen. (A,B) Forberedelse af de funktionaliserede dias. Silikonegitteret er fastgjort til det funktionaliserede dias. Derefter kobles 5'-aminoprimeren til diaset, hvilket muliggør forstærkning af det TOP1-specifikke substrat. (C,D) Generering af lukkede cirkulære substrater. Det TOP1-specifikke substrat foldes ind i en håndvægtsform med et foretrukket TOP1-spaltningssted i den dobbeltstrengede stilk og en primerbindende sekvens i en af de to enkeltstrengede sløjfer. (C) TOP1 frigives ved lysis af cellerne. Ved TOP1-medieret spaltning og ligering omdannes substratet til en lukket cirkel; D) der anvendes renset, rekombinant TOP1. (E) Forstærkning af rullende cirkel. De lukkede cirkulære substrater hybridiseres til den overfladeforankrede primer og forstærkes af RCA ved anvendelse af Phi29-polymerase. RCA kan opnås enten ved inkorporering af fluorescerende nukleotider som i F eller biotinylerede nukleotider som i G. De fluorescerende rullende cirkelprodukter visualiseres ved hjælp af enten et fluorescensmikroskop eller en fluorescensscanner. (H) Kobling af det HRP-konjugerede antibiotinantistof. De biotinylerede rullecirkelprodukter inkuberes med det HRP-konjugerede antibiotinantistof. Signaludviklingen medieres af HRP-enzymet, og signalerne visualiseres enten af ECL og detekteres ved hjælp af et CCD-kamera eller ved hjælp af TMB, der genererer en kolorimetrisk visualisering. Forkortelser: REEAD = rolling circle forbedret enzymaktivitetsdetektion; RCA = forstærkning af rullende cirkel; TOP1 = topoisomerase 1; HRP = peberrodsperoxidase; ECL = forbedret kemiluminescens; TMB = 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Målinger af TOP1-aktivitet ved hjælp af fluorescensscanneren. Venstre panel viser et repræsentativt billede af diaset, når man analyserer aktiviteten af 3-50 ng TOP1 ved hjælp af fluorescensscannerens udlæsningsprotokol. Højre panel viser den resulterende kvantificering. t-test med Welchs korrektion, p = 0,0064, n = 4. Forkortelse: TOP1 = topoisomerase 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Målinger af TOP1-aktivitet ved hjælp af fluorescensmikroskopet. Venstre panel viser repræsentative billeder af diaset, når aktiviteten af 0,1-12,5 ng TOP1 analyseres ved hjælp af fluorescensmikroskopudlæsningsprotokollen. Bemærk, at billederne er beskårne versioner for korrekt at vise prikkerne. Af denne grund ligner de ikke nummeret på signalerne i kvantificeringen vist i højre panel. t-test med Welchs korrektion, p = 0,0136, n = 3. Forkortelse: TOP1 = topoisomerase 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Målinger af TOP1-aktivitet ved hjælp af kemiluminescensaflæsning. (A) Venstre panel viser et repræsentativt billede af diaset, når man analyserer aktiviteten på 3-50 ng TOP1 ved hjælp af kemiluminescensaflæsningsprotokollen. Højre panel viser den resulterende kvantificering. t-test med Welchs korrektion, p < 0,0001, n = 4. (B) Venstre panel viser et repræsentativt billede af diaset, når man analyserer aktiviteten af TOP1 ekstraheret fra 156-40.000 Caco2-celler ved hjælp af kemiluminescensaflæsningsprotokollen. Højre panel viser den resulterende kvantificering. t-test med Welchs korrektion, p = 0,0224, n = 3. Forkortelser: TOP1 = topoisomerase 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Målinger af TOP1-aktivitet ved hjælp af kolorimetrisk udlæsning. (A) Venstre panel viser et repræsentativt billede af diaset, når man analyserer 3-50 ng TOP1 ved hjælp af den kolorimetriske udlæsningsprotokol. Højre panel viser den resulterende kvantificering. t-test med Welchs korrektion, p = 0,0012, n = 4. (B) Venstre panel viser et repræsentativt billede af diaset, når man analyserer aktiviteten af TOP1 ekstraheret fra 156-40.000 Caco2-celler ved hjælp af den kolorimetriske udlæsningsprotokol. Højre panel viser den resulterende kvantificering. t-test med Welchs korrektion, p = 0,0117, n = 3. Forkortelser: TOP1 = topoisomerase 1; TMB = 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Målinger af TOP1-aktivitet efter lægemiddelbehandling ved hjælp af kemiluminescensaflæsningsprotokollerne. Venstre panel viser et repræsentativt billede af diaset, når man analyserer 10 ng TOP1 i nærværelse af 5% DMSO eller 80 μM CPT i 1 min. Højre panel viser den resulterende kvantificering. t-test med Welchs korrektion, p = 0,0017, n = 3. Forkortelser: TOP1 = topoisomerase 1; CPT = camptothecin; DMSO = dimethylsulfoxid; Neg = negativ kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Topoisomeraser repræsenterer en klasse af DNA-modificerende enzymer, der tiltrækker høj forskning og klinisk interesse, idet de er målet for småmolekyleforbindelser med potentiel virkning i anticancerbehandling eller i bekæmpelsen af infektionssygdomme. Desuden har aktiviteten af human TOP1 vist sig at være en effektiv biomarkør for kræftprognose og behandling18,19,23. Selvom det er TOP1-aktiviteten, der påvirker effekten af en kemoterapeutisk hæmmer26, er det ofte mængden af DNA-RNA eller mængden af TOP1, der vurderes i kliniske indstillinger. Dette skyldes manglen på hurtige, nemme og gelbaserede gratis værktøjer, der kan give nøjagtig og præcis kvantificering af topoisomeraseaktivitet i alle laboratorieindstillinger.
Her beskrives en protokol for REEAD-analysen, der gør det muligt at måle TOP1-aktivitet på en gelfri måde. I denne protokol inkuberes oprenset TOP1 eller råekstrakt fra celler med et specielt designet DNA-håndvægtformet substrat, som ved spaltning / ligering medieret af TOP1 omdannes til et lukket, cirkulært molekyle. Cirklerne hybridiseres derefter på en glasoverflade og forstærkes af RCA. For at gøre det lettere at bruge ved udførelsen af reaktioner, der sker på diaset, er et silikonegitter fastgjort til glasset, hvilket gør individuelle brønde, hvor reaktionerne finder sted. På denne måde udnytter protokollen et multiwell-system - et silikonegitter - kaldet wellmaker.
Protokollen blev brugt til at detektere aktiviteten af rekombinant TOP1 og TOP1 ekstraheret fra kolorektal adenocarcinomceller Caco2, anvendt som et eksempel. Som et eksempel på REEAD, der skulle bruges som et lægemiddelscreeningsværktøj, blev protokollen desuden brugt til at detektere TOP1-aktivitetshæmning af den velkendte TOP1-hæmmer CPT24,25. Analysen blev kombineret med forskellige udlæsningsmetoder - fluorescensmikroskopi, som giver en høj følsomhed, og en fluorescensscanner, kemiluminescens eller kolorimetrisk, som kræver mindre specialiseret udstyr og træning. Den meget følsomme fluorescensmikroskopudlæsning har begrænsningerne for behovet for en fluorescensmikroskopindstilling af god kvalitet, dygtigt personale og tidskrævende billedoptagelse og analyse.
Af disse grunde præsenteres fluorescensscannerens udlæsning, der muliggør hurtigere erhvervelse og analyse, selvom det er på bekostning af følsomheden. I tilfælde af mangel på en fluorescensscanner kan to fremragende alternativer, kemiluminescens og kolorimetriske aflæsningsmetoder, overvejes. Begge metoder er hurtige og enkle og kræver intet dyrt udstyr eller specialuddannelse. I alle udlæsningsformater har REEAD mange fordele sammenlignet med de avancerede assays, som er mere tidskrævende, gelbaserede (med krav fra interkalerende midler) og mindre direkte kvantitative. Der er dog et par kritiske trin i den præsenterede protokol. Ved håndtering af lægemiddelscreeningen skal tidspunkterne, lægemiddelkoncentrationen og forholdet mellem TOP1-mængde / DNA-substrat optimeres sammenlignet med de beskrevne indstillinger, der er optimeret til CPT. Lægemidlet kan undersøges ved udførelse af en præinkubation med DNA-substratet eller en præinkubation med TOP1-enzymet. Dette kan give værdifuld information om molekylets evne til at hæmme TOP1 og give indsigt i lægemidlets virkningsmekanisme.
Hvis der oplever lave eller fraværende signaler, skyldes dette sandsynligvis en ineffektiv lysis af råprøven eller en nedbrydning af TOP1 i ekstraktet på grund af forkert brug af proteasehæmmere. Derudover kan dette også skyldes utilstrækkelig opbevaring af de vigtige assaykomponenter, såsom rekombinant TOP1, phi29-polymerase, nukleotider, substrat og primer. Endelig bør gentagne fryse-optøningscyklusser af oligonukleotiderne undgås, da dette dramatisk påvirker analyseydelsen. Når råekstrakt anvendes, skal ekstraktionseffektiviteten af den specifikke biologiske prøve optimeres, og mængden og aktiviteten af TOP1 kan variere fra det eksempel, der er rapporteret her. Af denne grund vil hvert råekstrakt, der skal testes, kræve en titrering til identifikation af assaydetektionsgrænsen og følsomhedsområdet ved anvendelse af den pågældende prøve. Protokollen er optimeret til påvisning af menneskelig TOP1. Aktiviteten af andre eukaryote TOP1'er kan måles, men NaCl-koncentrationen og inkubationstiden skal muligvis optimeres i henhold til enzymrensningsmetoden og optimal enzymaktivitet. Flere cirkulariserede substrater vil skyldes langvarig inkubation, mens færre cirkulariserede substrater vil skyldes forkortet inkubation.
Ud over de præsenterede applikationer giver REEAD mulighed for måling af TOP1-aktiviteten i råekstrakter fra små biopsier fra kræftpatienter18, forudsigelsen af den cytotoksiske anticancereffekt af CPT i kræftcellelinjer 20,21,22 og endda påvisning af enzymaktiviteten i enkeltceller20,21 . Desuden muliggør den præsenterede REEAD-indstilling ved hjælp af wellmakeren multiwell-baseret lægemiddelscreening af biblioteker af syntetiske eller naturlige forbindelser. Derudover er der udviklet en modificeret version af REEAD-analysen, kaldet REEAD C/L. Denne opsætning muliggør separate undersøgelser af spaltnings- og ligeringstrinnene i TOP1-reaktionen27. Med REEAD C / L er det muligt at bestemme virkningsmekanismen for små molekylehæmmere og karakterisere dem som TOP1 katalytiske hæmmere med potentielle antiparasitiske virkninger28 eller som TOP1-giftstoffer, der skal bruges til kræftbehandling24,25. Endelig er REEAD med specifikt redesign af DNA-substraterne for at matche de forskellige krav (til DNA-binding eller spaltningsligation) af andre TOP1-enzymer også blevet brugt til påvisning af infektionssygdomme (såsom i tilfælde af Plasmodium falciparum, der forårsager malaria29) eller Leishmania donovani og Monkeypox-virus (data ikke vist). Eller det kan bruges til at identificere små molekyleforbindelser med antipatogene virkninger. Den præsenterede protokol giver forskere inden for TOP1-feltet en nem metode til at detektere enzymaktivitet med ringe eller ingen optimering og med mulighed for at blive tilpasset til endnu bredere applikationer i fremtiden.
Disclosures
Forfatterne C.T. og K.M. er ansatte i VPCIR biosciences ApS. C.T., B.R.K. og MS er aktionærer og/eller indehavere af aktieoptioner. C.T., B.R.K. og M.S. erklærer, at de er navngivne opfindere af patentet EP2022/057172 indgivet i navnet VPCIR biosciences ApS. De øvrige forfattere erklærer, at de ikke har konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke laborant Noriko Y. Hansen, Institut for Molekylærbiologi og Genetik, Aarhus Universitet, for teknisk bistand i forbindelse med Phi29 og TOP1 enzymoprensninger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
References
- Baldwin, E. L., Osheroff, N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).
- Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).
- Ikeguchi, M., et al. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).
- Meisenberg, C., et al. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).
- Palshof, J. A., et al. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).
- Proszek, J., et al. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).
- Leppard, J. B., Champoux, J. J. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).
- Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).
- Redinbo, M. R., et al. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).
- Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M. Topoisomerase assays. Current Protocols in Pharmacology. 57 (1), 3 (2012).
- Tesauro, C., et al. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).
- Keller, J. G., et al. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).
- Christiansen, K., Westergaard, O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).
- Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).
- Stougaard, M., et al. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).
- Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).
- Jakobsen, A. K., et al. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).
- Jakobsen, A. K., et al. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).
- Keller, J. G., et al. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).
- Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R. Enzymatic activity in single cells. Trends in Biotechnology. 29 (5), 222-230 (2019).
- Tesauro, C., et al. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240 (2020).
- Tesauro, C., et al. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).
- Pommier, Y. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).
- Bailly, C. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398 (2019).
- Petersen, K. V., et al. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255 (2021).
- García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).
- Hede, M. S., et al. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
