Summary
Présenté ici est une méthode pour nourrir les tiques en sang in vitro via un système de membrane artificielle pour permettre l’engorgement partiel ou complet d’une variété de stades de vie des tiques.
Abstract
Les tiques et les maladies qui leur sont associées sont un sujet d’étude important en raison de leur charge de santé publique et vétérinaire. Cependant, les besoins alimentaires des tiques pendant l’étude et l’élevage peuvent limiter les questions expérimentales ou la capacité des laboratoires à faire des recherches sur les tiques et leurs agents pathogènes associés. Un système d’alimentation par membrane artificielle peut réduire ces problèmes et ouvrir de nouvelles voies de recherche qui n’auraient peut-être pas été possibles avec les systèmes d’alimentation animale traditionnels. Cette étude décrit un système d’alimentation par membrane artificielle qui a été affiné pour le succès de l’alimentation et de l’engorgement pour tous les stades de vie d’Ixodes scapularis . De plus, le système d’alimentation par membrane artificielle décrit dans cette étude peut être modifié pour être utilisé avec d’autres espèces de tiques par simple raffinement de l’épaisseur de membrane souhaitée. Les avantages d’un système d’alimentation par membrane artificielle sont contrebalancés par l’intensité de travail du système, les facteurs environnementaux supplémentaires qui peuvent avoir une incidence sur le succès de l’alimentation et la nécessité d’affiner la technique pour chaque nouvelle espèce et stade de vie des tiques.
Introduction
Les maladies transmises par les tiques ont un impact important sur la santé des humains et des animaux dans le monde, étant responsables de plus des deux tiers de toutes les maladies associées aux vecteurs aux États-Unis entre 2004 et 20161. En outre, le nombre de cas a augmenté ces dernières années, de plus en plus de personnes et de bétail étant touchées par les tiques etles maladies qui leur sont associées2,3. Bien qu’il y ait probablement de nombreuses causes à la tendance à la hausse du nombre de cas, le changement climatique est un facteur important 3,4. L’augmentation continue prévue du nombre de cas de maladies transmises par les tiques souligne la nécessité de développer de nouveaux outils pour étudier les relations entre les tiques et les agents pathogènes qu’elles transmettent.
On sait que les tiques subissent des changements physiologiques et d’expression génique pendant l’alimentation et que ces changements jouent un rôle dans la transmission des agents pathogènes 5,6. Il peut être difficile d’effectuer des études qui examinent les effets de l’alimentation complète et partielle sur la transmission et l’acquisition d’agents pathogènes à l’aide de modèles animaux, en particulier dans les situations où les modèles de rongeurs ne sont pas sensibles à l’infection par un agent pathogène particulier. Par exemple, la souche Anaplasma phagocytophilum Variant-1 est naturellement transmise entre Ixodes scapularis et les cerfs, mais est incapable d’infecter les souris, ce qui complique l’infection des tiques en laboratoire7. Les systèmes d’alimentation artificiels peuvent également être appliqués pour aider à étudier des agents pathogènes tels que Borrelia burgdorferi via l’utilisation de mutants transgéniques qui ont des délétions de gènes qui inhibent la transmission ou l’infection8. L’utilisation d’un système d’alimentation artificiel aide les chercheurs à isoler le rôle des gènes en permettant à l’infection ou à la transmission de se produire uniquement du côté de la tique, isolant ainsi toute réponse de l’hôte qui pourrait confondre de telles études.
De même, certains stades de vie des tiques impliquées dans la transmission de maladies et d’animaux peuvent ne pas être incités à se nourrir d’espèces modèles de laboratoire communes. Les femelles d’Ixodes scapularis , par exemple, doivent être nourries avec des animaux plus gros, généralement des lapins9. Bien que souvent accessibles pour l’expérimentation en laboratoire, les exigences administratives et d’élevage liées à l’utilisation de lapins dépassent celles des petits rongeurs et peuvent être prohibitives pour certains laboratoires. Les autres espèces de tiques, en particulier celles qui suscitent des préoccupations vétérinaires, doivent être nourries avec du bétail ou d’autres gros animaux qui ne sont pas pratiques à utiliser dans la plupart des laboratoires. Les méthodes d’alimentation in vitro et d’infection, telles que l’alimentation par membrane artificielle, offrent des alternatives à l’utilisation d’animaux hôtes de grande taille ou exotiques.
De plus, l’utilisation d’un système d’alimentation artificiel permet certaines analyses qui peuvent ne pas être possibles avec les méthodes traditionnelles d’alimentation animale. Un exemple est que, en séparant la source sanguine du mécanisme d’alimentation, l’examen du rôle que le sang de différents hôtes peut avoir dans la transmission de B. burgdorferi devient possible10. Cet examen du sang de l’hôte et du rôle que joue le sang lui-même en l’absence de réponse immunitaire de l’hôte est un facteur important pour comprendre les cycles de transmission des agents pathogènes et un facteur auquel les systèmes d’alimentation artificiels sont en mesure d’aider à répondre11. Il devient également possible de quantifier le nombre exact de transmissions d’un agent pathogène au cours d’une alimentation plutôt que de simplement examiner le succès de la transmission et l’établissement chez un hôte 8,12.
Certaines des premières membranes d’alimentation artificielles fabriquées pour les tiques dures ont été fabriquées à partir de peaux d’animaux ou de membranes d’origine animale dans les années 1950 et 196013,14. En raison de la nature biologique de ces membranes, il y avait des problèmes à la fois avec la production de nouvelles membranes et la durée de conservation. Dans les années 1990, des membranes entièrement artificielles ont été développées qui utilisaient un support de filet, de papier ou de tissu imprégné de silicone15,16. Le silicone était idéal car ses propriétés physiques imitent l’élasticité et le léger collant de la peau, ainsi que sa nature bio-inhérente. Sur cette base, Krober et Guerin, dont cette technique était basée sur les travaux, ont décrit une technique d’alimentation par membrane de rayonne imprégnée de silicone pour l’alimentation artificielle d’I. ricinus17.
Le perfectionnement des méthodes pour I. scapularis, une espèce étroitement apparentée, a conduit à des différences notables dans la dureté du silicone utilisé dans l’imprégnation membranaire, la recette pour la production de membrane, les dimensions de la chambre et le stimulant de fixation. Bien que les améliorations rapportées dans cette étude aient abouti à des caractéristiques membranaires similaires à celles rapportées par Andrade et al., qui ont également développé une membrane à base de silicone basée sur Krober et Guerin pour une utilisation chez I. scapularis, il existe une différence dans les étapes d’imprégnation de silicone, ce qui permet la flexibilité d’utiliser ce protocole pour les stades de vie immatures de I. scapularis15, 18. Cette étude décrit également les ajouts et les modifications techniques basés sur l’utilisation répétée de cette méthode, les meilleures pratiques qui aboutissent à un flux réussi et le dépannage des problèmes qui peuvent survenir. Cette méthode a été utilisée pour nourrir tous les stades de vie actifs, infecter les tiques avec des bactéries pathogènes et exposer les tiques à de multiples doses d’antibiotiques19,20. Bien que la méthode d’alimentation par membrane artificielle présentée soit pour I. scapularis, cette méthode est facilement adaptable à d’autres espèces de tiques avec des modifications mineures de l’épaisseur de la membrane.
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Protocol
1. Préparation de la chambre à membrane à tiques
- Préparez une surface plane et non poreuse telle qu’un plan de verre ou une base métallique recouverte de céramique d’un support de bras en l’essuyant avec de l’éthanol à 70 %, puis recouvrez-la d’une seule couche de pellicule de plastique, en vous assurant que la pellicule de plastique est plate et sans bulles ni rides (voir la figure 1A).
- Collez du papier nettoyant 100% rayonne sur la surface préparée. Assurez-vous qu’il est plat et légèrement tendu avec du ruban adhésif sur les quatre côtés du papier. Deux morceaux de 4 po x 6 dans du papier pour lentilles peuvent être transformés en membranes en utilisant les volumes décrits à l’étape 1.3.
NOTE: Ceci est suffisant pour constituer jusqu’à 12 chambres d’alimentation (voir Figure 1B). Si la membrane est destinée aux tiques larvaires, utilisez du papier unryu au lieu du papier de nettoyage des lentilles. - Préparer le mélange de silicone de dureté 00-10 en mesurant 5 mL de chaque partie du kit de silicone dans un récipient jetable, en mélangeant légèrement les deux liquides avant d’ajouter 1,5 mL d’hexane. Continuer à mélanger jusqu’à ce que le mélange soit homogène et bien mélangé.
REMARQUE: Si vous fabriquez des membranes pour les tiques adultes, utilisez du silicone de dureté 00-50. - Utilisez une petite raclette pour répartir le mélange de silicone sur le papier pour lentilles. Laisser reposer pendant 1 min pour s’assurer que le silicone a trempé dans le papier pour lentilles. Grattez régulièrement l’excès de silicone sur le côté avec la raclette en utilisant une petite quantité de pression vers le bas. Effectuez un deuxième passage avec la raclette, sans exercer de pression vers le bas, pour éliminer les lignes de silicone et produire une couche lisse.
NOTE: Cette étape de la procédure peut nécessiter une certaine pratique pour produire des membranes d’épaisseur optimale pour chaque stade de vie (adultes: 150-200 μm; nymphes: 90-120 μm; larves: 80-100 μm). Une membrane plus épaisse (dans les tolérances d’alimentation du stade de vie) produira généralement de meilleurs résultats en réduisant la condensation dans la chambre et en améliorant la caractéristique d’auto-guérison de la membrane. - Pour les larves seulement, trempez le haut de la chambre d’alimentation dans la résine fluoropolymère Fluon (PTFE-30) plusieurs fois, en lui permettant de sécher entre les applications pour produire une couche cohérente.
REMARQUE : L’application de Fluon formera une couche antiadhésive de résine fluoropolymère semblable à une casserole antiadhésive. Cela réduira le nombre de larves qui grimpent au sommet de la chambre21. - Laissez la membrane durcir pendant au moins 24 heures dans un environnement exempt de poussière, comme une armoire chimique ou de biosécurité fermée, avant de passer à l’étape suivante. Voir la figure 1C pour savoir à quoi ressemble le papier pour lentilles en rayonne après avoir laissé sécher le silicone.
- Préparer le mélange de silicone de 30 dureté pour fixer les chambres à la membrane en mélangeant des parties égales de mélange de silicone A et B.
- Trempez les chambres en polycarbonate d’environ un quart de pouce (6 mm) dans le mélange de silicone, puis placez-les sur la feuille de membrane, en prenant soin de ne pas chevaucher le ruban (Figure 1D).
- Laissez durcir le silicone de fixation pendant au moins 24 heures avant de passer aux étapes suivantes.
- À l’aide d’un scalpel, couper soigneusement la membrane autour de chacune des chambres attachées, en coupant les bords afin qu’elle puisse s’insérer en douceur dans un puits de la plaque à 6 puits sans trop gratter sur les côtés (figure 1E). Laisser suffisamment de matériau à l’extérieur de la chambre pour maximiser l’adhérence de la membrane.
REMARQUE: S’il reste trop de matériaux extérieurs, le retrait répété de la chambre de la plaque à 6 puits peut entraîner le détachement partiel de la membrane de la chambre. La réparation des membranes détachées est décrite à la section 5. - Coupez un petit morceau de la membrane restante de chacun des coins et du centre de la feuille de membrane. Retirez la pellicule de plastique de chaque morceau. Mesurez les pièces avec un micromètre pour déterminer l’épaisseur moyenne de la membrane.
REMARQUE : Si l’épaisseur de la membrane ne se situe pas dans la plage de tolérance pour le stade de vie (voir l’étape 1.4), les membranes doivent être jetées et refaites. L’épaisseur du papier Unryu est très variable en raison de ses brins épais de fibres et de ses régions minces. Bien que cette caractéristique permette aux larves de trouver des régions d’épaisseur optimale, elle rend difficile la détermination de l’épaisseur réelle de la membrane. - Placer les chambres d’alimentation avec un joint torique par chambre dans un bécher en verre à autoclaver à 121 °C pendant au moins 20 minutes pour stériliser. Laissez les chambres refroidir avant de les utiliser.
2. Configuration de l’alimentation contre les tiques
- Préparez une lampe ou une pièce de manière à ce que les lumières soient allumées pendant 16 h, puis éteintes pendant 8 h. Si vous utilisez une lampe, assurez-vous que le bain-marie de l’étape suivante est dans l’obscurité pendant ces 8 heures.
- Installez un bain-marie à 34 °C et avec des supports pour qu’une plaque à 6 puits puisse s’asseoir et flotter légèrement dedans. Utilisez de petits béchers en verre enfoncés dans le bain-marie comme supports. Utilisez un couvercle transparent pour le bain-marie afin de maintenir un cycle lumière-obscurité pour les tiques; si nécessaire, utilisez un support en T et une pellicule plastique pour faire une couverture. Pour réduire le risque de contamination, ajoutez 0,02 % de chlorure de benzalkonium au bain-marie et réglez un autre bain-marie à 36 °C pour réchauffer le sang réfrigéré.
- Retirez les chambres à membrane autoclavées préparées, placez le joint torique autour de la chambre (Figure 1F), puis remplissez chaque chambre avec suffisamment d’éthanol à 70% pour couvrir la membrane. Laisser reposer dans une plaque de 6 puits pendant 5 minutes, puis rechercher toute fuite entre la chambre et la membrane et dans la membrane elle-même.
REMARQUE: Si la membrane fuit, l’éthanol s’accumulera à la base du puits. Les membranes qui fuient doivent être jetées. - Videz l’éthanol des chambres, puis laissez-le sécher à l’air libre à l’intérieur d’une armoire de biosécurité ou d’une hotte à flux laminaire.
REMARQUE: Cela peut prendre plusieurs minutes en fonction de l’humidité ambiante. - En attendant, inactiver thermiquement le complément sanguin en chauffant à 56 °C pendant 40 min. Compléter le sang bovin déficiné mécaniquement avec 2 g/L de glucose.
- Une fois la membrane sèche, appliquez ~20 μL de phagostimulant à l’intérieur de la chambre, puis étalez-la sur la surface en inclinant la chambre. Voir rubrique 6 pour les instructions concernant la préparation d’un phagostimulant à partir de tiques frass.
- Attendez que le phagostimulant soit sec avant d’ajouter les tiques dans la chambre avec une brosse ou une pince. Travaillez le plus rapidement possible lors du transfert des tiques dans la chambre pour éviter toute fuite. Mettez les tiques dans un tube sur de la glace pendant 1-2 minutes avant de les transférer pour ralentir leur capacité à s’échapper. Une fois les tiques transférées, scellez le dessus avec du parafilm; Ne pas trop étirer le parafilm, car la chaleur du bain-marie peut le déchirer.
REMARQUE: Les forceps fonctionnent mieux avec les stades de vie nymphaux et adultes et les brosses fonctionnent mieux avec les stades de vie larvaires. - Ajouter 5 mL de sang inactivé par la chaleur par puits/chambre dans un tube conique et placer au bain-marie réglé à 36 °C. Amenez le sang réfrigéré au moins à la température ambiante avant d’y exposer les tiques. Réserver quatre chambres par plaque de 6 puits pour faciliter la manipulation des chambres. Plus de chambres par plaque doit être évité, cependant, selon la taille du bain-marie, plus de plaques peuvent être utilisées.
- Ajouter 5 μL de 3 mM d’ATP et 50 μL de 100x le stock de pénicilline/streptomycine/fongizone par 5 mL de sang dans le tube.
- Transférer 4,5 mL de sang dans un puits d’une plaque à 6 puits, puis placer doucement la chambre dans le puits, en ajustant la hauteur du joint torique sur la chambre de sorte que la membrane reste dans le sang mais que le taux sanguin autour du côté ne dépasse pas le puits. Placez le puits dans le sang à un angle pour éviter la formation de bulles d’air entre le sang et la membrane.
REMARQUE : Une plaque terminée est illustrée à la figure 2. - Placez le couvercle de la plaque à 6 puits au-dessus des chambres d’alimentation; Ensuite, placez la plaque à 6 puits avec des chambres dans le bain-marie préparé à 34 °C et fermez le couvercle.
REMARQUE: Le couvercle sur le dessus aidera à empêcher l’eau condensée d’entrer en contact avec le parafilm et de diluer le sang dans les puits.
3. Maintenir les tiques en train de nourrir les tiques en changeant le sang toutes les 12 heures
- Aliquote 5 mL de sang inactivé par la chaleur par puits dans un tube et réchauffez-le au bain-marie à 36 °C. Décongeler l’ATP et la pénicilline/streptomycine/fongizone au bain-marie en même temps.
- Ajouter 5 μL de 3 mM d’ATP et 50 μL de 100x le stock de pénicilline/streptomycine/fongizone par puits dans le tube sanguin. Transférer 4,5 mL de sang dans un puits d’une assiette fraîche à 6 puits.
- Sortez la plaque à 6 puits avec la chambre à tiques du bain-marie. Retirez la chambre du puits et rincez l’extérieur de la chambre et de la membrane avec 10 ml de 1x PBS stérile pour éliminer le sang.
- À l’aide de papier filtre autoclavé, sécher doucement la membrane et la chambre pour éliminer l’excès de PBS. Remplacez le parafilm sur le dessus de la chambre. S’il y a beaucoup de condensation à l’intérieur de la chambre, sécher les taches humides avec du papier filtre autoclavé avant de les sceller avec du parafilm frais.
- Placez la chambre à tiques dans la nouvelle plaque à 6 puits avec du sang frais, en ajustant la hauteur du joint torique si nécessaire. Répétez les étapes 3.3-3.5 pour chaque chambre de la plaque. Placez le couvercle de la plaque à 6 puits sur le dessus des chambres. Replacez la nouvelle plaque à 6 puits dans le bain-marie à 34 °C.
- Répétez les étapes 3.1-3.5 toutes les 12 heures jusqu’à la fin de l’alimentation de la tique. Attendez que les tiques se détachent d’elles-mêmes de la membrane lorsqu’elles sont engorgées ou retirez-les doucement de la membrane avec une pince à épiler douce au toucher tout en restant attachées pour obtenir des tiques partiellement engorgées.
4. Traitement antifongique
REMARQUE: Effectuer uniquement lorsque la croissance fongique est observée sur la membrane. Un champignon est susceptible de se former du côté sanguin de la membrane si l’alimentation est d’une durée suffisante. La première indication de contamination fongique est de petits flocons (1-3 mm) de sang coagulé visibles sur la membrane. Lorsque la contamination fongique est notée, les traitements antifongiques peuvent prolonger la durée de l’expérience et améliorer le succès de l’engorgement.
- Dissoudre 10 000 U de nystatine par mL dans de l’eau distillée, 5 mL par chambre d’alimentation. Filtrer-stériliser avec un filtre à seringue de 0,1 μm.
- Ajouter 5 mL de solution de nystatine par puits d’une nouvelle plaque à 6 puits, un puits pour chaque chambre d’alimentation.
- Placez les chambres rincées au PBS dans la solution. Laisser reposer pendant 10 min.
- Rincer les membranes traitées avec du PBS avant de les remettre dans du sang frais.
- Répétez le traitement antifongique tous les 2-3 jours (en fonction de l’étendue de la contamination fongique) jusqu’à la fin de l’expérience.
5. Membranes détachées réadhérées avec de la colle cyanoacrylate
REMARQUE: Effectuer uniquement lorsque le détachement de la membrane est remarqué.
- Les membranes peuvent se détacher partiellement des chambres d’alimentation, en particulier lors du retrait de la plaque à 6 puits. Si cela se produit, rincez la membrane du sang avec du PBS.
- Sécher doucement la zone touchée. Il n’a pas besoin d’être parfaitement sec, mais la présence d’humidité accélère le durcissement de la colle.
REMARQUE: La réadhésion de la membrane limite le temps de travail, cependant, selon la taille du détachement, un temps de prise plus rapide peut être souhaitable. - Pressez une petite quantité de colle cyanoacrylate dans l’espace où la membrane s’est éloignée de la chambre. Maintenez en place pendant ~2 minutes pour permettre à la colle de prendre.
- Replacez la chambre dans le sang dans la plaque à 6 puits.
6. Fabrication de phagostimulants
REMARQUE: Effectuer à la fin d’une alimentation ou avant qu’une alimentation membranaire n’ait commencé.
- Prélever les excréments de tiques provenant d’une alimentation membranaire antérieure ou d’une autre source d’alimentation des tiques. Conservez les matières fécales à -20 °C avant de fabriquer le phagostimulant. Écraser les granulés d’excréments de tiques et mélanger 0,1 g par 1 mL d’eau. Ajouter 1 mM de glutathion tripeptide réduit, dissoudre et mélanger soigneusement par vortex.
- Filtrer-stériliser avec un filtre à seringue de 0,1 μm.
- Congeler à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
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Representative Results
Une alimentation réussie dépend du fait qu’un engorgement partiel ou complet soit souhaité. Nourris avec succès I. scapularis prend une teinte de gris canon pour les adultes et se détache seul de la membrane. Cependant, s’ils sont au moins de la taille d’un pois, ils peuvent être détachés de la membrane lors de la fin de l’alimentation. Pour les stades immatures d’I. scapularis , la taille des tiques complètement engorgées varie, et parce que, contrairement aux adultes, elles ne présentent pas de changement de couleur, le détachement est le meilleur moyen de déterminer si une tique est complètement engorgée. Voir la figure 3 pour un exemple de l’apparence de la nymphe I. scapularis pendant une tétée. Les tiques adultes d’I. scapularis prennent 1 semaine ou plus à partir de la fixation jusqu’à ce qu’elles commencent à se détacher de la membrane; Les nymphes se détachent souvent environ 5 jours après l’attachement, et les larves commencent à se détacher ~3-4 jours après le premier attachement. Les tétées peuvent continuer aussi longtemps que l’on veut maintenir les changements sanguins deux fois par jour et tant que la moisissure n’a pas commencé à se développer au-delà de ce que le traitement antifongique peut contrôler. Les tiques partiellement engorgées doivent être détachées manuellement de la membrane.
Les tiques immatures (larves et nymphes) qui se détachent de la membrane d’elles-mêmes muent presque toujours avec succès jusqu’à leur prochain stade de vie, et en supposant qu’elles se sont suffisamment engorgées et sont d’une taille suffisamment grande, même celles qui sont détachées manuellement de la membrane à la fin d’une mue alimentaire. Les tiques femelles qui sont devenues gris canon pendant l’engorgement réussissent généralement à pondre des œufs. Cependant, contrairement aux moyens naturels d’alimentation, les femelles engorgées nourries à la membrane produisent des masses d’œufs plus petites et sont de plus petite taille que leurs homologues naturellement nourries aux animaux. Les résultats d’une expérience récente qui a nourri les larves d’I. scapularis à partir d’œufs par engorgement nymphal et mue peuvent être vus dans le tableau 1. Les nymphes résultantes de l’alimentation larvaire initiale ont été nourries 2 mois après la mue. Il est important de noter, cependant, que cette expérience a ajouté de l’homogénat d’organe de cerf au sang, ce qui peut avoir eu des effets néfastes sur le succès de l’alimentation des tiques.
Dans une autre expérience, 60 tiques I. scapularis femelles et 60 tiques I. scapularis mâles ont été placées dans quatre chambres d’alimentation (30 tiques appariées par chambre) et les tiques femelles ont été autorisées à se nourrir jusqu’à la réplétion. Ces tiques provenaient de la progéniture de femelles engorgées recueillies chez des cerfs tués par des chasseurs. Le poids moyen de la masse d’œufs et la fourchette, en plus des chiffres de réussite de l’engorgement (nombre de femelles qui ont pondu après l’engorgement et le détachement), peuvent être vus dans le tableau 1. Le poids massique des œufs pour I. scapularis est très variable dans la littérature, mais les tiques précédemment recueillies sur des cerfs tués par des chasseurs du Minnesota produisaient des masses d’œufs d’un poids moyen de 77 mg (19-147 mg)22. La mortalité des tiques est faible en utilisant le système d’alimentation par membrane artificielle; Les tiques qui ne s’attachent pas et ne se nourrissent pas survivent pour la plupart au processus, ce qui soulève la possibilité de tenter d’autres expériences d’alimentation par membrane avec les survivants.
Cette méthode a été utilisée pour infecter la nymphe I. scapularis avec une variété d’agents pathogènes transmis par les tiques, y compris A. phagocytophilum Variant-1, qui ne peut pas utiliser les méthodes traditionnelles d’infection des rongeurs7. L’infection des tiques par des bactéries a été confirmée par qPCR, et bien que toutes les tiques nymphales qui se sont nourries avec succès aient été positives après l’alimentation, selon l’espèce bactérienne, l’infection persisterait ou non transstadiquement19. Cette méthode a également été utilisée pour nourrir les femelles I. scapularis ciprofloxacine; Les tiques nourries avec succès ont montré une réduction comparable des niveaux de symbiotes bactériens aux tiques injectées20.
Figure 1 : Chambre à membrane à tiques. (A) Base de support revêtue de céramique recouverte d’une pellicule de plastique. (B) Papier pour lentilles collé sur une base enveloppée de plastique. Le rectangle bleu est la raclette utilisée dans le panneau C. (C) Papier pour lentilles après imprégnation de silicone. D) Chambres fixées à la membrane silicone-rayonne. Chaque feuille de papier de 4 po x 6 po peut accueillir six chambres. E) Une chambre complète avec la membrane silicone-rayonne. Une membrane silicone-rayonne détachée est représentée à droite. (F) Une chambre complète assemblée, avec un joint torique fixé dessus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Configuration de l’alimentation des tiques. Un exemple de ce à quoi ressemblera un ensemble de quatre chambres avec I. scapularis adulte une fois que tout est mis en place et avant qu’il ne soit placé dans le bain-marie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Une alimentation continue avec des nymphes d’Ixodes scapularis partiellement engorgées. Les points noirs ou bruns autour des sites de fixation (voir l’étiquette A par exemple) sont les frass qui peuvent être collectés pendant et après l’alimentation pour fabriquer le phagostimulant. Des nymphes d’I. scapularis partiellement engorgées sont attachées à la membrane (voir étiquette B). Une enveloppe de la mue des larves engorgées peut être vue par l’étiquette C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nombre de tiques de départ | Nombre de tiques engorgées avec succès | Masse d’oeufs Masse moyenne en mg (intervalle) | |
| Larve | 2 masses d’œufs éclos | 150 | N/A |
| Nymphes | 150 | 24 | N/A |
| Femmes adultes | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
Tableau 1 : Nombre d’engorgements de tiques et poids de masse d’œufs. Dans les conditions expérimentales d’engorgement larvaire et nymphal, un homogénat d’organe de cerf a été ajouté au sang en plus des suppléments utilisés dans ce protocole. Les conditions expérimentales d’engorgement des femelles adultes étaient telles que décrites dans le protocole ci-dessus. L’engorgement réussi a été défini comme des tiques engorgées qui ont mué avec succès au stade de vie suivant ou des femelles engorgées qui ont pondu avec succès des œufs.
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Discussion
L’alimentation par membrane artificielle des tiques fournit un outil utile pour une variété de procédures expérimentales, mais n’est pas susceptible de remplacer l’alimentation animale pour toutes les applications. Le maintien de grandes colonies de tiques à tous les stades de la vie sans nourrir les animaux est généralement intenable. Au lieu de cela, le système d’alimentation artificiel est utile à d’autres fins, telles que l’infection des tiques avec des agents pathogènes non pris en charge par des hôtes modèles, l’évaluation des impacts de doses contrôlées de composés ou de micro-organismes sur les tiques dans un environnement d’alimentation simplifié, ou l’élevage de petites colonies de tiques qui dépendent d’animaux hôtes qui ne sont pas facilement disponibles en laboratoire8, 10,11,23,24,25. Par rapport aux méthodes traditionnelles d’alimentation animale, l’alimentation par membrane artificielle exige beaucoup de main-d’œuvre et présente des défis15,24. C’est pour ces raisons que l’alimentation par membrane artificielle ne remplace pas les méthodes d’alimentation traditionnelles basées sur les animaux et permet plutôt des expériences qui ne peuvent pas être faites avec l’alimentation animale traditionnelle.
Le maintien des conditions d’hygiène à la fois dans les chambres d’alimentation et dans la colonie de tiques est essentiel pour éviter la contamination fongique et bactérienne. Cependant, lors de l’utilisation d’une alimentation artificielle pour exposer les tiques à des agents pathogènes, les suppléments de pénicilline / streptomycine / fonzone (P/S/F) doivent être évités du sang pour éviter de tuer les agents pathogènes. L’exposition des tiques à la ciprofloxacine dans le sang peut éliminer complètement Rickettsia buchneri, l’endosymbiote ovarien d’I. scapularis , d’un sous-ensemble de descendants F1, alors que l’ajout systématique de P/S/F au sang n’a pas cet effet20. Aucune étude sur la transmission transovarienne des pathogènes n’a été réalisée à l’aide de ce système, mais aucun changement n’a été observé dans la fécondité des femelles engorgées dans les expériences exposées aux antibiotiques par rapport aux expériences témoins. L’initiation rapide de l’alimentation et l’engorgement des tiques évitent bon nombre des problèmes associés à la contamination fongique; Pour cette raison, le système a tendance à travailler plus facilement avec les tiques larvaires et nymphales, car elles ont des temps d’alimentation plus courts. Le traitement périodique des membranes contaminées avec des antifongiques tels que la nystatine peut prolonger de quelques jours le temps disponible pour l’engorgement. Il est également important d’utiliser des tiques qui ont été muées assez longtemps pour être désireuses de se nourrir. Les larves sont prêtes 2 semaines après l’émergence de toutes les larves de la masse d’œufs, mais les nymphes et les adultes s’en sortent mieux s’ils sont utilisés au moins 10 semaines après la mue.
Cette méthode a montré un succès d’alimentation des tiques comparable à celui des animaux de laboratoire, avec généralement 30 % à 50 % des femelles et environ 50 % des nymphaux I. scapularis complétant l’engorgement, comparable au succès d’engorgement des adultes nourris avec des lapins de laboratoire ou des nymphes nourries avec des souris ou des hamsters19. De même, d’autres études utilisant des chambres d’alimentation artificielles ont rapporté un taux d’engorgement de 45% pour les femelles I. scapularis et de 72% pour les nymphes10,18. Pendant ce temps, pour les femelles et les nymphes d’Ixodes ricinus nourries via une membrane artificielle, les taux d’engorgement étaient respectivement de 71% et 58%,25. Par conséquent, les résultats peuvent varier en fonction du système utilisé et de l’espèce de tique étudiée.
L’épaisseur de la membrane est un facteur important dans le succès de l’alimentation; Les membranes plus minces sont moins capables de sceller autour des minuscules trous produits par le sondage et la fixation des tiques. Après le début de l’alimentation, plus d’humidité pénètre dans la chambre, ce qui peut entraîner des conditions humides, la liquéfaction et le reséchage ultérieur des frass et des moisissures. Il est donc important de produire des membranes à l’épaisseur maximale tolérable par l’espèce de tique et la longueur de l’hypostome du stade de vie à nourrir (voir les étapes du protocole 1.1-1.4). Les nymphes de I. scapularis et de Dermacentor variabilis se nourrissent de membranes entre 90 μm et 120 μm d’épaisseur, tandis que les adultes se nourrissent de membranes atteignant près de 200 μm d’épaisseur. L’hypostome I. scapularis adulte mesure 500 μm de longueur, tandis que les hypostomes nymphal et larvaire mesurent ~100 μm de long, ce qui s’avère suffisant pour pénétrer une membrane légèrement plus épaisse15,26. Le papier pour lentilles en rayonne a en moyenne une épaisseur de ~50 μm et les membranes fabriquées à partir de celui-ci ont une épaisseur minimale de 50 μm; Cependant, comme indiqué ci-dessus, des membranes plus épaisses produisent de meilleurs résultats. Les membranes d’alimentation larvaire fonctionnent bien à 80-100 μm d’épaisseur avec un papier unryu très léger (10 g/m3). Ce papier de mûrier irrégulier est lacé avec des fibres relativement épaisses qui soutiennent une membrane très mince par endroits, permettant de nombreux sites de fixation des larves.
En fonction de l’épaisseur de membrane et de la taille des chambres recommandées, il est préférable de limiter le nombre de femelles dans les aliments pour adultes à un maximum de 20 femelles (les tiques sont placées dans des chambres à l’étape 2.7 du protocole). Un plus grand nombre de femelles risquent de surpeupler les sites d’attache, car les tiques ont tendance à s’attacher très étroitement les unes aux autres, ce qui peut compromettre l’intégrité de la membrane dans la région et augmenter le risque de fuite, ainsi que ralentir le taux d’alimentation. Pour les tiques nymphales, les nombres maximaux sont beaucoup plus élevés et aucun effet néfaste significatif n’est noté, même en nourrissant 50 nymphes par chambre. Étant donné qu’il n’est pas raisonnable de compter les larves individuelles et qu’aucun problème de surpeuplement n’a été noté, une masse d’œufs d’une moitié à une masse entière par chambre est recommandée pour faciliter l’installation. Les masses d’œufs entiers comprennent ~ 1 000 larves ou plus, et au cours d’une alimentation, de dizaines à ~ 200 larves engorgées peuvent tomber d’une seule masse d’œufs. De plus, les tiques larvaires qui ne se nourrissent pas ont tendance à ne pas mourir et peuvent potentiellement être relogées pour une alimentation ultérieure.
D’autres plastiques ont été utilisés pour produire les chambres d’alimentation, dont le polycarbonate a été déterminé comme étant le plus durable et non réactif. D’autres plastiques, tels que les acryliques, sont sensibles aux solutions de nettoyage, ce qui peut provoquer des craquelures et des bris, en particulier aux extrémités coupées du tube. Le polycarbonate résiste bien à l’exposition à l’eau de Javel, à l’éthanol, à l’autoclavage et à la stérilisation aux ultraviolets.
Alors que les tiques dans une chambre peuvent éventuellement mordre et se fixer à la membrane en raison du stimulus thermique du sang réchauffé en dessous, des stimuli supplémentaires sous forme de phagostimulants chimiques aident à accélérer ce processus (pour la recette, voir l’étape 6 du protocole). Pour cette étude, l’utilisation d’excréments de tiques dissous dans l’eau est idéale en raison de leur capacité à être conservés à -20 °C pendant de longues périodes. Ils sont également facilement renouvelables, car les excréments de tiques peuvent être collectés à partir d’aliments ultérieurs. Naturellement, le premier aliment membranaire peut ne pas avoir accès au phagostimulant suggéré de l’extrait d’excréments de tiques et peut être effectué sans lui pour aider à le produire pour les aliments futurs. De plus, d’autres phagostimulants peuvent être utilisés, d’autres études ayant du succès avec différents stimuli chimiques ou mécaniques tels que les cheveux ou les extraits capillaires15,24.
L’alimentation par membrane artificielle fournit des outils supplémentaires aux chercheurs travaillant sur la biologie des tiques et des pathogènes transmis par les tiques. Il est abordable et simple, mais nécessite également beaucoup de main-d’œuvre, et nécessitera probablement des tests préliminaires pour optimiser l’application souhaitée et l’espèce / stade de vie des tiques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
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