Summary
यहां प्रस्तुत एक कृत्रिम झिल्ली प्रणाली के माध्यम से विट्रो में टिक्स को रक्त फ़ीड करने की एक विधि है ताकि विभिन्न प्रकार के टिक जीवन चरणों के आंशिक या पूर्ण संयोजन की अनुमति मिल सके।
Abstract
टिक्स और उनसे संबंधित बीमारियां उनके सार्वजनिक स्वास्थ्य और पशु चिकित्सा बोझ के कारण अध्ययन का एक महत्वपूर्ण विषय हैं। हालांकि, अध्ययन और पालन दोनों के दौरान टिक्स की भोजन की आवश्यकताएं प्रयोगात्मक प्रश्नों या टिक्स और उनके संबंधित रोगजनकों पर शोध करने के लिए प्रयोगशालाओं की क्षमता को सीमित कर सकती हैं। एक कृत्रिम झिल्ली आहार प्रणाली इन समस्याओं को कम कर सकती है और अनुसंधान के नए रास्ते खोल सकती है जो पारंपरिक पशु आहार प्रणालियों के साथ संभव नहीं हो सकती है। यह अध्ययन एक कृत्रिम झिल्ली भोजन प्रणाली का वर्णन करता है जिसे सभी इक्सोड्स स्कैपुलारिस जीवन चरणों के लिए भोजन और संवर्धन की सफलता के लिए परिष्कृत किया गया है। इसके अलावा, इस अध्ययन में वर्णित कृत्रिम झिल्ली भोजन प्रणाली को वांछित झिल्ली मोटाई के सरल शोधन के माध्यम से अन्य टिक प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है। कृत्रिम झिल्ली भोजन प्रणाली के लाभों को सिस्टम की श्रम गहनता, अतिरिक्त पर्यावरणीय कारकों से संतुलित किया जाता है जो भोजन की सफलता को प्रभावित कर सकते हैं, और प्रत्येक नई प्रजाति और टिक्स के जीवन चरण के लिए तकनीक को परिष्कृत करने की आवश्यकता होती है।
Introduction
टिक-जनित बीमारियां दुनिया भर में मनुष्यों और जानवरों के स्वास्थ्य को दृढ़ता से प्रभावित करती हैं, जो 2004 से 2016तक संयुक्त राज्य अमेरिका में सभी वेक्टर से जुड़ी बीमारियों के दो-तिहाई से अधिक के लिए जिम्मेदार हैं। इसके अतिरिक्त, हाल के वर्षों में मामलों की संख्या बढ़ रही है, जिसमें अधिक लोग और पशुधन टिक्स और उनकेसंबंधित रोगों से प्रभावित हो रहे हैं। जबकि मामले की संख्या में ऊपर की प्रवृत्ति के कई कारण हैं, बदलती जलवायु एक महत्वपूर्ण कारक 3,4 है। टिक-जनित रोग के मामलों की संख्या में अनुमानित चल रही वृद्धि टिक्स और उनके द्वारा संचारित रोगजनकों के बीच संबंधों की जांच करने के लिए नए उपकरण विकसित करने की आवश्यकता को रेखांकित करती है।
यह ज्ञात है कि टिक्स भोजन के दौरान शरीर विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन से गुजरते हैं और ये परिवर्तन रोगज़नक़ संचरण 5,6 में भूमिका निभाते हैं। पशु मॉडल का उपयोग करके रोगज़नक़ संचरण और अधिग्रहण पर पूर्ण और आंशिक भोजन के प्रभावों की जांच करने वाले अध्ययन करना मुश्किल हो सकता है, खासकर उन स्थितियों में जहां कृंतक मॉडल किसी विशेष रोगज़नक़ द्वारा संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील नहीं होते हैं। उदाहरण के लिए, एनाप्लाज्मा फागोसाइटोफिलम वेरिएंट -1 स्ट्रेन स्वाभाविक रूप से इक्सोड्स स्कैपुलारिस और हिरण के बीच फैलता है, लेकिन चूहों को संक्रमित करने में असमर्थ है, जिससे प्रयोगशाला7 में टिक संक्रमण जटिल हो जाता है। ट्रांसजेनिक उत्परिवर्ती के उपयोग के माध्यम से बोरेलिया बर्गडोरफेरी जैसे रोगजनकों का अध्ययन करने में मदद करने के लिए कृत्रिम फीडिंग सिस्टम भी लागू किया जा सकता है जिसमें जीन विलोपन होता है जो संचरण या संक्रमण को रोकताहै। कृत्रिम आहार प्रणाली का उपयोग करने से शोधकर्ताओं को संक्रमण या संचरण को केवल टिक के पक्ष में होने की अनुमति देकर जीन की भूमिका को अलग करने में मदद मिलती है, जिससे किसी भी मेजबान प्रतिक्रिया को अलग किया जा सकता है जो इस तरह के अध्ययनों को भ्रमित कर सकता है।
इसी तरह, बीमारी और पशु संचरण में शामिल टिक्स के कुछ जीवन चरणों को सामान्य प्रयोगशाला मॉडल प्रजातियों पर फ़ीड करने के लिए प्रेरित नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इक्सोड्स स्कैपुलारिस मादाओं को बड़े जानवरों पर खिलाया जाना चाहिए, आमतौर पर खरगोश9। जबकि अक्सर प्रयोगशाला प्रयोग के लिए सुलभ होता है, खरगोशों का उपयोग करने की प्रशासनिक और पशुपालन आवश्यकताएं छोटे कृन्तकों से अधिक होती हैं और कुछ प्रयोगशालाओं के लिए निषेधात्मक हो सकती हैं। अन्य टिक प्रजातियां, विशेष रूप से पशु चिकित्सा संबंधी चिंता के, मवेशियों या अन्य बड़े जानवरों पर खिलाया जाना चाहिए जो अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपयोग करने के लिए व्यावहारिक नहीं हैं। इन विट्रो फीडिंग और संक्रमण के तरीके, जैसे कृत्रिम झिल्ली खिलाना, बड़े या विदेशी मेजबान जानवरों का उपयोग करने के विकल्प प्रदान करते हैं।
इसके अतिरिक्त, एक कृत्रिम भोजन प्रणाली का उपयोग कुछ विश्लेषणों की अनुमति देता है जो पारंपरिक पशु आहार विधियों के साथ संभव नहीं हो सकते हैं। ऐसा ही एक उदाहरण यह है कि, भोजन तंत्र से रक्त स्रोत को अलग करके, बी बर्गडॉर्फरी संचरण में विभिन्न मेजबानों के रक्त की भूमिका कीजांच संभव हो जाती है। मेजबान रक्त की यह परीक्षा और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति में रक्त स्वयं की भूमिका रोगज़नक़ संचरण चक्रों को समझने में सक्षम होने में एक महत्वपूर्ण कारक है और एक यह कि कृत्रिम भोजन प्रणाली11 का उत्तर देने में मदद करने में सक्षम है। मेजबान 8,12 में संचरण की सफलता और स्थापना की जांच करने के बजाय फ़ीड के दौरान एक रोगज़नक़ की सटीक संचरण संख्या को निर्धारित करना भी संभव हो जाता है।
हार्ड टिक के लिए बने कुछ पहले कृत्रिम भोजन झिल्ली 1950 और 1960 के दशक में जानवरों की खाल या पशु-व्युत्पन्न झिल्ली से बने थे। इन झिल्लियों की जैविक प्रकृति के कारण, नई झिल्ली के उत्पादन और शेल्फ जीवन दोनों के साथ समस्याएं थीं। 1990 के दशक में, पूरी तरह से कृत्रिम झिल्ली विकसित की गई थी जिसमें सिलिकॉन इंप्रेग्नेशन15,16 के साथ जाल, कागज या कपड़े के समर्थन का उपयोग किया गया था। सिलिकॉन आदर्श था क्योंकि इसके भौतिक गुण इसकी जैव-अंतर्निहित प्रकृति के साथ-साथ त्वचा की खिंचाव और मामूली कठोरता की नकल करते हैं। इस पर निर्माण करते हुए, क्रोबर और गुएरिन, जिनके काम पर यह तकनीक आधारित थी, ने आई रिसिनस17 के कृत्रिम भोजन के लिए एक सिलिकॉन-इंप्रेग्नेटेड रेयान मेम्ब्रेन फीडिंग तकनीक का वर्णन किया।
स्कैपुलारिस, एक निकट से संबंधित प्रजाति के लिए विधियों के शोधन ने झिल्ली के संकुचन में उपयोग किए जाने वाले सिलिकॉन की कठोरता, झिल्ली उत्पादन के नुस्खा, कक्ष के आयाम और अनुलग्नक उत्तेजक में उल्लेखनीय अंतर पैदा किया है। जबकि इस अध्ययन में बताए गए परिशोधनों के परिणामस्वरूप एंड्रेड एट अल द्वारा रिपोर्ट की गई झिल्ली विशेषताओं के समान झिल्ली विशेषताएं हैं, जिन्होंने आई स्कैपुलारिस में उपयोग के लिए क्रोबर और गुएरिन पर आधारित सिलिकॉन-आधारित झिल्ली भी विकसित की है, सिलिकॉन इम्प्रेग्नेशन चरणों में अंतर है, जो आई स्कैपुलारिस15 के अपरिपक्व जीवन चरणों के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लचीलेपन की अनुमति देता है। 18. यह अध्ययन इस पद्धति के बार-बार उपयोग के आधार पर परिवर्धन और तकनीकी परिवर्तनों का भी वर्णन करता है, सर्वोत्तम प्रथाएं जिनके परिणामस्वरूप एक सफल फ़ीड होता है, और उत्पन्न होने वाली समस्याओं का निवारण होता है। इस विधि का उपयोग सभी सक्रिय जीवन चरणों को खिलाने, रोगजनक बैक्टीरिया के साथ टिक्स को संक्रमित करने और टिक्स को एंटीबायोटिक दवाओं 19,20 की कई खुराकके लिए उजागर करने के लिए किया गया है। जबकि दिखाया गया कृत्रिम झिल्ली भोजन विधि आई स्कैपुलारिस के लिए है, यह विधि झिल्ली मोटाई में मामूली संशोधनों के साथ टिक्स की अन्य प्रजातियों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है।
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Protocol
1. टिक झिल्ली कक्ष तैयार करना
- एक सपाट, गैर-छिद्रपूर्ण सतह तैयार करें जैसे कि कांच का एक विमान या हाथ स्टैंड का सिरेमिक-लेपित धातु आधार इसे 70% इथेनॉल के साथ पोंछकर और फिर इसे प्लास्टिक रैप की एक परत के साथ कवर करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्लास्टिक रैप सपाट है और बुलबुले या झुर्रियों के बिना है ( चित्रा 1 ए देखें)।
- तैयार सतह पर 100% रेयान लेंस सफाई कागज को टेप करें। सुनिश्चित करें कि यह कागज के सभी चार किनारों पर टेप के साथ सपाट और थोड़ा तना हुआ है। लेंस पेपर में x 6 में 4 के दो टुकड़ों को चरण 1.3 में वर्णित वॉल्यूम का उपयोग करके झिल्ली में बनाया जा सकता है।
नोट: यह 12 फीडिंग कक्षबनाने के लिए पर्याप्त है ( चित्रा 1 बी देखें)। यदि झिल्ली लार्वा टिक्स के लिए है, तो लेंस सफाई कागज के बजाय अनरयू पेपर का उपयोग करें। - सिलिकॉन किट के प्रत्येक भाग के 5 एमएल को एक डिस्पोजेबल कंटेनर में मापकर 00-10 कठोरता सिलिकॉन मिश्रण तैयार करें, 1.5 एमएल हेक्सेन जोड़ने से पहले दो तरल पदार्थों को हल्के से मिलाएं। मिश्रण को तब तक जारी रखें जब तक कि मिश्रण सजातीय और अच्छी तरह से मिश्रित न हो जाए।
नोट: वयस्क टिक्स के लिए झिल्ली बनाते समय, 00-50 कठोरता सिलिकॉन का उपयोग करें। - लेंस पेपर पर सिलिकॉन मिश्रण वितरित करने के लिए एक छोटी स्क्वीजी का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करने के लिए 1 मिनट के लिए खड़े होने दें कि सिलिकॉन लेंस पेपर में भिगो गया है। थोड़ी मात्रा में नीचे के दबाव का उपयोग करके स्क्वीजी के साथ साइड में अतिरिक्त सिलिकॉन को लगातार खुरचें। सिलिकॉन की किसी भी रेखा को हटाने और एक चिकनी परत का उत्पादन करने के लिए, स्क्वीजी के साथ एक दूसरा पास करें, कोई नीचे का दबाव नहीं डालते हैं।
नोट: प्रक्रिया के इस चरण में प्रत्येक जीवन चरण के लिए इष्टतम मोटाई की झिल्ली का उत्पादन करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है (वयस्क: 150-200 μm; अप्सरा: 90-120 μm; लार्वा: 80-100 μm)। एक मोटी झिल्ली (जीवन स्तर की भोजन सहिष्णुता के भीतर) आमतौर पर कक्ष में संघनन को कम करके और झिल्ली की आत्म-चिकित्सा विशेषता में सुधार करके बेहतर परिणाम उत्पन्न करेगी। - केवल लार्वा के लिए, फीडिंग चैंबर के शीर्ष को कई बार फ्लुओन फ्लोरोपॉलीमर राल (पीटीएफई -30) में डुबोएं, जिससे यह एक सुसंगत परत का उत्पादन करने के लिए अनुप्रयोगों के बीच सूख सकता है।
नोट: फ्लुऑन का आवेदन एक नॉन-स्टिक कुकिंग पैन के समान फ्लोरोपॉलीमर राल की एक नॉन-स्टिक परत बनाएगा। यह कक्ष21 के शीर्ष पर चढ़ने वाले लार्वा की संख्या को कम करेगा। - अगले चरण पर जाने से पहले, धूल मुक्त वातावरण में कम से कम 24 घंटे के लिए झिल्ली को ठीक करने के लिए छोड़ दें, जैसे कि एक बंद रासायनिक या जैव सुरक्षा कैबिनेट। सिलिकॉन को सूखने की अनुमति देने के बाद रेयान लेंस पेपर कैसा दिखता है, इसके लिए चित्रा 1 सी देखें।
- सिलिकॉन मिश्रण ए और बी के बराबर भागों को मिलाकर कक्षों को झिल्ली से जोड़ने के लिए 30-कठोरता सिलिकॉन मिश्रण तैयार करें।
- पॉली कार्बोनेट कक्षों को सिलिकॉन मिश्रण में लगभग एक चौथाई इंच (6 मिमी) डुबोएं, और फिर झिल्ली शीट पर रखें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि टेप में से किसी को भी ओवरलैप न किया जाए (चित्रा 1 डी)।
- अगले चरणों में जाने से पहले संलग्न सिलिकॉन को कम से कम 24 घंटे तक ठीक करने की अनुमति दें।
- एक स्केलपेल का उपयोग करके, प्रत्येक संलग्न कक्षों के चारों ओर झिल्ली को सावधानीपूर्वक काटें, किनारों को ट्रिम करें ताकि यह किनारों पर ज्यादा स्क्रैपिंग के बिना 6-वेल प्लेट के कुएं में आसानी से फिट हो सके (चित्रा 1 ई)। झिल्ली के आसंजन को अधिकतम करने के लिए कक्ष के बाहर पर्याप्त सामग्री की अनुमति दें।
नोट: यदि बहुत अधिक बाहरी सामग्री बनी रहती है, तो 6-वेल प्लेट से कक्ष को बार-बार हटाने से झिल्ली आंशिक रूप से कक्ष से अलग हो सकती है। अलग झिल्ली की मरम्मत खंड 5 में वर्णित है। - प्रत्येक कोनों और झिल्ली शीट के केंद्र से बचे हुए झिल्ली का एक छोटा टुकड़ा काटें। प्रत्येक टुकड़े से प्लास्टिक की चादर निकालें। औसत झिल्ली मोटाई निर्धारित करने के लिए माइक्रोमीटर के साथ टुकड़ों को मापें।
नोट: यदि झिल्ली की मोटाई जीवन स्तर के लिए सहिष्णुता सीमा के भीतर नहीं आती है (चरण 1.4 देखें), झिल्ली को त्याग दिया जाना चाहिए और फिर से बनाया जाना चाहिए। फाइबर और पतले क्षेत्रों के मोटे किस्में के कारण अनरयू पेपर मोटाई अत्यधिक परिवर्तनशील है। हालांकि यह विशेषता लार्वा को इष्टतम मोटाई के क्षेत्रों को खोजने की अनुमति देती है, इससे वास्तविक झिल्ली मोटाई निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है। - प्रति कक्ष एक ओ-रिंग के साथ फीडिंग कक्षों को कांच के बीकर में रखें ताकि कम से कम 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर बंधा हो सके। उनका उपयोग करने से पहले कक्षों को ठंडा होने दें।
2. टिक फ़ीड सेट करना
- एक दीपक या कमरा तैयार करें ताकि रोशनी 16 घंटे के लिए चालू हो और फिर 8 घंटे के लिए बंद हो। यदि दीपक का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि अगले चरण में पानी का स्नान उन 8 घंटों के लिए अंधेरे में है।
- 34 डिग्री सेल्सियस पर और समर्थन के साथ एक पानी स्नान सेट करें ताकि 6-वेल प्लेट बैठ सके और इसमें थोड़ा तैर सके। समर्थन के रूप में पानी के स्नान में डूबे हुए छोटे ग्लास बीकर का उपयोग करें। टिक्स के लिए एक हल्के-अंधेरे चक्र को बनाए रखने के लिए पानी के स्नान के लिए एक पारदर्शी कवर का उपयोग करें; यदि आवश्यक हो, तो कवर बनाने के लिए टी-स्टैंड और प्लास्टिक रैप का उपयोग करें। संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, पानी के स्नान में 0.02% बेंजाल्कोनियम क्लोराइड जोड़ें और ठंडे रक्त को गर्म करने के लिए 36 डिग्री सेल्सियस पर एक और पानी स्नान सेट करें।
- पूर्व तैयार, आटोक्लेव झिल्ली कक्षों को बाहर निकालें, कक्ष के चारों ओर ओ-रिंग रखें (चित्रा 1 एफ), और फिर झिल्ली को कवर करने के लिए प्रत्येक कक्ष को पर्याप्त 70% इथेनॉल से भरें। 5 मिनट के लिए 6-वेल प्लेट में अच्छी तरह से बैठने दें और फिर कक्ष और झिल्ली के बीच और झिल्ली में किसी भी रिसाव की तलाश करें।
नोट: यदि झिल्ली लीक हो रही है, तो इथेनॉल कुएं के आधार में जमा होगा। रिसाव झिल्ली को छोड़ दिया जाना चाहिए। - कक्षों से इथेनॉल को खाली करें और फिर इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट या लैमिनार प्रवाह हुड के अंदर हवा में सूखने दें।
नोट: परिवेश आर्द्रता के आधार पर इसमें कई मिनट लग सकते हैं। - प्रतीक्षा करते समय, 40 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके रक्त में पूरक को गर्म करें। 2 ग्राम / एल ग्लूकोज के साथ यांत्रिक रूप से डिफिब्रिनेटेड गोजातीय रक्त को पूरक करें।
- झिल्ली सूखने के बाद, कक्ष के अंदर फागोस्टिमुलेंट के ~ 20 μL लागू करें और फिर कक्ष को झुकाकर इसे सतह के चारों ओर फैलाएं। टिक फ्रैस से फागोस्टिमुलेंट तैयार करने के संबंध में निर्देशों के लिए अनुभाग 6 देखें।
- ब्रश या बल के साथ कक्ष में टिक्स जोड़ने से पहले फागोस्टिमुलेंट सूखने तक प्रतीक्षा करें। भागने से रोकने के लिए टिक्स को कक्ष में स्थानांतरित करते समय जितनी जल्दी हो सके काम करें। टिक्स को बर्फ पर एक ट्यूब में 1-2 मिनट के लिए रखें, इससे पहले कि उन्हें भागने की उनकी क्षमता को धीमा कर दिया जाए। टिक्स स्थानांतरित होने के बाद, पैराफिल्म के साथ शीर्ष को सील करें; पैराफिल्म को ओवरस्ट्रेच न करें, क्योंकि पानी के स्नान से गर्मी इसे चीरने का कारण बन सकती है।
नोट: फोर्सअप्स अप्सरा और वयस्क जीवन चरणों के साथ सबसे अच्छा काम करते हैं और ब्रश लार्वा जीवन चरणों के साथ सबसे अच्छा काम करते हैं। - कक्ष में 5 मिलीलीटर गर्मी-निष्क्रिय रक्त को शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें और 36 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान सेट में रखें। टिक्स को उजागर करने से पहले ठंडा रक्त को कम से कम कमरे के तापमान तक लाएं। कक्षों की आसान हैंडलिंग के लिए प्रति 6-वेल प्लेट में चार कक्ष अलग रखें। प्रति प्लेट अधिक कक्षों से बचा जाना चाहिए, हालांकि, पानी के स्नान के आकार के आधार पर, अधिक प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है।
- ट्यूब में प्रति 5 एमएल रक्त में पेनिसिलिन /स्ट्रेप्टोमाइसिन / फंगीज़ोन के 3 एमएम एटीपी के 5 μL और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / फंगीज़ोन के 100x स्टॉक का 50 μL जोड़ें।
- 4.5 मिलीलीटर रक्त को 6-वेल प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें, और फिर कक्ष को धीरे से कुएं में रखें, कक्ष पर ओ-रिंग ऊंचाई को समायोजित करें ताकि झिल्ली रक्त में बैठ जाए लेकिन साइड के चारों ओर रक्त का स्तर कुएं से ऊपर न हो। रक्त और झिल्ली के बीच हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए कुएं को एक कोण पर रक्त में रखें।
नोट: एक पूर्ण प्लेट चित्रा 2 में दिखाया गया है। - फीडिंग कक्षों के शीर्ष पर 6-वेल प्लेट का ढक्कन रखें; फिर, कक्षों के साथ 6-वेल प्लेट को तैयार 34 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डालें और ढक्कन बंद करें।
नोट: शीर्ष पर ढक्कन संघनित पानी को पैराफिल्म से संपर्क करने और कुओं में रक्त को पतला करने से रोकने में मदद करेगा।
3. हर 12 घंटे में रक्त बदलकर फीडिंग टिक को बनाए रखना
- एलिकोट 5 एमएल गर्मी-निष्क्रिय रक्त को एक ट्यूब में अच्छी तरह से डाल ता है और इसे 36 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म करता है। एक ही समय में पानी के स्नान में एटीपी और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / फंगीज़ोन को पिघलाएं।
- रक्त ट्यूब में 3 एमएम एटीपी का 5 μL और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / फंगीज़ोन के 100x स्टॉक का 50 μL जोड़ें। 4.5 एमएल रक्त को एक ताजा 6-वेल प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें।
- 6-वेल प्लेट को टिक चैंबर के साथ पानी के स्नान से निकालें। कक्ष को कुएं से निकालें और रक्त को हटाने के लिए 10 मिलीलीटर बाँझ 1x PBS के साथ कक्ष और झिल्ली के बाहर कुल्ला करें।
- आटोक्लेव फिल्टर पेपर का उपयोग करके, अतिरिक्त पीबीएस को हटाने के लिए झिल्ली और कक्ष को धीरे से सुखाएं। कक्ष के शीर्ष पर पैराफिल्म को बदलें। यदि कक्ष के अंदर बहुत अधिक संघनन है, तो ताजा पैराफिल्म के साथ सील करने से पहले गीले स्थानों को आटोक्लेव फिल्टर पेपर से सुखाएं।
- यदि आवश्यक हो तो ओ-रिंग ऊंचाई को समायोजित करते हुए, ताजा रक्त के साथ नए 6-वेल प्लेट में टिक चैंबर रखें। प्लेट पर प्रत्येक कक्ष के लिए चरण 3.3-3.5 दोहराएं। कक्षों के शीर्ष पर 6-वेल प्लेट का ढक्कन रखें। नई 6-वेल प्लेट को 34 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में वापस ले जाएं।
- टिक फ़ीड के समापन तक हर 12 घंटे में चरण 3.1-3.5 दोहराएं। टिक्स के झिल्ली से अलग होने की प्रतीक्षा करें या धीरे-धीरे उन्हें नरम-स्पर्श चिमटी के साथ झिल्ली से हटा दें, जबकि अभी भी आंशिक रूप से संलग्न टिक्स प्राप्त करने के लिए जुड़े हुए हैं।
4. एंटिफंगल उपचार
नोट: केवल तभी प्रदर्शन करें जब झिल्ली पर फंगल विकास देखा जाता है। कवक झिल्ली के रक्त पक्ष पर बनने की संभावना है यदि भोजन पर्याप्त अवधि का है। फंगल संदूषण का पहला संकेत झिल्ली पर दिखाई देने वाले कोगुलेटेड रक्त के छोटे (1-3 मिमी) गुच्छे हैं। जब फंगल संदूषण का उल्लेख किया जाता है, तो एंटिफंगल उपचार प्रयोग की अवधि को बढ़ा सकते हैं और एन्जर्जमेंट सफलता में सुधार कर सकते हैं।
- आसुत जल में 10,000 यू निस्टेटिन प्रति एमएल, प्रति फीडिंग चैंबर में 5 एमएल घोलें। 0.1 μm सिरिंज फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें।
- एक नई 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 5 एमएल निस्टैटिन समाधान जोड़ें, प्रत्येक फीडिंग चैंबर के लिए एक अच्छी तरह से।
- पीबीएस-कुल्ला कक्षों को घोल में रखें। 10 मिनट के लिए बैठने दें।
- ताजा रक्त में वापस डालने से पहले पीबीएस के साथ इलाज किए गए झिल्ली को कुल्ला करें।
- प्रयोग के पूरा होने तक हर 2-3 दिनों (फंगल संदूषण की सीमा के आधार पर) एंटीफंगल उपचार को दोहराएं।
5. साइनोएक्रिलेट गोंद के साथ अलग झिल्ली का फिर से पालन करना
नोट: केवल तभी प्रदर्शन करें जब झिल्ली अलगाव देखा जाता है।
- झिल्ली आंशिक रूप से फीडिंग कक्षों से अलग हो सकती है, खासकर 6-वेल प्लेट से हटाने के दौरान। यदि ऐसा होता है, तो पीबीएस के साथ रक्त की झिल्ली को कुल्ला करें।
- प्रभावित क्षेत्र को धीरे से सुखाएं। इसे पूरी तरह से सूखा होने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन नमी की उपस्थिति गोंद को तेजी से सेट करने का कारण बनती है।
नोट: झिल्ली का फिर से पालन करने से काम का समय सीमित हो जाता है, हालांकि, अलगाव के आकार के आधार पर, एक तेज सेटिंग समय वांछनीय हो सकता है। - उस अंतराल में साइनोएक्रिलेट गोंद की एक छोटी मात्रा निचोड़ें जहां झिल्ली कक्ष से दूर खींची गई है। गोंद को सेट करने की अनुमति देने के लिए ~ 2 मिनट के लिए जगह पर रखें।
- कक्ष को 6-वेल प्लेट में रक्त में वापस रखें।
6. फागोस्टिमुलेंट बनाना
नोट: फ़ीड के अंत में या झिल्ली फ़ीड शुरू होने से पहले प्रदर्शन करें।
- या तो एक पूर्व झिल्ली फ़ीड या फीडिंग टिक्स के किसी अन्य स्रोत से टिक मल एकत्र करें। फागोस्टिमुलेंट बनाने से पहले मल को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। टिक मल के छर्रों को कुचल दें और 0.1 ग्राम प्रति 1 एमएल पानी मिलाएं। 1 एमएम ट्राइपेप्टाइड कम ग्लूटाथियोन जोड़ें, घोलें, और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
- 0.1 μm सिरिंज फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें।
- जरूरत पड़ने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
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Representative Results
एक सफल भोजन इस बात पर निर्भर करता है कि आंशिक या पूर्ण गर्भाधान वांछित है या नहीं। स्कैपुलारिस वयस्कों के लिए गनमेटल ग्रे की छाया को बदल देता है और झिल्ली से अपने आप अलग हो जाता है। हालांकि, यदि वे कम से कम मटर के आकार के हैं, तो उन्हें भोजन समाप्त करते समय झिल्ली से अलग किया जा सकता है। स्कैपुलारिस के अपरिपक्व चरणों के लिए, पूरी तरह से संलग्न टिक्स के लिए आकार भिन्न होता है, और क्योंकि, वयस्कों के विपरीत, वे रंग परिवर्तन प्रदर्शित नहीं करते हैं, अलगाव यह निर्धारित करने का सबसे अच्छा तरीका है कि क्या टिक पूरी तरह से घिरा हुआ है। एक उदाहरण के लिए चित्र 3 देखें कि फ़ीड के दौरान अप्सरा I. स्कैपुलारिस कैसा दिख सकता है। स्कैपुलारिस टिक्स को लगाव से 1 सप्ताह या उससे अधिक समय लगता है जब तक कि वे झिल्ली से अलग होना शुरू नहीं करते; अप्सराएं अक्सर लगाव के लगभग 5 दिन बाद अलग हो जाती हैं, और लार्वा पहले लगाव के 3-4 दिन बाद अलग होना शुरू कर देते हैं। फ़ीड तब तक जारी रह सकता है जब तक कोई दो बार दैनिक रक्त परिवर्तन को बनाए रखना चाहता है और जब तक मोल्ड ने एंटिफंगल उपचार को नियंत्रित करना शुरू नहीं किया है। आंशिक रूप से संलग्न टिक्स को झिल्ली से मैन्युअल रूप से अलग किया जाना चाहिए।
अपरिपक्व टिक्स (लार्वा और अप्सराएं) जो अपने आप झिल्ली से अलग हो जाते हैं, लगभग हमेशा सफलतापूर्वक अपने अगले जीवन चरण में घुल जाते हैं, और यह मानते हुए कि वे पर्याप्त रूप से घुल गए हैं और बड़े आकार के हैं, यहां तक कि वे भी जो फ़ीड मोल्ट के अंत में झिल्ली से मैन्युअल रूप से अलग हो जाते हैं। मादा टिक जो गर्भाधान के दौरान एक गनमेटल ग्रे हो गए हैं, आमतौर पर सफलतापूर्वक अंडे देते हैं। हालांकि, भोजन के प्राकृतिक साधनों के विपरीत, झिल्ली-पोषित एनगोर्ज्ड मादाएं छोटे अंडे के द्रव्यमान का उत्पादन करती हैं और अपने स्वाभाविक रूप से पशु-पोषित समकक्षों की तुलना में छोटे आकार की होती हैं। हाल ही में किए गए एक प्रयोग के परिणाम, जिसमें आई. स्कैपुलारिस लार्वा को अंडे से निम्फ्रा एनगोर्जमेंट और मोल्टिंग के माध्यम से खिलाया गया था, तालिका 1 में देखा जा सकता है। प्रारंभिक लार्वा फ़ीड से परिणामी अप्सराओं को 2 महीने बाद मोल्ट खिलाया गया था। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रयोग में रक्त में हिरण अंग होमोजेनेट जोड़ा गया था, जिसका टिक फीडिंग सफलता पर हानिकारक प्रभाव पड़ सकता है।
एक अन्य प्रयोग में, 60 महिला और 60 पुरुष आई स्कैपुलरिस टिक्स को चार फीडिंग चैंबर (प्रति कक्ष 30 सेक्स-मिलान टिक्स) में रखा गया था और महिला टिक्स को खिलाने की अनुमति दी गई थी। ये टिक्स शिकारी-मारे गए हिरण से एकत्रित मादाओं की संतानों के रूप में उत्पन्न हुए। औसत अंडे द्रव्यमान वजन और सीमा, एन्गोर्जमेंट सफलता संख्या (अंडे देने वाली महिलाओं की संख्या) के अलावा, तालिका 1 में देखा जा सकता है। स्कैपुलारिस के लिए अंडे का द्रव्यमान वजन साहित्य में अत्यधिक परिवर्तनशील है, लेकिन मिनेसोटा से शिकारी-मारे गए हिरण से पहले एकत्र किए गए टिक्स ने 77 मिलीग्राम (19-147 मिलीग्राम) 22 के औसत वजन के साथ अंडे के द्रव्यमान का उत्पादन किया। कृत्रिम झिल्ली आहार प्रणाली का उपयोग करके टिक मृत्यु दर कम है; टिक्स जो संलग्न नहीं होते हैं और फ़ीड नहीं करते हैं, ज्यादातर प्रक्रिया से बचते हैं, जिससे बचे हुए लोगों के साथ आगे झिल्ली खिलाने के प्रयोगों का प्रयास करने की संभावना बढ़ जाती है।
इस विधि का उपयोग विभिन्न प्रकार के टिक-जनित रोगजनकों के साथ अप्सरा I. स्कैपुलारिस को संक्रमित करने के लिए किया गया है, जिसमें ए फागोसाइटोफिलम वेरिएंट -1 शामिल है, जो पारंपरिक कृंतक संक्रमण विधियों का उपयोग नहीं करसकता है। बैक्टीरिया द्वारा टिक्स के संक्रमण की पुष्टि क्यूपीसीआर के साथ की गई थी, और जबकि सफलतापूर्वक खिलाए गए सभी अप्सरा टिक्स बैक्टीरिया प्रजातियों के आधार पर सकारात्मक पोस्ट-फीडिंग थे, संक्रमण ट्रांसस्टेडिली19 तक जारी रहेगा या नहीं। इस विधि का उपयोग महिला I. स्कैपुलारिस सिप्रोफ्लोक्सासिन को खिलाने के लिए भी किया गया है; सफलतापूर्वक खिलाए गए टिक्स ने इंजेक्शन टिक्स20 के लिए बैक्टीरियल सिम्बियोनेट स्तरों का तुलनीय वध दिखाया।
चित्र 1: टिक झिल्ली कक्ष। (ए) सिरेमिक-लेपित स्टैंड बेस प्लास्टिक रैप से ढका हुआ है। (बी) लेंस पेपर प्लास्टिक से लिपटे आधार पर टैप किया गया। नीला आयत पैनल सी में उपयोग किया जाने वाला स्क्वीजी है। (सी) सिलिकॉन के साथ गर्भवती होने के बाद लेंस पेपर। (डी) सिलिकॉन-रेयान झिल्ली से जुड़े चैंबर। लेंस पेपर शीट में x 6 में प्रत्येक 4 छह कक्षों को समायोजित कर सकता है। (ई) सिलिकॉन-रेयान झिल्ली के साथ एक पूर्ण कक्ष। दाईं ओर एक अलग सिलिकॉन-रेयान झिल्ली दिखाई गई है। (एफ) एक इकट्ठे पूर्ण कक्ष, जिस पर एक ओ-रिंग सुरक्षित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: टिक फ़ीड सेट करना। एक उदाहरण है कि वयस्क I. स्कैपुलारिस के साथ चार कक्षों का एक सेट कैसे दिखेगा जब सब कुछ स्थापित हो जाता है और इससे पहले कि इसे पानी के स्नान में रखा जाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: आंशिक रूप से संलग्न इक्सोड्स स्कैपुलारिस अप्सराओं के साथ एक चल रही फ़ीड। अनुलग्नक साइटों के आसपास काले या भूरे रंग के बिंदु (उदाहरण के लिए लेबल ए देखें) फ्रास हैं जिन्हें फागोस्टिमुलेंट बनाने के लिए फ़ीड के दौरान और बाद में एकत्र किया जा सकता है। स्कैपुलारिस अप्सराओं को झिल्ली पर जुड़ा हुआ देखा जाता है (लेबल बी देखें)। एंगोराइज्ड लार्वा मोल्ट की एक भूसी लेबल सी द्वारा देखी जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| शुरुआती टिक्स की संख्या | सफलतापूर्वक प्राप्त किए गए टिक्स की संख्या | अंडे का द्रव्यमान औसत द्रव्यमान मिलीग्राम (रेंज) में | |
| लार्वा | 2 हैच किए गए अंडे के द्रव्यमान | 150 | N/A |
| अप्सराएं | 150 | 24 | N/A |
| वयस्क महिलाएं | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
तालिका 1: टिक एन्जर्जेमेंट नंबर और अंडे द्रव्यमान वजन। लार्वा और निम्फाल एनगोर्जमेंट प्रयोगात्मक स्थितियों में इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले पूरक के अलावा रक्त में हिरण अंग होमोजेनेट जोड़ा गया था। वयस्क महिला भ्रूण प्रयोगात्मक स्थितियों को ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया था। सफल गर्भाधान को या तो एन्गोर्ग्ड टिक्स के रूप में परिभाषित किया गया था जो सफलतापूर्वक अगले जीवन चरण में पहुंच गए थे या सफलतापूर्वक अंडे देने वाली मादाओं को आकर्षित करते थे।
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Discussion
टिक्स का कृत्रिम झिल्ली भोजन विभिन्न प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है, लेकिन सभी अनुप्रयोगों के लिए पशु आहार को प्रतिस्थापित करने की संभावना नहीं है। जानवरों को खिलाने के बिना सभी जीवन चरणों में टिक्स की बड़ी कॉलोनियों को बनाए रखना आम तौर पर अस्थिर है। इसके बजाय, कृत्रिम भोजन प्रणाली अन्य उद्देश्यों के लिए मूल्यवान है जैसे कि मॉडल मेजबानों द्वारा समर्थित रोगजनकों के साथ टिक्स को संक्रमित करना, सरलीकृत भोजन वातावरण में टिक्स पर यौगिकों या सूक्ष्मजीवों के नियंत्रित खुराक के प्रभावों का मूल्यांकन करना, या टिक्स की छोटी कॉलोनियों का पालन करना जो मेजबान जानवरों पर निर्भर हैं जो प्रयोगशाला में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। 10,11,23,24,25. पारंपरिक पशु आहार विधियों की तुलना में, कृत्रिम झिल्ली भोजन श्रम-गहन है औरचुनौतियों को प्रस्तुत करता है 15,24। यह इन कारणों से है कि कृत्रिम झिल्ली भोजन पारंपरिक पशु-आधारित भोजन विधियों का प्रतिस्थापन नहीं है और इसके बजाय उन प्रयोगों की अनुमति देता है जो पारंपरिक पशु आहार के साथ नहीं किए जा सकते हैं।
फंगल और बैक्टीरियल संदूषण से बचने के लिए फीडिंग चैंबर और टिक कॉलोनी दोनों में स्वच्छ स्थितियों को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। हालांकि, रोगजनकों को टिक्स को उजागर करने के लिए कृत्रिम भोजन का उपयोग करते समय, रोगजनकों को मारने से बचने के लिए रक्त से पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / फंगीज़ोन (पी / एस / एफ) की खुराक से बचा जाना चाहिए। रक्त में सिप्रोफ्लोक्सासिन के संपर्क में आने से एफ 1 संतान के उप-समूह से आई स्कैपुलारिस के डिम्बग्रंथि एंडोसिम्बियोनेट रिकेट्सिया बुचनेरी को पूरी तरह से खत्म किया जा सकता है, जबकि रक्त में नियमित पी / एस / एफ जोड़ कायह प्रभाव नहीं होता है। ट्रांसोवेरियल रोगज़नक़ संचरण अध्ययन इस प्रणाली का उपयोग करके नहीं किया गया था, लेकिन एंटीबायोटिक-उजागर बनाम नियंत्रण प्रयोगों में संक्रमित महिलाओं की प्रजनन क्षमता में कोई बदलाव नहीं देखा गया था। टिक्स के भोजन और संवर्धन की तेजी से शुरुआत फंगल संदूषण से जुड़े कई मुद्दों से बचती है; इस कारण से, सिस्टम लार्वा और अप्सरा टिक्स के साथ अधिक आसानी से काम करता है, क्योंकि उनके पास कम भोजन समय होता है। निस्टैटिन जैसे एंटिफंगल के साथ दूषित झिल्ली का आवधिक उपचार कुछ दिनों तक गर्भाधान के लिए उपलब्ध समय को बढ़ा सकता है। टिक्स का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है जो खिलाने के लिए उत्सुक होने के लिए लंबे समय से मोल किए गए हैं। अंडे के द्रव्यमान में सभी लार्वा के उद्भव के 2 सप्ताह बाद लार्वा तैयार होते हैं, लेकिन अप्सरा और वयस्क बेहतर प्रदर्शन करते हैं यदि मोलिंग के कम से कम 10 सप्ताह बाद उपयोग किया जाता है।
इस विधि ने प्रयोगशाला जानवरों का उपयोग करने के लिए तुलनीय टिक फीडिंग सफलता दिखाई है, जिसमें आम तौर पर 30% -50% मादा और लगभग 50% अप्सरा I. स्कैपुलारिस गर्भाधान पूरा करते हैं, जो प्रयोगशाला खरगोशों या चूहों या हैम्स्टर्स पर खिलाए गए अप्सराओं पर खिलाए गए वयस्कों की सफलता केबराबर है। इसी तरह, कृत्रिम भोजन कक्षों का उपयोग करने वाले अन्य अध्ययनों ने आई स्कैपुलारिस महिलाओं के लिए 45% और अप्सराओं के लिए 72% भोजन दर10,18 की सूचना दी है। इस बीच, एक कृत्रिम झिल्ली के माध्यम से खिलाए गए इक्सोड्स रिसिनस मादाओं और अप्सराओं के लिए, गर्भधारणदर क्रमशः 71% और 58% थी। इसलिए, उपयोग में सिस्टम और जांच की गई टिक प्रजातियों के आधार पर परिणाम परिवर्तनशील हो सकते हैं।
झिल्ली मोटाई भोजन की सफलता में एक महत्वपूर्ण कारक है; पतली झिल्ली टिक जांच और लगाव द्वारा उत्पादित छोटे छेदों के चारों ओर सील करने में कम सक्षम होती है। भोजन शुरू होने के बाद, कक्ष में अधिक नमी मिलती है, जिससे गीली स्थिति, द्रवीकरण और बाद में फ्रास और मोल्ड का पुन: निर्माण हो सकता है। इसलिए टिक प्रजातियों और जीवन स्तर की हाइपोस्टोम लंबाई द्वारा सहनीय अधिकतम मोटाई पर झिल्ली का उत्पादन करना महत्वपूर्ण है जिसे खिलाया जाना है (प्रोटोकॉल चरण 1.1-1.4 देखें)। स्कैपुलारिस और डर्मासेंटर वैरियाबिलिस की अप्सराएं 90 μm और 120 μm मोटाई के बीच झिल्ली पर फ़ीड करती हैं, जबकि वयस्क लगभग 200 μm की मोटाई तक झिल्ली पर फ़ीड करते हैं। स्कैपुलारिस हाइपोस्टोम लंबाई में 500 μm है, जबकि अप्सरा और लार्वा हाइपोस्टोम ~ 100 μm लंबे हैं, जो थोड़ी मोटी झिल्ली15,26 में प्रवेश करने के लिए पर्याप्त साबित होता है। रेयॉन लेंस पेपर औसतन मोटाई में ~ 50 μm है और इससे बने झिल्ली में न्यूनतम 50 μm मोटाई होती है; हालांकि, जैसा कि ऊपर कहा गया है, मोटी झिल्ली बेहतर परिणाम देती है। लार्वा फीडिंग झिल्ली बहुत हल्के अनरयू पेपर (10 ग्राम / एम3) का उपयोग करके मोटाई में 80-100 μm पर अच्छी तरह से काम करती है। यह अनियमित शहतूत कागज अपेक्षाकृत मोटे फाइबर से भरा होता है जो एक झिल्ली को समर्थन प्रदान करता है जो स्थानों में बहुत पतला होता है, जिससे पर्याप्त लार्वा लगाव साइटों की अनुमति मिलती है।
अनुशंसित झिल्ली मोटाई और कक्ष के आकार के आधार पर, वयस्क फ़ीड में महिलाओं की संख्या को अधिकतम 20 महिलाओं तक सीमित करना सबसे अच्छा है (प्रोटोकॉल चरण 2.7 में टिक्स को कक्षों में रखा जाता है)। अधिक महिलाएं अनुलग्नक साइटों पर भीड़भाड़ का जोखिम उठाती हैं, क्योंकि टिक्स एक साथ बहुत निकटता से जुड़ते हैं, जो स्थानीय क्षेत्र में झिल्ली अखंडता से समझौता कर सकते हैं और रिसाव के जोखिम को बढ़ा सकते हैं, साथ ही साथ भोजन की दर को धीमा कर सकते हैं। अप्सरा टिक्स के लिए, अधिकतम संख्या बहुत अधिक है और प्रति कक्ष 50 अप्सराओं को खिलाते समय भी कोई महत्वपूर्ण हानिकारक प्रभाव नहीं देखा जाता है। चूंकि अलग-अलग लार्वा की गिनती उचित नहीं है और कोई भीड़भाड़ का मुद्दा नोट नहीं किया गया था, इसलिए सेटअप में आसानी के लिए प्रति कक्ष एक-आधा से पूरे अंडे द्रव्यमान की सिफारिश की जाती है। पूरे अंडे के द्रव्यमान में ~ 1,000 या अधिक लार्वा होते हैं, और फ़ीड के दौरान दर्जनों से ~ 200 तक के लार्वा एक अंडे के द्रव्यमान से गिर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, लार्वा टिक्स जो फ़ीड नहीं करते हैं, वे मरते नहीं हैं और संभावित रूप से बाद में खिलाने के लिए फिर से रखे जा सकते हैं।
अन्य प्लास्टिक का उपयोग फीडिंग कक्षों का उत्पादन करने के लिए किया गया है, जिनमें से पॉली कार्बोनेट को सबसे टिकाऊ और गैर-प्रतिक्रियाशील निर्धारित किया गया है। अन्य प्लास्टिक, जैसे ऐक्रेलिक, सफाई समाधानों के प्रति संवेदनशील होते हैं, जो क्रेज़िंग और टूटने का कारण बन सकते हैं, खासकर ट्यूबिंग के कटे हुए सिरों पर। पॉली कार्बोनेट ब्लीच, इथेनॉल, ऑटोक्लेविंग और पराबैंगनी नसबंदी के संपर्क में अच्छी तरह से रहता है।
जबकि एक कक्ष में टिक्स अंततः गर्म रक्त की गर्मी उत्तेजना के कारण झिल्ली को काट सकते हैं और संलग्न हो सकते हैं, रासायनिक फागोस्टिमुलेंट के रूप में अतिरिक्त उत्तेजना इस प्रक्रिया को तेज करने में मदद करती है (नुस्खा के लिए, प्रोटोकॉल चरण 6 देखें)। इस अध्ययन के लिए, पानी में घुल गए टिक मल का उपयोग लंबे समय तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित होने की उनकी क्षमता के कारण आदर्श है। वे आसानी से नवीकरणीय भी हैं, क्योंकि टिक मल को बाद के फ़ीड से एकत्र किया जा सकता है। स्वाभाविक रूप से, पहले झिल्ली फ़ीड में टिक मल निकालने के सुझाए गए फागोस्टिमुलेंट तक पहुंच नहीं हो सकती है और भविष्य के फ़ीड के लिए इसका उत्पादन करने में मदद करने के लिए इसके बिना प्रदर्शन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, वैकल्पिक फागोस्टिमुलेंट का उपयोग किया जा सकता है, अन्य अध्ययनों में विभिन्न रासायनिक या यांत्रिक उत्तेजनाओं जैसे बाल या बालों के अर्क के साथ सफलता मिलती है।
कृत्रिम झिल्ली भोजन टिक और टिक-जनित रोगज़नक़ जीव विज्ञान में काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए अतिरिक्त उपकरण प्रदान करता है। यह सस्ती और सरल है, लेकिन श्रम-गहन भी है, और संभवतः उनके वांछित अनुप्रयोग और टिक प्रजातियों / जीवन चरण के लिए अनुकूलन करने के लिए कुछ प्रारंभिक परीक्षण की आवश्यकता होगी।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
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