Summary
Presentato qui è un metodo per alimentare le zecche in vitro tramite un sistema di membrana artificiale per consentire l'ingorgo parziale o totale di una varietà di fasi di vita delle zecche.
Abstract
Le zecche e le loro malattie associate sono un importante argomento di studio a causa della loro salute pubblica e del carico veterinario. Tuttavia, le esigenze alimentari delle zecche durante lo studio e l'allevamento possono limitare le domande sperimentali o la capacità dei laboratori di ricercare le zecche e i loro agenti patogeni associati. Un sistema di alimentazione artificiale a membrana può ridurre questi problemi e aprire nuove strade di ricerca che potrebbero non essere state possibili con i tradizionali sistemi di alimentazione animale. Questo studio descrive un sistema di alimentazione a membrana artificiale che è stato perfezionato per il successo dell'alimentazione e dell'ingorgo per tutte le fasi di vita di Ixodes scapularis . Inoltre, il sistema di alimentazione artificiale a membrana descritto in questo studio può essere modificato per l'uso con altre specie di zecche attraverso un semplice perfezionamento dello spessore della membrana desiderato. I benefici di un sistema di alimentazione artificiale a membrana sono controbilanciati dall'intensità di lavoro del sistema, dai fattori ambientali aggiuntivi che possono influire sul successo dell'alimentazione e dalla necessità di perfezionare la tecnica per ogni nuova specie e fase di vita delle zecche.
Introduction
Le malattie trasmesse dalle zecche hanno un forte impatto sulla salute degli esseri umani e degli animali in tutto il mondo, essendo responsabili di oltre due terzi di tutte le malattie associate ai vettori negli Stati Uniti dal 2004 al 20161. Inoltre, il numero di casi è cresciuto negli ultimi anni, con più persone e bestiame colpiti da zecche e malattie associate 2,3. Mentre ci sono probabilmente numerose cause per la tendenza al rialzo del numero di casi, il cambiamento climatico è un fattore importante 3,4. Il previsto aumento in corso del numero di casi di malattie trasmesse da zecche sottolinea la necessità di sviluppare nuovi strumenti per studiare le relazioni tra le zecche e gli agenti patogeni che trasmettono.
È noto che le zecche subiscono cambiamenti nella fisiologia e nell'espressione genica durante l'alimentazione e che questi cambiamenti svolgono un ruolo nella trasmissione dei patogeni 5,6. Può essere difficile eseguire studi che esaminino gli effetti dell'alimentazione completa e parziale sulla trasmissione e l'acquisizione di agenti patogeni utilizzando modelli animali, in particolare in situazioni in cui i modelli di roditori non sono suscettibili all'infezione da un particolare agente patogeno. Ad esempio, il ceppo Anaplasma phagocytophilum Variant-1 viene trasmesso naturalmente tra Ixodes scapularis e cervi, ma non è in grado di infettare i topi, complicando l'infezione da zecche nel laboratorio7. I sistemi di alimentazione artificiale possono anche essere applicati per aiutare a studiare agenti patogeni come Borrelia burgdorferi attraverso l'uso di mutanti transgenici che hanno delezioni geniche che inibiscono la trasmissione o l'infezione8. L'utilizzo di un sistema di alimentazione artificiale aiuta i ricercatori a isolare il ruolo dei geni consentendo all'infezione o alla trasmissione di verificarsi solo sul lato della zecca, isolando così qualsiasi risposta dell'ospite che possa confondere tali studi.
Allo stesso modo, alcune fasi di vita delle zecche coinvolte nella malattia e nella trasmissione animale potrebbero non essere indotte a nutrirsi di specie modello di laboratorio comuni. Le femmine di Ixodes scapularis , ad esempio, devono essere nutrite con animali più grandi, in genere conigli9. Sebbene spesso accessibili per la sperimentazione di laboratorio, i requisiti amministrativi e di allevamento dell'uso dei conigli superano quelli dei piccoli roditori e possono essere proibitivi per alcuni laboratori. Altre specie di zecche, in particolare quelle di interesse veterinario, devono essere nutrite con bovini o altri animali di grandi dimensioni che non sono pratici da usare nella maggior parte dei laboratori. I metodi di alimentazione e infezione in vitro , come l'alimentazione artificiale a membrana, forniscono alternative all'utilizzo di animali ospiti di grandi dimensioni o esotici.
Inoltre, l'uso di un sistema di alimentazione artificiale consente alcune analisi che potrebbero non essere possibili con i metodi tradizionali di alimentazione animale. Uno di questi esempi è che, separando la fonte di sangue dal meccanismo di alimentazione, diventa possibile esaminare il ruolo che il sangue di diversi ospiti può avere nella trasmissione di B. burgdorferi 10. Questo esame del sangue dell'ospite e del ruolo che il sangue stesso svolge in assenza della risposta immunitaria dell'ospite è un fattore importante per essere in grado di comprendere i cicli di trasmissione dei patogeni e uno che i sistemi di alimentazione artificiale sono in grado di aiutare a rispondere11. Diventa anche possibile quantificare i numeri esatti di trasmissione di un agente patogeno durante un mangime piuttosto che esaminare semplicemente il successo della trasmissione e l'insediamento in un ospite 8,12.
Alcune delle prime membrane artificiali di alimentazione fatte per zecche dure sono state fatte di pelli animali o membrane di origine animale negli anni 1950 e 196013,14. A causa della natura biologica di queste membrane, ci sono stati problemi sia con la produzione di nuove membrane che con la durata di conservazione. Nel 1990 sono state sviluppate membrane completamente artificiali che utilizzavano un supporto di rete, carta o tessuto con impregnazione di silicone15,16. Il silicone era ideale in quanto le sue proprietà fisiche imitano l'elasticità e la leggera appiccicosità della pelle, insieme alla sua natura bio-inerente. Basandosi su questo, Krober e Guerin, il cui lavoro era basato su questa tecnica, hanno descritto una tecnica di alimentazione con membrana di rayon impregnata di silicone per l'alimentazione artificiale di I. ricinus17.
Il perfezionamento dei metodi per I. scapularis, una specie strettamente correlata, ha portato a notevoli differenze nella durezza del silicone utilizzato nell'impregnazione della membrana, nella ricetta per la produzione di membrane, nelle dimensioni della camera e nello stimolante di attacco. Mentre i perfezionamenti riportati in questo studio hanno portato a caratteristiche di membrana simili a quelle riportate da Andrade et al., che ha anche sviluppato una membrana a base di silicone basata su Krober e Guerin per l'uso in I. scapularis, c'è una differenza nelle fasi di impregnazione del silicone, che consente la flessibilità di utilizzare questo protocollo per fasi di vita immature di I. scapularis 15, 18. Questo studio descrive anche le aggiunte e le modifiche tecniche basate sull'uso ripetuto di questo metodo, le migliori pratiche che si traducono in un feed di successo e la risoluzione dei problemi che possono sorgere. Questo metodo è stato utilizzato per alimentare tutte le fasi della vita attiva, infettare le zecche con batteri patogeni ed esporre le zecche a dosi multiple di antibiotici19,20. Mentre il metodo di alimentazione a membrana artificiale mostrato è per I. scapularis, questo metodo è facilmente adattabile ad altre specie di zecche con piccole modifiche nello spessore della membrana.
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Protocol
1. Preparazione della camera della membrana tick
- Preparare una superficie piana e non porosa, come un piano di vetro o una base metallica rivestita in ceramica, pulendola con etanolo al 70% e quindi coprirla con un singolo strato di pellicola trasparente, assicurandosi che l'involucro di plastica sia piatto e privo di bolle o rughe (vedere Figura 1A).
- Incollare con nastro adesivo la carta per la pulizia delle lenti in rayon al 100% sulla superficie preparata. Assicurarsi che sia piatto e leggermente teso con nastro adesivo su tutti e quattro i lati della carta. Due pezzi di carta da 4 in x 6 in lenti possono essere trasformati in membrane utilizzando i volumi descritti al punto 1.3.
NOTA: Questo è sufficiente per realizzare fino a 12 camere di alimentazione (vedere Figura 1B). Se la membrana è per zecche larvali, utilizzare carta unryu invece di carta per la pulizia delle lenti. - Preparare la miscela di silicone di durezza 00-10 misurando 5 ml di ciascuna parte del kit di silicone in un contenitore monouso, mescolando leggermente i due liquidi prima di aggiungere 1,5 ml di esano. Continuare a mescolare fino a quando il composto è omogeneo e ben miscelato.
NOTA: Se si realizzano membrane per zecche adulte, utilizzare silicone di durezza 00-50. - Utilizzare un piccolo tergipavimento per distribuire la miscela di silicone sulla carta dell'obiettivo. Lasciare riposare per 1 minuto per assicurarsi che il silicone si sia impregnato nella carta dell'obiettivo. Raschiare costantemente il silicone in eccesso sul lato con il tergipavimento usando una piccola quantità di pressione verso il basso. Eseguire un secondo passaggio con il tergipavimento, senza esercitare alcuna pressione verso il basso, per rimuovere eventuali linee di silicone e produrre uno strato liscio.
NOTA: Questa fase della procedura può richiedere una certa pratica per produrre membrane di spessore ottimale per ogni fase della vita (adulti: 150-200 μm; ninfe: 90-120 μm; larve: 80-100 μm). Una membrana più spessa (entro le tolleranze di alimentazione della fase di vita) di solito produce risultati migliori riducendo la condensa nella camera e migliorando la caratteristica di auto-guarigione della membrana. - Solo per le larve, immergere più volte la parte superiore della camera di alimentazione nella resina fluoropolimerica Fluon (PTFE-30), lasciandola asciugare tra un'applicazione e l'altra per produrre uno strato coerente.
NOTA: L'applicazione di Fluon formerà uno strato antiaderente di resina fluoropolimerica simile a una padella antiaderente. Ciò ridurrà il numero di larve che salgono in cima alla camera21. - Lasciare la membrana polimerizzare per almeno 24 ore in un ambiente privo di polvere, come un armadio chimico o di biosicurezza chiuso, prima di passare alla fase successiva. Vedere la Figura 1C per l'aspetto della carta per lenti di rayon dopo che il silicone è stato lasciato asciugare.
- Preparare la miscela di silicone a 30 durezze per fissare le camere alla membrana mescolando parti uguali di miscela siliconica A e B.
- Immergere le camere in policarbonato di circa un quarto di pollice (6 mm) nella miscela di silicone, quindi posizionarle sul foglio della membrana, facendo attenzione a non sovrapporsi a nessuno dei nastri (Figura 1D).
- Lasciare indurire il silicone di fissaggio per almeno 24 ore prima di passare ai passaggi successivi.
- Usando un bisturi, tagliare con cura la membrana attorno a ciascuna delle camere attaccate, tagliando i bordi in modo che possa adattarsi agevolmente in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti senza molto raschiamento sui lati (Figura 1E). Lasciare materiale sufficiente all'esterno della camera per massimizzare l'adesione della membrana.
NOTA: se rimane troppo materiale esterno, la rimozione ripetuta della camera dalla piastra a 6 pozzetti può causare il distacco parziale della membrana dalla camera. La riparazione delle membrane staccate è descritta nel paragrafo 5. - Tagliare un piccolo pezzo della membrana rimanente da ciascuno degli angoli e dal centro del foglio di membrana. Rimuovere l'involucro di plastica da ogni pezzo. Misurare i pezzi con un micrometro per determinare lo spessore medio della membrana.
NOTA: Se lo spessore della membrana non rientra nell'intervallo di tolleranza per la fase di vita (vedere il punto 1.4), le membrane devono essere scartate e rifatte. Lo spessore della carta Unryu è molto variabile a causa dei suoi spessi fili di fibre e delle regioni sottili. Mentre questa caratteristica consente alle larve di trovare regioni di spessore ottimale, rende difficile determinare lo spessore effettivo della membrana. - Posizionare le camere di alimentazione insieme a un O-ring per camera in un becher di vetro da sterilizzare in autoclave a 121 °C per almeno 20 minuti. Lasciare raffreddare le camere prima di utilizzarle.
2. Impostazione del feed tick
- Preparare una lampada o una stanza in modo che le luci siano accese per 16 ore e poi spente per 8 ore. Se si utilizza una lampada, assicurarsi che il bagno d'acqua nella fase successiva sia al buio per quelle 8 ore.
- Installare un bagno d'acqua a 34 °C e con supporti in modo che una piastra a 6 pozzetti possa sedersi e galleggiare leggermente al suo interno. Utilizzare piccoli bicchieri di vetro affondati nel bagno d'acqua come supporti. Utilizzare una copertura trasparente per il bagno d'acqua per mantenere un ciclo luce-buio per le zecche; se necessario, utilizzare un supporto a T e un involucro di plastica per realizzare una copertura. Per ridurre il rischio di contaminazione, aggiungere lo 0,02% di benzalconio cloruro al bagnomaria e impostare un altro bagno d'acqua a 36 °C per riscaldare il sangue freddo.
- Estrarre le camere a membrana autoclavate prepreparate, posizionando l'O-ring attorno alla camera (Figura 1F), quindi riempire ciascuna camera con abbastanza etanolo al 70% per coprire la membrana. Lasciare riposare in un pozzo a 6 pozzetti per 5 minuti e quindi cercare eventuali perdite tra la camera e la membrana e nella membrana stessa.
NOTA: Se la membrana perde, l'etanolo si accumulerà nella base del pozzo. Le membrane che perdono devono essere scartate. - Svuotare l'etanolo dalle camere e quindi lasciarlo asciugare all'aria all'interno di un armadio di biosicurezza o di una cappa a flusso laminare.
NOTA: questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti a seconda dell'umidità ambientale. - Durante l'attesa, inattivare il complemento nel sangue riscaldando a 56 °C per 40 minuti. Integrare sangue bovino defibrinato meccanicamente con 2 g/L di glucosio.
- Dopo che la membrana è asciutta, applicare ~ 20 μL di fagostimolante all'interno della camera e quindi distribuirlo sulla superficie inclinando la camera. Vedere paragrafo 6 per le istruzioni relative alla preparazione di un fagostimolante da zecche frass.
- Attendere che il fagostimolante sia asciutto prima di aggiungere le zecche alla camera con un pennello o una pinza. Lavorare il più rapidamente possibile quando si trasferiscono le zecche nella camera per evitare la fuga. Metti le zecche in un tubo sul ghiaccio per 1-2 minuti prima di trasferirle per rallentare la loro capacità di fuga. Dopo che le zecche sono state trasferite, sigillare la parte superiore con parafilm; Non allungare eccessivamente il parafilm, poiché il calore del bagno d'acqua può causarne lo strappo.
NOTA: Le pinze funzionano meglio con le fasi della vita ninfali e adulta e le spazzole funzionano meglio con le fasi della vita larvale. - Aggiungere 5 mL di sangue inattivato dal calore per pozzetto/camera in un tubo conico e metterlo a bagnomaria a 36 °C. Portare il sangue freddo almeno a temperatura ambiente prima di esporre le zecche ad esso. Mettere da parte quattro camere per piastra a 6 pozzetti per una facile manipolazione delle camere. Dovrebbero essere evitate più camere per piastra, tuttavia, a seconda delle dimensioni del bagno d'acqua, è possibile utilizzare più piastre.
- Aggiungere 5 μL di 3 mM ATP e 50 μL di 100x stock di penicillina/streptomicina/fungizone per 5 mL di sangue alla provetta.
- Trasferire 4,5 ml di sangue in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, quindi posizionare delicatamente la camera nel pozzetto, regolando l'altezza dell'O-ring sulla camera in modo che la membrana si trovi nel sangue ma il livello del sangue intorno al lato non sovrasti il pozzetto. Posizionare il pozzo nel sangue ad angolo per evitare la formazione di bolle d'aria tra il sangue e la membrana.
NOTA: una lastra completata è mostrata nella Figura 2. - Posizionare il coperchio della piastra a 6 pozzetti sopra le camere di alimentazione; quindi, inserire la piastra a 6 pozzetti con camere nel bagno d'acqua preparato a 34 °C e chiudere il coperchio.
NOTA: Il coperchio sulla parte superiore aiuterà a impedire all'acqua condensata di entrare in contatto con il parafilm e diluire il sangue nei pozzetti.
3. Mantenere le zecche di alimentazione cambiando il sangue ogni 12 ore
- Aliquot 5 mL di sangue inattivato dal calore per pozzetto in un tubo e riscaldarlo a bagnomaria a 36 °C. Scongelare contemporaneamente l'ATP e la penicillina / streptomicina / fungizone nel bagnomaria.
- Aggiungere 5 μL di 3 mM ATP e 50 μL di 100x stock di penicillina/streptomicina/fungizone per pozzetto al tubo sanguigno. Trasferire 4,5 ml di sangue in un pozzetto di una piastra fresca a 6 pozzetti.
- Estrarre la piastra a 6 pozzetti con la camera di zecca dal bagno d'acqua. Rimuovere la camera dal pozzetto e sciacquare l'esterno della camera e la membrana con 10 ml di 1x PBS sterile per rimuovere il sangue.
- Utilizzando carta da filtro autoclavata, tamponare delicatamente la membrana e la camera per rimuovere il PBS in eccesso. Sostituire il parafilm sulla parte superiore della camera. Se c'è molta condensa all'interno della camera, tamponare i punti umidi con carta da filtro autoclavata prima di sigillare con un nuovo parafilm.
- Posizionare la camera tick nella nuova piastra a 6 pozzetti con sangue fresco, regolando l'altezza dell'O-ring se necessario. Ripetere i passaggi 3,3-3,5 per ciascuna camera sulla piastra. Posizionare il coperchio della piastra a 6 pozzetti sopra le parti superiori delle camere. Spostare nuovamente la nuova piastra a 6 pozzetti nel bagno d'acqua a 34 °C.
- Ripetere i passaggi 3,1-3,5 ogni 12 ore fino alla conclusione del feed tick. Attendere che le zecche si stacchino dalla membrana da sole quando sono ingorgate o rimuoverle delicatamente dalla membrana con una pinzetta morbida al tatto mentre sono ancora attaccate per ottenere zecche parzialmente ingorgate.
4. Trattamento antifungino
NOTA: Eseguire solo quando si osserva una crescita fungina sulla membrana. È probabile che il fungo si formi sul lato sanguigno della membrana se l'alimentazione è di durata sufficiente. La prima indicazione di contaminazione fungina sono piccole (1-3 mm) scaglie di sangue coagulato visibili sulla membrana. Quando si nota contaminazione fungina, i trattamenti antifungini possono prolungare la durata dell'esperimento e migliorare il successo dell'ingorgo.
- Sciogliere 10.000 U nistatina per mL in acqua distillata, 5 mL per camera di alimentazione. Filtrare-sterilizzare con un filtro a siringa da 0,1 μm.
- Aggiungere 5 ml di soluzione di nistatina per pozzetto di una nuova piastra a 6 pozzetti, un pozzetto per ciascuna camera di alimentazione.
- Posizionare le camere di risciacquo con PBS nella soluzione. Lasciare riposare per 10 min.
- Risciacquare le membrane trattate con PBS prima di rimetterle nel sangue fresco.
- Ripetere il trattamento antifungino ogni 2-3 giorni (a seconda dell'entità della contaminazione fungina) fino al completamento dell'esperimento.
5. Riadesione delle membrane staccate con colla cianoacrilica
NOTA: eseguire solo quando si nota il distacco della membrana.
- Le membrane possono parzialmente staccarsi dalle camere di alimentazione, specialmente durante la rimozione dalla piastra a 6 pozzetti. Se ciò accade, sciacquare la membrana del sangue con PBS.
- Asciugare delicatamente l'area interessata. Non è necessario che sia perfettamente asciutto, ma la presenza di umidità fa sì che la colla si imposti più velocemente.
NOTA: la riadesione della membrana limita il tempo di lavoro, tuttavia, a seconda delle dimensioni del distacco, potrebbe essere auspicabile un tempo di presa più rapido. - Spremere una piccola quantità di colla cianoacrilica nello spazio in cui la membrana si è allontanata dalla camera. Tenere premuto in posizione per ~ 2 minuti per consentire alla colla di fissarsi.
- Rimettere la camera nel sangue nella piastra a 6 pozzetti.
6. Fare fagostimolante
NOTA: Eseguire alla fine di un mangime o prima che sia iniziata un'alimentazione a membrana.
- Raccogli le feci delle zecche da un precedente mangime a membrana o da un'altra fonte di zecche di alimentazione. Conservare le feci a -20 °C prima di produrre il fagostimolante. Schiacciare i pellet di feci di zecca e mescolare 0,1 g per 1 ml di acqua. Aggiungere 1 mM di glutatione ridotto dal tripeptide, sciogliere e mescolare accuratamente mediante vortice.
- Filtrare-sterilizzare con un filtro a siringa da 0,1 μm.
- Congelare a -20 °C fino al momento del bisogno.
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Representative Results
Un'alimentazione di successo dipende dal fatto che si desideri un ingorgo parziale o completo. Alimentato con successo I. scapularis diventa una tonalità di grigio canna di fucile per gli adulti e si stacca da solo dalla membrana. Tuttavia, se sono almeno delle dimensioni di un pisello, possono essere staccati dalla membrana quando finiscono l'alimentazione. Per gli stadi immaturi di I. scapularis , la dimensione per le zecche completamente ingorgate varia e, poiché, a differenza degli adulti, non mostrano un cambiamento di colore, il distacco è il modo migliore per determinare se un segno di spunta è completamente gonfio. Vedere la Figura 3 per un esempio di come il ninfal I. scapularis può apparire durante un pasto. Le zecche adulte di I. scapularis impiegano 1 settimana o più dall'attaccamento fino a quando non iniziano a staccarsi dalla membrana; Le ninfe spesso si staccano circa 5 giorni dopo l'attaccamento e le larve iniziano a staccarsi ~ 3-4 giorni dopo il primo attaccamento. I mangimi possono continuare per tutto il tempo in cui si desidera mantenere i cambiamenti di sangue due volte al giorno e fino a quando la muffa non ha iniziato a crescere oltre ciò che il trattamento antifungino può controllare. Le zecche parzialmente ingorgate devono essere staccate manualmente dalla membrana.
Zecche immature (larve e ninfe) che si staccano dalla membrana da sole quasi sempre muta con successo nella loro prossima fase di vita, e supponendo che si siano sufficientemente ingorgate e siano di dimensioni abbastanza grandi, anche quelle che vengono staccate manualmente dalla membrana alla fine di una muta di alimentazione. Le zecche femminili che sono diventate grigio canna di sparo durante l'ingorgo di solito depongono con successo le uova. Tuttavia, a differenza dei mezzi naturali di alimentazione, le femmine ingorgate alimentate con membrana producono masse di uova più piccole e sono di dimensioni più piccole rispetto alle loro controparti nutrite naturalmente con animali. I risultati di un recente esperimento che ha alimentato le larve di I. scapularis dalle uova attraverso l'ingorgo ninfale e la muta possono essere visti nella Tabella 1. Le ninfe risultanti dal mangime larvale iniziale sono state alimentate 2 mesi dopo la muta. È importante notare, tuttavia, che questo esperimento ha avuto l'omogenato di organi di cervo aggiunto al sangue, che potrebbe aver avuto effetti dannosi sul successo dell'alimentazione delle zecche.
In un altro esperimento, 60 zecche I. scapularis femmine e 60 maschi sono state collocate in quattro camere di alimentazione (30 zecche abbinate al sesso per camera) e le zecche femminili sono state autorizzate a nutrirsi fino al riempimento. Queste zecche hanno avuto origine come progenie di femmine ingorgate raccolte da cervi uccisi dai cacciatori. Il peso medio della massa delle uova e la gamma, oltre ai numeri di successo dell'ingorgo (numero di femmine che hanno deposto le uova dopo l'ingorgo e il distacco), possono essere visti nella Tabella 1. I pesi della massa delle uova per I. scapularis sono molto variabili in letteratura, ma le zecche precedentemente raccolte da cervi uccisi dai cacciatori del Minnesota hanno prodotto masse di uova con un peso medio di 77 mg (19-147 mg)22. La mortalità delle zecche è bassa utilizzando il sistema di alimentazione a membrana artificiale; Le zecche che non si attaccano e non si nutrono per lo più sopravvivono al processo, aumentando la possibilità di tentare ulteriori esperimenti di alimentazione a membrana con i sopravvissuti.
Questo metodo è stato utilizzato per infettare la ninfa I. scapularis con una varietà di agenti patogeni trasmessi dalle zecche, tra cui A. phagocytophilum Variant-1, che non può utilizzare i metodi tradizionali di infezione dei roditori7. L'infezione delle zecche da parte dei batteri è stata confermata con qPCR, e mentre tutte le zecche ninfali che si sono alimentate con successo erano positive dopo l'alimentazione, a seconda della specie batterica, l'infezione persisterebbe o meno transstalmente19. Questo metodo è stato utilizzato anche per nutrire la femmina I. scapularis ciprofloxacina; Le zecche alimentate con successo hanno mostrato un abbattimento comparabile dei livelli di simbionti batterici alle zecche iniettate20.
Figura 1: La camera della membrana tick . (A) Base del supporto rivestita in ceramica coperta da un involucro di plastica. (B) Carta per lenti attaccata su una base avvolta in plastica. Il rettangolo blu è il tergipavimento utilizzato nel pannello C. (C) Carta per lenti dopo essere stata impregnata di silicone. D) Camere fissate alla membrana di retino siliconico. Ogni foglio di carta da 4 in x 6 in lente può ospitare sei camere. (E) Una camera completa con membrana di silicone-rayon. Una membrana di silicone staccata è mostrata sulla destra. (F) Una camera assemblata completa, con un O-ring fissato su di essa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Impostazione del tick feed. Un esempio di come apparirà un set di quattro camere con I. scapularis adulto una volta che tutto è impostato e prima che venga posto a bagnomaria. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Un feed in corso con ninfe Ixodes scapularis parzialmente ingorgate. I punti neri o marroni attorno ai siti di attacco (vedi etichetta A per esempio) sono il frass che può essere raccolto durante e dopo il mangime per produrre il fagostimolante. Sulla membrana si vedono ninfe I . scapularis parzialmente ingorgate (vedi etichetta B). Una buccia della muta delle larve ingorgate può essere vista dall'etichetta C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Numero di zecche di partenza | Numero di zecche ingorgate con successo | Massa d'uovo massa media in mg (intervallo) | |
| Larve | 2 masse di uova schiuse | 150 | N/D |
| Ninfe | 150 | 24 | N/D |
| Femmine adulte | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
Tabella 1: Numeri di ingorgo di zecche e pesi della massa di uova. Le condizioni sperimentali di ingorgo larvale e ninfale, hanno aggiunto omogenato di organi di cervo al sangue oltre agli integratori utilizzati in questo protocollo. Le condizioni sperimentali di ingorgo femminile adulto erano quelle descritte nel protocollo sopra. L'ingorgo riuscito è stato definito come zecche ingorgate che si sono ammassate con successo alla fase successiva della vita o femmine ingorgate che hanno deposto con successo le uova.
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Discussion
L'alimentazione artificiale a membrana delle zecche fornisce uno strumento utile per una varietà di procedure sperimentali, ma non è probabile che sostituisca l'alimentazione animale per tutte le applicazioni. Mantenere grandi colonie di zecche in tutte le fasi della vita senza alimentazione animale è generalmente insostenibile. Invece, il sistema di alimentazione artificiale è prezioso per altri scopi come infettare le zecche con agenti patogeni non supportati da ospiti modello, valutare gli impatti di dosaggi controllati di composti o microrganismi sulle zecche in un ambiente di alimentazione semplificato o allevare piccole colonie di zecche che si basano su animali ospiti che non sono prontamente disponibili in laboratorio8, 10,11,23,24,25. Rispetto ai metodi tradizionali di alimentazione animale, l'alimentazione artificiale a membrana è laboriosa e presenta sfide15,24. È per questi motivi che l'alimentazione artificiale a membrana non sostituisce i tradizionali metodi di alimentazione basati sugli animali e consente invece esperimenti che non possono essere fatti con l'alimentazione animale tradizionale.
Mantenere le condizioni igieniche sia nelle camere di alimentazione che nella colonia di zecche è vitale per evitare la contaminazione fungina e batterica. Tuttavia, quando si utilizza l'alimentazione artificiale per esporre le zecche agli agenti patogeni, gli integratori di penicillina / streptomicina / fungizone (P / S / F) dovrebbero essere evitati dal sangue per evitare di uccidere gli agenti patogeni. L'esposizione delle zecche alla ciprofloxacina nel sangue può eliminare completamente Rickettsia buchneri, l'endosimbionte ovarico di I. scapularis , da un sottogruppo di progenie F1, mentre l'aggiunta di routine di P / S / F al sangue non ha questo effetto20. Gli studi di trasmissione transovarica dei patogeni non sono stati eseguiti utilizzando questo sistema, ma non sono stati osservati cambiamenti nella fecondità delle femmine ingorgate negli esperimenti esposti agli antibiotici rispetto a quelli di controllo. L'inizio rapido dell'alimentazione e dell'ingorgo delle zecche evita molti dei problemi associati alla contaminazione fungina; Per questo motivo, il sistema tende a funzionare più facilmente con zecche larvali e ninfali, in quanto hanno tempi di alimentazione più brevi. Il trattamento periodico delle membrane contaminate con antimicotici come la nistatina può prolungare il tempo disponibile per l'ingorgo di alcuni giorni. È anche importante usare zecche che sono state mutate abbastanza a lungo da essere desiderose di nutrirsi. Le larve sono pronte 2 settimane dopo che tutte le larve nella massa dell'uovo hanno completato l'emergenza, ma le ninfe e gli adulti vanno meglio se usati almeno 10 settimane dopo la muta.
Questo metodo ha dimostrato un successo paragonabile all'alimentazione delle zecche all'uso di animali da laboratorio, con tipicamente il 30% -50% delle femmine e circa il 50% della ninfa I. scapularis che completa l'ingorgo, paragonabile al successo dell'ingorgo degli adulti nutriti con conigli da laboratorio o ninfe nutrite con topi o criceti19. Allo stesso modo, altri studi che utilizzano camere di alimentazione artificiali hanno riportato un tasso di ingorgo del 45% per le femmine di I. scapularis e un tasso di alimentazione del 72% per le ninfe10,18. Nel frattempo, per le femmine e le ninfe di Ixodes ricinus alimentate attraverso una membrana artificiale, i tassi di ingorgo erano rispettivamente del 71% e del 58%,25. Pertanto, i risultati possono essere variabili a seconda del sistema in uso e delle specie di zecche studiate.
Lo spessore della membrana è un fattore importante per il successo dell'alimentazione; Le membrane più sottili sono meno in grado di sigillare attorno ai piccoli fori prodotti dal sondaggio e dall'attacco delle zecche. Dopo l'inizio dell'alimentazione, più umidità entra nella camera, il che può portare a condizioni di umidità, alla liquefazione e alla successiva riasciugatura di frass e muffe. È quindi importante produrre membrane allo spessore massimo tollerabile dalla specie di zecca e dalla lunghezza dell'ipostoma della fase di vita che deve essere alimentata (vedi fasi del protocollo 1.1-1.4). Le ninfe di I. scapularis e Dermacentor variabilis si nutrono di membrane di spessore compreso tra 90 μm e 120 μm, mentre gli adulti si nutrono di membrane fino a spessori di quasi 200 μm. L'ipostoma adulto di I. scapularis è lungo 500 μm, mentre gli ipostomi ninfali e larvali sono lunghi ~100 μm, il che si rivela sufficiente per penetrare una membrana leggermente più spessa15,26. La carta per lenti di rayon ha in media uno spessore di ~ 50 μm e le membrane realizzate con esso hanno uno spessore minimo di 50 μm; Tuttavia, come detto sopra, membrane più spesse producono risultati migliori. Le membrane di alimentazione larvale funzionano bene a 80-100 μm di spessore utilizzando una carta unryu molto leggera (10 g / m3). Questa carta di gelso irregolare è allacciata con fibre relativamente spesse che forniscono supporto a una membrana che è molto sottile in alcuni punti, consentendo ampi siti di attacco delle larve.
In base allo spessore della membrana raccomandato e alle dimensioni della camera, è meglio limitare il numero di femmine nei mangimi per adulti a un massimo di 20 femmine (le zecche sono collocate nelle camere nella fase 2.7 del protocollo). Più femmine rischiano di sovraffollare i siti di attacco, poiché le zecche tendono ad attaccarsi molto strettamente, il che può compromettere l'integrità della membrana nell'area locale e aumentare il rischio di perdite, oltre a rallentare la velocità di alimentazione. Per le zecche ninfali, i numeri massimi sono molto più alti e non si notano effetti dannosi significativi, anche quando si alimentano 50 ninfe per camera. Poiché il conteggio delle singole larve non è ragionevole e non sono stati notati problemi di sovraffollamento, si raccomanda una massa di uova da metà a un'intera per camera per facilità di configurazione. Le masse di uova intere comprendono ~ 1.000 o più larve e nel corso di un mangime ovunque da dozzine a ~ 200 larve ingorgate possono cadere da una singola massa di uova. Inoltre, le zecche larvali che non si nutrono tendono a non morire e possono potenzialmente essere rialloggiate per un'alimentazione successiva.
Altre materie plastiche sono state utilizzate per produrre le camere di alimentazione, di cui il policarbonato è stato determinato per essere il più resistente e non reattivo. Altre materie plastiche, come gli acrilici, sono sensibili alle soluzioni detergenti, che possono causare incrostazioni e rotture, specialmente alle estremità tagliate del tubo. Il policarbonato resiste bene all'esposizione a candeggina, etanolo, autoclave e sterilizzazione ultravioletta.
Mentre le zecche in una camera possono eventualmente mordere e attaccarsi alla membrana a causa dello stimolo termico del sangue riscaldato sottostante, ulteriori stimoli sotto forma di fagostimolanti chimici aiutano ad accelerare questo processo (per la ricetta, vedere il protocollo fase 6). Per questo studio, l'uso di feci di zecca che sono state sciolte in acqua è ideale grazie alla loro capacità di essere conservate a -20 ° C per lunghi periodi. Sono anche facilmente rinnovabili, poiché le feci di zecche possono essere raccolte dai mangimi successivi. Naturalmente, il primo mangime a membrana potrebbe non avere accesso al fagostimolante suggerito dell'estratto di feci di zecca e può essere eseguito senza di esso per aiutare a produrlo per i mangimi futuri. Inoltre, possono essere utilizzati fagostimolanti alternativi, con altri studi che hanno avuto successo con diversi stimoli chimici o meccanici come capelli o estratti di capelli15,24.
L'alimentazione artificiale a membrana fornisce strumenti aggiuntivi per i ricercatori che lavorano nella biologia dei patogeni trasmessi da zecche e zecche. È economico e semplice, ma anche laborioso, e probabilmente richiederà alcuni test preliminari per ottimizzare l'applicazione desiderata e la fase di vita delle specie / zecche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
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