Summary
تظهر هنا طريقة لتغذية القراد في الدم في المختبر عبر نظام غشاء اصطناعي للسماح باحتقان جزئي أو كامل لمجموعة متنوعة من مراحل حياة القراد.
Abstract
القراد والأمراض المرتبطة بها هي موضوع مهم للدراسة بسبب الصحة العامة والعبء البيطري. ومع ذلك ، فإن متطلبات تغذية القراد أثناء الدراسة والتربية يمكن أن تحد من الأسئلة التجريبية أو قدرة المختبرات على البحث عن القراد ومسببات الأمراض المرتبطة به. يمكن لنظام التغذية بالغشاء الاصطناعي أن يقلل من هذه المشاكل ويفتح طرقا جديدة للبحث ربما لم تكن ممكنة مع أنظمة تغذية الحيوانات التقليدية. تصف هذه الدراسة نظام تغذية الغشاء الاصطناعي الذي تم تحسينه للتغذية ونجاح الاحتقان لجميع مراحل حياة Ixodes scapularis . علاوة على ذلك ، يمكن تعديل نظام تغذية الغشاء الاصطناعي الموصوف في هذه الدراسة للاستخدام مع أنواع القراد الأخرى من خلال التحسين البسيط لسمك الغشاء المطلوب. يتم موازنة فوائد نظام التغذية بالغشاء الاصطناعي من خلال كثافة اليد العاملة للنظام ، والعوامل البيئية الإضافية التي قد تؤثر على نجاح التغذية ، والحاجة إلى تحسين التقنية لكل نوع جديد ومرحلة حياة القراد.
Introduction
تؤثر الأمراض المنقولة بالقراد بشدة على صحة البشر والحيوانات في جميع أنحاء العالم ، كونها مسؤولة عن أكثر من ثلثي جميع الأمراض المرتبطة بالنواقل في الولايات المتحدة الأمريكية من 2004 إلى 20161. بالإضافة إلى ذلك ، تزايدت أعداد الحالات في السنوات الأخيرة ، مع تأثر المزيد من الناس والماشية بالقراد والأمراض المرتبطة به 2,3. في حين أن هناك العديد من الأسباب المحتملة للاتجاه التصاعدي في أعداد الحالات ، فإن المناخ المتغير هو عامل مهم 3,4. تؤكد الزيادة المستمرة المتوقعة في عدد حالات الأمراض المنقولة بالقراد على الحاجة إلى تطوير أدوات جديدة للتحقيق في العلاقات بين القراد ومسببات الأمراض التي تنقلها.
من المعروف أن القراد يخضع لتغيرات في علم وظائف الأعضاء والتعبير الجيني أثناء التغذية وأن هذه التغييرات تلعب دورا في انتقال مسببات الأمراض 5,6. قد يكون من الصعب إجراء دراسات تدرس آثار التغذية الكاملة والجزئية على انتقال مسببات الأمراض واكتسابها باستخدام النماذج الحيوانية ، لا سيما في الحالات التي لا تكون فيها نماذج القوارض عرضة للإصابة بممرض معين. على سبيل المثال ، تنتقل سلالة Anaplasma phagocytophilum Variant-1 بشكل طبيعي بين Ixodes scapularis والغزلان ولكنها غير قادرة على إصابة الفئران ، مما يعقد عدوى القراد في المختبر7. يمكن أيضا تطبيق أنظمة التغذية الاصطناعية للمساعدة في دراسة مسببات الأمراض مثل Borrelia burgdorferi عن طريق استخدام الطفرات المعدلة وراثيا التي لها حذف جيني يمنع الانتقال أو العدوى8. يساعد استخدام نظام التغذية الاصطناعي الباحثين على عزل دور الجينات عن طريق السماح للعدوى أو الانتقال بالحدوث فقط على جانب القراد ، وبالتالي عزل أي استجابة مضيفة قد تربك مثل هذه الدراسات.
وبالمثل ، قد لا يتم حث بعض مراحل حياة القراد المتورط في المرض وانتقال الحيوانات على التغذية على الأنواع النموذجية المختبرية الشائعة. على سبيل المثال ، يجب تغذية إناث Ixodes scapularis على الحيوانات الكبيرة ، وعادة ما تكون الأرانب9. في حين أنه غالبا ما يمكن الوصول إليها للتجارب المعملية ، فإن المتطلبات الإدارية وتربية الأرانب تتجاوز متطلبات القوارض الصغيرة وقد تكون باهظة بالنسبة لبعض المختبرات. يجب تغذية أنواع القراد الأخرى ، وخاصة تلك ذات الاهتمام البيطري ، على الماشية أو غيرها من الحيوانات الكبيرة التي لا يمكن استخدامها عمليا في معظم المختبرات. توفر طرق التغذية والعدوى في المختبر ، مثل التغذية بالغشاء الاصطناعي ، بدائل لاستخدام الحيوانات المضيفة الكبيرة أو الغريبة.
بالإضافة إلى ذلك ، يسمح استخدام نظام التغذية الاصطناعية ببعض التحليلات التي قد لا تكون ممكنة باستخدام طرق تغذية الحيوانات التقليدية. أحد الأمثلة على ذلك هو أنه من خلال فصل مصدر الدم عن آلية التغذية ، يصبح فحص الدور الذي قد يلعبه دم المضيفين المختلفين في انتقال B. burgdorferi ممكنا10. يعد هذا الفحص لدم المضيف والدور الذي يلعبه الدم نفسه في غياب الاستجابة المناعية للمضيف عاملا مهما في القدرة على فهم دورات انتقال مسببات الأمراض وعاملا يمكن أن تساعد أنظمة التغذية الاصطناعية في الإجابةعن السؤال 11. يصبح من الممكن أيضا تحديد أرقام الانتقال الدقيقة لممرض أثناء التغذية بدلا من مجرد فحص نجاح الإرسال وتأسيسه في مضيف 8,12.
بعض من أول أغشية التغذية الاصطناعية المصنوعة للقراد الصلب كانت مصنوعة من جلود الحيوانات أو الأغشية المشتقة من الحيوانات في 1950s و 1960s13،14. بسبب الطبيعة البيولوجية لهذه الأغشية ، كانت هناك مشاكل في كل من إنتاج أغشية جديدة ومدة الصلاحية. في 1990s ، تم تطوير الأغشية الاصطناعية بالكامل التي تستخدم دعم المعاوضة أو الورق أو النسيج مع تشريب السيليكون15,16. كان السيليكون مثاليا لأن خصائصه الفيزيائية تحاكي تمدد البشرة ولطفها الطفيف ، إلى جانب طبيعتها الحيوية. بناء على ذلك ، وصف كروبر وغيرين ، اللذان استندت هذه التقنية إلى عملهما ، تقنية تغذية غشاء الرايون المشبع بالسيليكون للتغذية الاصطناعية ل I. ricinus17.
أدى تحسين طرق I. scapularis ، وهو نوع وثيق الصلة ، إلى اختلافات ملحوظة في صلابة السيليكون المستخدمة في التشريب الغشائي ، وصفة إنتاج الغشاء ، وأبعاد الغرفة ، ومنشط المرفق. في حين أن التحسينات التي تم الإبلاغ عنها في هذه الدراسة قد أسفرت عن خصائص غشاء مماثلة لتلك التي أبلغ عنها Andrade et al. ، الذي طور أيضا غشاءا قائما على السيليكون يعتمد على Krober و Guerin للاستخدام في I. scapularis ، هناك اختلاف في خطوات تشريب السيليكون ، مما يسمح بالمرونة في استخدام هذا البروتوكول لمراحل الحياة غير الناضجة ل I. scapularis 15 ، 18. تصف هذه الدراسة أيضا الإضافات والتعديلات الفنية بناء على الاستخدام المتكرر لهذه الطريقة ، وأفضل الممارسات التي تؤدي إلى تغذية ناجحة ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشاكل التي قد تنشأ. تم استخدام هذه الطريقة لإطعام جميع مراحل الحياة النشطة ، وإصابة القراد بالبكتيريا المسببة للأمراض ، وتعريض القراد لجرعات متعددة من المضادات الحيوية19,20. في حين أن طريقة تغذية الغشاء الاصطناعي الموضحة هي ل I. scapularis ، فإن هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة مع الأنواع الأخرى من القراد مع تعديلات طفيفة في سمك الغشاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحضير غرفة غشاء القراد
- قم بإعداد سطح مستو غير مسامي مثل مستوى من الزجاج أو قاعدة معدنية مطلية بالسيراميك لحامل ذراع عن طريق مسحه بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم تغطيته بطبقة واحدة من الغلاف البلاستيكي ، مع التأكد من أن الغلاف البلاستيكي مسطح وبدون فقاعات أو تجاعيد (انظر الشكل 1 أ).
- قم بلصق ورق تنظيف عدسة الرايون بنسبة 100٪ على السطح المجهز. تأكد من أنها مسطحة ومشدودة قليلا مع شريط لاصق على جميع الجوانب الأربعة للورقة. يمكن تحويل قطعتين من ورق العدسة مقاس 4 بوصات × 6 إلى أغشية باستخدام وحدات التخزين الموضحة في الخطوة 1.3.
ملاحظة: هذا يكفي لإنشاء ما يصل إلى 12 غرفة تغذية (انظر الشكل 1 ب). إذا كان الغشاء مخصصا لقراد اليرقات ، فاستخدم ورق unryu بدلا من ورق تنظيف العدسة. - قم بإعداد خليط السيليكون الصلابة 00-10 عن طريق قياس 5 مل من كل جزء من مجموعة السيليكون في حاوية يمكن التخلص منها ، مع خلط السائلين برفق قبل إضافة 1.5 مل من الهكسان. استمر في الخلط حتى يصبح الخليط متجانسا ومختلطا تماما.
ملاحظة: في حالة صنع أغشية للقراد البالغ ، استخدم سيليكون صلابة 00-50. - استخدم ممسحة صغيرة لتوزيع مزيج السيليكون على ورق العدسة. السماح للوقوف لمدة 1 دقيقة للتأكد من أن السيليكون قد غارقة في ورقة العدسة. كشط السيليكون الزائد بثبات إلى الجانب مع الممسحة باستخدام كمية صغيرة من الضغط الهبوطي. قم بإجراء تمريرة ثانية باستخدام الممسحة ، دون ممارسة أي ضغط هبوطي ، لإزالة أي خطوط من السيليكون وإنتاج طبقة ناعمة.
ملاحظة: قد تتطلب هذه الخطوة من الإجراء بعض الممارسة لإنتاج أغشية ذات سمك مثالي لكل مرحلة من مراحل الحياة (البالغين: 150-200 ميكرومتر ؛ الحوريات: 90-120 ميكرومتر ؛ اليرقات: 80-100 ميكرومتر). عادة ما ينتج عن الغشاء السميك (ضمن تفاوتات التغذية في مرحلة الحياة) نتائج أفضل عن طريق تقليل التكثيف في الغرفة وتحسين خاصية الشفاء الذاتي للغشاء. - بالنسبة لليرقات فقط ، اغمس الجزء العلوي من غرفة التغذية في راتنج فلوروبوليمر Fluon (PTFE-30) عدة مرات ، مما يسمح لها بالجفاف بين التطبيقات لإنتاج طبقة متسقة.
ملاحظة: سيشكل تطبيق Fluon طبقة غير لاصقة من راتنج الفلوروبوليمر مماثلة لمقلاة الطهي غير اللاصقة. سيؤدي ذلك إلى تقليل عدد اليرقات التي تصعد إلى أعلى الغرفة21. - اترك الغشاء ليعالج لمدة 24 ساعة على الأقل في بيئة خالية من الغبار ، مثل خزانة مغلقة للمواد الكيميائية أو السلامة الحيوية ، قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. انظر الشكل 1C لمعرفة كيف تبدو ورقة عدسة الرايون بعد السماح للسيليكون بالجفاف.
- تحضير خليط السيليكون 30 صلابة لربط الغرف بالغشاء عن طريق خلط أجزاء متساوية من مزيج السيليكون A و B.
- اغمس غرف البولي كربونات حوالي ربع بوصة (6 مم) في خليط السيليكون ، ثم ضعها على لوح الغشاء ، مع الحرص على عدم تداخل أي من الشريط (الشكل 1 د).
- اسمح للسيليكون المرفق بالشفاء لمدة 24 ساعة على الأقل قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.
- باستخدام مشرط ، قم بقص الغشاء بعناية حول كل غرفة من الغرف المرفقة ، مع تقليم الحواف بحيث يمكن وضعها بسلاسة في بئر من لوحة 6 آبار دون كشط كبير على الجانبين (الشكل 1E). السماح بمواد كافية خارج الغرفة لزيادة التصاق الغشاء.
ملاحظة: إذا بقي الكثير من المواد الخارجية ، فإن الإزالة المتكررة للغرفة من لوحة 6 آبار يمكن أن تتسبب في انفصال الغشاء جزئيا عن الغرفة. يتم وصف إصلاح الأغشية المنفصلة في القسم 5. - قطع قطعة صغيرة من الغشاء المتبقي من كل من الزوايا ومركز ورقة الغشاء. قم بإزالة الغلاف البلاستيكي من كل قطعة. قم بقياس القطع باستخدام ميكرومتر لتحديد متوسط سمك الغشاء.
ملاحظة: إذا كان سمك الغشاء لا يقع ضمن نطاق التسامح لمرحلة الحياة (انظر الخطوة 1.4) ، فيجب التخلص من الأغشية وإعادة تشكيلها. سمك ورق Unryu متغير للغاية بسبب خيوطه السميكة من الألياف والمناطق الرقيقة. في حين أن هذه الخاصية تسمح لليرقات بالعثور على مناطق ذات سمك مثالي ، إلا أنها تجعل من الصعب تحديد سمك الغشاء الفعلي. - ضع غرف التغذية مع حلقة O واحدة لكل حجرة في دورق زجاجي ليتم تعقيمها عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لتعقيمها. اترك الغرف تبرد قبل استخدامها.
2. إعداد تغذية القراد
- قم بإعداد مصباح أو غرفة بحيث تضيء الأضواء لمدة 16 ساعة ثم تنطفئ لمدة 8 ساعات. إذا كنت تستخدم مصباحا ، فتأكد من أن الحمام المائي في الخطوة التالية في الظلام لمدة 8 ساعات.
- قم بإعداد حمام مائي عند 34 درجة مئوية وبدعامات بحيث يمكن للوحة ذات 6 آبار أن تجلس وتطفو فيها قليلا. استخدم أكواب زجاجية صغيرة غارقة في حمام مائي كدعم. استخدم غطاء شفافا للحمام المائي للحفاظ على دورة الضوء والظلام للقراد ؛ إذا لزم الأمر ، استخدم حامل T وغلاف بلاستيكي لعمل غطاء. لتقليل مخاطر التلوث ، أضف 0.02٪ كلوريد البنزالكونيوم إلى الحمام المائي واضبط حماما مائيا آخر على 36 درجة مئوية لتسخين الدم المبرد.
- أخرج غرف الغشاء المعدة مسبقا ، وضع الحلقة O حول الغرفة (الشكل 1F) ، ثم املأ كل غرفة بما يكفي من الإيثانول بنسبة 70٪ لتغطية الغشاء. اتركه في طبق من 6 آبار جيدا لمدة 5 دقائق ثم ابحث عن أي تسرب بين الحجرة والغشاء وفي الغشاء نفسه.
ملاحظة: إذا كان الغشاء يتسرب ، فسوف يتراكم الإيثانول في قاعدة البئر. يجب التخلص من الأغشية المتسربة. - أفرغ الإيثانول من الغرف ثم اتركه يجف في الهواء داخل خزانة السلامة الحيوية أو غطاء التدفق الرقائقي.
ملاحظة: قد يستغرق هذا عدة دقائق حسب الرطوبة المحيطة. - أثناء الانتظار ، قم بتسخين المكمل في الدم عن طريق التسخين عند 56 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. تكملة الدم البقري ناقص ميكانيكيا مع 2 جم / لتر الجلوكوز.
- بعد أن يجف الغشاء ، ضع ~ 20 ميكرولتر من المنشطات البلعمية داخل الغرفة ثم انشرها حول السطح عن طريق إمالة الغرفة. انظر القسم 6 للحصول على تعليمات بشأن إعداد المنشطات البلعمية من القراد frass.
- انتظر حتى يجف المنشط البلعمي قبل إضافة القراد إلى الحجرة إما بفرشاة أو ملقط. العمل في أسرع وقت ممكن عند نقل القراد إلى الغرفة لمنع الهروب. ضع القراد في أنبوب على الثلج لمدة 1-2 دقيقة قبل نقلها لإبطاء قدرتها على الهروب. بعد نقل القراد ، أغلق الجزء العلوي بالبارافيلم ؛ لا تفرط في تمديد البارافيلم ، لأن الحرارة من الحمام المائي يمكن أن تتسبب في تمزيقه.
ملاحظة: يعمل الملقط بشكل أفضل مع مراحل حياة الحوريات والبالغين وتعمل الفرش بشكل أفضل مع مراحل حياة اليرقات. - أضف 5 مل من الدم المعطل بالحرارة لكل بئر / غرفة في أنبوب مخروطي وضعه في حمام مائي عند 36 درجة مئوية. ارفع الدم المبرد إلى درجة حرارة الغرفة على الأقل قبل تعريض القراد له. ضع جانبا أربع غرف لكل لوحة 6 آبار لسهولة التعامل مع الغرف. يجب تجنب المزيد من الغرف لكل لوحة ، ومع ذلك ، اعتمادا على حجم الحمام المائي ، يمكن استخدام المزيد من اللوحات.
- أضف 5 ميكرولتر من 3 مللي مول ATP و 50 ميكرولتر من مخزون 100x من البنسلين / الستربتومايسين / فطريات لكل 5 مل من الدم إلى الأنبوب.
- انقل 4.5 مل من الدم إلى بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار ، ثم ضع الحجرة برفق في البئر ، واضبط ارتفاع الحلقة O على الغرفة بحيث يجلس الغشاء في الدم ولكن مستوى الدم حول الجانب لا يتجاوز البئر. ضع البئر في الدم بزاوية لتجنب تكوين فقاعة هواء بين الدم والغشاء.
ملاحظة: تظهر لوحة مكتملة في الشكل 2. - ضع غطاء الصفيحة المكونة من 6 آبار أعلى غرف التغذية ؛ ثم ضع اللوحة المكونة من 6 آبار مع غرف في الحمام المائي المحضر بدرجة حرارة 34 درجة مئوية وأغلق الغطاء.
ملاحظة: سيساعد الغطاء الموجود في الأعلى على منع الماء المكثف من ملامسة البارافيلم وتخفيف الدم في الآبار.
3. الحفاظ على قراد التغذية عن طريق تغيير الدم كل 12 ساعة
- حصة 5 مل من الدم المعطل بالحرارة لكل بئر في أنبوب وتسخينه في حمام مائي 36 درجة مئوية. قم بإذابة ATP والبنسلين / الستربتومايسين / فطريات في حمام مائي في نفس الوقت.
- أضف 5 ميكرولتر من 3 مللي مول ATP و 50 ميكرولتر من مخزون 100x من البنسلين / الستربتومايسين / فطريات لكل بئر إلى أنبوب الدم. انقل 4.5 مل من الدم إلى بئر من صفيحة جديدة مكونة من 6 آبار.
- أخرج لوحة 6 آبار مع غرفة القراد من حمام مائي. أخرج الحجرة من البئر وشطف الجزء الخارجي من الغرفة والغشاء ب 10 مل من 1x PBS المعقم لإزالة الدم.
- باستخدام ورق الترشيح المعقم ، جفف الغشاء والغرفة برفق لإزالة PBS الزائد. استبدل البارافيلم الموجود أعلى الغرفة. إذا كان هناك الكثير من التكثيف داخل الغرفة ، جفف البقع الرطبة بورق ترشيح معقم قبل ختمها باستخدام بارافيلم جديد.
- ضع حجرة القراد في اللوحة الجديدة المكونة من 6 آبار بدماء جديدة ، واضبط ارتفاع الحلقة O إذا لزم الأمر. كرر الخطوات 3.3-3.5 لكل غرفة على اللوحة. ضع غطاء اللوحة المكونة من 6 آبار فوق قمم الغرف. انقل اللوحة الجديدة المكونة من 6 آبار مرة أخرى إلى حمام مائي بدرجة حرارة 34 درجة مئوية.
- كرر الخطوات 3.1-3.5 كل 12 ساعة حتى الانتهاء من تغذية القراد. انتظر حتى تنفصل القراد عن الغشاء من تلقاء نفسها عند احتقانها أو قم بإزالتها برفق من الغشاء باستخدام ملاقط ناعمة الملمس بينما لا تزال متصلة للحصول على قراد محتقن جزئيا.
4. العلاج المضاد للفطريات
ملاحظة: أداء فقط عندما ينظر إلى نمو الفطريات على الغشاء. من المحتمل أن تتشكل الفطريات على جانب الدم من الغشاء إذا كانت التغذية ذات مدة كافية. أول مؤشر على التلوث الفطري هو رقائق صغيرة (1-3 مم) من الدم المتخثر مرئية على الغشاء. عند ملاحظة التلوث الفطري ، يمكن للعلاجات المضادة للفطريات إطالة مدة التجربة وتحسين نجاح الاحتقان.
- قم بإذابة 10000 U nystatin لكل مل في الماء المقطر ، و 5 مل لكل غرفة تغذية. مرشح تعقيم مع مرشح حقنة 0.1 ميكرومتر.
- أضف 5 مل من محلول النيستاتين لكل بئر من لوحة جديدة مكونة من 6 آبار ، بئر واحدة لكل غرفة تغذية.
- ضع غرف مغسولة PBS في المحلول. اتركيه لمدة 10 دقائق.
- شطف الأغشية المعالجة مع PBS قبل وضعها مرة أخرى في دم جديد.
- كرر العلاج المضاد للفطريات كل 2-3 أيام (حسب مدى التلوث الفطري) حتى الانتهاء من التجربة.
5. إعادة الالتصاق الأغشية المنفصلة بغراء cyanoacrylate
ملاحظة: قم بالتنفيذ فقط عند ملاحظة انفصال الغشاء.
- قد تنفصل الأغشية جزئيا عن غرف التغذية ، خاصة أثناء الإزالة من لوحة 6 آبار. إذا حدث هذا ، شطف غشاء الدم مع برنامج تلفزيوني.
- جفف المنطقة المصابة برفق. لا يلزم أن تكون جافة تماما ، لكن وجود الرطوبة يؤدي إلى ضبط الغراء بشكل أسرع.
ملاحظة: إعادة الالتصاق بالغشاء يحد من وقت العمل ، ومع ذلك ، اعتمادا على حجم الانفصال ، قد يكون من المستحسن تحديد وقت إعداد أسرع. - اضغط على كمية صغيرة من غراء cyanoacrylate في الفجوة حيث انسحب الغشاء بعيدا عن الغرفة. ثبت في مكانه لمدة ~ 2 دقيقة للسماح للغراء بالتثبيت.
- ضع الحجرة مرة أخرى في الدم في لوحة 6 آبار.
6. صنع المنشطات البلعمية
ملاحظة: قم بالتنفيذ في نهاية التغذية أو قبل بدء التغذية الغشائية.
- جمع براز القراد إما من تغذية غشاء سابقة أو مصدر آخر للقراد التغذية. قم بتخزين البراز في درجة حرارة -20 درجة مئوية قبل صنع المنشط. سحق الكريات من براز القراد وتخلط 0.1 غرام لكل 1 مل من الماء. أضف 1 mM ثلاثي الببتيد الجلوتاثيون المختزل ، وقم بإذابته ، واخلطه جيدا عن طريق الدوامة.
- مرشح تعقيم مع مرشح حقنة 0.1 ميكرومتر.
- تجمد عند -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعتمد التغذية الناجحة على ما إذا كان الاحتقان الجزئي أو الكامل مطلوبا. تغذية I. scapularis بنجاح تحويل الظل من الرمادي جونميتال للبالغين وفصل من تلقاء نفسها من الغشاء. ومع ذلك ، إذا كانت بحجم حبة البازلاء على الأقل ، فقد يتم فصلها عن الغشاء عند الانتهاء من التغذية. بالنسبة للمراحل غير الناضجة من I. scapularis ، يختلف حجم القراد المحتقن بالكامل ، ولأنهم ، على عكس البالغين ، لا يظهرون تغيرا في اللون ، فإن الانفصال هو أفضل طريقة لتحديد ما إذا كان القراد محتقنا بالكامل. انظر الشكل 3 للحصول على مثال على كيف يمكن أن تبدو nymphal I. scapularis أثناء التغذية. الكبار I. كتفي القراد يستغرق 1 أسبوع أو أكثر من التعلق حتى تبدأ في الانفصال عن الغشاء. غالبا ما تنفصل الحوريات بعد حوالي 5 أيام من التعلق ، وتبدأ اليرقات في الانفصال ~ 3-4 أيام بعد التعلق الأول. قد تستمر التغذية طالما أراد المرء الحفاظ على تغيرات الدم مرتين يوميا وطالما أن العفن لم يبدأ في النمو بما يتجاوز ما يمكن أن يتحكم فيه العلاج المضاد للفطريات. يجب فصل القراد المحتقن جزئيا يدويا عن الغشاء.
القراد غير الناضج (اليرقات والحوريات) التي تنفصل عن الغشاء من تلقاء نفسها دائما ما تتساقط بنجاح في مرحلة حياتها التالية ، وعلى افتراض أنها قد احتقنت بشكل كاف وذات حجم كبير بما يكفي ، حتى تلك التي يتم فصلها يدويا عن الغشاء في نهاية ذوبان التغذية. القراد الإناث التي تحولت إلى اللون الرمادي الداكن أثناء الاحتقان عادة ما تضع البيض بنجاح. ومع ذلك ، على عكس وسائل التغذية الطبيعية ، تنتج الإناث المحتقنة التي تتغذى على الغشاء كتل بيض أصغر وتكون أصغر حجما من نظيراتها التي تتغذى على الحيوانات بشكل طبيعي. يمكن رؤية نتائج تجربة حديثة قامت بتغذية يرقات I. scapularis من البيض من خلال احتقان الحوريات والذوبان في الجدول 1. تم تغذية الحوريات الناتجة من تغذية اليرقات الأولية 2 أشهر بعد الذوبان. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذه التجربة تحتوي على تجانس أعضاء الغزلان المضافة إلى الدم ، والتي ربما كان لها آثار ضارة على نجاح تغذية القراد.
في تجربة أخرى ، تم وضع 60 أنثى و 60 ذكرا من قراد I. scapularis في أربع غرف تغذية (30 قرادة متطابقة الجنس لكل غرفة) وسمح للقراد الأنثوي بالتغذية حتى التجديد. نشأت هذه القراد كنسل للإناث المحتقنة التي تم جمعها من الغزلان التي قتلها الصيادون. يمكن رؤية متوسط وزن كتلة البيض ومداها ، بالإضافة إلى أرقام نجاح الاحتقان (عدد الإناث اللائي وضعن البيض بعد الاحتقان والانفصال) ، في الجدول 1. تختلف أوزان كتلة البيض ل I. scapularis بشكل كبير في الأدبيات ، لكن القراد الذي تم جمعه سابقا من الغزلان التي قتلها الصيادون من مينيسوتا أنتجت كتل بيض بمتوسط وزن 77 مجم (19-147 مجم)22. معدل وفيات القراد منخفض باستخدام نظام تغذية الغشاء الاصطناعي ؛ القراد الذي لا يلتصق ويتغذى في الغالب ينجو من العملية ، مما يزيد من إمكانية محاولة إجراء المزيد من تجارب التغذية الغشائية مع الناجين.
تم استخدام هذه الطريقة لإصابة nymphal I. scapularis بمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض المنقولة بالقراد ، بما في ذلك A. phagocytophilum Variant-1 ، والتي لا يمكنها استخدام طرق عدوى القوارض التقليدية7. تم تأكيد إصابة القراد بالبكتيريا باستخدام qPCR ، وعلى الرغم من أن جميع القراد الحورية التي تغذت بنجاح كانت إيجابية بعد التغذية ، اعتمادا على الأنواع البكتيرية ، فإن العدوى ستستمر أو لا تستمر عبر19. وقد استخدمت هذه الطريقة أيضا لتغذية الإناث I. scapularis سيبروفلوكساسين. أظهرت القراد التي تم تغذيتها بنجاح ضربة قاضية مماثلة لمستويات التكافل البكتيري للقرادالمحقون 20.
الشكل 1: غرفة غشاء القراد . (أ) قاعدة حامل مطلية بالسيراميك مغطاة بغلاف بلاستيكي. (ب) ورق عدسة مثبت على قاعدة مغلفة بالبلاستيك. المستطيل الأزرق هو الممسحة المستخدمة في اللوحة C. ج: ورق العدسة بعد تشريبه بالسيليكون. د: الغرف الملحقة بغشاء حرير السيليكون. يمكن أن تستوعب كل ورقة ورق عدسة مقاس 4 بوصات × 6 في ست غرف. ه: حجرة مكتملة مزودة بغشاء حرير السيليكون. يظهر غشاء منفصل من حرير السيليكون على اليمين. (و) غرفة مكتملة مجمعة ، مع حلقة O مثبتة عليها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: إعداد موجز القراد. مثال على كيفية ظهور مجموعة من أربع غرف مع الكبار I. scapularis بمجرد إعداد كل شيء وقبل وضعه في حمام مائي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تغذية مستمرة مع حوريات Ixodes scapularis المحتقنة جزئيا. النقاط السوداء أو البنية حول مواقع التعلق (انظر الملصق A على سبيل المثال) هي الفتحة التي يمكن جمعها أثناء وبعد التغذية لصنع المنشط. وينظر إلى حوريات I. scapularis المحتقنة جزئيا على الغشاء (انظر التسمية B). يمكن رؤية قشر اليرقات المحتقنة من خلال الملصق C. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| عدد علامات البداية | عدد القراد المحتقن بنجاح | كتلة البيض متوسط الكتلة في ملغ (المدى) | |
| يرقات | 2 كتل بيض فقس | 150 | غير متوفر |
| الحوريات | 150 | 24 | غير متوفر |
| الإناث البالغات | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
الجدول 1: أرقام احتقان القراد وأوزان كتلة البيض. كانت الظروف التجريبية لاحتقان اليرقات والحوريات تحتوي على تجانس أعضاء الغزلان المضافة إلى الدم بالإضافة إلى المكملات المستخدمة في هذا البروتوكول. كانت الظروف التجريبية لاحتقان الإناث البالغات كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. تم تعريف الاحتقان الناجح على أنه إما القراد المحتقن الذي نجح في الانتقال إلى مرحلة الحياة التالية أو الإناث المحتقنة التي وضعت البيض بنجاح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر التغذية بالأغشية الاصطناعية للقراد أداة مفيدة لمجموعة متنوعة من الإجراءات التجريبية ، ولكن من غير المحتمل أن تحل محل تغذية الحيوانات لجميع التطبيقات. الحفاظ على مستعمرات كبيرة من القراد في جميع مراحل الحياة دون تغذية الحيوانات أمر لا يمكن الدفاع عنه بشكل عام. بدلا من ذلك ، يعد نظام التغذية الاصطناعية ذا قيمة لأغراض أخرى مثل إصابة القراد بمسببات الأمراض التي لا يدعمها مضيفو النموذج ، أو تقييم آثار الجرعات الخاضعة للرقابة من المركبات أو الكائنات الحية الدقيقة على القراد في بيئة تغذية مبسطة ، أو تربية مستعمرات صغيرة من القراد التي تعتمد على الحيوانات المضيفة التي لا تتوفر بسهولة في المختبر8 ، 10،11،23،24،25. بالمقارنة مع طرق تغذية الحيوانات التقليدية ، فإن التغذية بالأغشية الاصطناعية كثيفة العمالة وتمثل تحديات 15,24. ولهذه الأسباب ، فإن التغذية بالأغشية الاصطناعية ليست بديلا عن طرق التغذية التقليدية القائمة على الحيوانات ، وبدلا من ذلك تسمح بإجراء تجارب لا يمكن إجراؤها مع تغذية الحيوانات التقليدية.
الحفاظ على الظروف الصحية في كل من غرف التغذية ومستعمرة القراد أمر حيوي لتجنب التلوث الفطري والبكتيري. ومع ذلك ، عند استخدام التغذية الاصطناعية لتعريض القراد لمسببات الأمراض ، يجب تجنب مكملات البنسلين / الستربتومايسين / فطريات (P / S / F) من الدم لتجنب قتل مسببات الأمراض. يمكن أن يؤدي التعرض للقراد للسيبروفلوكساسين في الدم إلى القضاء تماما على Rickettsia buchneri ، وهو التعايش الداخلي للمبيض من I. scapularis ، من مجموعة فرعية من ذرية F1 ، في حين أن إضافة P / S / F الروتينية إلى الدم ليس لها هذا التأثير20. لم يتم إجراء دراسات انتقال مسببات الأمراض عبر المبيض باستخدام هذا النظام ، ولكن لم تلاحظ أي تغييرات في خصوبة الإناث المحتقنة في التجارب المعرضة للمضادات الحيوية مقابل تجارب التحكم. البدء السريع في تغذية واحتقان القراد يتجنب العديد من المشكلات المرتبطة بالتلوث الفطري. لهذا السبب ، يميل النظام إلى العمل بسهولة أكبر مع قراد اليرقات والحوريات ، حيث أن أوقات التغذية أقصر. يمكن أن يؤدي العلاج الدوري للأغشية الملوثة بمضادات الفطريات مثل النيستاتين إلى إطالة الوقت المتاح للاحتقان لبضعة أيام. من المهم أيضا استخدام القراد الذي تم ذوبانه لفترة كافية لتكون حريصا على إطعامه. اليرقات جاهزة بعد 2 أسابيع من اكتمال ظهور جميع اليرقات في كتلة البيض ، ولكن الحوريات والبالغين أفضل حالا إذا تم استخدامها بعد 10 أسابيع على الأقل من طرح الريش.
أظهرت هذه الطريقة نجاحا مماثلا في تغذية القراد لاستخدام المختبر ، حيث تكمل عادة 30٪ -50٪ من الإناث وحوالي 50٪ من حورية I. scapularis الاحتقان ، مقارنة بنجاح احتقان البالغين الذين يتغذون على أرانب المختبر أو الحوريات التي تتغذى على الفئران أو الهامستر19. وبالمثل ، أبلغت دراسات أخرى تستخدم غرف التغذية الاصطناعية عن معدل احتقان بنسبة 45٪ للإناث I. scapularis ومعدل تغذية 72٪ للحوريات10,18. وفي الوقت نفسه ، بالنسبة لإناث Ixodes ricinus والحوريات التي تتغذى عبر غشاء اصطناعي ، كانت معدلات الاحتقان 71٪ و 58٪ على التوالي25. لذلك ، يمكن أن تكون النتائج متغيرة اعتمادا على النظام المستخدم وأنواع القراد التي تم فحصها.
سمك الغشاء هو عامل مهم في نجاح التغذية. الأغشية الرقيقة أقل قدرة على الإغلاق حول الثقوب الصغيرة الناتجة عن فحص القراد والتعلق. بعد بدء التغذية ، تدخل المزيد من الرطوبة إلى الغرفة ، مما قد يؤدي إلى ظروف رطبة ، وتسييل وإعادة تجفيف لاحق للفراس ، والعفن. لذلك من المهم إنتاج أغشية بأقصى سمك يمكن تحمله من قبل أنواع القراد وطول hypostome في مرحلة الحياة التي سيتم إطعامها (انظر خطوات البروتوكول 1.1-1.4). تتغذى حوريات I. scapularis و Dermacentor variabilis على الأغشية التي يتراوح سمكها بين 90 ميكرومتر و 120 ميكرومتر ، بينما تتغذى الحشرات البالغة على أغشية يصل سمكها إلى ما يقرب من 200 ميكرومتر. يبلغ طول I. scapularis hypostome البالغ 500 ميكرومتر ، بينما يبلغ طول الهيبوستومات الحورية واليرقات ~ 100 ميكرومتر ، مما يثبت أنه كاف لاختراق غشاء أكثر سمكا قليلا15,26. يبلغ سمك ورق عدسة الرايون في المتوسط ~ 50 ميكرومتر والأغشية المصنوعة منه لا يقل سمكها عن 50 ميكرومتر ؛ ومع ذلك ، كما هو مذكور أعلاه ، فإن الأغشية السميكة تنتج نتائج أفضل. تعمل أغشية تغذية اليرقات بشكل جيد بسمك 80-100 ميكرومتر باستخدام ورق unryu خفيف جدا (10 جم / م3). ورق التوت غير المنتظم هذا مغطى بألياف سميكة نسبيا توفر الدعم لغشاء رقيق جدا في بعض الأماكن ، مما يسمح بمواقع ارتباط اليرقات الواسعة.
بناء على سمك الغشاء الموصى به وأحجام الحجرة ، من الأفضل الحد من عدد الإناث في الأعلاف البالغة بحد أقصى 20 أنثى (يتم وضع القراد في الغرف في خطوة البروتوكول 2.7). يخاطر المزيد من الإناث باكتظاظ مواقع التعلق ، حيث تميل القراد إلى الالتصاق ببعضها البعض بشكل وثيق ، مما قد يضر بسلامة الغشاء في المنطقة المحلية ويزيد من خطر التسرب ، فضلا عن إبطاء معدل التغذية. بالنسبة للقراد الحورية ، تكون الأرقام القصوى أعلى بكثير ولا تلاحظ أي آثار ضارة كبيرة ، حتى عند إطعام 50 حورية لكل غرفة. نظرا لأن عد اليرقات الفردية ليس معقولا ولم يلاحظ أي مشاكل في الاكتظاظ ، يوصى باستخدام نصف إلى كتلة بيضة كاملة لكل غرفة لسهولة الإعداد. تتكون كتل البيض الكاملة من ~ 1000 يرقة أو أكثر ، وعلى مدار العلف في أي مكان من عشرات إلى ~ 200 يرقة محتقنة قد تسقط من كتلة بيضة واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، تميل قراد اليرقات التي لا تتغذى إلى عدم الموت ويمكن إعادة تسكينها لتغذية لاحقة.
تم استخدام مواد بلاستيكية أخرى لإنتاج غرف التغذية ، والتي تم تحديد البولي كربونات منها لتكون الأكثر متانة وغير تفاعلية. المواد البلاستيكية الأخرى ، مثل الأكريليك ، حساسة لمحاليل التنظيف ، والتي يمكن أن تسبب الجنون والكسر ، خاصة في الأطراف المقطوعة للأنبوب. يتحمل البولي كربونات جيدا التعرض للتبييض والإيثانول والتعقيم بالأشعة فوق البنفسجية.
في حين أن القراد في الغرفة قد يعض في النهاية ويلتصق بالغشاء بسبب التحفيز الحراري للدم الدافئ تحته ، فإن المحفزات الإضافية في شكل منشطات كيميائية تساعد في تسريع هذه العملية (للحصول على الوصفة ، انظر خطوة البروتوكول 6). بالنسبة لهذه الدراسة ، يعد استخدام براز القراد الذي تم إذابته في الماء مثاليا نظرا لقدرته على الحفاظ عليه عند -20 درجة مئوية لفترات طويلة. كما أنها قابلة للتجديد بسهولة ، حيث يمكن جمع براز القراد من الأعلاف اللاحقة. بطبيعة الحال ، قد لا تتمكن تغذية الغشاء الأولى من الوصول إلى المنشط البلعمي المقترح لمستخلص براز القراد ويمكن إجراؤها بدونه للمساعدة في إنتاجه للأعلاف المستقبلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام المنشطات البلعمية البديلة ، مع نجاح الدراسات الأخرى مع محفزات كيميائية أو ميكانيكية مختلفة مثل مستخلصات الشعر أو الشعر15,24.
توفر التغذية بالأغشية الاصطناعية أدوات إضافية للباحثين العاملين في بيولوجيا مسببات الأمراض المنقولة بالقراد والقراد. إنها ميسورة التكلفة وبسيطة ، ولكنها أيضا كثيفة العمالة ، ومن المحتمل أن تتطلب بعض الاختبارات الأولية لتحسين التطبيق المطلوب وأنواع القراد / مرحلة الحياة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
- Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
- Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
- Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
- Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
- Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
- Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
- Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
- Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
- Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
- Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
- Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
- Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
- Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
- Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
- Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
- González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
- Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
