Summary
מוצגת כאן שיטה להאכלת קרציות במבחנה באמצעות מערכת ממברנות מלאכותית המאפשרת גודש חלקי או מלא של מגוון שלבי חיים של הקרציות.
Abstract
קרציות והמחלות הנלוות אליהן הן נושא מחקר חשוב בשל בריאות הציבור והנטל הווטרינרי שלהן. עם זאת, דרישות ההזנה של קרציות במהלך המחקר והגידול יכולות להגביל שאלות ניסוי או את יכולתן של מעבדות לחקור קרציות ואת הפתוגנים הקשורים אליהן. מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות יכולה להפחית בעיות אלה ולפתוח כיווני מחקר חדשים שאולי לא היו אפשריים במערכות מסורתיות להאכלת בעלי חיים. מחקר זה מתאר מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות ששוכללה להצלחת הזנה וגודש בכל שלבי החיים של Ixodes scapularis . יתר על כן, ניתן לשנות את מערכת הזנת הממברנות המלאכותית המתוארת במחקר זה לשימוש עם מיני קרציות אחרים באמצעות עידון פשוט של עובי הממברנה הרצוי. היתרונות של מערכת הזנה מלאכותית ממברנות מאוזנים על ידי אינטנסיביות העבודה של המערכת, הגורמים הסביבתיים הנוספים שעשויים להשפיע על הצלחת ההאכלה, והצורך לשכלל את הטכניקה עבור כל מין חדש ושלב החיים של הקרציות.
Introduction
מחלות המועברות על ידי קרציות משפיעות מאוד על בריאותם של בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם, ואחראיות ליותר משני שלישים מכל המחלות הקשורות לווקטורים בארה"ב בין השנים 2004 ל -20161. בנוסף, מספר המקרים גדל בשנים האחרונות, כאשר יותר אנשים ובעלי חיים מושפעים מקרציות והמחלות הקשורות אליהן 2,3. בעוד שסביר להניח שיש סיבות רבות למגמת העלייה במספר המקרים, האקלים המשתנה הוא גורם חשוב 3,4. העלייה המתמשכת הצפויה במספר מקרי המחלה המועברת על ידי קרציות מדגישה את הצורך לפתח כלים חדשים לחקר היחסים בין קרציות לפתוגנים שהן מעבירות.
ידוע כי קרציות עוברות שינויים פיזיולוגיים וביטוי גנים במהלך ההאכלה וכי שינויים אלה ממלאים תפקיד בהעברת פתוגן 5,6. ייתכן שיהיה קשה לבצע מחקרים הבוחנים את ההשפעות של הזנה מלאה וחלקית על העברה ורכישה של פתוגנים באמצעות מודלים של בעלי חיים, במיוחד במצבים שבהם מודלים של מכרסמים אינם רגישים לזיהום על ידי פתוגן מסוים. לדוגמה, זן Anaplasma phagocytophilum Variant-1 מועבר באופן טבעי בין Ixodes scapularis לאיילים אך אינו מסוגל להדביק עכברים, מה שמסבך את זיהום הקרציות במעבדה7. מערכות הזנה מלאכותיות יכולות להיות מיושמות גם כדי לסייע בחקר פתוגנים כגון Borrelia burgdorferi באמצעות שימוש במוטציות טרנסגניות שיש להן מחיקות גנים המעכבות העברה או זיהום8. שימוש במערכת הזנה מלאכותית מסייע לחוקרים לבודד את תפקיד הגנים בכך שהוא מאפשר להדבקה או העברה להתרחש רק בצד הקרציה, ובכך לבודד כל תגובה פונדקאית שעלולה לבלבל מחקרים כאלה.
באופן דומה, ייתכן שחלק משלבי החיים של קרציות המעורבות במחלות ובהעברת בעלי חיים לא יופעלו כדי להיזון ממיני מודל מעבדה נפוצים. נקבות Ixodes scapularis , למשל, חייבות להיות מוזנות מבעלי חיים גדולים יותר, בדרך כלל ארנבות9. בעוד שלעתים קרובות נגיש לניסויי מעבדה, הדרישות המנהליות והחקלאיות של שימוש בארנבים עולות על אלה של מכרסמים קטנים ועשויות להיות אסורות עבור מעבדות מסוימות. מיני קרציות אחרים, במיוחד אלה המעוררים דאגה וטרינרית, חייבים להיות מוזנים בבקר או בבעלי חיים גדולים אחרים שאינם מעשיים לשימוש ברוב המעבדות. שיטות האכלה חוץ גופית וזיהום, כגון הזנת ממברנות מלאכותיות, מספקות חלופות לשימוש בבעלי חיים מארחים גדולים או אקזוטיים.
בנוסף, השימוש במערכת הזנה מלאכותית מאפשר ניתוחים מסוימים שאולי לא יהיו אפשריים בשיטות האכלה מסורתיות של בעלי חיים. דוגמה אחת לכך היא שעל ידי הפרדת מקור הדם ממנגנון ההזנה, מתאפשרת בחינת התפקיד שעשוי להיות לדם של פונדקאים שונים בהעברת B. burgdorferi 10. בדיקה זו של הדם המארח והתפקיד שהדם עצמו ממלא בהיעדר התגובה החיסונית של המאכסן היא גורם חשוב ביכולת להבין מחזורי העברה של פתוגנים וכזה שמערכות הזנה מלאכותיות מסוגלות לעזור לענות עליו11. כמו כן, ניתן לכמת את מספרי ההעברה המדויקים של פתוגן במהלך הזנה ולא רק לבחון את הצלחת השידור והתבססותו במארח 8,12.
חלק מממברנות ההזנה המלאכותיות הראשונות שיוצרו עבור קרציות קשות יוצרו מעורות בעלי חיים או מממברנות שמקורן בבעלי חיים בשנות ה-50 וה-60 של המאה ה-2013,14. בשל האופי הביולוגי של ממברנות אלה, היו בעיות הן בייצור של ממברנות חדשות והן בחיי מדף. בשנות ה-90 פותחו קרומים מלאכותיים לחלוטין שהשתמשו בגב של רשת, נייר או בד עם ספיגת סיליקון15,16. סיליקון היה אידיאלי מכיוון שתכונותיו הפיזיות מחקות את נחיצות העור ודביקות קלה, יחד עם טבעו הביולוגי. בהתבסס על כך, קרובר וגרין, שעל עבודתם התבססה טכניקה זו, תיארו טכניקת הזנה של קרום קרניים ספוג סיליקון עבור הזנה מלאכותית של I. ricinus17.
שכלול השיטות של I. scapularis, מין קרוב, הוביל להבדלים בולטים בקשיות הסיליקון המשמש בספיגת קרום, המתכון לייצור ממברנה, מידות התא וממריץ ההתקשרות. בעוד שהשכלולים שדווחו במחקר זה הביאו למאפייני קרום דומים לאלה שדווחו על ידי Andrade et al., שפיתחו גם קרום מבוסס סיליקון המבוסס על Krober ו- Guerin לשימוש ב- I. scapularis, קיים הבדל בשלבי ספיגת הסיליקון, המאפשר את הגמישות להשתמש בפרוטוקול זה לשלבי חיים לא בוגרים של I. scapularis15, 18. מחקר זה מתאר גם תוספות ושינויים טכניים המבוססים על שימוש חוזר ונשנה בשיטה זו, שיטות עבודה מומלצות שמביאות להזנה מוצלחת ופתרון בעיות שעלולות להתעורר. שיטה זו שימשה להאכלת כל שלבי החיים הפעילים, להדבקת קרציות בחיידקים פתוגניים ולחשיפת קרציות למינונים מרובים של אנטיביוטיקה 19,20. בעוד ששיטת האכלת הממברנה המלאכותית המוצגת היא עבור I. scapularis, שיטה זו ניתנת להתאמה בקלות למינים אחרים של קרציות עם שינויים קלים בעובי הממברנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תא קרום הקרציות
- הכינו משטח שטוח ולא נקבובי כמו בסיס זכוכית או מתכת מצופה קרמיקה של מעמד זרוע על-ידי ניגובו באתנול 70% ולאחר מכן כסו אותו בשכבה אחת של ניילון נצמד, וודאו שהניילון הנצמד שטוח וללא בועות או קמטים (ראו איור 1A).
- הדביקו נייר ניקוי עדשה 100% קרני אור למשטח המוכן. ודא שהוא שטוח ומתוח מעט באמצעות סרט דבק לכל ארבעת צידי הנייר. ניתן להפוך שתי חתיכות של 4 אינץ 'x 6 בנייר עדשה לממברנות באמצעות הנפחים המתוארים בשלב 1.3.
הערה: זה מספיק כדי ליצור עד 12 תאי האכלה (ראה איור 1B). אם הממברנה מיועדת לקרציות זחל, השתמשו בנייר unryu במקום בנייר ניקוי עדשות. - הכינו את תערובת הסיליקון בדרגת קשיות 00-10 על ידי מדידת 5 מ"ל מכל חלק של ערכת הסיליקון לתוך מיכל חד פעמי, ערבוב קל של שני הנוזלים לפני הוספת 1.5 מ"ל הקסאן. ממשיכים לערבב עד שהתערובת הומוגנית ומעורבבת היטב.
הערה: אם אתם מכינים ממברנות לקרציות בוגרות, השתמשו בסיליקון בדרגת קשיות 00-50. - השתמשו בסחיטה קטנה כדי לפזר את תערובת הסיליקון על נייר העדשה. השאירו מעמד למשך דקה אחת כדי לוודא שהסיליקון נספג בנייר העדשה. מגרדים בהתמדה את עודפי הסיליקון הצידה עם הסחיטה תוך שימוש בכמות קטנה של לחץ כלפי מטה. בצע מעבר שני עם הסחיטה, ללא הפעלת לחץ כלפי מטה, כדי להסיר קווי סיליקון ולייצר שכבה חלקה.
הערה: שלב זה של ההליך עשוי לדרוש תרגול מסוים כדי לייצר ממברנות בעובי אופטימלי לכל שלב בחיים (מבוגרים: 150-200 מיקרומטר; נימפות: 90-120 מיקרומטר; זחלים: 80-100 מיקרומטר). קרום עבה יותר (בתוך סובלנות ההזנה של שלב החיים) בדרך כלל יניב תוצאות טובות יותר על ידי הפחתת העיבוי בחדר ושיפור מאפיין הריפוי העצמי של הממברנה. - עבור זחלים בלבד, טבלו את החלק העליון של תא ההזנה בשרף פלואורופולימר פלואון (PTFE-30) מספר פעמים, ואפשרו לו להתייבש בין יישומים כדי ליצור שכבה עקבית.
הערה: היישום של Fluon ייצור שכבה נון-סטיק של שרף פלואורופולימר בדומה למחבת בישול נון סטיק. זה יפחית את מספר הזחלים שמטפסים לראש החדר21. - השאירו את הממברנה לריפוי למשך 24 שעות לפחות בסביבה נטולת אבק, כגון ארון כימיקלים או בטיחות ביולוגית סגור, לפני שתעברו לשלב הבא. ראו איור 1C כיצד נייר עדשת קרני השמש נראה לאחר שהסיליקון הורשה להתייבש.
- הכינו את תערובת הסיליקון בעלת 30 הקשיות לחיבור התאים לממברנה על ידי ערבוב חלקים שווים של תערובת סיליקון A ו-B.
- טבלו את תאי הפוליקרבונט כ-6 מ"מ לתוך תערובת הסיליקון, ולאחר מכן הניחו על יריעת הממברנה, תוך הקפדה שלא לחפוף אף סרט (איור 1D).
- אפשרו לסיליקון המתחבר להחלים למשך 24 שעות לפחות לפני שתעברו לשלבים הבאים.
- בעזרת אזמל, חתכו בזהירות את הממברנה סביב כל אחד מהתאים המחוברים, חתכו את הקצוות כך שהיא תוכל להיכנס בצורה חלקה לבאר של צלחת 6 בארות ללא גירוד רב בצדדים (איור 1E). יש לאפשר הידבקות מספקת של חומר מחוץ לתא כדי למקסם את ההדבקה של הממברנה.
הערה: אם נשאר יותר מדי חומר חיצוני, הסרה חוזרת ונשנית של החדר מהצלחת בעלת 6 הבארות עלולה לגרום לקרום להתנתק חלקית מהחדר. תיקון קרומים מנותקים מתואר בסעיף 5. - חותכים חתיכה קטנה משאריות הקרום מכל אחת מהפינות וממרכז יריעת הממברנה. הסירו את הניילון הנצמד מכל חתיכה. למדוד את חתיכות עם מיקרומטר כדי לקבוע את עובי הממברנה הממוצע.
הערה: אם עובי הממברנה אינו נופל בטווח הסיבולת לשלב החיים (ראה שלב 1.4), יש להשליך את הממברנות וליצור אותן מחדש. עובי נייר Unryu משתנה מאוד בשל גדילי סיבים עבים ואזורים דקים. בעוד מאפיין זה מאפשר לזחלים למצוא אזורים בעובי אופטימלי, הוא מקשה לקבוע את עובי הממברנה בפועל. - הניחו את תאי ההאכלה יחד עם טבעת O אחת בכל תא לתוך זכוכית כדי להיות autoclaved ב 121 ° C במשך לפחות 20 דקות כדי לעקר. הניחו לתאים להתקרר לפני השימוש בהם.
2. הגדרת הזנת הקרציות
- הכינו מנורה או חדר כך שהאורות יהיו דולקים למשך 16 שעות ולאחר מכן יכבו למשך 8 שעות. אם אתה משתמש במנורה, ודא כי אמבט המים בשלב הבא הוא בחושך עבור אלה 8 שעות.
- הגדירו אמבט מים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ועם תומכים, כך שצלחת בת 6 בארות תוכל לשבת ולצוף מעט בתוכה. השתמשו בכוסות זכוכית קטנות השקועות באמבט המים כתומכות. השתמש כיסוי שקוף עבור אמבט המים כדי לשמור על מחזור בהיר-כהה עבור הקרציות; במידת הצורך, השתמש במעמד T ובניילון נצמד כדי ליצור כיסוי. כדי להפחית את הסיכון לזיהום, להוסיף 0.02% בנזלקוניום כלוריד לאמבט המים ולהגדיר אמבט מים נוסף ל 36 מעלות צלזיוס לחימום דם צונן.
- הוציאו את תאי הממברנה האוטוקלאביים המוכנים, הניחו את טבעת ה-O מסביב לתא (איור 1F), ואז מלאו כל תא במספיק אתנול של 70% כדי לכסות את הממברנה. מניחים לצלחת 6 בארות היטב במשך 5 דקות ולאחר מכן לחפש דליפות בין החדר לממברנה ובממברנה עצמה.
הערה: אם הממברנה דולפת, אתנול יצטבר בבסיס הבאר. יש להשליך קרומים דולפים. - רוקנו את האתנול מהתאים ואז תנו לו להתייבש באוויר בתוך ארון בטיחות ביולוגית או מכסה מנוע זרימה למינרית.
הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות, בהתאם ללחות הסביבה. - בזמן ההמתנה, השבת בחום את המשלים בדם על ידי חימום ב 56 ° C למשך 40 דקות. יש ליטול תוסף מכני לדם בקר עם 2 גרם/ליטר גלוקוז.
- לאחר שהקרום יבש, יש למרוח ~20 μL של phagostimulant על החלק הפנימי של החדר ולאחר מכן להפיץ אותו על פני השטח על ידי הטיית החדר. ראה סעיף 6 להוראות לגבי הכנת פגוסטיל מריץ קרציות.
- המתינו עד שהפאגוסטימולנט יתייבש לפני שתוסיפו את הקרציות לתא בעזרת מברשת או מלקחיים. עבוד מהר ככל האפשר בעת העברת הקרציות לחדר כדי למנוע בריחה. הניחו את הקרציות בצינור על קרח למשך 1-2 דקות לפני העברתן כדי להאט את יכולתן לברוח. לאחר העברת הקרציות, לאטום את החלק העליון עם parafilm; אין למתוח יתר על המידה את הפרפילם, מכיוון שהחום מאמבט המים עלול לגרום לו להיקרע.
הערה: מלקחיים עובדים בצורה הטובה ביותר עם שלבי חיים נימפתיים ובוגרים ומברשות פועלות בצורה הטובה ביותר עם שלבי חיי הזחל. - הוסף 5 מ"ל של דם מומת בחום לכל באר / חדר לתוך צינור חרוטי ומניחים באמבט המים להגדיר על 36 ° C. הביאו דם צונן לפחות לטמפרטורת החדר לפני שאתם חושפים אליו את הקרציות. הניחו בצד ארבעה תאים לכל צלחת בת 6 בארות לטיפול קל בתאים. יש להימנע מיותר תאים לכל צלחת, עם זאת, בהתאם לגודל אמבט המים, ניתן להשתמש בצלחות נוספות.
- הוסף 5 μL של 3 mM ATP ו 50 μL של מלאי 100x של פניצילין/סטרפטומיצין/פטריות לכל 5 מ"ל דם לצינור.
- מעבירים 4.5 מ"ל של הדם לבאר של צלחת 6 בארות, ולאחר מכן מניחים בעדינות את החדר לתוך הבאר, התאמת גובה טבעת O על התא כך שהקרום יושב בדם אך רמת הדם סביב הצד אינה עולה על הבאר. הניחו את הבאר לתוך הדם בזווית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בין הדם לממברנה.
הערה: לוח שלם מוצג באיור 2. - מניחים את המכסה של צלחת 6 באר על גבי תאי האכלה; לאחר מכן, לשים את צלחת 6 באר עם תאים לתוך מוכן 34 ° C מים אמבטיה ולסגור את המכסה.
הערה: המכסה למעלה יעזור למנוע ממים מרוכזים ליצור קשר עם הפרפילם ולדלל את הדם בבארות.
3. שמירה על קרציות האכלה על ידי שינוי הדם כל 12 שעות
- Aliquot 5 מ"ל של דם מומת בחום לכל באר לתוך צינור לחמם אותו באמבט מים 36 מעלות צלזיוס. הפשירו את ה-ATP והפניצילין/סטרפטומיצין/פטריות באמבט המים בו זמנית.
- הוסף 5 μL של 3 mM ATP ו 50 μL של מלאי 100x של פניצילין/סטרפטומיצין/פטריות לכל באר לצינור הדם. מעבירים 4.5 מ"ל דם לבאר של צלחת טרייה בת 6 בארות.
- הוציאו את צלחת 6 הבארות עם תא הקרציות מאמבט המים. הסר את החדר מן הבאר ולשטוף את החלק החיצוני של החדר ואת הממברנה עם 10 מ"ל של סטרילי 1x PBS כדי להסיר את הדם.
- בעזרת נייר סינון אוטומטי, יבשו בעדינות את הממברנה ואת התא כדי להסיר את עודפי PBS. החלף את הפרפילם בחלק העליון של החדר. אם יש הרבה עיבוי בתוך התא, לטפוח יבש את הכתמים הרטובים עם נייר מסנן autoclaved לפני איטום עם parafilm טרי.
- הכניסו את תא השנתות לצלחת החדשה בעלת 6 הקידוחים עם דם טרי, והתאימו את גובה טבעת ה-O במידת הצורך. חזור על שלבים 3.3-3.5 עבור כל תא בצלחת. מניחים את המכסה של צלחת 6 בארות מעל החלק העליון של החדרים. העבר את צלחת 6 הבארות החדשה בחזרה לאמבט המים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס.
- חזור על שלבים 3.1-3.5 כל 12 שעות עד לסיום הזנת הקרציות. המתינו עד שהקרציות יתנתקו מעצמן כאשר הן חרוטות או הוציאו אותן בעדינות מהקרום עם פינצטה רכה למגע בעודן מחוברות לקבלת קרציות חרוטות חלקית.
4. טיפול אנטי פטרייתי
הערה: בצע רק כאשר צמיחה פטרייתית נראית על הממברנה. פטרייה עשויה להיווצר בצד הדם של הממברנה אם האכלה היא של משך מספיק. האינדיקציה הראשונה לזיהום פטרייתי היא פתיתים קטנים (1-3 מ"מ) של דם קרוש הנראה על הממברנה. כאשר מציינים זיהום פטרייתי, טיפולים אנטי פטרייתיים יכולים להאריך את משך הניסוי ולשפר את הצלחת הגודש.
- יש להמיס 10,000 U nystatin למ"ל במים מזוקקים, 5 מ"ל לכל תא האכלה. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.1 מיקרומטר.
- הוסף 5 מ"ל של תמיסת ניסטטין לכל באר של צלחת חדשה בת 6 בארות, באר אחת לכל תא האכלה.
- הכניסו את התאים שטופי PBS לתמיסה. מניחים ל-10 דקות.
- יש לשטוף את הקרומים המטופלים עם PBS לפני החזרתם לדם טרי.
- חזור על הטיפול האנטי פטרייתי כל 2-3 ימים (בהתאם למידת הזיהום הפטרייתי) עד להשלמת הניסוי.
5. הדבקה מחדש של קרומים מנותקים עם דבק ציאנואקרילט
הערה: יש לבצע רק כאשר מבחינים בניתוק הממברנה.
- הממברנות עשויות להתנתק חלקית מתאי ההזנה, במיוחד במהלך ההסרה מהצלחת בעלת 6 הקידוחים. אם זה קורה, לשטוף את קרום הדם עם PBS.
- יבשו בעדינות את האזור הפגוע. זה לא צריך להיות יבש לחלוטין, אבל נוכחות של לחות גורם דבק להגדיר מהר יותר.
הערה: הדבקה מחדש של הממברנה מגבילה את זמן העבודה, עם זאת, בהתאם לגודל הניתוק, זמן הגדרה מהיר יותר עשוי להיות רצוי. - סחטו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט לתוך הרווח שבו הממברנה התרחקה מהחדר. החזק במקום למשך ~2 דקות כדי לאפשר לדבק להתייצב.
- מניחים את החדר בחזרה לתוך הדם בצלחת 6 בארות.
6. ביצוע phagostimulant
הערה: בצע בסוף הזנה או לפני תחילת הזנת ממברנה.
- אספו צואת קרציות ממזון קרום קודם או ממקור אחר להאכלת קרציות. אחסנו את הצואה בטמפרטורה של -20°C לפני הכנת הפאגוסטימולנט. מרסקים את כדורי צואת הקרציות ומערבבים 0.1 גרם לכל 1 מ"ל מים. מוסיפים 1 mM טריפפטיד מופחת גלוטתיון, ממיסים ומערבבים היטב על ידי ערבול.
- יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.1 מיקרומטר.
- מקפיאים ב-20°C עד לצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האכלה מוצלחת תלויה אם רוצים גודש חלקי או מלא. מוזן בהצלחה I. scapularis להפוך גוון של אפור מתכת עבור מבוגרים להתנתק בכוחות עצמם מן הממברנה. עם זאת, אם הם לפחות בגודל אפונה, הם עשויים להיות מנותקים מן הממברנה בעת סיום האכלה. בשלבים לא בוגרים של I. scapularis , הגודל של קרציות חרוטות לחלוטין משתנה, ומכיוון שבניגוד לבוגרים, הן אינן מציגות שינוי צבע, ניתוק הוא הדרך הטובה ביותר לקבוע אם הקרצייה מעורבת במלואה. ראו איור 3 דוגמה לאופן שבו נימפה I. scapularis עשויה להיראות במהלך הזנה. קרציות I. scapularis בוגרות לוקחות שבוע או יותר מההתקשרות עד שהן מתחילות להתנתק מהממברנה; נימפות לעיתים קרובות מתנתקות כ -5 ימים לאחר ההתקשרות, והזחלים מתחילים להתנתק ~ 3-4 ימים לאחר החיבור הראשון. הזנות יכולות להימשך כל עוד רוצים לשמור על שינויי הדם פעמיים ביום וכל עוד העובש לא התחיל לגדול מעבר למה שטיפול אנטי פטרייתי יכול לשלוט בו. קרציות חרוטות חלקית צריכות להיות מנותקות ידנית מהממברנה.
קרציות לא בוגרות (זחלים ונימפות) שמתנתקות מהקרום בכוחות עצמן כמעט תמיד מצליחות להתיך לשלב החיים הבא שלהן, ובהנחה שהן התעסקו מספיק והן בגודל גדול מספיק, גם כאלה שמתנתקות ידנית מהקרום בסוף המספוא. נקבות קרציות שהפכו לאפורות במהלך הגודש בדרך כלל מטילות ביצים בהצלחה. עם זאת, בניגוד לאמצעי האכלה טבעיים, נקבות חרוטות הניזונות מברנה מייצרות מסת ביצים קטנה יותר והן בגודל קטן יותר ממקבילותיהן הניזונות באופן טבעי מבעלי חיים. תוצאות מניסוי שנערך לאחרונה שהאכילו את זחלי I. scapularis מביצים דרך גודש נימפתי והתכה ניתן לראות בטבלה 1. הנימפות שהתקבלו מהזנת הזחלים הראשונית הוזנו חודשיים לאחר ההתכה. חשוב לציין, עם זאת, כי בניסוי זה נוספו איברי צבי הומוגנט לדם, מה שעלול היה להשפיע לרעה על הצלחת האכלת הקרציות.
בניסוי אחר, 60 נקבות ו-60 קרציות I. scapularis זכרים הוכנסו לארבעה תאי האכלה (30 קרציות תואמות מין בכל חדר) ונקבות הקרציות הורשו להיזון עד להתמלא. מקורן של קרציות אלה הוא בצאצאיהן של נקבות חרוטות שנאספו מצבאים שנהרגו. את משקל מסת הביצים הממוצע ואת טווחו, בנוסף למספרי ההצלחה של הגודש (מספר הנקבות שהטילו ביצים לאחר גודש וניתוק), ניתן לראות בטבלה 1. משקלי מסת הביצים של I. scapularis משתנים מאוד בספרות, אך קרציות שנאספו בעבר מצבאים שנהרגו על ידי ציידים ממינסוטה הפיקו גושי ביצים במשקל ממוצע של 77 מ"ג (19-147 מ"ג)22. התמותה מקרציות נמוכה באמצעות מערכת הזנת הממברנה המלאכותית; קרציות שאינן נצמדות וניזונות לרוב שורדות את התהליך, מה שמעלה את האפשרות לנסות ניסויים נוספים בהזנת ממברנות עם הניצולים.
שיטה זו שימשה להדבקת נימפה I. scapularis במגוון פתוגנים הנישאים על ידי קרציות, כולל A. phagocytophilum Variant-1, אשר אינו יכול להשתמש בשיטות מסורתיות להדבקת מכרסמים7. הדבקה של הקרציות על ידי חיידקים אושרה עם qPCR, ובעוד שכל קרציות הנימפה שהואכלו בהצלחה היו חיוביות לאחר ההאכלה, בהתאם למין החיידקים, הזיהום היה נמשך או לא היה נמשך באופן טרנססטאדיאלי19. שיטה זו שימשה גם להאכלת נקבת I. scapularis ciprofloxacin; הקרציות שהואכלו בהצלחה הראו ירידה דומה ברמות הסימביונט של חיידקים לקרציות שהוזרקו20.
איור 1: תא קרום הקרציות . (A) בסיס מעמד מצופה קרמיקה מכוסה בניילון נצמד. (B) נייר עדשה המודבק לבסיס עטוף בניילון. המלבן הכחול הוא המלבן המשמש בלוח C. (C) נייר עדשה לאחר שהיה ספוג בסיליקון. (D) תאים המחוברים לקרום הסיליקון-ריון. כל גיליון נייר עדשה בגודל 4 אינץ' x 6 אינץ' יכול להכיל שישה תאים. (E) תא שלם עם קרום סיליקון-ריון. קרום סיליקון מנותק מוצג מימין. (F) תא מורכב ושלם, שעליו מאובטחת טבעת O. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת הזנת הקרציות. דוגמה כיצד קבוצה של ארבעה חדרים עם מבוגר I. scapularis ייראה ברגע שהכל מוגדר ולפני שהוא ממוקם באמבט המים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הזנה מתמשכת עם נימפות Ixodes scapularis מעורבות חלקית. הנקודות השחורות או החומות סביב אתרי ההתקשרות (ראה תווית A לדוגמה) הן הפראס שניתן לאסוף במהלך ואחרי ההזנה כדי להפוך את phagostimulant. נימפות I. scapularis חרוטות חלקית נראות מחוברות על הממברנה (ראה תווית B). קליפה של הזחלים החרוטים מותכת ניתן לראות על ידי תווית C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מספר קרציות התחלתיות | מספר הקרציות שהתחרתו בהצלחה | מסת ביצה מסה ממוצעת במ"ג (טווח) | |
| הזחלים | 2 גושי ביצים שבקעו | 150 | לא ישים |
| נימפות | 150 | 24 | לא ישים |
| נקבות בוגרות | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
טבלה 1: מספרי גודש קרציות ומשקלי מסת ביצים. בתנאים ניסיוניים של גודש זחל ונימפה נוסף הומוגנט של איברי צבי לדם בנוסף לתוספים המשמשים בפרוטוקול זה. תנאי הניסוי של גודש נשי בוגר היו כמתואר בפרוטוקול לעיל. גודש מוצלח הוגדר כקרציות חרוטות שנמסו בהצלחה לשלב החיים הבא או נקבות חרוטות שהטילו ביצים בהצלחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האכלה מלאכותית של קרציות באמצעות ממברנות מספקת כלי שימושי למגוון הליכים ניסיוניים, אך לא צפויה להחליף את האכלת בעלי החיים בכל היישומים. שמירה על מושבות גדולות של קרציות בכל שלבי החיים ללא האכלת בעלי חיים היא בדרך כלל בלתי נסבלת. במקום זאת, מערכת ההזנה המלאכותית היא בעלת ערך למטרות אחרות כגון הדבקת קרציות בפתוגנים שאינם נתמכים על ידי פונדקאי מודל, הערכת ההשפעות של מינונים מבוקרים של תרכובות או מיקרואורגניזמים על הקרציות בסביבת הזנה פשוטה, או גידול מושבות קטנות של קרציות המסתמכות על חיות מארחות שאינן זמינות בקלות במעבדה8, 10,11,23,24,25. בהשוואה לשיטות מסורתיות להאכלת בעלי חיים, האכלת ממברנות מלאכותיות היא עתירת עבודה ומציבה אתגרים15,24. מסיבות אלה, האכלת ממברנות מלאכותיות אינה תחליף לשיטות האכלה מסורתיות המבוססות על בעלי חיים, ובמקום זאת מאפשרת ניסויים שלא ניתן לבצע עם האכלת בעלי חיים מסורתית.
שמירה על תנאים היגייניים הן בתאי ההאכלה והן במושבת הקרציות חיונית למניעת זיהום פטרייתי וחיידקי. עם זאת, בעת שימוש בהזנה מלאכותית לחשיפת קרציות לפתוגנים, יש להימנע מתוספי פניצילין/סטרפטומיצין/פטריות (P/S/F) מהדם כדי להימנע מהרג הפתוגנים. חשיפה לקרציות לציפרופלוקסצין בדם יכולה לחסל לחלוטין את Rickettsia buchneri, אנדוסימביונט השחלות של I. scapularis , מתת-קבוצה של צאצאי F1, בעוד שתוספת P/S/F שגרתית לדם אינה משפיעה20. מחקרי העברת פתוגן טרנס-שחלתיים לא בוצעו באמצעות מערכת זו, אך לא נצפו שינויים בפוריות של נקבות חרוטות בניסויים שנחשפו לאנטיביוטיקה לעומת ניסויי ביקורת. התחלה מהירה של האכלה וגודש של קרציות מונעת רבות מהבעיות הקשורות לזיהום פטרייתי; מסיבה זו, המערכת נוטה לעבוד בקלות רבה יותר עם זחלים וקרציות נימפה, שכן יש להם זמני האכלה קצרים יותר. טיפול תקופתי של ממברנות מזוהמות עם antifungals כגון nystatin יכול להאריך את הזמן הזמין עבור גודש על ידי כמה ימים. חשוב גם להשתמש בקרציות שהותכו מספיק זמן כדי להיות להוטות להאכיל. הזחלים מוכנים שבועיים לאחר שכל הזחלים במסת הביצים השלימו את הופעתם, אך נימפות ובוגרים מסתדרים טוב יותר אם משתמשים בהם לפחות 10 שבועות לאחר ההתכה.
שיטה זו הראתה הצלחה דומה בהאכלת קרציות לשימוש בחיות מעבדה, כאשר בדרך כלל 30%-50% מהנקבות וכ-50% מהנימפות I. scapularis משלימות גודש, בדומה להצלחת הגודש של מבוגרים הניזונים מארנבי מעבדה או נימפות הניזונות מעכברים או אוגרים19. באופן דומה, מחקרים אחרים שהשתמשו בתאי הזנה מלאכותיים דיווחו על שיעור גודש של 45% עבור נקבות I. scapularis ושיעור האכלה של 72% עבור נימפות10,18. בינתיים, עבור נקבות Ixodes ricinus ונימפות שניזונו דרך קרום מלאכותי, שיעורי הגודש היו 71% ו-58%, בהתאמה25. לכן, התוצאות יכולות להשתנות בהתאם למערכת בשימוש ולמיני הקרציות שנחקרו.
עובי הממברנה הוא גורם חשוב בהצלחת ההזנה; קרומים דקים יותר מסוגלים פחות לאטום סביב החורים הזעירים הנוצרים על ידי חיטוט וחיבור קרציות. לאחר האכלה מתחילה, לחות יותר נכנס לחדר, אשר יכול להוביל תנאים רטובים, נזילות וייבוש מחדש לאחר מכן של frass, ועובש. לכן חשוב לייצר קרומים בעובי המרבי הנסבל על ידי מיני הקרציות ואורך ההיפוסטום של שלב החיים שיש להאכיל (ראו פרוטוקול שלבים 1.1-1.4). נימפות של I. scapularis ו-Dermacentor variabilis ניזונות מממברנות בעובי שבין 90 מיקרומטר ל-120 מיקרומטר, בעוד שבוגרים ניזונים מממברנות בעובי של כמעט 200 מיקרומטר. אורכו של ההיפוסטום I. scapularis הבוגר הוא 500 מיקרומטר, בעוד שההיפוסטומים של הנימפה והזחל הם ~100 מיקרומטר, מה שמוכיח מספיק כדי לחדור קרום מעט עבה יותר15,26. נייר עדשת Rayon בממוצע הוא ~ 50 מיקרומטר בעובי וממברנות העשויות ממנו יש מינימום של 50 מיקרומטר; עם זאת, כאמור לעיל, קרומים עבים יותר מייצרים תוצאות טובות יותר. קרומי הזנת הזחלים פועלים היטב בעובי 80-100 מיקרומטר באמצעות נייר אונריו קל מאוד (10 גרם/מ"ק). נייר תות לא סדיר זה שזור בסיבים עבים יחסית המספקים תמיכה לקרום דק מאוד במקומותיו, המאפשר אתרי חיבור רבים של הזחלים.
בהתבסס על עובי הממברנה המומלץ וגודל התא, עדיף להגביל את מספר הנקבות במזון בוגר למקסימום של 20 נקבות (הקרציות ממוקמות בתאים בשלב פרוטוקול 2.7). נקבות רבות יותר מסתכנות בצפיפות יתר באתרי ההתקשרות, שכן הקרציות נוטות להיצמד מאוד זו לזו, מה שעלול לפגוע בשלמות הממברנה באזור המקומי ולהגביר את הסיכון לדליפה, כמו גם להאט את קצב ההאכלה. עבור קרציות נימפה, המספרים המרביים גבוהים בהרבה ולא נרשמות השפעות מזיקות משמעותיות, גם כאשר מאכילים 50 נימפות בכל חדר. מכיוון שספירת הזחלים הבודדים אינה סבירה ולא נרשמו בעיות צפיפות, מומלצת מסת ביצה שלמה של חצי עד חצי תא כדי להקל על ההתקנה. מסת ביצים שלמות כוללת ~1,000 זחלים או יותר, ובמהלך האכלה בין עשרות ל~200 זחלים חרוטים עשויים לנשור ממסת ביצה אחת. נוסף על כך, קרציות זחלים שאינן ניזונות נוטות שלא למות וייתכן שהן ישוכנו מחדש להאכלה מאוחרת יותר.
פלסטיק אחר שימש לייצור תאי ההזנה, אשר פוליקרבונט נקבע להיות עמיד ביותר ולא תגובתי. פלסטיק אחר, כגון אקריליק, רגיש לתמיסות ניקוי, מה שעלול לגרום לשיגעון ושבירה, במיוחד בקצוות החתוכים של הצינור. פוליקרבונט עמיד היטב בפני חשיפה לאקונומיקה, אתנול, אוטוקלאבינג ועיקור אולטרה סגול.
בעוד קרציות בתא עשויות בסופו של דבר לנשוך ולהיצמד לממברנה עקב גירוי החום של הדם המחומם שמתחת, גירויים נוספים בצורה של פאגוסטימולנטים כימיים עוזרים להאיץ את התהליך הזה (למתכון, ראו פרוטוקול שלב 6). עבור מחקר זה, השימוש בצואת קרציות שהומסו במים הוא אידיאלי בשל יכולתן להישמר ב -20 מעלות צלזיוס לתקופות ארוכות. הם גם מתחדשים בקלות, כמו צואת קרציות ניתן לאסוף מן הזנות הבאות. באופן טבעי, ייתכן שלהזנת הממברנה הראשונה לא תהיה גישה לפאגוסטימולנט המוצע של תמצית צואת קרציות, וניתן לבצע אותה בלעדיה כדי לסייע בייצורה להזנות עתידיות. בנוסף, ניתן להשתמש בפאגוסטימולנטים חלופיים, כאשר מחקרים אחרים הצליחו עם גירויים כימיים או מכניים שונים כגון תמציות שיער או שיער15,24.
הזנת ממברנות מלאכותיות מספקת כלים נוספים לחוקרים העובדים בביולוגיה של פתוגנים הנישאים על קרציות וקרציות. זה זול ופשוט, אבל גם עתיר עבודה, וסביר להניח שידרוש כמה בדיקות מקדימות כדי לייעל את היישום הרצוי ואת מיני הקרציות / שלב החיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
- Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
- Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
- Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
- Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
- Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
- Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
- Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
- Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
- Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
- Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
- Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
- Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
- Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
- Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
- Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
- González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
- Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
