Summary
Presentert her er en metode for å blodmate flått in vitro via et kunstig membransystem for å muliggjøre delvis eller full engorgement av en rekke flåttlivsstadier.
Abstract
Flått og tilhørende sykdommer er et viktig tema for studier på grunn av deres folkehelse og veterinær byrde. Imidlertid kan fôringskravene til flått under både studier og oppdrett begrense eksperimentelle spørsmål eller laboratoriets evne til å undersøke flått og tilhørende patogener. Et kunstig membranfôringssystem kan redusere disse problemene og åpne opp nye forskningsveier som kanskje ikke har vært mulig med tradisjonelle dyrefôringssystemer. Denne studien beskriver et kunstig membranfôringssystem som har blitt raffinert for fôring og engorgementsuksess for alle Ixodes scapularis livsstadier. Videre kan det kunstige membranfôringssystemet beskrevet i denne studien modifiseres for bruk med andre flåttarter gjennom enkel foredling av ønsket membrantykkelse. Fordelene ved et kunstig membranfôringssystem oppveies av arbeidsintensiviteten i systemet, de ekstra miljøfaktorene som kan påvirke fôringssuksess, og behovet for å forfine teknikken for hver ny art og livsstadium av flått.
Introduction
Flåttbårne sykdommer har stor innvirkning på helsen til mennesker og dyr over hele verden, og er ansvarlig for mer enn to tredjedeler av all vektorassosiert sykdom i USA fra 2004 til 20161. I tillegg har antall tilfeller vokst de siste årene, med flere mennesker og husdyr som blir rammet av flått og tilhørende sykdommer 2,3. Selv om det sannsynligvis er mange årsaker til den oppadgående trenden i antall tilfeller, er det endrede klimaet en viktig faktor 3,4. Den forventede pågående økningen i antall flåttbårne sykdomstilfeller understreker behovet for å utvikle nye verktøy for å undersøke forholdet mellom flått og patogenene de overfører.
Det er kjent at flått gjennomgår endringer i fysiologi og genuttrykk under fôring, og at disse endringene spiller en rolle i patogenoverføring 5,6. Det kan være vanskelig å utføre studier som undersøker effekten av full og delvis fôring på patogenoverføring og oppkjøp ved hjelp av dyremodeller, spesielt i situasjoner der gnagermodeller ikke er utsatt for infeksjon av et bestemt patogen. For eksempel overføres Anaplasma phagocytophilum Variant-1-stammen naturlig mellom Ixodes scapularis og hjort, men kan ikke infisere mus, noe som kompliserer kryssinfeksjon i laboratoriet7. Kunstige fôringssystemer kan også brukes til å studere patogener som Borrelia burgdorferi ved bruk av transgene mutanter som har gendelesjoner som hemmer overføring eller infeksjon8. Ved hjelp av et kunstig fôringssystem hjelper forskere å isolere genenes rolle ved å la infeksjon eller overføring bare forekomme på tippens side, og dermed isolere eventuelle vertsresponser som kan forvirre slike studier.
På samme måte kan noen livsstadier av flått involvert i sykdom og dyreoverføring ikke induseres til å mate på vanlige laboratoriemodellarter. Ixodes scapularis-hunner må for eksempel fôres på større dyr, typisk kaniner9. Selv om de ofte er tilgjengelige for laboratorieeksperimenter, overstiger de administrative kravene og kravene til bruk av kaniner smågnagere og kan være uoverkommelige for noen laboratorier. Andre flåttarter, spesielt de av veterinær bekymring, må fôres på storfe eller andre store dyr som ikke er praktiske å bruke i de fleste laboratorier. In vitro fôrings- og infeksjonsmetoder, som kunstig membranfôring, gir alternativer til bruk av store eller eksotiske vertsdyr.
I tillegg tillater bruk av et kunstig fôringssystem visse analyser som kanskje ikke er mulige med tradisjonelle dyrefôringsmetoder. Et slikt eksempel er at ved å skille blodkilden fra fôringsmekanismen, blir undersøkelse av rollen som forskjellige verters blod kan ha i B. burgdorferi-overføring mulig10. Denne undersøkelsen av vertsblod og rollen blod selv spiller i fravær av vertsimmunresponsen er en viktig faktor for å kunne forstå patogenoverføringssykluser og en som kunstige fôringssystemer kan bidra til å svarepå 11. Det blir også mulig å kvantifisere de eksakte overføringsnumrene til et patogen under en fôring i stedet for bare å undersøke overføringssuksess og etablering i en vert 8,12.
Noen av de første kunstige fôringsmembranene laget for harde flått ble laget av dyreskinn eller animalske avledede membraner på 1950- og 1960-tallet13,14. På grunn av den biologiske naturen til disse membranene var det problemer med både produksjon av nye membraner og holdbarhet. På 1990-tallet ble det utviklet helt kunstige membraner som benyttet en bakside av netting, papir eller stoff med silikonimpregnering15,16. Silikon var ideell da dens fysiske egenskaper etterligner hudens elastisitet og svak klebrighet, sammen med dens bio-iboende natur. Basert på dette beskrev Krober og Guerin, hvis arbeid denne teknikken var basert på, en silikonimpregnert rayonmembranfôringsteknikk for kunstig fôring av I. ricinus17.
Forbedring av metodene for I. scapularis, en nært beslektet art, har ført til bemerkelsesverdige forskjeller i hardheten til silikon som brukes i membranimpregnering, oppskriften på membranproduksjon, kammerets dimensjoner og festestimulanten. Mens forbedringene rapportert i denne studien har resultert i lignende membranegenskaper som de som er rapportert av Andrade et al., som også utviklet en silikonbasert membran basert på Krober og Guerin for bruk i I. scapularis, er det en forskjell i silikonimpregneringstrinnene, noe som gir fleksibilitet til å bruke denne protokollen for umodne livsstadier av I. scapularis 15, 18. Denne studien beskriver også tillegg og tekniske endringer basert på gjentatt bruk av denne metoden, anbefalte fremgangsmåter som resulterer i en vellykket feed, og feilsøking av problemer som kan oppstå. Denne metoden har blitt brukt til å mate alle aktive livsstadier, infisere flått med patogene bakterier og utsette flått for flere doser antibiotika19,20. Mens den kunstige membranfôringsmetoden vist er for I. scapularis, er denne metoden lett å tilpasse til andre arter av flått med mindre modifikasjoner i membrantykkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøre flåttmembrankammeret
- Forbered en flat, ikke-porøs overflate, for eksempel et plan av glass eller keramisk belagt metallbase av et armstativ ved å tørke det ned med 70% etanol og dekk det deretter med et enkelt lag plastfolie, og sørg for at plastfolien er flat og uten bobler eller rynker (se figur 1A).
- Teip ned rengjøringspapir for 100 % rayonlinser til den forberedte overflaten. Sørg for at den er flat og litt stram med tape over alle fire sidene av papiret. To stykker av 4 x 6 i linsepapir kan gjøres til membraner ved hjelp av volumene beskrevet i trinn 1.3.
MERK: Dette er tilstrekkelig til å lage opptil 12 fôringskamre (se figur 1B). Hvis membranen er for larval flått, bruk unryu papir i stedet for linse rengjøringspapir. - Forbered silikonblandingen 00-10 hardhet ved å måle ut 5 ml av hver del av silikonsettet i en engangsbeholder, bland de to væskene lett før du tilsetter 1,5 ml heksan. Fortsett å blande til blandingen er homogen og grundig blandet.
NOTAT: Hvis du lager membraner for voksne flått, bruk 00-50 hardhet silikon. - Bruk en liten squeegee til å fordele silikonblandingen over linsepapiret. La stå i 1 min for å sikre at silikonet har trukket inn i linsepapiret. Skrap jevnt overflødig silikon til siden med squeegee ved hjelp av en liten mengde nedadgående trykk. Utfør et andre pass med squeegee, som ikke utøver noe nedadgående trykk, for å fjerne eventuelle silikonlinjer og produsere et jevnt lag.
MERK: Dette trinnet i prosedyren kan kreve litt øvelse for å produsere membraner med optimal tykkelse for hvert livsstadium (voksne: 150-200 μm; nymfer: 90-120 μm; larver: 80-100 μm). En tykkere membran (innenfor fôringstoleransene i livsstadiet) vil vanligvis gi bedre resultater ved å redusere kondens i kammeret og forbedre membranens selvhelbredende karakteristikk. - Bare for larver, dypp toppen av fôringskammeret i Fluon fluoropolymerharpiks (PTFE-30) flere ganger, slik at den tørker mellom applikasjoner for å produsere et konsistent lag.
MERK: Påføringen av Fluon vil danne et non-stick lag av fluorpolymerharpiks som ligner på en non-stick kokepanne. Dette vil redusere antall larver som klatrer til toppen av kammeret21. - La membranen herde i minst 24 timer i et støvfritt miljø, for eksempel et lukket kjemikalie- eller biosikkerhetsskap, før du går videre til neste trinn. Se figur 1C for hvordan rayonlinsepapiret ser ut etter at silikonet har fått tørke.
- Forbered silikonblandingen med 30 hardhet for å feste kamrene til membranen ved å blande like deler silikonblanding A og B.
- Dypp polykarbonatkamrene omtrent en kvart tomme (6 mm) i silikonblandingen, og legg deretter på membranarket, pass på at du ikke overlapper noen av båndet (figur 1D).
- La den festede silikonen herde i minst 24 timer før du går videre til de neste trinnene.
- Bruk en skalpell, kutt forsiktig membranen rundt hvert av de vedlagte kamrene, trim ned kantene slik at den kan passe jevnt inn i en brønn på 6-brønnsplaten uten mye skraping på sidene (figur 1E). La tilstrekkelig materiale utenfor kammeret for å maksimere vedheft av membranen.
MERK: Hvis det gjenstår for mye utvendig materiale, kan gjentatt fjerning av kammeret fra 6-brønnsplaten føre til at membranen delvis løsner fra kammeret. Reparasjon av frittliggende membraner er beskrevet i avsnitt 5. - Klipp et lite stykke av den resterende membranen fra hvert av hjørnene og midten av membranarket. Fjern plastfolien fra hvert stykke. Mål stykkene med en mikrometer for å bestemme gjennomsnittlig membrantykkelse.
MERK: Hvis membrantykkelsen ikke faller innenfor toleranseområdet for livsstadiet (se trinn 1.4), bør membranene kasseres og lages på nytt. Unryu papirtykkelse er svært variabel på grunn av sine tykke tråder av fiber og tynne regioner. Mens denne egenskapen tillater larver å finne regioner med optimal tykkelse, gjør det det vanskelig å bestemme den faktiske membrantykkelsen. - Plasser fôringskamrene sammen med en O-ring per kammer i et glassbeger som autoklaveres ved 121 °C i minst 20 minutter for å sterilisere. La kamrene avkjøles før du bruker dem.
2. Sette opp flåttfeeden
- Forbered en lampe eller et rom slik at lysene er på i 16 timer og deretter av i 8 timer. Hvis du bruker en lampe, må du sørge for at vannbadet i neste trinn er i mørket i de 8 timene.
- Sett opp et vannbad ved 34 °C og med støtter slik at en 6-brønns plate kan sitte og flyte litt i den. Bruk små glassbeger nedsunket i vannbadet som støtter. Bruk et gjennomsiktig deksel til vannbadet for å opprettholde en lys-mørk syklus for flåtten; om nødvendig, bruk et T-stativ og plastfolie for å lage et deksel. For å redusere risikoen for kontaminering, tilsett 0,02 % benzalkoniumklorid i vannbadet og sett et nytt vannbad på 36 °C for oppvarming av nedkjølt blod.
- Ta ut de forberedte, autoklaverte membrankamrene, plasser O-ringen rundt kammeret (figur 1F), og fyll deretter hvert kammer med nok 70% etanol til å dekke membranen. La stå i en 6-brønns platebrønn i 5 min og se deretter etter eventuelle lekkasjer mellom kammeret og membranen og i selve membranen.
MERK: Hvis membranen lekker, vil etanol samle seg i bunnen av brønnen. Lekkende membraner bør kastes. - Tøm ut etanolen fra kamrene og la den lufttørke inne i et biosikkerhetsskap eller laminær avtrekkshette.
MERK: Dette kan ta flere minutter, avhengig av luftfuktigheten. - Mens du venter, deaktiverer du komplementet i blodet ved å varme opp ved 56 °C i 40 minutter. Suppler mekanisk defibrinert storfeblod med 2 g / l glukose.
- Etter at membranen er tørr, bruk ~ 20 μL fagostimulerende middel på innsiden av kammeret og spred det deretter rundt overflaten ved å vippe kammeret. Se avsnitt 6 for instruksjoner om tilberedning av et fagostimulerende middel fra flåttfrass.
- Vent til fagostimulanten er tørr før du legger flåttene til kammeret med enten en børste eller tang. Arbeid så raskt som mulig når du overfører flåttene til kammeret for å forhindre rømning. Legg flåtten i et rør på is i 1-2 min før du overfører dem for å bremse fluktevnen. Etter at flåttene er overført, forsegl toppen med parafilm; Ikke overstretch parafilmen, da varmen fra vannbadet kan føre til at den revner.
MERK: Tang fungerer best med nymfestale og voksne livsstadier, og børster fungerer best med larvelivsstadier. - Tilsett 5 ml av det varmeinaktiverte blodet per brønn/kammer i et kjegleformet rør og sett i vannbadet satt til 36 °C. Ta kjølt blod opp til minst romtemperatur før du utsetter flåtten for det. Sett av fire kamre per 6-brønns plate for enkel håndtering av kamre. Flere kamre per plate bør unngås, men avhengig av størrelsen på vannbadet, kan flere plater brukes.
- Tilsett 5 μL 3 mM ATP og 50 μL 100x lager av penicillin / streptomycin / soppsone per 5 ml blod til røret.
- Overfør 4,5 ml av blodet til en brønn på en 6-brønnsplate, og plasser deretter kammeret forsiktig i brønnen, juster O-ringhøyden på kammeret slik at membranen sitter i blodet, men blodnivået rundt siden ikke overtopper brønnen. Plasser brønnen i blodet i en vinkel for å unngå luftbobledannelse mellom blodet og membranen.
MERK: En ferdig plate er vist i figur 2. - Plasser lokket på 6-brønnsplaten på toppen av fôringskamrene; Sett deretter 6-brønnsplaten med kamre inn i det tilberedte vannbadet på 34 °C og lukk lokket.
MERK: Lokket på toppen vil bidra til å stoppe kondensert vann fra å kontakte parafilmen og fortynne blodet i brønnene.
3. Opprettholde fôringsflåttene ved å bytte blod hver 12.
- Aliquot 5 ml av det varmeinaktiverte blodet per brønn inn i et rør og varm det opp i et vannbad på 36 °C. Tine ATP og penicillin/streptomycin/soppsone i vannbadet samtidig.
- Tilsett 5 μL av 3 mM ATP og 50 μL av 100x lager av penicillin / streptomycin / fungizone per brønn til blodrøret. Overfør 4,5 ml blod til en brønn med en fersk 6-brønnsplate.
- Ta ut 6-brønnsplaten med krysskammeret fra vannbadet. Fjern kammeret fra brønnen og skyll utsiden av kammeret og membranen med 10 ml steril 1x PBS for å fjerne blodet.
- Bruk autoklavert filterpapir til å tørke membranen og kammeret forsiktig for å fjerne overflødig PBS. Sett inn parafilmen på toppen av kammeret. Hvis det er mye kondens inne i kammeret, tørk de våte flekkene med autoklavert filterpapir før du forsegler med fersk parafilm.
- Plasser flåttkammeret i den nye 6-brønnsplaten med friskt blod, og juster O-ringhøyden om nødvendig. Gjenta trinn 3,3-3,5 for hvert kammer på platen. Plasser lokket på 6-brønnsplaten over toppen av kamrene. Flytt den nye 6-brønnsplaten tilbake i vannbadet på 34 °C.
- Gjenta trinn 3,1-3,5 hver 12. time til avslutningen av kryssfôret. Vent til flåttene løsner fra membranen av seg selv når de engorged eller fjern dem forsiktig fra membranen med myk berøring pinsett mens de fortsatt er festet for å oppnå delvis engorged flått.
4. Antifungal behandling
MERK: Utfør bare når soppvekst ses på membranen. Svamp er sannsynlig å danne på blodsiden av membranen hvis fôringen er av tilstrekkelig varighet. Den første indikasjonen på soppforurensning er små (1-3 mm) flak av koagulert blod synlig på membranen. Når soppforurensning er notert, kan antifungale behandlinger forlenge eksperimentets varighet og forbedre engorgementsuksess.
- Løs opp 10 000 U nystatin per ml i destillert vann, 5 ml per fôringskammer. Filtrer steriliser med et 0,1 μm sprøytefilter.
- Tilsett 5 ml nystatinoppløsning per brønn av en ny 6-brønnsplate, en brønn for hvert fôringskammer.
- Plasser PBS-skyllede kamre i løsningen. La sitte i 10 min.
- Skyll de behandlede membranene med PBS før du legger tilbake i friskt blod.
- Gjenta antifungal behandlingen hver 2-3 dager (avhengig av omfanget av soppforurensning) til forsøket er fullført.
5. Fest frittliggende membraner på nytt med cyanoakrylat lim
MERK: Utfør bare når membranavløsning blir lagt merke til.
- Membraner kan delvis løsne fra fôringskamrene, spesielt under fjerning fra 6-brønnplaten. Hvis dette skjer, skyll membranen av blod med PBS.
- Tørk det berørte området forsiktig. Det trenger ikke å være helt tørt, men tilstedeværelsen av fuktighet får limet til å sette seg raskere.
MERK: Å feste membranen begrenser arbeidstiden, men avhengig av løsrivelsesstørrelse kan det være ønskelig med en raskere innstillingstid. - Klem en liten mengde cyanoakrylat lim inn i gapet der membranen har trukket seg bort fra kammeret. Hold på plass i ~2 min for å la limet stivne.
- Plasser kammeret tilbake i blodet i 6-brønnplaten.
6. Å lage fagostimulerende middel
MERK: Utfør på slutten av en mating eller før en membrantilførsel har startet.
- Samle flåttavføring fra enten en tidligere membranfôr eller en annen kilde til flåttflått. Oppbevar avføringen ved -20 °C før fagostimuleringen tilberedes. Knus pellets av kryss avføring og bland 0,1 g per 1 ml vann. Tilsett 1 mM tripeptid redusert glutation, oppløs og bland grundig ved vortexing.
- Filtrer steriliser med et 0,1 μm sprøytefilter.
- Frys ved -20 °C til det trengs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket fôring avhenger av om en delvis eller full engorgement er ønsket. Vellykket matet I. scapularis gjør en nyanse av gunmetal grå for voksne og løsner på egen hånd fra membranen. Men hvis de er minst ertestore, kan de løsnes fra membranen når du er ferdig med fôringen. For umodne stadier av I. scapularis varierer størrelsen for fullt engorged flått, og fordi de, i motsetning til voksne, ikke viser en fargeendring, er løsrivelse den beste måten å avgjøre om et kryss er fullt engorged. Se figur 3 for et eksempel på hvordan nymfe I. scapularis kan se ut under en mating. Voksen I. scapularis flått tar 1 uke eller mer fra vedlegg til de begynner å løsne fra membranen; Nymfer løsner ofte ca. 5 dager etter tilknytning, og larver begynner å løsne ~3-4 dager etter første tilknytning. Fôr kan fortsette så lenge man ønsker å opprettholde de to daglige blodendringene og så lenge mugg ikke har begynt å vokse utover hva antifungal behandling kan kontrollere. Delvis engorged flått må manuelt løsnes fra membranen.
Umodne flått (larver og nymfer) som løsner fra membranen alene, smelter nesten alltid vellykket inn i sitt neste livsstadium, og antar at de har engorged tilstrekkelig og er av stor nok størrelse, selv de som løsnes manuelt fra membranen på slutten av en fôrmolt. Kvinnelige flått som har blitt en gunmetal grå under engorgement, legger vanligvis egg. Imidlertid, i motsetning til naturlige fôringsmidler, produserer membranmatede engorged kvinner mindre eggmasser og er av mindre størrelse enn deres naturlig dyrematede kolleger. Resultater fra et nylig eksperiment som matet I. scapularis larver fra egg gjennom nymphal engorgement og smelting kan ses i tabell 1. De resulterende nymfene fra den første larvefôret ble matet 2 måneder etter smelt. Det er imidlertid viktig å merke seg at dette forsøket hadde hjorteorganhomogenat tilsatt blodet, noe som kan ha hatt skadelige effekter på flåttfôringssuksessen.
I et annet eksperiment ble 60 kvinnelige og 60 mannlige I. scapularis flått plassert i fire fôringskamre (30 kjønnsmatchede flått per kammer) og de kvinnelige flåttene fikk lov til å mate til repletion. Disse flåttene oppsto som avkom av engorged kvinner samlet fra jeger-drept hjort. Gjennomsnittlig eggmassevekt og -rekkevidde, i tillegg til suksesstall for engorgement (antall hunner som la egg etter engorgement og -detachment), kan ses i tabell 1. Eggmassevekter for I. scapularis er svært variable i litteraturen, men flått tidligere samlet inn fra jegerdrepte hjortedyr fra Minnesota produserte eggmasser med en gjennomsnittlig vekt på 77 mg (19-147 mg)22. Tick dødelighet er lav ved bruk av kunstig membran fôringssystem; Flått som ikke fester seg og spiser overlever for det meste prosessen, noe som øker muligheten for å forsøke ytterligere membranfôringseksperimenter med de overlevende.
Denne metoden har blitt brukt til å infisere nymphal I. scapularis med en rekke flåttbårne patogener, inkludert A. phagocytophilum Variant-1, som ikke kan bruke tradisjonelle gnagerinfeksjonsmetoder7. Infeksjon av flåtten av bakterier ble bekreftet med qPCR, og mens alle nymfestlått som vellykket matet var positive etter fôring, avhengig av bakteriearten, ville infeksjonen eller ikke vedvare transstadialt19. Denne metoden har også blitt brukt til å mate kvinnelig I. scapularis ciprofloxacin; De vellykkede matede flåttene viste en sammenlignbar knockdown av bakterielle symbiontnivåer til injiserte flått20.
Figur 1: Flåttmembrankammeret . (A) Keramisk belagt stativbase dekket med plastfolie. (B) Linsepapir teipet på plastinnpakket base. Det blå rektangelet er squeegee som brukes i panel C. (C) Linsepapir etter å ha blitt impregnert med silikon. (D) Kamre festet til silikon-rayonmembranen. Hver 4 i x 6 i linsepapirark har plass til seks kamre. (E) Et ferdig kammer med silikon-rayon membran. En frittliggende silikon-rayonmembran er vist til høyre. (F) Et montert ferdig kammer, med en O-ring festet på den. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Konfigurering av flåttfeeden. Et eksempel på hvordan et sett med fire kamre med voksen I. scapularis vil se ut når alt er satt opp og før det er plassert i vannbadet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: En pågående fôr med delvis engorged Ixodes scapularis nymfer. De svarte eller brune prikkene rundt festestedene (se for eksempel etikett A) er frassen som kan samles under og etter fôret for å lage fagostimulanten. Delvis engorged I. scapularis nymfer ses festet på membranen (se etikett B). Et skall av larvemolten kan sees ved etikett C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antall startflått | Antall vellykkede engorged flått | Eggmasse gjennomsnittlig masse i mg (område) | |
| Larver | 2 klekkede eggmasser | 150 | N/A |
| Nymfer | 150 | 24 | N/A |
| Voksne kvinner | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
Tabell 1: Tick engorgement tall og eggmasse vekter. Larve og nymphal engorgement eksperimentelle forhold hadde hjort organ homogenat lagt til blodet i tillegg til kosttilskudd som brukes i denne protokollen. Voksne kvinnelige engorgement eksperimentelle forhold var som beskrevet i protokollen ovenfor. Vellykket engorgement ble definert som enten engorged flått som vellykket smeltet til neste livsstadium eller engorged kvinner som vellykket la egg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kunstig membranfôring av flått gir et nyttig verktøy for en rekke eksperimentelle prosedyrer, men vil sannsynligvis ikke erstatte dyrefôring for alle applikasjoner. Å opprettholde store kolonier av flått i alle livsstadier uten dyrefôring er generelt uholdbart. I stedet er det kunstige fôringssystemet verdifullt for andre formål som å infisere flått med patogener som ikke støttes av modellverter, evaluere virkningen av kontrollerte doser av forbindelser eller mikroorganismer på flåtten i et forenklet fôringsmiljø, eller oppdrett av små kolonier av flått som er avhengige av vertsdyr som ikke er lett tilgjengelige i laboratoriet8, 10,11,23,24,25. Sammenlignet med tradisjonelle dyrefôringsmetoder er kunstig membranfôring arbeidskrevende og gir utfordringer 15,24. Det er av disse grunnene at kunstig membranfôring ikke er en erstatning for tradisjonelle dyrebaserte fôringsmetoder, men i stedet tillater eksperimenter som ikke kan gjøres med tradisjonell dyrefôring.
Det er viktig å opprettholde hygieniske forhold både i fôringskamrene og flåttkolonien for å unngå sopp- og bakterieforurensning. Men når du bruker kunstig fôring for å eksponere flått for patogener, bør penicillin / streptomycin / fungizone (P / S / F) kosttilskudd unngås fra blodet for å unngå å drepe patogener. Tick eksponering for ciprofloxacin i blodet kan helt eliminere Rickettsia buchneri, ovarie endosymbiont av I. scapularis , fra en undergruppe av F1 avkom, mens rutinemessig P / S / F tillegg til blod ikke har denne effekten20. Transovariale patogenoverføringsstudier ble ikke utført ved bruk av dette systemet, men ingen endringer ble observert i fecundity av engorged kvinner i antibiotika-eksponerte versus kontrolleksperimenter. Rask initiering av fôring og engorgement av flått unngår mange av problemene forbundet med soppforurensning; Av denne grunn har systemet en tendens til å fungere lettere med larver og nymfestlått, da de har kortere fôringstider. Periodisk behandling av forurensede membraner med antifungale midler som nystatin kan forlenge tiden tilgjengelig for engorgement med noen dager. Det er også viktig å bruke flått som har blitt smeltet lenge nok til å være ivrig etter å mate. Larvene er klare 2 uker etter at alle larver i eggmassen har fullført fremveksten, men nymfer og voksne klarer seg bedre hvis de brukes minst 10 uker etter smelting.
Denne metoden har vist sammenlignbar flåttfôringssuksess med bruk av laboratoriedyr, med typisk 30% -50% av kvinnelige og ca. 50% av nymfe I. scapularis som fullfører engorgement, sammenlignbar med engorgementsuksessen til voksne matet på laboratoriekaniner eller nymfer matet på mus eller hamstere19. Tilsvarende har andre studier ved bruk av kunstige fôringskamre rapportert en 45% engorgement rate for I. scapularis kvinner og 72% fôringshastighet for nymfer10,18. I mellomtiden, for Ixodes ricinus kvinner og nymfer matet via en kunstig membran, var engorgement priser henholdsvis 71% og 58%,25. Derfor kan resultatene variere avhengig av systemet som er i bruk og hvilken flåttart som undersøkes.
Membrantykkelse er en viktig faktor for fôringssuksess; Tynnere membraner er mindre i stand til å forsegle rundt de små hullene som produseres av kryssprobing og vedlegg. Etter at fôring begynner, kommer mer fuktighet inn i kammeret, noe som kan føre til våte forhold, flytning og påfølgende tørking av frass og mugg. Det er derfor viktig å produsere membraner med maksimal tykkelse som flåttarten og livsfasens hypostomelengde som skal fôres (se protokolltrinn 1.1-1.4). Nymfer av I. scapularis og Dermacentor variabilis spiser på membraner mellom 90 μm og 120 μm tykkelse, mens voksne spiser på membraner opp til tykkelser på nesten 200 μm. Den voksne I. scapularis hypostome er 500 μm lang, mens nymfe- og larvehypostomer er ~100 μm lange, noe som viser seg tilstrekkelig til å trenge gjennom en litt tykkere membran15,26. Rayon-linsepapir er i gjennomsnitt ~ 50 μm i tykkelse og membraner laget av det har minst 50 μm tykkelse; Imidlertid, som nevnt ovenfor, gir tykkere membraner bedre resultater. Larvefôringsmembraner fungerer godt ved 80-100 μm i tykkelse ved bruk av et veldig lett unryu-papir (10 g / m3). Dette uregelmessige morbærpapiret er laced med relativt tykke fibre som gir støtte til en membran som er veldig tynn på steder, noe som gir rikelig med larver festesteder.
Basert på anbefalt membrantykkelse og kammerstørrelser, er det best å begrense antall hunner i voksenfôr til maksimalt 20 hunner (flått plasseres i kamre i protokolltrinn 2.7). Flere kvinner risikerer overbefolkning av festestedene, da flåttene har en tendens til å feste seg veldig tett sammen, noe som kan kompromittere membranintegriteten i lokalområdet og øke risikoen for lekkasje, samt redusere fôringshastigheten. For nymphal flått er maksimumstallene mye høyere og ingen signifikante skadelige effekter er notert, selv når man fôrer 50 nymfer per kammer. Siden telling av individuelle larver ikke er rimelig og ingen overbefolkningsproblemer ble notert, anbefales en halv til en hel eggmasse per kammer for enkel oppsett. Hele eggmasser består av ~ 1000 eller flere larver, og i løpet av en feed hvor som helst fra dusinvis til ~ 200 engorged larver kan falle av fra en enkelt eggmasse. I tillegg har larveflått som ikke spiser en tendens til ikke å dø og kan potensielt omplasseres for senere fôring.
Annen plast har blitt brukt til å produsere fôringskamrene, hvorav polykarbonat har blitt bestemt å være den mest holdbare og ikke-reaktive. Annen plast, som akryl, er følsomme for rengjøringsløsninger, noe som kan forårsake krakelering og brudd, spesielt ved kuttendene av slangen. Polykarbonat holder seg godt til eksponering for blekemiddel, etanol, autoklavering og ultrafiolett sterilisering.
Mens flått i et kammer til slutt kan bite og feste seg til membranen på grunn av varmestimulansen til det oppvarmede blodet under, bidrar ytterligere stimuli i form av kjemiske fagostimulerende midler til å fremskynde denne prosessen (for oppskriften, se protokoll trinn 6). For denne studien er bruken av flåttavføring som er oppløst i vann ideell på grunn av deres evne til å bli bevart ved -20 ° C i lange perioder. De er også lett fornybare, da kryss avføring kan samles fra etterfølgende fôr. Naturligvis kan den første membranfôret ikke ha tilgang til det foreslåtte fagostimulerende middelet av kryss avføring ekstrakt og kan utføres uten det for å bidra til å produsere det for fremtidige strømmer. I tillegg kan alternative fagostimulerende midler brukes, med andre studier som har suksess med forskjellige kjemiske eller mekaniske stimuli som hår eller hårekstrakter 15,24.
Kunstig membranfôring gir ekstra verktøy for forskere som arbeider med flått- og flåttbåren patogenbiologi. Det er rimelig og enkelt, men også arbeidskrevende, og vil sannsynligvis kreve litt foreløpig testing for å optimalisere for ønsket applikasjon og flåttart/livsfase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
- Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
- Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
- Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
- Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
- Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
- Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
- Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
- Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
- Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
- Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
- Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
- Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
- Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
- Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
- Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
- González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
- Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
