Summary
Здесь представлен метод кормления клеток кровью in vitro через искусственную мембранную систему, позволяющую частично или полностью нагружать различные стадии жизни клещей.
Abstract
Клещи и связанные с ними заболевания являются важной темой изучения из-за их общественного здравоохранения и ветеринарной нагрузки. Тем не менее, требования к кормлению клещей как во время изучения, так и выращивания могут ограничивать экспериментальные вопросы или способность лабораторий исследовать клещей и связанные с ними патогены. Система искусственного мембранного кормления может уменьшить эти проблемы и открыть новые направления исследований, которые, возможно, были невозможны с традиционными системами кормления животных. В этом исследовании описывается система искусственного мембранного питания, которая была усовершенствована для успешного кормления и нагружения на всех этапах жизни Ixodes scapularis . Кроме того, система искусственного мембранного питания, описанная в этом исследовании, может быть модифицирована для использования с другими видами клещей путем простого уточнения желаемой толщины мембраны. Преимущества искусственной мембранной системы кормления уравновешиваются трудоемкостью системы, дополнительными факторами окружающей среды, которые могут повлиять на успех кормления, и необходимостью совершенствования техники для каждого нового вида и стадии жизни клещей.
Introduction
Клещевые заболевания сильно влияют на здоровье людей и животных во всем мире, являясь причиной более двух третей всех трансмиссивных заболеваний в США с 2004 по 2016год1. Кроме того, в последние годы растет число случаев заболевания, при этом все больше людей и домашнего скота страдают от клещей и связанных с ними заболеваний 2,3. Хотя, вероятно, существует множество причин тенденции к росту числа случаев заболевания, изменение климата является важным фактором 3,4. Прогнозируемое продолжающееся увеличение числа случаев клещевых заболеваний подчеркивает необходимость разработки новых инструментов для изучения взаимосвязей между клещами и патогенами, которые они передают.
Известно, что клещи претерпевают изменения в физиологии и экспрессии генов во время кормления и что эти изменения играют роль в передаче патогена 5,6. Может быть трудно провести исследования, изучающие влияние полного и частичного кормления на передачу и приобретение патогенов с использованием животных моделей, особенно в ситуациях, когда модели грызунов не восприимчивы к заражению конкретным патогеном. Например, штамм Anaplasma phagocytophilum Variant-1 естественным образом передается между Ixodes scapularis и оленями, но не может заражать мышей, что усложняет клещевую инфекцию в лаборатории7. Искусственные системы кормления также могут быть применены для изучения патогенов, таких как Borrelia burgdorferi, с использованием трансгенных мутантов, которые имеют делеции генов, которые ингибируют передачу или инфекцию8. Использование искусственной системы кормления помогает исследователям изолировать роль генов, позволяя инфекции или передаче происходить только на стороне клеща, тем самым изолируя любую реакцию хозяина, которая может сбить с толку такие исследования.
Аналогичным образом, некоторые этапы жизни клещей, участвующих в передаче болезней и животных, не могут быть вызваны для питания общими лабораторными модельными видами. Самки Ixodes scapularis , например, должны питаться более крупными животными, обычно кроликами9. Хотя они часто доступны для лабораторных экспериментов, административные и сельскохозяйственные требования к использованию кроликов превышают требования мелких грызунов и могут быть непомерно высокими для некоторых лабораторий. Другие виды клещей, особенно те, которые имеют ветеринарное значение, должны питаться крупным рогатым скотом или другими крупными животными, которые непрактичны для использования в большинстве лабораторий. Методы кормления in vitro и заражения, такие как искусственное мембранное вскармливание, обеспечивают альтернативы использованию крупных или экзотических животных-хозяев.
Кроме того, использование искусственной системы кормления позволяет проводить определенные анализы, которые могут быть невозможны при традиционных методах кормления животных. Одним из таких примеров является то, что, отделяя источник крови от механизма питания, становится возможным изучение роли, которую кровь разных хозяев может играть в передаче B. burgdorferi 10. Это исследование крови хозяина и роли, которую сама кровь играет в отсутствие иммунного ответа хозяина, является важным фактором в понимании циклов передачи патогенов и тем, что системы искусственного питания могут помочь ответить11. Также становится возможным количественно оценить точное количество передачи патогена во время кормления, а не просто изучать успех передачи и установление у хозяина 8,12.
Некоторые из первых искусственных кормовых мембран, предназначенных для твердых клещей, были сделаны из шкур животных или мембран животного происхождения в 1950-х и 1960-х годах13,14. Из-за биологической природы этих мембран возникли проблемы как с производством новых мембран, так и со сроком годности. В 1990-х годах были разработаны полностью искусственные мембраны, которые использовали подложку из сетки, бумаги или ткани с силиконовой пропиткой15,16. Силикон был идеальным, поскольку его физические свойства имитируют эластичность и легкую липкость кожи, а также его био-присущую природу. Основываясь на этом, Кробер и Герин, на чьей работе была основана эта техника, описали пропитанную силиконом технику подачи вискозной мембраны для искусственного кормления I. ricinus17.
Усовершенствование методов для I. scapularis, близкородственного вида, привело к заметным различиям в твердости силикона, используемого в мембранной пропитке, рецептуре производства мембраны, размерах камеры и стимуляторе прикрепления. В то время как уточнения, о которых сообщалось в этом исследовании, привели к аналогичным характеристикам мембраны, о которых сообщили Andrade et al., которые также разработали силиконовую мембрану на основе Krober и Guerin для использования в I. scapularis, существует разница в стадиях пропитки силикона, что позволяет гибко использовать этот протокол для незрелых стадий жизни I. scapularis15, 18. В этом исследовании также описываются дополнения и технические изменения, основанные на повторном использовании этого метода, лучшие практики, которые приводят к успешной подаче, и устранение неполадок, которые могут возникнуть. Этот метод использовался для питания всех активных стадий жизни, заражения клещей патогенными бактериями и воздействия на клещей нескольких доз антибиотиков19,20. В то время как показанный метод искусственного мембранного кормления предназначен для I. scapularis, этот метод легко адаптируется к другим видам клещей с незначительными изменениями толщины мембраны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка камеры клещевой мембраны
- Подготовьте плоскую, непористую поверхность, такую как плоскость стеклянной или керамической металлической основы подставки для рук, протерев ее 70% этанолом, а затем покройте ее одним слоем полиэтиленовой пленки, убедившись, что пластиковая пленка плоская и без пузырьков или морщин (см. Рисунок 1А).
- Приклейте 100% бумагу для очистки вискозной линзы на подготовленную поверхность. Убедитесь, что он плоский и слегка натянутый с помощью ленты на всех четырех сторонах бумаги. Два куска 4 в х 6 в бумаге для линз могут быть превращены в мембраны с использованием объемов, описанных на этапе 1.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этого достаточно, чтобы создать до 12 камер подачи (см. Рисунок 1B). Если мембрана предназначена для личиночных клещей, используйте бумагу unryu вместо бумаги для чистки линз. - Приготовьте силиконовую смесь твердости 00-10, отмерив 5 мл каждой части силиконового набора в одноразовый контейнер, слегка перемешав две жидкости перед добавлением 1,5 мл гексана. Продолжайте перемешивать до тех пор, пока смесь не станет однородной и тщательно перемешана.
ПРИМЕЧАНИЕ: При изготовлении мембран для взрослых клещей используйте силикон твердости 00-50. - Используйте небольшой скребок, чтобы распределить силиконовую смесь по бумаге линзы. Дайте постоять в течение 1 минуты, чтобы убедиться, что силикон пропитался бумагой линзы. Неуклонно соскребайте избыток силикона в сторону с помощью скребка, используя небольшое количество нисходящего давления. Выполните второй проход со скребком, не оказывая давления вниз, чтобы удалить любые линии силикона и получить гладкий слой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап процедуры может потребовать некоторой практики для получения мембран оптимальной толщины для каждой стадии жизни (взрослые особи: 150-200 мкм; нимфы: 90-120 мкм; личинки: 80-100 мкм). Более толстая мембрана (в пределах допусков питания на жизненной стадии) обычно дает лучшие результаты за счет уменьшения конденсации в камере и улучшения самовосстанавливающейся характеристики мембраны. - Только для личинок несколько раз окуните верхнюю часть камеры подачи в фторполимерную смолу Fluon (PTFE-30), что позволит ей высохнуть между применениями для получения последовательного слоя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применение Fluon образует антипригарный слой фторполимерной смолы, похожий на антипригарную сковороду. Это позволит уменьшить количество личинок, которые поднимаются на вершину камеры21. - Оставьте мембрану для отверждения в течение не менее 24 часов в свободной от пыли среде, такой как закрытый химический шкаф или шкаф биобезопасности, прежде чем перейти к следующему этапу. На рисунке 1C показано, как выглядит бумага для вискозных линз после того, как силикону дали высохнуть.
- Приготовьте силиконовую смесь с 30 твердостью для прикрепления камер к мембране путем смешивания равных частей силиконовой смеси А и В.
- Опустите поликарбонатные камеры примерно на четверть дюйма (6 мм) в силиконовую смесь, а затем поместите на мембранный лист, следя за тем, чтобы не перекрывать какую-либо ленту (рисунок 1D).
- Дайте прикрепляющему силикону затвердеть не менее 24 часов, прежде чем переходить к следующим шагам.
- С помощью скальпеля аккуратно обрежьте мембрану вокруг каждой из прикрепленных камер, обрезав края так, чтобы она могла плавно вписаться в колодец из 6-луночной пластины без особого соскабливания по бокам (рисунок 1Е). Допустите достаточное количество материала за пределы камеры, чтобы максимизировать адгезию мембраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если остается слишком много внешнего материала, повторное удаление камеры из 6-луночной пластины может привести к частичному отсоединению мембраны от камеры. Ремонт отслоившихся мембран описан в разделе 5. - Отрежьте небольшой кусочек оставшейся мембраны от каждого из углов и центра мембранного листа. Снимите полиэтиленовую пленку с каждого кусочка. Измерьте куски микрометром, чтобы определить среднюю толщину мембраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если толщина мембраны не соответствует допустимому диапазону для стадии жизненного цикла (см. этап 1.4), мембраны должны быть выброшены и переделаны. Толщина бумаги Unryu сильно варьируется из-за ее толстых нитей волокна и тонких областей. Хотя эта характеристика позволяет личинкам находить области оптимальной толщины, она затрудняет определение фактической толщины мембраны. - Поместите питательные камеры вместе с одним уплотнительным кольцом на камеру в стеклянный стакан для автоклавирования при 121 °C в течение не менее 20 минут для стерилизации. Дайте камерам остыть перед их использованием.
2. Настройка ленты тиков
- Подготовьте лампу или комнату так, чтобы свет был включен в течение 16 ч, а затем выключен в течение 8 ч. Если вы используете лампу, убедитесь, что водяная баня на следующем этапе находится в темноте в течение этих 8 часов.
- Установите водяную баню при температуре 34 °C и с опорами так, чтобы 6-луночная плита могла сидеть и слегка плавать в ней. Используйте небольшие стеклянные стаканы, утопленные на водяной бане, в качестве опоры. Используйте прозрачный чехол для водяной бани, чтобы поддерживать светло-темный цикл для клещей; при необходимости используйте Т-образную подставку и полиэтиленовую пленку, чтобы сделать крышку. Чтобы снизить риск загрязнения, добавьте 0,02% хлорида бензалкония на водяную баню и установите еще одну водяную баню на 36 °C для согревания охлажденной крови.
- Выньте предварительно подготовленные, автоклавные мембранные камеры, поместив уплотнительное кольцо вокруг камеры (рисунок 1F), а затем заполните каждую камеру достаточным количеством этанола на 70% для покрытия мембраны. Дайте посидеть в 6-луночной пластине в течение 5 минут, а затем поищите любые утечки между камерой и мембраной и в самой мембране.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мембрана протекает, этанол будет накапливаться в основании скважины. Негерметичные мембраны следует выбросить. - Выпустите этанол из камер, а затем дайте ему высохнуть на воздухе внутри шкафа биобезопасности или ламинарной вытяжки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять несколько минут в зависимости от влажности окружающей среды. - Во время ожидания нагревают-инактивируют комплемент в крови нагреванием при 56 °C в течение 40 мин. Добавка с механически дефибринированной бычьей кровью содержит 2 г/л глюкозы.
- После того, как мембрана высохнет, нанесите ~ 20 мкл фагостимулята на внутреннюю часть камеры, а затем распределите его по поверхности, наклонив камеру. См. раздел 6 для получения инструкций относительно приготовления фагостимулятора из клещевого фрасса.
- Подождите, пока фагостимулятор высохнет, прежде чем добавлять клещей в камеру с помощью щетки или щипцов. Работайте как можно быстрее при переносе клещей в камеру, чтобы предотвратить побег. Поместите клещей в трубку на лед на 1-2 минуты, прежде чем перенести их, чтобы замедлить их способность к побегу. После того, как клещи были перенесены, запечатайте верхнюю часть парапленкой; не перерастягивайте парапленку, так как тепло от водяной бани может привести к ее разрыву.
ПРИМЕЧАНИЕ: Щипцы лучше всего работают на стадиях жизни нимфы и взрослых особей, а щетки лучше всего работают на стадиях жизни личинок. - Добавьте 5 мл термоинактивированной крови на лунку/камеру в коническую трубку и поместите на водяную баню при температуре 36 °C. Доведите охлажденную кровь, по крайней мере, до комнатной температуры, прежде чем подвергать ее воздействию клещей. Выделите четыре камеры на 6-луночную пластину для удобства работы с камерами. Следует избегать большего количества камер на тарелку, однако, в зависимости от размера водяной бани, можно использовать больше пластин.
- Добавьте 5 мкл 3 мМ АТФ и 50 мкл 100-кратного запаса пенициллина/стрептомицина/фунгизона на 5 мл крови в пробирку.
- Переложите 4,5 мл крови в колодец из 6-луночной пластины, а затем аккуратно поместите камеру в колодец, регулируя высоту уплотнительного кольца на камере так, чтобы мембрана сидела в крови, но уровень крови вокруг стороны не перекрывал колодец. Поместите лунку в кровь под углом, чтобы избежать образования пузырьков воздуха между кровью и мембраной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Заполненная пластина показана на рисунке 2. - Поместите крышку 6-луночной пластины поверх подающих камер; затем поместите 6-луночную плиту с камерами в подготовленную водяную баню при температуре 34 °C и закройте крышку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка сверху поможет предотвратить контакт конденсированной воды с парапленкой и разбавление крови в колодцах.
3. Поддержание кормящихся клещей путем смены крови каждые 12 ч
- Аликвот 5 мл термоинактивированной крови на лунку в пробирку и разогрейте ее на водяной бане при температуре 36 °C. Разморозить АТФ и пенициллин/стрептомицин/фунгизон на водяной бане одновременно.
- Добавьте в пробирку 5 мкл 3 мМ АТФ и 50 мкл 100-кратного запаса пенициллина/стрептомицина/фунгизона на лунку. Переложите 4,5 мл крови в лунку из свежей 6-луночной пластины.
- Выньте из водяной бани 6-луночную пластину с клещевой камерой. Извлеките камеру из колодца и промойте внешнюю часть камеры и мембраны 10 мл стерильного 1x PBS для удаления крови.
- Используя автоклавную фильтровальную бумагу, аккуратно высушите мембрану и камеру, чтобы удалить избыток PBS. Замените парапленку в верхней части камеры. Если внутри камеры много конденсата, высушите влажные пятна автоклавной фильтровальной бумагой перед запечатыванием свежей парапленкой.
- Поместите клещевую камеру в новую 6-луночную пластину со свежей кровью, при необходимости регулируя высоту уплотнительного кольца. Повторите шаги 3.3-3.5 для каждой камеры на пластине. Поместите крышку 6-луночной пластины поверх верхних частей камер. Переместите новую 6-луночную плиту обратно на водяную баню с температурой 34 °C.
- Повторяйте шаги 3,1-3,5 каждые 12 ч до завершения подачи клеща. Подождите, пока клещи отсоединятся от мембраны сами по себе при набухании или осторожно удалите их из мембраны мягким на ощупь пинцетом, все еще прикрепленным, чтобы получить частично набухших клещей.
4. Противогрибковое лечение
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте только тогда, когда грибковый рост виден на мембране. Грибок, вероятно, образуется на стороне крови мембраны, если кормление имеет достаточную продолжительность. Первым признаком грибкового загрязнения являются небольшие (1-3 мм) хлопья свернутой крови, видимые на мембране. Когда отмечается грибковое загрязнение, противогрибковые процедуры могут продлить продолжительность эксперимента и улучшить успех нагрубания.
- Растворите 10 000 U нистатина на мл в дистиллированной воде, 5 мл на камеру кормления. Фильтр-стерилизуйте с помощью шприцевого фильтра 0,1 мкм.
- Добавьте 5 мл раствора нистатина на лунку новой 6-луночной пластины, по одной лунке для каждой питательной камеры.
- Поместите в раствор камеры, промытые PBS. Дать постоять 10 мин.
- Промыть обработанные мембраны PBS перед тем, как вернуть их в свежую кровь.
- Повторяют противогрибковую обработку каждые 2-3 дня (в зависимости от степени грибкового загрязнения) до завершения эксперимента.
5. Повторное приклеивание отсоединенных мембран цианоакрилатным клеем
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте только при обнаружении отслоения мембраны.
- Мембраны могут частично отсоединяться от питательных камер, особенно во время удаления из 6-луночной пластины. Если это произошло, промыть мембрану крови PBS.
- Аккуратно высушите пораженный участок. Он не обязательно должен быть идеально сухим, но наличие влаги заставляет клей схватываться быстрее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное приклеивание мембраны ограничивает рабочее время, однако, в зависимости от размера отслоения, может быть желательно более быстрое время схватывания. - Выдавите небольшое количество цианоакрилатного клея в щель, где мембрана оторвалась от камеры. Держите на месте в течение ~ 2 мин, чтобы клей сросся.
- Поместите камеру обратно в кровь в 6-луночную пластину.
6. Изготовление фагостимулятора
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте в конце кормления или до начала мембранной подачи.
- Собирайте фекалии клещей либо из предыдущего мембранного корма, либо из другого источника кормления клещей. Храните кал при -20 °C до приготовления фагостимулятора. Измельчите гранулы клещевого кала и смешайте по 0,1 г на 1 мл воды. Добавьте 1 мМ трипептида с восстановленным содержанием глутатиона, растворите и тщательно перемешайте путем вихря.
- Фильтр-стерилизуйте с помощью шприцевого фильтра 0,1 мкм.
- Заморозить при -20 °C до необходимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное кормление зависит от того, желательна ли частичная или полная нагрубание. Успешно кормят I. scapularis оттенок оружейного серого цвета для взрослых особей и отделяют самостоятельно от мембраны. Однако, если они по крайней мере размером с горошину, они могут быть отделены от мембраны при завершении кормления. Для незрелых стадий I. scapularis размер полностью набухших клещей варьируется, и поскольку, в отличие от взрослых особей, они не проявляют изменения цвета, отслойка является лучшим способом определить, полностью ли клещ полностью набух. Смотрите рисунок 3 для примера того, как nymphal I. scapularis может выглядеть во время кормления. Взрослым клещам I. scapularis требуется 1 неделя и более от прикрепления до тех пор, пока они не начнут отделяться от мембраны; нимфы часто отделяются примерно через 5 дней после прикрепления, а личинки начинают отделяться ~ через 3-4 дня после первого прикрепления. Кормление может продолжаться до тех пор, пока человек хочет поддерживать изменения крови два раза в день, и до тех пор, пока плесень не начала расти сверх того, что может контролировать противогрибковое лечение. Частично набухшие клещи должны быть вручную отделены от мембраны.
Незрелые клещи (личинки и нимфы), которые отделяются от мембраны самостоятельно, почти всегда успешно линяют на следующей стадии жизни, и если предположить, что они достаточно набухли и имеют достаточно большой размер, даже те, которые отделяются вручную от мембраны в конце кормовой линьки. Самки клещей, которые стали серыми во время нагрубания, обычно успешно откладывают яйца. Однако, в отличие от естественных средств питания, набухшие самки с мембранным питанием производят меньшие яичные массы и имеют меньший размер, чем их естественно животные собратья. Результаты недавнего эксперимента, в котором кормили личинок I. scapularis из яиц через нимфальное нагрубание и линьку, можно увидеть в таблице 1. Полученных нимф из первоначального личиночного корма кормили через 2 месяца после линьки. Однако важно отметить, что в этом эксперименте в кровь был добавлен гомогенат органа оленя, что, возможно, оказало пагубное влияние на успех кормления клещей.
В другом эксперименте 60 самок и 60 самцов клещей I. scapularis были помещены в четыре кормовые камеры (30 клещей, подобранных по половому признаку на камеру), и самкам клещей было разрешено кормиться до изобилия. Эти клещи возникли как потомство набухших самок, собранных у убитых охотниками оленей. Средний вес и диапазон массы яйца, в дополнение к показателям успешности нагрубания (число самок, которые отложили яйца после нагрубания и отслоения), можно увидеть в таблице 1. Вес яичной массы для I. scapularis сильно варьируется в литературе, но клещи, ранее собранные у убитых охотниками оленей из Миннесоты, производили яичные массы со средним весом 77 мг (19-147 мг)22. Смертность клещей низкая при использовании искусственной мембранной системы кормления; клещи, которые не прикрепляются и не питаются, в основном выживают в процессе, что повышает вероятность дальнейших экспериментов по мембранному питанию с выжившими.
Этот метод был использован для заражения нимфальной I. scapularis различными клещевыми патогенами, включая A. phagocytophilum Variant-1, который не может использовать традиционные методы заражения грызунов7. Заражение клещей бактериями было подтверждено с помощью qPCR, и хотя все нимфальные клещи, которые успешно питались, были положительными после кормления, в зависимости от вида бактерий, инфекция будет или не будет сохраняться трансстадиально19. Этот метод также использовался для кормления самок I. scapularis ципрофлоксацином; успешно сытые клещи показали сопоставимое снижение уровня бактериального симбионта с введенными клещами20.
Рисунок 1: Камера с клещевой мембраной. (A) Основание стенда с керамическим покрытием, покрытое полиэтиленовой пленкой. (B) Бумага для линз, прикрепленная к основанию в пластиковой упаковке. Синий прямоугольник — это скребок, используемый в панели C. (C) Бумага для линз после пропитки силиконом. D) камеры, прикрепленные к силиконово-вискозной мембране. Каждый бумажный лист размером 4 x 6 линз может вместить шесть камер. E) комплектная камера с силиконово-вискозной мембраной. Отдельно стоящая силиконово-вискозная мембрана показана справа. F) собранная готовая камера с закрепленным на ней уплотнительным кольцом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Настройка ленты тиков. Пример того, как будет выглядеть набор из четырех камер со взрослой I. scapularis после того, как все будет настроено и до того, как его поместят на водяную баню. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Продолжающееся кормление с частично набухшими нимфами Ixodes scapularis . Черные или коричневые точки вокруг мест прикрепления (см., например, метку А) - это фрасс, который можно собирать во время и после кормления, чтобы сделать фагостимулятор. Частично набухшие нимфы I. scapularis прикреплены на мембране (см. метку B). Шелуху набухших личинок можно увидеть на этикетке C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Количество стартовых тиков | Количество успешно набухших клещей | Средняя масса яйца в мг (диапазон) | |
| Личинки | 2 вылупившиеся яйцевидные массы | 150 | Н/Д |
| Нимфы | 150 | 24 | Н/Д |
| Взрослые суки | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
Таблица 1: Количество нагрубаний клещей и весы массы яиц. В экспериментальных условиях нагрубания личинок и нимф были добавлены гомогенаты органов оленей в кровь в дополнение к добавкам, используемым в этом протоколе. Экспериментальные условия нагрубания взрослых женщин были такими, как описано в протоколе выше. Успешное нагрубание определялось либо набухшими клещами, которые успешно линяли до следующей стадии жизни, либо набухшими самками, которые успешно откладывали яйца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Искусственное мембранное кормление клещей является полезным инструментом для различных экспериментальных процедур, но вряд ли заменит кормление животных для всех применений. Поддержание больших колоний клещей на всех этапах жизни без кормления животных, как правило, несостоятельно. Вместо этого система искусственного кормления ценна для других целей, таких как заражение клещей патогенами, не поддерживаемыми хозяевами модели, оценка воздействия контролируемых доз соединений или микроорганизмов на клещей в упрощенной среде кормления или выращивание небольших колоний клещей, которые полагаются на животных-хозяев, которые не легко доступны в лаборатории8, 10,11,23,24,25. По сравнению с традиционными методами кормления животных, искусственное мембранное кормление является трудоемким и представляет проблемы15,24. Именно по этим причинам искусственное мембранное кормление не является заменой традиционным методам кормления на основе животных и вместо этого позволяет проводить эксперименты, которые не могут быть проведены с традиционным кормлением животных.
Поддержание гигиенических условий как в камерах кормления, так и в колонии клещей имеет жизненно важное значение для предотвращения грибкового и бактериального загрязнения. Однако при использовании искусственного вскармливания для воздействия на клещей патогенов следует избегать добавок пенициллина / стрептомицина / грибка (P / S / F) из крови, чтобы избежать уничтожения патогенов. Клещевое воздействие ципрофлоксацина в крови может полностью устранить Rickettsia buchneri, эндосимбионт яичников I. scapularis, из подмножества потомства F1, в то время как рутинное добавление P/S/F в кровь не оказывает такого эффекта20. Исследования передачи трансовариальных патогенов не проводились с использованием этой системы, но не было отмечено никаких изменений в плодовитости набухших женщин в экспериментах, подвергшихся воздействию антибиотиков, по сравнению с контрольными. Быстрое начало кормления и нагрубания клещей позволяет избежать многих проблем, связанных с грибковым загрязнением; по этой причине система имеет тенденцию легче работать с личиночными и нимфальными клещами, так как у них более короткое время кормления. Периодическая обработка загрязненных мембран противогрибковыми препаратами, такими как нистатин, может продлить время, доступное для набухания, на несколько дней. Также важно использовать клещей, которые были линяты достаточно долго, чтобы иметь желание кормиться. Личинки готовы через 2 недели после того, как все личинки в яичной массе завершили появление, но нимфы и взрослые особи чувствуют себя лучше, если их использовать по крайней мере через 10 недель после линьки.
Этот метод показал сопоставимый успех кормления клещей с использованием лабораторных животных, причем обычно 30-50% самок и примерно 50% нимфальной I. scapularis завершают нагрубание, что сопоставимо с успехом нагрубания взрослых особей, питающихся лабораторными кроликами или нимфами, питающимися мышами или хомяками19. Аналогичным образом, в других исследованиях с использованием искусственных камер кормления сообщалось о 45% скорости нагрубания для самок I. scapularis и 72% для нимф10,18. Между тем, для самок и нимф Ixodes ricinus, которых кормили через искусственную мембрану, показатели нагрубания составляли 71% и 58% соответственно25. Таким образом, результаты могут быть переменными в зависимости от используемой системы и исследуемых видов клещей.
Толщина мембраны является важным фактором успеха кормления; более тонкие мембраны менее способны герметизировать вокруг крошечных отверстий, образующихся при прощупывании и прикреплении клещей. После начала кормления в камеру попадает больше влаги, что может привести к влажным условиям, сжижению и последующему покраснению фрасса, плесени. Поэтому важно производить мембраны максимальной толщины, допустимой для вида клещей, и гипостомной длины стадии жизни, которая должна питаться (см. этапы протокола 1.1-1.4). Нимфы I. scapularis и Dermacentor variabilis питаются мембранами толщиной от 90 мкм до 120 мкм, в то время как взрослые питаются мембранами толщиной до 200 мкм. Взрослая гипостома I. scapularis имеет длину 500 мкм, в то время как нимфальные и личиночные гипостомы имеют длину ~ 100 мкм, что оказывается достаточным для проникновения в немного более толстую мембрану15,26. Бумага для вискозных линз в среднем имеет толщину ~50 мкм, а мембраны, изготовленные из нее, имеют толщину не менее 50 мкм; однако, как указывалось выше, более толстые мембраны дают лучшие результаты. Личиночные питательные мембраны хорошо работают при толщине 80-100 мкм с использованием очень легкой бумаги unryu (10 г/м3). Эта нерегулярная тутовая бумага пронизана относительно толстыми волокнами, которые обеспечивают поддержку мембраны, которая местами очень тонкая, что позволяет создавать обширные места прикрепления личинок.
Исходя из рекомендуемой толщины мембраны и размеров камеры, лучше всего ограничить количество самок во взрослых кормах максимум до 20 самок (клещи помещаются в камеры на этапе протокола 2.7). Больше самок рискуют перенасеть места прикрепления, так как клещи, как правило, прикрепляются очень близко друг к другу, что может поставить под угрозу целостность мембраны в местной области и увеличить риск утечки, а также замедлить скорость кормления. Для нимфальных клещей максимальные числа намного выше и не отмечается существенных пагубных последствий даже при кормлении 50 нимф на камеру. Поскольку подсчет отдельных личинок не является разумным и не было отмечено никаких проблем с переполненностью, для удобства настройки рекомендуется от половины до целой яичной массы на камеру. Целые яичные массы состоят из ~ 1000 или более личинок, и в течение кормления от десятков до ~ 200 набухших личинок могут выпадать из одной яичной массы. Кроме того, личиночные клещи, которые не питаются, как правило, не умирают и потенциально могут быть перемещены для последующего кормления.
Другие пластмассы были использованы для производства камер подачи, из которых поликарбонат был определен как наиболее прочный и нереакционноспособный. Другие пластмассы, такие как акрил, чувствительны к чистящим растворам, которые могут вызвать сумасшествие и поломку, особенно на разрезанных концах трубки. Поликарбонат хорошо выдерживает воздействие отбеливателя, этанола, автоклавирования и ультрафиолетовой стерилизации.
В то время как клещи в камере могут в конечном итоге укусить и прикрепиться к мембране из-за теплового стимула подогретой кровью под ней, дополнительные стимулы в виде химических фагостимуляторов помогают ускорить этот процесс (рецепт см. в протоколе шага 6). Для этого исследования использование клещевых фекалий, которые были растворены в воде, идеально подходит из-за их способности сохраняться при -20 ° C в течение длительных периодов времени. Они также легко возобновляются, так как фекалии клещей могут быть собраны из последующих кормов. Естественно, первый мембранный корм может не иметь доступа к предложенному фагостимулятору экстракта клещевых фекалий и может быть выполнен без него, чтобы помочь производить его для будущих кормов. Кроме того, могут использоваться альтернативные фагостимуляторы, причем другие исследования имеют успех с различными химическими или механическими стимулами, такими как волосы или экстракты волос15,24.
Искусственное мембранное кормление предоставляет дополнительные инструменты для исследователей, работающих в биологии клещей и клещевых патогенов. Это доступно и просто, но также трудоемко и, вероятно, потребует некоторого предварительного тестирования для оптимизации для их желаемого применения и вида клещей / стадии жизни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
- Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
- Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
- Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
- Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
- Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
- Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
- Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
- Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
- Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
- Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
- Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
- Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
- Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
- Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
- Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
- González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
- Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
