Summary
Burada sunulan, çeşitli kene yaşam aşamalarının kısmi veya tam olarak engorgementine izin vermek için yapay bir membran sistemi aracılığıyla keneleri in vitro olarak kan beslemek için bir yöntemdir.
Abstract
Keneler ve bunlarla ilişkili hastalıklar, halk sağlığı ve veterinerlik yükü nedeniyle önemli bir çalışma konusudur. Bununla birlikte, hem çalışma hem de yetiştirme sırasında kenelerin beslenme gereksinimleri, deneysel soruları veya laboratuvarların keneleri ve bunlarla ilişkili patojenleri araştırma yeteneğini sınırlayabilir. Yapay bir membran besleme sistemi bu sorunları azaltabilir ve geleneksel hayvan besleme sistemleriyle mümkün olmayabilecek yeni araştırma yolları açabilir. Bu çalışmada, tüm Ixodes skapularis yaşam evreleri için beslenme ve engorgement başarısı için rafine edilmiş yapay bir membran besleme sistemi açıklanmaktadır. Ayrıca, bu çalışmada açıklanan yapay membran besleme sistemi, istenen membran kalınlığının basit bir şekilde iyileştirilmesi yoluyla diğer kene türleriyle kullanılmak üzere değiştirilebilir. Yapay membran besleme sisteminin faydaları, sistemin emek yoğunluğu, besleme başarısını etkileyebilecek ek çevresel faktörler ve kenelerin her yeni türü ve yaşam aşaması için tekniğin rafine edilmesi ihtiyacı ile dengelenir.
Introduction
Kene kaynaklı hastalıklar, 2004'ten 2016'ya kadar ABD'deki tüm vektörle ilişkili hastalıkların üçte ikisinden fazlasından sorumlu olarak, dünyadaki insan ve hayvanların sağlığını güçlü bir şekilde etkilemektedir1. Ek olarak, vaka sayıları son yıllarda artmakta, daha fazla insan ve hayvancılık keneler ve bunlarla ilişkili hastalıklardan etkilenmektedir 2,3. Vaka sayılarındaki artış eğiliminin çok sayıda nedeni olsa da, değişen iklim önemli bir faktördür 3,4. Kene kaynaklı hastalık vakalarının sayısında öngörülen devam eden artış, keneler ve ilettikleri patojenler arasındaki ilişkileri araştırmak için yeni araçlar geliştirme ihtiyacının altını çizmektedir.
Kenelerin beslenme sırasında fizyoloji ve gen ekspresyonunda değişikliklere uğradığı ve bu değişikliklerin patojen iletiminde rol oynadığı bilinmektedir 5,6. Özellikle kemirgen modellerinin belirli bir patojen tarafından enfeksiyona duyarlı olmadığı durumlarda, hayvan modellerini kullanarak tam ve kısmi beslenmenin patojen iletimi ve edinimi üzerindeki etkilerini inceleyen çalışmalar yapmak zor olabilir. Örneğin, Anaplasma phagocytophilum Variant-1 suşu doğal olarak Ixodes scapularis ve geyik arasında bulaşır, ancak fareleri enfekte edemez ve laboratuarda kene enfeksiyonunu karmaşıklaştırır7. Yapay besleme sistemleri, Borrelia burgdorferi gibi patojenlerin, iletimi veya enfeksiyonu engelleyen gen delesyonlarına sahip transgenik mutantların kullanımı yoluyla incelenmesine yardımcı olmak için de uygulanabilir8. Yapay bir besleme sistemi kullanmak, araştırmacıların enfeksiyon veya bulaşmanın yalnızca kene tarafında gerçekleşmesine izin vererek genlerin rolünü izole etmelerine yardımcı olur, böylece bu tür çalışmaları karıştırabilecek herhangi bir konakçı tepkisini izole eder.
Benzer şekilde, hastalık ve hayvan bulaşmasında rol oynayan kenelerin bazı yaşam aşamaları, ortak laboratuvar modeli türleriyle beslenmeye teşvik edilemeyebilir. Örneğin, Ixodes scapularis dişileri, daha büyük hayvanlarla, tipik olarak tavşanlarla beslenmelidir9. Laboratuvar deneyleri için genellikle erişilebilir olsa da, tavşan kullanmanın idari ve hayvancılık gereksinimleri küçük kemirgenlerinkini aşmaktadır ve bazı laboratuvarlar için engelleyici olabilir. Diğer kene türleri, özellikle veterinerlikle ilgili olanlar, çoğu laboratuvarda kullanımı pratik olmayan sığırlar veya diğer büyük hayvanlarla beslenmelidir. Yapay membran besleme gibi in vitro besleme ve enfeksiyon yöntemleri, büyük veya egzotik konakçı hayvanların kullanımına alternatifler sunar.
Ek olarak, yapay bir besleme sisteminin kullanılması, geleneksel hayvan besleme yöntemleriyle mümkün olmayabilecek bazı analizlere izin verir. Böyle bir örnek, kan kaynağını beslenme mekanizmasından ayırarak, farklı konakçıların kanının B. burgdorferi iletiminde sahip olabileceği rolün incelenmesinin mümkün olmasıdır10. Konakçı kanın ve konakçı immün yanıtının yokluğunda kanın kendisinin oynadığı rolün incelenmesi, patojen bulaşma döngülerini anlayabilmede önemli bir faktördür ve yapay beslenme sistemlerinin11'i cevaplamaya yardımcı olabileceği bir faktördür. Ayrıca,bir yem sırasında bir patojenin kesin bulaşma sayılarını ölçmek sadece bulaşma başarısını ve bir konakçıdaki 8,12'deki kuruluşu incelemek yerine mümkün hale gelir.
Sert keneler için yapılan ilk yapay besleme zarlarından bazıları, 1950'lerde ve 1960'larda hayvan derilerinden veya hayvan kaynaklı zarlardan yapılmıştır13,14. Bu membranların biyolojik doğası nedeniyle, hem yeni membranların üretiminde hem de raf ömründe sorunlar yaşanmıştır. 1990'larda, silikon emprenye15,16 ile ağ, kağıt veya kumaş desteğini kullanan tamamen yapay membranlar geliştirildi. Silikon, fiziksel özellikleri cildin gerginliğini ve hafif yapışkanlığını ve biyo-doğal doğasıyla birlikte taklit ettiği için idealdi. Buna dayanarak, bu tekniğin çalışmalarına dayanan Krober ve Guerin, I. ricinus17'nin yapay beslenmesi için silikon emdirilmiş bir rayon membranı besleme tekniğini tanımladılar.
Yakından ilişkili bir tür olan I. skapulalis için yöntemlerin iyileştirilmesi, membran emprenyesinde kullanılan silikonun sertliğinde, membran üretim reçetesinde, odanın boyutlarında ve ataşman uyarıcısında dikkate değer farklılıklara yol açmıştır. Bu çalışmada bildirilen iyileştirmeler, I. scapularis'te kullanılmak üzere Krober ve Guerin'e dayanan silikon bazlı bir membran geliştiren Andrade ve ark. tarafından bildirilenlerle benzer membran özelliklerine neden olsa da, silikon emprenye adımlarında, I. scapularis15'in olgunlaşmamış yaşam aşamaları için bu protokolü kullanma esnekliğine izin veren bir fark vardır. 18. Bu çalışmada ayrıca, bu yöntemin tekrar tekrar kullanılmasına, başarılı bir beslemeyle sonuçlanan en iyi uygulamalara ve ortaya çıkabilecek sorunların giderilmesine dayanan eklemeler ve teknik değişiklikler açıklanmaktadır. Bu yöntem, tüm aktif yaşam aşamalarını beslemek, keneleri patojenik bakterilerle enfekte etmek ve keneleri çoklu antibiyotik dozlarına maruz bırakmak için kullanılmıştır19,20. Gösterilen yapay membran besleme yöntemi I. skapulalis için olsa da, bu yöntem membran kalınlığında küçük değişikliklerle diğer kene türlerine kolayca adapte olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kene zarı odasının hazırlanması
- Bir kol standının cam düzlemi veya seramik kaplı metal tabanı gibi düz, gözeneksiz bir yüzeyi,% 70 etanol ile silerek hazırlayın ve ardından plastik ambalajın düz ve kabarcıklar veya kırışıklıklar olmadığından emin olarak tek bir plastik sargı tabakasıyla örtün (bkz. Şekil 1A).
- %100 rayon lens temizleme kağıdını hazırlanan yüzeye bantlayın. Kağıdın dört tarafında da bantla düz ve hafif gergin olduğundan emin olun. Lens kağıdındaki 4 inç x 6'dan oluşan iki parça, adım 1.3'te açıklanan hacimler kullanılarak membran haline getirilebilir.
NOT: Bu, 12 adede kadar besleme odası oluşturmak için yeterlidir (bkz. Şekil 1B). Membran larva keneleri içinse, lens temizleme kağıdı yerine unryu kağıdı kullanın. - 00-10 sertlikteki silikon karışımını, silikon kitinin her bir parçasının 5 mL'sini tek kullanımlık bir kaba ölçerek hazırlayın, 1,5 mL hekzan eklemeden önce iki sıvıyı hafifçe karıştırın. Karışım homojen hale gelene ve iyice karışana kadar karıştırmaya devam edin.
NOT: Yetişkin keneler için membran yapıyorsanız, 00-50 sertlikte silikon kullanın. - Silikon karışımını lens kağıdının üzerine dağıtmak için küçük bir silecek kullanın. Silikonun lens kağıdına batırıldığından emin olmak için 1 dakika bekletin. Az miktarda aşağı doğru basınç kullanarak fazla silikonu silecekle yana doğru sürekli kazıyın. Herhangi bir silikon çizgisini çıkarmak ve pürüzsüz bir tabaka oluşturmak için aşağı doğru basınç uygulamadan silecek ile ikinci bir geçiş yapın.
NOT: Prosedürün bu adımı, her yaşam aşaması için optimum kalınlıkta membranlar üretmek için bazı uygulamalar gerektirebilir (yetişkinler: 150-200 μm; nimfler: 90-120 μm; larvalar: 80-100 μm). Daha kalın bir membran (yaşam aşamasının besleme toleransları dahilinde), odadaki yoğuşmayı azaltarak ve membranın kendi kendini iyileştirme özelliğini geliştirerek genellikle daha iyi sonuçlar üretecektir. - Sadece larvalar için, besleme odasının üst kısmını birkaç kez Fluon floropolimer reçinesine (PTFE-30) batırın ve tutarlı bir tabaka üretmek için uygulamalar arasında kurumasını sağlayın.
NOT: Fluon uygulaması, yapışmaz bir pişirme tavasına benzer yapışmaz bir floropolimer reçine tabakası oluşturacaktır. Bu, odanın tepesine tırmanan larva sayısını azaltacaktır21. - Bir sonraki adıma geçmeden önce, kapalı bir kimyasal veya biyogüvenlik kabini gibi tozsuz bir ortamda membranı en az 24 saat kürlenmeye bırakın. Silikonun kurumasına izin verildikten sonra rayon lens kağıdının nasıl göründüğünü öğrenmek için Şekil 1C'ye bakın.
- Silikon karışımı A ve B'nin eşit parçalarını karıştırarak odaları membrana tutturmak için 30 sertlikteki silikon karışımını hazırlayın.
- Polikarbonat odalarını silikon karışımına yaklaşık çeyrek inç (6 mm) batırın ve ardından bandın herhangi birinin üst üste binmemesine dikkat ederek membran tabakasına yerleştirin (Şekil 1D).
- Sonraki adımlara geçmeden önce tutturulan silikonun en az 24 saat sertleşmesine izin verin.
- Bir neşter kullanarak, bağlı odaların her birinin etrafındaki zarı dikkatlice kesin, kenarları kırpın, böylece yanlarda fazla kazıma olmadan 6 delikli plakanın bir kuyusuna düzgün bir şekilde sığabilir (Şekil 1E). Membranın yapışmasını en üst düzeye çıkarmak için odanın dışına yeterli malzemeye izin verin.
NOT: Çok fazla dış malzeme kalırsa, haznenin 6 delikli plakadan tekrar tekrar çıkarılması, membranın odadan kısmen ayrılmasına neden olabilir. Müstakil membranların onarımı bölüm 5'te açıklanmıştır. - Artık membranın küçük bir parçasını köşelerin her birinden ve membran tabakasının merkezinden kesin. Plastik ambalajı her parçadan çıkarın. Ortalama membran kalınlığını belirlemek için parçaları bir mikrometre ile ölçün.
NOT: Membran kalınlığı yaşam aşaması için tolerans aralığına girmiyorsa (bkz. adım 1.4), membranlar atılmalı ve yeniden yapılmalıdır. Unryu kağıt kalınlığı, kalın lif telleri ve ince bölgeleri nedeniyle oldukça değişkendir. Bu özellik larvaların optimal kalınlıktaki bölgeleri bulmasına izin verirken, gerçek membran kalınlığını belirlemeyi zorlaştırır. - Besleme odalarını, oda başına bir O-ring ile birlikte, sterilize etmek için en az 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlanacak bir cam beherin içine yerleştirin. Kullanmadan önce odaların soğumasını bekleyin.
2. Kene beslemesini ayarlama
- Işıkların 16 saat boyunca yanması ve ardından 8 saat boyunca kapanması için bir lamba veya oda hazırlayın. Bir lamba kullanıyorsanız, bir sonraki adımdaki su banyosunun bu 8 saat boyunca karanlıkta olduğundan emin olun.
- 34 ° C'de ve desteklerle bir su banyosu kurun, böylece 6 delikli bir plaka oturabilir ve hafifçe yüzebilir. Su banyosuna batırılmış küçük cam bardakları destek olarak kullanın. Keneler için açık-karanlık bir döngü sürdürmek için su banyosu için şeffaf bir kapak kullanın; Gerekirse, bir kapak yapmak için bir T-standı ve plastik bir sargı kullanın. Kirlenme riskini azaltmak için, su banyosuna% 0.02 benzalkonyum klorür ekleyin ve soğutulmuş kanı ısıtmak için başka bir su banyosunu 36 ° C'ye ayarlayın.
- Önceden hazırlanmış, otoklavlanmış membran odalarını çıkarın, O-ringi odanın etrafına yerleştirin (Şekil 1F) ve ardından her odayı membranı örtmek için yeterli% 70 etanol ile doldurun. 6 delikli bir plakada 5 dakika bekletin ve ardından oda ile membran arasında ve membranın kendisinde herhangi bir sızıntı olup olmadığına bakın.
NOT: Membran sızıntı yapıyorsa, kuyunun tabanında etanol birikecektir. Sızdıran membranlar atılmalıdır. - Etanol'ü odalardan boşaltın ve ardından bir biyogüvenlik kabini veya laminer akış davlumbazının içinde hava ile kurumasını bekleyin.
NOT: Bu işlem, ortam nemine bağlı olarak birkaç dakika sürebilir. - Beklerken, kandaki tamamlayıcıyı 40 dakika boyunca 56 ° C'de ısıtarak etkisiz hale getirin. Mekanik olarak defibrinlenmiş sığır kanını 2 g / L glikoz ile destekleyin.
- Membran kuruduktan sonra, odanın içine ~ 20 μL fagostimülan uygulayın ve daha sonra odayı eğerek yüzeyin etrafına yayın. Kene frassından bir fagostimülan hazırlanması ile ilgili talimatlar için bölüm 6'ya bakınız.
- Kenelerin odaya bir fırça veya forseps ile eklenmesinden önce fagostimülanın kurumasını bekleyin. Kaçışı önlemek için keneleri odaya aktarırken mümkün olduğunca çabuk çalışın. Keneler, kaçma yeteneklerini yavaşlatmak için aktarmadan önce 1-2 dakika boyunca buz üzerindeki bir tüpe koyun. Keneler transfer edildikten sonra, üstünü parafilm ile kapatın; Parafilmi aşırı germeyin, çünkü su banyosundan gelen ısı yırtılmasına neden olabilir.
NOT: Forsepsler nimf ve yetişkin yaşam evrelerinde en iyi şekilde çalışır ve fırçalar larva yaşam evrelerinde en iyi şekilde çalışır. - Kuyu / oda başına ısıyla inaktive edilen kanı konik bir tüpe ekleyin ve 36 ° C'de ayarlanmış su banyosuna yerleştirin. Keneler maruz bırakmadan önce soğutulmuş kanı en az oda sıcaklığına getirin. Odaların kolay kullanımı için 6 delikli plaka başına dört hazne ayırın. Plaka başına daha fazla odacıktan kaçınılmalıdır, ancak su banyosunun boyutuna bağlı olarak daha fazla plaka kullanılabilir.
- Tüpe 5 mL kan başına 5 μL 3 mM ATP ve 50 μL 100x penisilin / streptomisin / fungizone stoğu ekleyin.
- Kanın, 4.5 mL'sini 6 kuyucuklu bir plakanın kuyusuna aktarın ve daha sonra odayı yavaşça kuyuya yerleştirin, odadaki O-ring yüksekliğini, zarın kanda oturması için ayarlayın, ancak yan taraftaki kan seviyesi kuyunun üzerine çıkmaz. Kan ve zar arasında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için kuyuyu kana bir açıyla yerleştirin.
NOT: Tamamlanmış bir plaka Şekil 2'de gösterilmiştir. - 6 delikli plakanın kapağını besleme odalarının üzerine yerleştirin; Daha sonra, hazneli 6 delikli plakayı hazırlanan 34 °C su banyosuna koyun ve kapağı kapatın.
NOT: Üstteki kapak, yoğunlaştırılmış suyun parafilmle temas etmesini ve kuyulardaki kanı seyreltmesini önlemeye yardımcı olacaktır.
3. Her 12 saatte bir kanı değiştirerek beslenme kenelerini korumak
- Kuyu başına ısıl olarak inaktive edilen kanın 5 mL'sini bir tüpe boşaltın ve 36 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın. ATP ve penisilin / streptomisin / mantar bölgesini aynı anda su banyosunda çözün.
- Kan tüpüne kuyucuk başına 5 μL 3 mM ATP ve 50 μL 100x penisilin / streptomisin / fungizone stoğu ekleyin. 4.5 mL kanı taze bir 6 delikli plakanın kuyucuğuna aktarın.
- 6 kuyucuklu plakayı kene odasıyla su banyosundan çıkarın. Odayı kuyudan çıkarın ve kanı çıkarmak için odanın ve zarın dışını 10 mL steril 1x PBS ile durulayın.
- Otoklavlanmış filtre kağıdı kullanarak, fazla PBS'yi gidermek için membranı ve hazneyi nazikçe kurulayın. Odanın üstündeki parafilmi değiştirin. Odanın içinde çok fazla yoğuşma varsa, taze parafilm ile kapatmadan önce ıslak lekeleri otoklavlanmış filtre kağıdı ile kurulayın.
- Kene odacığını taze kanla yeni 6 delikli plakaya yerleştirin ve gerekirse O-ring yüksekliğini ayarlayın. Plakadaki her oda için 3.3-3.5 arasındaki adımları tekrarlayın. 6 delikli plakanın kapağını odaların üst kısımlarına yerleştirin. Yeni 6 delikli plakayı 34 °C su banyosuna geri taşıyın.
- Kene beslemesinin sonuna kadar her 12 saatte bir 3.1-3.5 adımlarını tekrarlayın. Kenelerin tıkandığında zardan kendi başlarına ayrılmasını bekleyin veya kısmen engorge keneler elde etmek için hala bağlıyken yumuşak dokunuşlu cımbızla membrandan yavaşça çıkarın.
4. Antifungal tedavi
NOT: Sadece membranda mantar büyümesi görüldüğünde gerçekleştirin. Beslenmenin yeterli süreli olması durumunda mantarın zarın kan tarafında oluşması muhtemeldir. Mantar kontaminasyonunun ilk belirtisi, zarda görülebilen küçük (1-3 mm) pıhtılaşmış kan pullarıdır. Mantar kontaminasyonu not edildiğinde, antifungal tedaviler deneyin süresini uzatabilir ve engorgement başarısını artırabilir.
- mL başına 10.000 U nistatin, damıtılmış suda, besleme odası başına 5 mL çözün. 0,1 μm şırınga filtresi ile filtre-sterilize edin.
- Her besleme odası için bir kuyucuk olan yeni bir 6 delikli plakanın kuyucuğu başına 5 mL nistatin çözeltisi ekleyin.
- PBS ile durulanmış odaları çözeltinin içine yerleştirin. 10 dakika bekletin.
- Tedavi edilen membranları taze kana geri koymadan önce PBS ile durulayın.
- Deneyin tamamlanmasına kadar antifungal tedaviyi her 2-3 günde bir (mantar kontaminasyonunun derecesine bağlı olarak) tekrarlayın.
5. Müstakil membranların siyanoakrilat tutkal ile yeniden yapıştırılması
NOT: Yalnızca membran sökümü fark edildiğinde gerçekleştirin.
- Membranlar, özellikle 6 delikli plakadan çıkarılırken besleme odalarından kısmen ayrılabilir. Bu durumda, kan zarını PBS ile durulayın.
- Etkilenen bölgeyi nazikçe kurulayın. Tamamen kuru olması gerekmez, ancak nemin varlığı tutkalın daha hızlı ayarlanmasına neden olur.
NOT: Membranın yeniden yapıştırılması çalışma süresini sınırlar, ancak ayrılma boyutuna bağlı olarak daha hızlı bir ayar süresi istenebilir. - Membranın odadan çekildiği boşluğa az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı sıkın. Tutkalın ayarlanmasına izin vermek için ~ 2 dakika yerinde tutun.
- Odayı 6 delikli plakadaki kana geri yerleştirin.
6. Fagostimülan yapmak
NOT: Bir beslemenin sonunda veya bir membran beslemesi başlamadan önce gerçekleştirin.
- Kene dışkısını önceki bir membran beslemesinden veya başka bir besleme kene kaynağından toplayın. Fagostimülanı yapmadan önce dışkıyı -20 ° C'de saklayın. Kene dışkısı topaklarını ezin ve 1 mL su başına 0.1 g karıştırın. 1 mM tripeptid indirgenmiş glutatyon ekleyin, çözün ve vorteks yaparak iyice karıştırın.
- 0,1 μm şırınga filtresi ile filtre-sterilize edin.
- Gerekene kadar -20 °C'de dondurun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir beslenme, kısmi veya tam bir engorgementin istenip istenmediğine bağlıdır. Başarıyla beslenen I. skapularis yetişkinler için gunmetal grisinin bir tonunu çevirir ve zardan kendi başlarına ayrılır. Bununla birlikte, en azından bezelye büyüklüğündeyse, beslemeyi bitirirken zardan ayrılabilirler. I. scapularis'in olgunlaşmamış aşamaları için, tamamen engorged kenelerin büyüklüğü değişir ve yetişkinlerin aksine, renk değişikliği göstermedikleri için, ayrılma, bir kenenin tamamen engorge olup olmadığını belirlemenin en iyi yoludur. Bir besleme sırasında nimf I. skapularis'in nasıl görünebileceğine dair bir örnek için Şekil 3'e bakın. Yetişkin I. scapularis keneler, zardan ayrılmaya başlayana kadar bağlanmadan 1 hafta veya daha fazla sürer; nimfler genellikle bağlanmadan yaklaşık 5 gün sonra ayrılır ve larvalar ilk bağlanmadan ~ 3-4 gün sonra ayrılmaya başlar. Yemler, günde iki kez kan değişikliklerini sürdürmek istediği sürece ve küf antifungal tedavinin kontrol edebileceğinin ötesinde büyümeye başlamadığı sürece devam edebilir. Kısmen engorge keneler membrandan manuel olarak ayrılmalıdır.
Zardan kendi başlarına ayrılan olgunlaşmamış keneler (larvalar ve nimfler) neredeyse her zaman bir sonraki yaşam aşamalarına başarılı bir şekilde erir ve yeterince meşgul olduklarını ve yeterince büyük bir boyutta olduklarını varsayarsak, hatta bir yem eriyiğinin sonunda zardan manuel olarak ayrılanlar bile. Engorgement sırasında gunmetal grisine dönüşen dişi keneler genellikle başarılı bir şekilde yumurta bırakırlar. Bununla birlikte, doğal beslenme yöntemlerinden farklı olarak, membranla beslenen engorged dişiler daha küçük yumurta kütleleri üretir ve doğal olarak hayvanla beslenen meslektaşlarından daha küçük boyuttadır. I. scapularis larvalarını yumurtalardan nimf engorgement ve küflenme yoluyla besleyen yeni bir deneyin sonuçları Tablo 1'de görülebilir. İlk larva yeminden elde edilen nimfler, erimeden 2 ay sonra beslendi. Bununla birlikte, bu deneyin kana geyik organı homojenatı eklendiğini ve bunun kene besleme başarısı üzerinde zararlı etkileri olabileceğini belirtmek önemlidir.
Başka bir deneyde, 60 dişi ve 60 erkek I. scapularis kenesi dört besleme odasına (oda başına 30 cinsiyetle eşleşen kene) yerleştirildi ve dişi kenelerin yenilenmeye kadar beslenmelerine izin verildi. Bu keneler, avcı tarafından öldürülen geyiklerden toplanan engorged dişilerin yavruları olarak ortaya çıkmıştır. Ortalama yumurta kütle ağırlığı ve aralığı, engorgement başarı sayılarına ek olarak (engorgement ve -ayrılma sonrası yumurta bırakan kadın sayısı) Tablo 1'de görülebilir. I. scapularis için yumurta kütle ağırlıkları literatürde oldukça değişkendir, ancak daha önce Minnesota'dan avcı tarafından öldürülen geyiklerden toplanan keneler, ortalama ağırlığı 77 mg (19-147 mg) olan yumurta kütleleri üretmiştir. Yapay membran besleme sistemi kullanılarak kene mortalitesi düşüktür; Bağlanmayan ve beslenmeyen keneler çoğunlukla işlemden sağ kurtulur ve hayatta kalanlarla daha fazla membran besleme deneyi yapma olasılığını arttırır.
Bu yöntem, nimf I. skapularis'i , geleneksel kemirgen enfeksiyonu yöntemlerini kullanamayan A. phagocytophilum Variant-1 dahil olmak üzere kene kaynaklı çeşitli patojenlerle enfekte etmek için kullanılmıştır7. Kenelerin bakteriler tarafından enfeksiyonu qPCR ile doğrulandı ve başarılı bir şekilde beslenen tüm nimf keneler beslenme sonrası pozitif iken, bakteri türlerine bağlı olarak, enfeksiyon transstadial olarak devam edecek veya etmeyecekti19. Bu yöntem aynı zamanda dişi I. scapularis siprofloksasini beslemek için de kullanılmıştır; başarılı bir şekilde beslenen keneler, enjekte edilen keneler20 ile karşılaştırılabilir bir bakteriyel simbiyont seviyelerinin nakavtını gösterdi.
Resim 1: Kene membran odası . (A) Plastik sargı ile kaplanmış seramik kaplı stand tabanı. (B) Plastik sarılı tabana bantlanmış lens kağıdı. Mavi dikdörtgen, C panelinde kullanılan silecek . (C) Silikon ile emprenye edildikten sonra lens kağıdı. (D) Silikon-rayon membranına tutturulmuş odalar. Lensli kağıt yaprağındaki her 4 inç x 6 altı odacığı barındırabilir. (E) Silikon-rayon membranlı tamamlanmış bir oda. Sağ tarafta müstakil bir silikon-rayon membran gösterilmiştir. (F) Üzerine bir O-ring sabitlenmiş, monte edilmiş tamamlanmış bir oda. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kene beslemesini ayarlama. Yetişkin I. skapularis ile dört odacıktan oluşan bir setin, her şey kurulduktan sonra ve su banyosuna yerleştirilmeden önce nasıl görüneceğine bir örnek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kısmen engorge Ixodes scapularis nimfleri ile devam eden bir besleme. Bağlantı bölgelerinin etrafındaki siyah veya kahverengi noktalar (örneğin A etiketine bakın), fagostimülanı yapmak için yem sırasında ve sonrasında toplanabilen frasslardır. Kısmen engorge I. scapularis nimfleri membran üzerine tutturulmuş olarak görülür (bkz. etiket B). Engorged larva moltünün bir kabuğu C etiketi ile görülebilir.
| Başlangıç kenelerinin sayısı | Başarılı bir şekilde işlenmiş kene sayısı | Yumurta kütlesi mg cinsinden ortalama kütle (aralık) | |
| Larva | 2 yumurtadan çıkmış yumurta kütlesi | 150 | YOK |
| Perileri | 150 | 24 | YOK |
| Yetişkin dişiler | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
Tablo 1: Kene engorgement sayıları ve yumurta kütle ağırlıkları. Larva ve nimf engorgement deney koşullarında, bu protokolde kullanılan takviyelere ek olarak kana geyik organ homojenatı eklenmiştir. Yetişkin kadın engorgement deney koşulları yukarıdaki protokolde açıklandığı gibidir. Başarılı engorgement, ya bir sonraki yaşam aşamasına başarılı bir şekilde erimiş engorge keneler ya da başarılı bir şekilde yumurta bırakan engorge dişiler olarak tanımlandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kenelerin yapay membran beslenmesi, çeşitli deneysel prosedürler için yararlı bir araç sağlar, ancak tüm uygulamalar için hayvan beslemenin yerini alması muhtemel değildir. Hayvan besleme olmadan tüm yaşam aşamalarında büyük kene kolonilerinin korunması genellikle savunulamaz. Bunun yerine, yapay besleme sistemi, keneleri model konakçılar tarafından desteklenmeyen patojenlerle enfekte etmek, kontrollü bileşik veya mikroorganizma dozajlarının basitleştirilmiş bir beslenme ortamında keneler üzerindeki etkilerini değerlendirmek veya laboratuvarda hazır bulunmayan konakçı hayvanlara dayanan küçük kene kolonileri yetiştirmek gibi diğer amaçlar için değerlidir8, 10,11,23,24,25. Geleneksel hayvan besleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, yapay membran besleme emek yoğundur ve zorluklar ortaya koymaktadır 15,24. Bu nedenlerden dolayı, yapay membran besleme, geleneksel hayvan bazlı besleme yöntemlerinin yerini almaz ve bunun yerine geleneksel hayvan besleme ile yapılamayan deneylere izin verir.
Hem besleme odalarında hem de kene kolonisinde hijyenik koşulların korunması, mantar ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, keneleri patojenlere maruz bırakmak için yapay beslenme kullanıldığında, patojenleri öldürmekten kaçınmak için penisilin / streptomisin / fungizone (P / S / F) takviyelerinden kandan kaçınılmalıdır. Kandaki siprofloksasine kene maruziyeti, I. scapularis'in yumurtalık endosimbiyontu olan Rickettsia buchneri'yi F1 soyunun bir alt kümesinden tamamen ortadan kaldırabilirken, kana rutin P / S / F ilavesi bu etkiye sahip değildir20. Transovarial patojen bulaşma çalışmaları bu sistem kullanılarak yapılmadı, ancak antibiyotiğe maruz kalan ve kontrol deneylerinde engorge olmuş kadınların doğurganlığında herhangi bir değişiklik kaydedilmedi. Beslenmenin hızlı bir şekilde başlatılması ve kenelerin engorgementasyonu, mantar kontaminasyonu ile ilişkili sorunların çoğunu önler; Bu nedenle, sistem daha kısa beslenme sürelerine sahip oldukları için larva ve nimf keneleri ile daha kolay çalışma eğilimindedir. Kirlenmiş membranların nistatin gibi antifungallerle periyodik olarak işlenmesi, engorgement için mevcut süreyi birkaç gün uzatabilir. Beslenmeye istekli olmak için yeterince uzun süre erimiş kenelerin kullanılması da önemlidir. Larvalar, yumurta kütlesindeki tüm larvaların ortaya çıkmasını tamamladıktan 2 hafta sonra hazırdır, ancak nimfler ve yetişkinler, kalıplamadan en az 10 hafta sonra kullanılırsa daha iyi ücret alırlar.
Bu yöntem, laboratuvar hayvanlarının kullanımıyla karşılaştırılabilir kene besleme başarısı göstermiştir; tipik olarak% 30-50'si dişi% 30-50'si ve nimf I. skapularis'in yaklaşık% 50'si engorgementi tamamlamıştır; laboratuar tavşanlarında beslenen yetişkinlerin engorgement başarısı veya fareler veya hamsterlerle beslenen nimfler19. Benzer şekilde, yapay besleme odalarını kullanan diğer çalışmalar, I. scapularis dişileri için% 45'lik bir engorgement oranı ve nimfler için% 72'lik bir beslenme oranı10,18 bildirmiştir. Bu arada, yapay bir membranla beslenen Ixodes ricinus dişileri ve nimfleri için, engorgement oranları sırasıyla% 71 ve% 58,25 idi. Bu nedenle, sonuçlar kullanılan sisteme ve araştırılan kene türüne bağlı olarak değişebilir.
Membran kalınlığı besleme başarısında önemli bir faktördür; Daha ince membranlar, kene problama ve ataşman ile üretilen küçük deliklerin etrafını daha az kapatabilir. Besleme başladıktan sonra, odaya daha fazla nem girer, bu da ıslak koşullara, sıvılaşmaya ve daha sonra frassın yeniden kurumasına ve küflenmeye neden olabilir. Bu nedenle, kene türleri ve beslenecek yaşam evresinin hipostom uzunluğu tarafından tolere edilebilecek maksimum kalınlıkta membranlar üretmek önemlidir (bkz. protokol adımları 1.1-1.4). I. scapularis ve Dermacentor variabilis'in nimfleri 90 μm ila 120 μm kalınlık arasındaki membranlarla beslenirken, yetişkinler yaklaşık 200 μm kalınlığa kadar membranlarla beslenir. Yetişkin I. scapularis hipostomu 500 μm uzunluğundayken, nimf ve larva hipostomları ~ 100 μm uzunluğundadır, bu da biraz daha kalın bir zara15,26 nüfuz etmek için yeterli olduğunu kanıtlar. Rayon lens kağıdı ortalama olarak ~ 50 μm kalınlığındadır ve ondan yapılan membranlar minimum 50 μm kalınlığa sahiptir; Bununla birlikte, yukarıda belirtildiği gibi, daha kalın membranlar daha iyi sonuçlar verir. Larva besleme membranları, çok hafif bir unryu kağıdı (10 g /m3) kullanarak 80-100 μm kalınlığında iyi çalışır. Bu düzensiz dut kağıdı, yer yer çok ince olan bir zara destek sağlayan ve bol miktarda larva bağlanma bölgesine izin veren nispeten kalın liflerle bağlanmıştır.
Önerilen membran kalınlığına ve oda boyutlarına dayanarak, yetişkin yemlerindeki dişi sayısını maksimum 20 dişi ile sınırlamak en iyisidir (keneler protokol adımı 2.7'deki odalara yerleştirilir). Daha fazla dişi, bağlanma bölgelerinin aşırı kalabalıklaşması riskini taşır, çünkü keneler birbirine çok yakın yapışma eğilimindedir, bu da yerel alanda membran bütünlüğünü tehlikeye atabilir ve sızıntı riskini artırabilir ve beslenme hızını yavaşlatabilir. Nimf keneler için, maksimum sayılar çok daha yüksektir ve oda başına 50 nimf beslenirken bile önemli bir zararlı etki kaydedilmez. Bireysel larvaların sayılması makul olmadığından ve aşırı kalabalıklaşma sorunları belirtilmediğinden, kurulum kolaylığı için oda başına yarım ila bir yumurta kütlesi önerilir. Bütün yumurta kütleleri ~ 1.000 veya daha fazla larvadan oluşur ve bir yem boyunca düzinelerce ila ~ 200 arasında herhangi bir yerde engorged larvalar tek bir yumurta kütlesinden düşebilir. Ek olarak, beslenmeyen larva keneleri ölmeme eğilimindedir ve daha sonraki bir beslenme için potansiyel olarak yeniden yerleştirilebilir.
Polikarbonatın en dayanıklı ve reaktif olmadığı belirlenen besleme odalarını üretmek için başka plastikler kullanılmıştır. Akrilikler gibi diğer plastikler, özellikle borunun kesilmiş uçlarında çılgınlığa ve kırılmaya neden olabilecek temizleme çözeltilerine karşı hassastır. Polikarbonat, ağartıcı, etanol, otoklavlama ve ultraviyole sterilizasyonuna maruz kalmaya iyi dayanır.
Bir odadaki keneler, altındaki ısıtılmış kanın ısı uyaranı nedeniyle sonunda ısırır ve zara yapışabilirken, kimyasal fagostimülanlar şeklinde ek uyaranlar bu süreci hızlandırmaya yardımcı olur (tarif için, protokol adım 6'ya bakınız). Bu çalışma için, suda çözünmüş kene dışkısının kullanımı, uzun süre -20 ° C'de korunma yetenekleri nedeniyle idealdir. Kene dışkısı sonraki yemlerden toplanabildiğinden, kolayca yenilenebilirler. Doğal olarak, ilk membran yemi, kene dışkısı ekstraktının önerilen fagostimülanına erişemeyebilir ve gelecekteki yemler için üretilmesine yardımcı olmak için onsuz gerçekleştirilebilir. Ek olarak, alternatif fagostimülanlar kullanılabilir, diğer çalışmalar saç veya saç özleri gibi farklı kimyasal veya mekanik uyaranlarla başarılı olur15,24.
Yapay membran besleme, kene ve kene kaynaklı patojen biyolojisinde çalışan araştırmacılar için ek araçlar sağlar. Uygun fiyatlı ve basit, aynı zamanda emek yoğundur ve muhtemelen istenen uygulamaları optimize etmek ve türleri / yaşam aşamasını işaretlemek için bazı ön testler gerektirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
- Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
- Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
- Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
- Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
- Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
- Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
- Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
- Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
- Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
- Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
- Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
- Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
- Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
- Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
- Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
- González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
- Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
