Summary
Præsenteret her er en metode til blodfodring af flåter in vitro via et kunstigt membransystem for at muliggøre delvis eller fuld overfyldning af en række forskellige flåtlivsstadier.
Abstract
Flåter og deres tilknyttede sygdomme er et vigtigt emne for undersøgelse på grund af deres folkesundhed og veterinære byrde. Imidlertid kan fodringsbehovet for flåter under både undersøgelse og opdræt begrænse eksperimentelle spørgsmål eller laboratoriernes evne til at undersøge flåter og deres tilknyttede patogener. Et kunstigt membranfodringssystem kan reducere disse problemer og åbne nye forskningsveje, som måske ikke har været mulige med traditionelle dyrefodringssystemer. Denne undersøgelse beskriver et kunstigt membranfodringssystem, der er blevet raffineret til fodring og engorgement succes for alle Ixodes scapularis livsstadier. Desuden kan det kunstige membranfodringssystem, der er beskrevet i denne undersøgelse, modificeres til brug sammen med andre flåtarter gennem simpel forfining af den ønskede membrantykkelse. Fordelene ved et kunstigt membranfodringssystem opvejes af systemets arbejdsintensitet, de yderligere miljøfaktorer, der kan påvirke fodringssucces, og behovet for at forfine teknikken for hver ny art og livsfase af flåter.
Introduction
Flåtbårne sygdomme påvirker stærkt menneskers og dyrs sundhed over hele verden og er ansvarlige for mere end to tredjedele af alle vektorassocierede sygdomme i USA fra 2004 til 20161. Derudover er antallet af tilfælde vokset i de senere år, hvor flere mennesker og husdyr er ramt af flåter og deres tilknyttede sygdomme 2,3. Mens der sandsynligvis er mange årsager til den opadgående tendens i antallet af tilfælde, er det ændrede klima en vigtig faktor 3,4. Den forventede fortsatte stigning i antallet af tilfælde af flåtbårne sygdomme understreger behovet for at udvikle nye værktøjer til at undersøge forholdet mellem flåter og de patogener, de overfører.
Det er kendt, at flåter gennemgår ændringer i fysiologi og genekspression under fodring, og at disse ændringer spiller en rolle i patogenoverførsel 5,6. Det kan være vanskeligt at udføre undersøgelser, der undersøger virkningerne af fuld og delvis fodring på patogenoverførsel og erhvervelse ved hjælp af dyremodeller, især i situationer, hvor gnavermodeller ikke er modtagelige for infektion med et bestemt patogen. For eksempel overføres Anaplasma phagocytophilum Variant-1-stammen naturligt mellem Ixodes scapularis og hjorte, men er ude af stand til at inficere mus, hvilket komplicerer flåtinfektion i laboratoriet7. Kunstige fodringssystemer kan også anvendes til at hjælpe med at studere patogener som Borrelia burgdorferi via brug af transgene mutanter, der har gendeletioner, der hæmmer transmission eller infektion8. Brug af et kunstigt fodringssystem hjælper forskere med at isolere genernes rolle ved at tillade infektion eller transmission kun at forekomme på flåtens side og derved isolere ethvert værtsrespons, der kan forvirre sådanne undersøgelser.
På samme måde kan nogle livsstadier af flåter, der er involveret i sygdom og overførsel af dyr, muligvis ikke tilskyndes til at fodre med almindelige laboratoriemodelarter. Ixodes scapularis hunner skal for eksempel fodres med større dyr, typisk kaniner9. Selv om de ofte er tilgængelige for laboratorieforsøg, overstiger de administrative krav og kravene til opdræt af kaniner kravene til små gnavere og kan være uoverkommelige for nogle laboratorier. Andre flåtarter, især dem, der er af veterinær betydning, skal fodres med kvæg eller andre store dyr, der ikke er praktiske at bruge i de fleste laboratorier. In vitro-fodrings - og infektionsmetoder, såsom kunstig membranfodring, giver alternativer til at bruge store eller eksotiske værtsdyr.
Derudover giver brugen af et kunstigt fodringssystem mulighed for visse analyser, som måske ikke er mulige med traditionelle dyrefodringsmetoder. Et sådant eksempel er, at ved at adskille blodkilden fra fodringsmekanismen bliver det muligt at undersøge den rolle, som forskellige værters blod kan have i B. burgdorferi-transmission 10. Denne undersøgelse af værtsblod og selve blodets rolle i fravær af værtsimmunrespons er en vigtig faktor for at kunne forstå patogenoverførselscyklusser og en, som kunstige fodringssystemer er i stand til at hjælpe med at besvare11. Det bliver også muligt at kvantificere det nøjagtige overførselsantal af et patogen under et foder i stedet for blot at undersøge overførselssucces og etablering i en vært 8,12.
Nogle af de første kunstige fodringsmembraner lavet til hårde flåter blev lavet af dyreskind eller dyreafledte membraner i 1950'erne og 1960'erne13,14. På grund af disse membraners biologiske natur var der problemer med både produktion af nye membraner og holdbarhed. I 1990'erne blev der udviklet fuldt kunstige membraner, der udnyttede en bagside af net, papir eller stof med silikoneimprægnering15,16. Silikone var ideel, da dens fysiske egenskaber efterligner hudens strækbarhed og lette klæbrighed sammen med dens bioiboende natur. På baggrund af dette beskrev Krober og Guerin, hvis arbejde denne teknik var baseret på, en silikoneimprægneret rayonmembranfodringsteknik til kunstig fodring af I. ricinus17.
Forfining af metoderne til I. scapularis, en nært beslægtet art, har ført til bemærkelsesværdige forskelle i hårdheden af silikone, der anvendes til membranimprægnering, opskriften på membranproduktion, kammerets dimensioner og fastgørelsesstimulerende middel. Mens de forbedringer, der er rapporteret i denne undersøgelse, har resulteret i lignende membranegenskaber som dem, der er rapporteret af Andrade et al., Som også udviklede en silikonebaseret membran baseret på Krober og Guerin til brug i I. scapularis, er der en forskel i silikoneimprægneringstrinnene, hvilket giver fleksibilitet til at udnytte denne protokol til umodne livsstadier af I. scapularis 15, 18. Denne undersøgelse beskriver også tilføjelser og tekniske ændringer baseret på gentagen brug af denne metode, bedste praksis, der resulterer i et vellykket feed, og fejlfinding af problemer, der kan opstå. Denne metode er blevet brugt til at fodre alle aktive livsstadier, inficere flåter med patogene bakterier og udsætte flåter for flere doser antibiotika19,20. Mens den viste kunstige membranfodringsmetode er for I. scapularis, kan denne metode let tilpasses andre arter af flåter med mindre ændringer i membrantykkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargøring af krydsmembrankammeret
- Forbered en flad, ikke-porøs overflade, såsom et plan af glas eller keramisk belagt metalbase på et armstativ ved at tørre det af med 70% ethanol og derefter dække det med et enkelt lag plastfolie, og sørg for, at plastfolien er flad og uden bobler eller rynker (se figur 1A).
- Tape 100% rayon linse rengøringspapir ned til den forberedte overflade. Sørg for, at den er flad og let stram med tape på tværs af alle fire sider af papiret. To stykker 4 tommer x 6 i objektivpapir kan laves til membraner ved hjælp af de volumener, der er beskrevet i trin 1.3.
BEMÆRK: Dette er tilstrækkeligt til at udgøre op til 12 fødekamre (se figur 1B). Hvis membranen er til larveflåter, skal du bruge unryu-papir i stedet for linserensningspapir. - Forbered silikoneblandingen 00-10 hårdhed ved at måle 5 ml af hver del af silikonesættet i en engangsbeholder, bland de to væsker let, inden der tilsættes 1,5 ml hexan. Fortsæt blandingen, indtil blandingen er homogen og grundigt blandet.
BEMÆRK: Hvis du laver membraner til voksne flåter, skal du bruge 00-50 hårdhed silikone. - Brug en lille gummiskraber til at fordele silikoneblandingen over linsepapiret. Lad det stå i 1 min for at sikre, at silikonen er gennemblødt i linsepapiret. Skrab støt overskydende silikone til siden med gummiskraberen ved hjælp af en lille mængde nedadgående tryk. Udfør en anden passage med gummiskraberen, uden at udøve noget nedadgående tryk, for at fjerne eventuelle silikonelinjer og producere et glat lag.
BEMÆRK: Dette trin i proceduren kan kræve en vis øvelse for at producere membraner med optimal tykkelse for hvert livsstadium (voksne: 150-200 μm; nymfer: 90-120 μm; larver: 80-100 μm). En tykkere membran (inden for fødetolerancerne i livsstadiet) vil normalt give bedre resultater ved at reducere kondens i kammeret og forbedre membranens selvhelbredende karakteristik. - Kun for larver dyppes toppen af fødekammeret i Fluon-fluorpolymerharpiks (PTFE-30) flere gange, så det tørrer mellem applikationer for at producere et ensartet lag.
BEMÆRK: Anvendelsen af Fluon vil danne et non-stick lag af fluorpolymerharpiks svarende til en non-stick kogepande. Dette vil reducere antallet af larver, der klatrer til toppen af kammeret21. - Lad membranen hærde i mindst 24 timer i et støvfrit miljø, såsom et lukket kemikalie- eller biosikkerhedsskab, før du går videre til næste trin. Se figur 1C for, hvordan rayonlinsepapiret ser ud, efter at silikonen har fået lov til at tørre.
- Forbered silikoneblandingen med 30 hårdheder for at fastgøre kamrene til membranen ved at blande lige dele silikoneblanding A og B.
- Dyp polykarbonatkamrene ca. en kvart tomme (6 mm) i silikoneblandingen, og læg dem derefter på membranpladen, og pas på ikke at overlappe noget af båndet (figur 1D).
- Lad den fastgjorte silikone hærde i mindst 24 timer, før du går videre til de næste trin.
- Brug en skalpel til forsigtigt at skære membranen rundt om hvert af de vedhæftede kamre og trimme kanterne ned, så den kan passe glat ind i en brønd på 6-brøndpladen uden meget skrabning på siderne (figur 1E). Tillad tilstrækkeligt materiale uden for kammeret for at maksimere vedhæftningen af membranen.
BEMÆRK: Hvis der er for meget udvendigt materiale tilbage, kan gentagen fjernelse af kammeret fra 6-brøndpladen medføre, at membranen delvist løsner sig fra kammeret. Reparation af løsrevne membraner er beskrevet i afsnit 5. - Skær et lille stykke af den resterende membran fra hvert af hjørnerne og midten af membranpladen. Fjern plastfolien fra hvert stykke. Mål stykkerne med et mikrometer for at bestemme den gennemsnitlige membrantykkelse.
BEMÆRK: Hvis membrantykkelsen ikke falder inden for toleranceområdet for levetidsstadiet (se trin 1.4), skal membranerne kasseres og laves om igen. Unryu papirtykkelse er meget variabel på grund af dens tykke tråde af fiber og tynde områder. Mens denne egenskab gør det muligt for larver at finde områder med optimal tykkelse, gør det det vanskeligt at bestemme den faktiske membrantykkelse. - Fødekamrene anbringes sammen med en O-ring pr. kammer i et glasbægerglas, der autoklaveres ved 121 °C i mindst 20 minutter for at sterilisere. Lad kamrene køle af, før du bruger dem.
2. Opsætning af krydsfoderet
- Forbered en lampe eller et rum, så lysene er tændt i 16 timer og derefter slukket i 8 timer. Hvis du bruger en lampe, skal du sørge for, at vandbadet i næste trin er i mørke i de 8 timer.
- Opsæt et vandbad ved 34 °C og med understøtninger, så en plade med 6 brønde kan sidde og flyde lidt i det. Brug små glasbægre nedsænket i vandbadet som understøtninger. Brug et gennemsigtigt dæksel til vandbadet for at opretholde en lys-mørk cyklus for flåterne; Brug om nødvendigt et T-stativ og plastfolie til at lave et dæksel. For at reducere risikoen for kontaminering tilsættes 0,02% benzalkoniumchlorid til vandbadet og indstilles et andet vandbad til 36 °C til opvarmning af kølet blod.
- Tag de forberedte, autoklaverede membrankamre ud, placer O-ringen rundt om kammeret (figur 1F), og fyld derefter hvert kammer med nok 70% ethanol til at dække membranen. Lad sidde i en 6-brønds pladebrønd i 5 minutter, og se derefter efter lækager mellem kammeret og membranen og i selve membranen.
BEMÆRK: Hvis membranen lækker, akkumuleres ethanol i bunden af brønden. Utætte membraner skal kasseres. - Tøm ethanolen ud af kamrene, og lad den derefter lufttørre inde i et biosikkerhedsskab eller laminar strømningshætte.
BEMÆRK: Dette kan tage flere minutter afhængigt af luftfugtigheden. - Mens du venter, varmeinaktiveres komplementet i blodet ved opvarmning til 56 °C i 40 minutter. Suppler mekanisk defibrineret kvægblod med 2 g / l glucose.
- Når membranen er tør, påføres ~ 20 μL fagstimulerende middel på indersiden af kammeret og spredes derefter rundt om overfladen ved at vippe kammeret. Se punkt 6 for instruktioner vedrørende fremstilling af et fagstimulerende middel fra flåtfrass.
- Vent, indtil fagstimulerende er tør, før du tilføjer flåterne til kammeret med enten en børste eller tang. Arbejd så hurtigt som muligt, når du overfører flåterne til kammeret for at forhindre flugt. Sæt flåterne i et rør på is i 1-2 minutter, før du overfører dem for at bremse deres evne til at flygte. Når flåterne er overført, forsegles toppen med parafilm; Overstræk ikke parafilmen, da varmen fra vandbadet kan få den til at rive.
BEMÆRK: Tang fungerer bedst med nymphal og voksne livsstadier, og børster fungerer bedst med larvelivsstadier. - Der tilsættes 5 ml varmeinaktiveret blod pr. hul/kammer i et konisk rør og anbringes i vandbadet indstillet til 36 °C. Bring kølet blod op til mindst stuetemperatur, før du udsætter flåterne for det. Afsæt fire kamre pr. 6-brøndsplade for nem håndtering af kamre. Flere kamre pr. plade bør undgås, men afhængigt af vandbadets størrelse kan flere plader bruges.
- Der tilsættes 5 μL 3 mM ATP og 50 μL 100x lager penicillin/streptomycin/fungizone pr. 5 ml blod til røret.
- Overfør 4,5 ml af blodet til en brønd i en 6-brøndplade, og placer derefter forsigtigt kammeret i brønden, juster O-ringhøjden på kammeret, så membranen sidder i blodet, men blodniveauet omkring siden ikke overgår brønden. Placer brønden i blodet i en vinkel for at undgå dannelse af luftbobler mellem blodet og membranen.
BEMÆRK: En færdig plade er vist i figur 2. - Anbring låget på 6-brøndpladen oven på fødekamrene; Sæt derefter 6-brøndspladen med kamre i det forberedte 34 °C vandbad, og luk låget.
BEMÆRK: Låget på toppen hjælper med at forhindre kondenseret vand i at komme i kontakt med parafilmen og fortynde blodet i brøndene.
3. Vedligeholdelse af foderflåter ved at skifte blod hver 12. time
- Der saltes 5 ml varmeinaktiveret blod pr. brønd i et rør, og det opvarmes i et vandbad ved 36 °C. Optø ATP og penicillin/streptomycin/fungizone i vandbadet på samme tid.
- Der tilsættes 5 μL 3 mM ATP og 50 μL 100x lager penicillin/streptomycin/fungizone pr. brønd til blodrøret. Overfør 4,5 ml blod til en brønd med en frisk 6-brøndplade.
- Tag 6-brøndpladen med krydskammeret ud af vandbadet. Fjern kammeret fra brønden og skyl ydersiden af kammeret og membranen med 10 ml steril 1x PBS for at fjerne blodet.
- Brug autoklaveret filterpapir til forsigtigt at tørre membranen og kammeret for at fjerne overskydende PBS. Udskift parafilmen øverst i kammeret. Hvis der er meget kondens inde i kammeret, tørres de våde pletter med autoklaveret filterpapir, inden de forsegles med frisk parafilm.
- Placer flåtkammeret i den nye 6-brønds plade med frisk blod, og juster O-ringhøjden, hvis det er nødvendigt. Gentag trin 3.3-3.5 for hvert kammer på pladen. Placer låget på 6-brøndpladen over toppen af kamrene. Flyt den nye 6-brønds plade tilbage i 34 °C vandbadet.
- Gentag trin 3.1-3.5 hver 12. time indtil afslutningen af krydsfoderet. Vent på, at flåterne løsner sig fra membranen af sig selv, når de er opslugt, eller fjern dem forsigtigt fra membranen med en blød pincet, mens de stadig er fastgjort for at opnå delvist engorged flåter.
4. Antifungal behandling
BEMÆRK: Udfør kun, når der ses svampevækst på membranen. Svampe vil sandsynligvis dannes på blodsiden af membranen, hvis fodringen er af tilstrækkelig varighed. Den første indikation af svampeforurening er små (1-3 mm) flager af koaguleret blod synligt på membranen. Når svampeforurening bemærkes, kan svampedræbende behandlinger forlænge eksperimentets varighed og forbedre engorgement succes.
- 10.000 E nystatin opløses pr. ml i destilleret vand, 5 ml pr. fodringskammer. Filtersteriliser med et 0,1 μm sprøjtefilter.
- Tilsæt 5 ml nystatinopløsning pr. hul i en ny 6-brønds plade, en brønd til hvert fodringskammer.
- PBS-skyllede kamre anbringes i opløsningen. Lad sidde i 10 min.
- Skyl de behandlede membraner med PBS, før de sættes tilbage i frisk blod.
- Gentag svampedræbende behandling hver 2-3 dage (afhængigt af omfanget af svampeforurening) indtil afslutningen af eksperimentet.
5. Genklæbende løsrevne membraner med cyanoacrylatlim
BEMÆRK: Udfør kun, når membranløsningen bemærkes.
- Membraner kan delvist løsne sig fra fodringskamrene, især under fjernelse fra 6-brøndpladen. Hvis dette sker, skylles blodmembranen med PBS.
- Tør forsigtigt det berørte område. Det behøver ikke at være helt tørt, men tilstedeværelsen af fugt får limen til at sætte sig hurtigere.
BEMÆRK: Genklæbning af membranen begrænser arbejdstiden, men afhængigt af løsrivelsesstørrelse kan en hurtigere indstillingstid være ønskelig. - Klem en lille mængde cyanoacrylatlim ind i mellemrummet, hvor membranen er trukket væk fra kammeret. Hold på plads i ~ 2 minutter for at lade limen hærde.
- Placer kammeret tilbage i blodet i 6-brøndpladen.
6. Gør fagstimulerende
BEMÆRK: Udfør ved afslutningen af en fremføring, eller før en membrantilførsel er startet.
- Saml flåtafføring fra enten en tidligere membranfoder eller en anden kilde til fodring af flåter. Opbevar afføringen ved -20 °C, inden fagstimulansen fremstilles. Knus pellets af kryds afføring og bland 0,1 g pr. 1 ml vand. Tilsæt 1 mM tripeptidreduceret glutathion, opløses og blandes grundigt ved hvirvelstrøm.
- Filtersteriliser med et 0,1 μm sprøjtefilter.
- Fryses ved -20 °C, indtil det er nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket fodring afhænger af, om der ønskes en delvis eller fuld engorgement. Succesfuldt fodret I. scapularis drej en skygge af gunmetal grå for voksne og løsne sig alene fra membranen. Men hvis de i det mindste er ærtestore, kan de løsnes fra membranen, når fodringen er afsluttet. For umodne stadier af I. scapularis varierer størrelsen for fuldt engorged flåter, og fordi de i modsætning til voksne ikke udviser en farveændring, er løsrivelse den bedste måde at afgøre, om et kryds er fuldt engorged. Se figur 3 for et eksempel på, hvordan nymphal I. scapularis kan se ud under et foder. Voksne I. scapularis flåter tager 1 uge eller mere fra fastgørelse, indtil de begynder at løsne sig fra membranen; Nymfer løsner sig ofte ca. 5 dage efter vedhæftning, og larver begynder at løsne sig ~ 3-4 dage efter den første vedhæftning. Feeds kan fortsætte, så længe man ønsker at opretholde de to gange daglige blodforandringer, og så længe skimmelsvamp ikke er begyndt at vokse ud over, hvad svampedræbende behandling kan kontrollere. Delvist engorged flåter skal manuelt løsnes fra membranen.
Umodne flåter (larver og nymfer), der løsner sig fra membranen alene, smelter næsten altid med succes ind i deres næste livsfase, og forudsat at de har engorged tilstrækkeligt og er af en stor nok størrelse, selv dem, der løsnes manuelt fra membranen i slutningen af en fodermolt. Hunflåter, der er blevet gunmetalgrå under engorgement, lægger normalt æg med succes. I modsætning til naturlige fodringsmetoder producerer membranfodrede engorged hunner mindre ægmasser og er af mindre størrelse end deres naturligt dyrefodrede modstykker. Resultater fra et nyligt eksperiment, der fodrede I. scapularis larver fra æg gennem nymphal engorgement og smeltning, kan ses i tabel 1. De resulterende nymfer fra den oprindelige larvefoder blev fodret 2 måneder efter molt. Det er dog vigtigt at bemærke, at dette forsøg havde hjorteorganhomogenat tilsat blodet, hvilket kan have haft skadelige virkninger på flåtfodringssuccesen.
I et andet forsøg blev 60 kvindelige og 60 mandlige I. scapularis flåter placeret i fire fodringskamre (30 kønsmatchede flåter pr. Kammer), og de kvindelige flåter fik lov til at fodre til repletion. Disse flåter stammer fra afkom af engorged hunner indsamlet fra jægerdræbte hjorte. Den gennemsnitlige ægmassevægt og -rækkevidde ud over succestal for engorgement (antal hunner, der lagde æg efter engorgement og -løsrivelse) kan ses i tabel 1. Ægmassevægten for I. scapularis varierer meget i litteraturen, men flåter, der tidligere blev indsamlet fra jægerdræbte hjorte fra Minnesota, producerede ægmasser med en gennemsnitsvægt på 77 mg (19-147 mg)22. Flåtdødeligheden er lav ved hjælp af det kunstige membranfodringssystem; Flåter, der ikke sætter sig fast og fodrer, overlever for det meste processen, hvilket øger muligheden for at forsøge yderligere membranfodringsforsøg med de overlevende.
Denne metode er blevet anvendt til at inficere nymphal I. scapularis med en række krydsbårne patogener, herunder A. phagocytophilum Variant-1, som ikke kan anvende traditionelle gnaverinfektionsmetoder7. Infektion af flåterne med bakterier blev bekræftet med qPCR, og mens alle nymphalflåter, der med succes fodrede, var positive efter fodring, afhængigt af bakteriearten, ville infektion eller ikke fortsætte transstadialt19. Denne metode er også blevet brugt til at fodre kvindelige I. scapularis ciprofloxacin; De vellykkede fodrede flåter viste en sammenlignelig knockdown af bakterielle symbiontniveauer til injicerede flåter20.
Figur 1: Flåtmembrankammeret . A) Keramisk belagt fod beklædt med plastfolie. (B) Linsepapir tapet fast på plastindpakket bund. Det blå rektangel er den gummiskraber, der anvendes i panel C. (C) Linsepapir efter imprægnering med silikone. D) Kamre, der er fastgjort til silikone-rayonmembranen. Hver 4 tommer x 6 i linsepapirark kan rumme seks kamre. E) Et færdigt kammer med silikone-rayonmembranen. En løsrevet silikone-rayonmembran er vist til højre. (F) Et samlet færdigt kammer med en O-ring fastgjort på det. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opsætning af flåtfoderet. Et eksempel på, hvordan et sæt med fire kamre med voksen I. scapularis vil se ud, når alt er sat op, og før det placeres i vandbadet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Et løbende foder med delvist opslugte Ixodes scapularis nymfer. De sorte eller brune prikker omkring fastgørelsesstederne (se f.eks. etiket A) er den frass, der kan indsamles under og efter foderet for at gøre fagosstimulansen. Delvist engorged I. scapularis nymfer ses fastgjort på membranen (se etiket B). En skal af de engorged larver molt kan ses ved etiket C. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antal startflåter | Antal vellykkede engorged flåter | Ægmasse gennemsnitlig masse i mg (interval) | |
| Larver | 2 rugeægsmasser | 150 | NIELSEN |
| Nymfer | 150 | 24 | NIELSEN |
| Voksne kvinder | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
Tabel 1: Tick engorgement numre og ægmasse vægte. Larve- og nymphal-engorgement eksperimentelle betingelser havde hjorteorganhomogenat tilsat blodet ud over de kosttilskud, der blev anvendt i denne protokol. Voksne kvindelige engorgement eksperimentelle betingelser var som beskrevet i protokollen ovenfor. Vellykket engorgement blev defineret som enten engorged flåter, der med succes smeltede til næste livsstadium eller engorged hunner, der med succes lagde æg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kunstig membranfodring af flåter giver et nyttigt værktøj til en række eksperimentelle procedurer, men vil sandsynligvis ikke erstatte dyrefoder til alle applikationer. Opretholdelse af store kolonier af flåter på alle livsstadier uden dyrefoder er generelt uholdbart. I stedet er det kunstige fodringssystem værdifuldt til andre formål såsom at inficere flåter med patogener, der ikke understøttes af modelværter, evaluere virkningerne af kontrollerede doser af forbindelser eller mikroorganismer på flåterne i et forenklet fodringsmiljø eller opdrætte små kolonier af flåter, der er afhængige af værtsdyr, der ikke er let tilgængelige i laboratoriet8. 10,11,23,24,25. Sammenlignet med traditionelle dyrefodringsmetoder er kunstig membranfodring arbejdskrævende og giver udfordringer15,24. Det er af disse grunde, at kunstig membranfodring ikke er en erstatning for traditionelle dyrebaserede fodringsmetoder og i stedet giver mulighed for forsøg, der ikke kan udføres med traditionel dyrefodring.
Opretholdelse af hygiejniske forhold både i fodringskamrene og flåtkolonien er afgørende for at undgå svampe- og bakterieforurening. Men når du bruger kunstig fodring til at udsætte flåter for patogener, bør penicillin / streptomycin / fungizone (P / S / F) kosttilskud undgås fra blodet for at undgå at dræbe patogenerne. Flåteksponering for ciprofloxacin i blodet kan fuldstændigt eliminere Rickettsia buchneri, ovarieendosymbionten af I. scapularis , fra en delmængde af F1-afkom, mens rutinemæssig P / S / F-tilsætning til blod ikke har denne effekt20. Transovariale patogentransmissionsundersøgelser blev ikke udført ved hjælp af dette system, men der blev ikke observeret ændringer i frugtbarheden af engorged hunner i antibiotikaeksponerede versus kontroleksperimenter. Hurtig initiering af fodring og overfyldning af flåter undgår mange af de problemer, der er forbundet med svampeforurening; Af denne grund har systemet tendens til at arbejde lettere med larve- og nymphalflåter, da de har kortere fodringstider. Periodisk behandling af forurenede membraner med svampemidler såsom nystatin kan forlænge den tid, der er til rådighed for engorgement med et par dage. Det er også vigtigt at bruge flåter, der er smeltet længe nok til at være ivrige efter at fodre. Larver er klar 2 uger efter, at alle larver i ægmassen har afsluttet fremkomsten, men nymfer og voksne klarer sig bedre, hvis de bruges mindst 10 uger efter smeltning.
Denne metode har vist sammenlignelig flåtfodringssucces med brug af forsøgsdyr, hvor typisk 30% -50% af hunnen og ca. 50% af nymphal I. scapularis fuldfører engorgement, hvilket kan sammenlignes med engorgement-succesen hos voksne fodret med laboratoriekaniner eller nymfer fodret med mus eller hamstere19. Tilsvarende har andre undersøgelser, der bruger kunstige fodringskamre, rapporteret en 45% engorgement rate for I. scapularis hunner og 72% fodringshastighed for nymfer10,18. I mellemtiden, for Ixodes ricinus hunner og nymfer fodret via en kunstig membran, var engorgement satser henholdsvis 71% og 58%,25%. Derfor kan resultaterne variere afhængigt af det anvendte system og den undersøgte flåtart.
Membrantykkelse er en vigtig faktor for fodringssucces; Tyndere membraner er mindre i stand til at forsegle omkring de små huller, der produceres ved krydssondering og fastgørelse. Efter fodring begynder, kommer mere fugt ind i kammeret, hvilket kan føre til våde forhold, flydende og efterfølgende gentørring af frass og skimmel. Det er derfor vigtigt at fremstille membraner med den maksimale tykkelse, der kan tolereres af flåtarten og livsstadiets hypostomilængde, der skal fodres (se protokoltrin 1.1-1.4). Nymfer af I. scapularis og Dermacentor variabilis lever af membraner mellem 90 μm og 120 μm tykkelse, mens voksne lever af membraner op til tykkelser på næsten 200 μm. Den voksne I. scapularis hypostomi er 500 μm lang, mens nymphal- og larvehypostomer er ~ 100 μm lange, hvilket viser sig tilstrækkeligt til at trænge igennem en lidt tykkere membran15,26. Rayon-linsepapir er i gennemsnit ~ 50 μm i tykkelse, og membraner fremstillet af det har mindst 50 μm tykkelse; Som nævnt ovenfor giver tykkere membraner imidlertid bedre resultater. Larvefodringsmembraner fungerer godt med en tykkelse på 80-100 μm ved hjælp af et meget let unryu-papir (10 g/m3). Dette uregelmæssige morbærpapir er snøret med relativt tykke fibre, der giver støtte til en membran, der er meget tynd på steder, hvilket tillader rigelige larverfastgørelsessteder.
Baseret på den anbefalede membrantykkelse og kammerstørrelser er det bedst at begrænse antallet af kvinder i voksne feeds til maksimalt 20 kvinder (flåter placeres i kamre i protokoltrin 2.7). Flere hunner risikerer at overfylde fastgørelsesstederne, da flåterne har tendens til at binde sig meget tæt sammen, hvilket kan kompromittere membranintegriteten i lokalområdet og øge risikoen for lækage samt sænke fodringshastigheden. For nymphal flåter er de maksimale tal meget højere, og der bemærkes ingen signifikante skadelige virkninger, selv når der fodres 50 nymfer pr. Kammer. Da det ikke er rimeligt at tælle individuelle larver, og der ikke blev konstateret problemer med overbelægning, anbefales en halv til en hel ægmasse pr. Kammer for nem opsætning. Hele ægmasser består af ~ 1.000 eller flere larver, og i løbet af et foder kan alt fra snesevis til ~ 200 engorged larver falde fra en enkelt ægmasse. Derudover har larveflåter, der ikke fodrer, tendens til ikke at dø og kan potentielt genhuses til en senere fodring.
Andre plastmaterialer er blevet brugt til at producere fødekamrene, hvoraf polycarbonat er blevet bestemt til at være det mest holdbare og ikke-reaktive. Anden plast, såsom akryl, er følsom over for rengøringsopløsninger, hvilket kan forårsage crazing og brud, især i de afskårne ender af slangen. Polycarbonat holder godt op til udsættelse for blegemiddel, ethanol, autoklavering og ultraviolet sterilisering.
Mens flåter i et kammer i sidste ende kan bide og fastgøres til membranen på grund af varmestimuleringen af det opvarmede blod nedenunder, hjælper yderligere stimuli i form af kemiske fagostimulanser med at fremskynde denne proces (for opskriften, se protokol trin 6). Til denne undersøgelse er brugen af flåtafføring, der er opløst i vand, ideel på grund af deres evne til at blive konserveret ved -20 ° C i lange perioder. De er også let vedvarende, da kryds afføring kan indsamles fra efterfølgende feeds. Naturligvis kan det første membranfoder ikke have adgang til den foreslåede fagstimulerende af krydsafføringekstrakt og kan udføres uden at hjælpe med at producere det til fremtidige feeds. Derudover kan alternative fagstimulerende midler anvendes, hvor andre undersøgelser har succes med forskellige kemiske eller mekaniske stimuli såsom hår- eller hårekstrakter15,24.
Kunstig membranfodring giver yderligere værktøjer til forskere, der arbejder inden for kryds- og krydsbåren patogenbiologi. Det er overkommeligt og enkelt, men også arbejdskrævende, og vil sandsynligvis kræve nogle indledende test for at optimere til deres ønskede anvendelse og flåtarter / livsfase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
- Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
- Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
- Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
- Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
- Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
- Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
- Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
- Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
- Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
- Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
- Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
- Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
- Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
- Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
- Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
- González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
- Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
