Summary
ここに提示されるのは、様々なダニの生活段階の部分的または完全な充血を可能にするために、人工膜システム を介してインビトロで ダニを血液供給する方法である。
Abstract
ダニとそれに関連する病気は、公衆衛生と獣医の負担のために重要な研究トピックです。ただし、研究と飼育の両方におけるダニの摂食要件は、実験的な質問や、ダニとそれに関連する病原体を研究するラボの能力を制限する可能性があります。人工膜給餌システムは、これらの問題を軽減し、従来の動物給餌システムでは不可能だったかもしれない新しい研究の道を開くことができます。この研究では、すべての Ixodes scapularis ライフステージの給餌と充血の成功のために改良された人工膜給餌システムについて説明します。さらに、この研究で説明した人工膜供給システムは、所望の膜厚さの単純な改良を通じて、他のダニ種で使用するように変更することができる。人工膜供給システムの利点は、システムの労働集約性、給餌の成功に影響を与える可能性のある追加の環境要因、およびダニの新種とライフステージごとに技術を洗練する必要性によって相殺されます。
Introduction
ダニ媒介性疾患は、世界中の人間と動物の健康に強く影響し、2004年から2016年までの米国におけるすべてのベクター関連疾患の3分の2以上を占めています1。さらに、近年、症例数が増加しており、より多くの人々と家畜がダニとそれに関連する病気の影響を受けています2,3。症例数の増加傾向には多くの原因がある可能性がありますが、気候の変化は重要な要素です3,4。ダニ媒介性疾患の症例数の予測される継続的な増加は、ダニとそれらが伝染する病原体との関係を調査するための新しいツールを開発する必要性を強調しています。
マダニは摂食中に生理学と遺伝子発現の変化を受け、これらの変化が病原体の伝染に役割を果たすことが知られています5,6。特にげっ歯類モデルが特定の病原体による感染を受けにくい状況では、動物モデルを使用して病原体の伝播と獲得に対する完全および部分的な摂食の影響を調べる研究を実施することは難しい場合があります。たとえば、アナプラズマ食細胞菌バリアント-1株は、肩甲骨とシカの間で自然に伝染しますが、マウスに感染することができず、実験室でのダニ感染を複雑にします7。人工栄養システムは、感染または感染を阻害する遺伝子欠失を有するトランスジェニック変異体の使用を介して、ボレリア・ブルグドルフェリなどの病原体の研究を支援するために適用することもできます8。人工栄養システムを使用すると、研究者は感染または伝播がダニの側でのみ発生するようにすることで遺伝子の役割を分離し、それによってそのような研究を混乱させる可能性のある宿主の反応を分離するのに役立ちます。
同様に、病気や動物の伝染に関与するダニのいくつかのライフステージは、一般的な実験室モデル種を食べるように誘導されない可能性があります。たとえば、 Ixodes scapularis の雌は、より大きな動物、通常はウサギ9に餌を与えなければなりません。実験室での実験に利用できることがよくありますが、ウサギを使用するための管理上および飼育上の要件は、小さなげっ歯類の要件を超えており、一部の実験室では禁止されている場合があります。他のダニ種、特に獣医学が懸念される種は、ほとんどの実験室で使用するのが実用的ではない牛または他の大型動物に餌を与えなければなりません。人工膜給餌などの in vitro 給餌および感染方法は、大型またはエキゾチックな宿主動物を使用する代わりになります。
さらに、人工給餌システムを使用することで、従来の動物給餌方法では不可能な特定の分析が可能になります。そのような例の1つは、血液源を摂食機構から分離することにより、異なる宿主の血液がB.ブルグドルフェリの伝達に果たす可能性のある役割の調査が可能になることです10。宿主の血液と宿主の免疫応答がない場合に血液自体が果たす役割のこの検査は、病原体の伝播サイクルを理解するための重要な要素であり、人工栄養システムが答えるのに役立つものです11。また、宿主における伝播の成功および確立を単に調べるのではなく、飼料中の病原体の正確な伝播数を定量化することも可能になる8,12。
硬いダニのために作られた最初の人工給餌膜のいくつかは、1950年代と1960年代に動物の皮または動物由来の膜から作られました13,14。これらの膜の生物学的性質のために、新しい膜の製造と貯蔵寿命の両方に問題がありました。1990年代には、シリコーン含浸を施した網、紙、または布の裏地を利用した完全人工膜が開発されました15,16。シリコーンは、その物理的特性が皮膚の伸縮性とわずかな粘着性を模倣し、その生体固有の性質を備えているため、理想的でした。これに基づいて、この技術が基づいていたKroberとGuerinは、I. ricinus17の人工給餌のためのシリコーン含浸レーヨン膜供給技術について説明しました。
近縁種であるI. scapularisの方法の改良により、膜含浸に使用されるシリコーンの硬度、膜製造のレシピ、チャンバーの寸法、および付着刺激剤に顕著な違いがもたらされました。この研究で報告された改良は、I. scapularisで使用するためにKroberとGuerinに基づくシリコーンベースの膜を開発したAndradeらによって報告されたものと同様の膜特性をもたらしましたが、シリコーン含浸ステップに違いがあり、I. scapularisの未熟なライフステージにこのプロトコルを利用する柔軟性を可能にします15、18.この調査では、この方法の繰り返し使用に基づく追加と技術的な変更、フィードを成功させるためのベスト プラクティス、および発生する可能性のある問題のトラブルシューティングについても説明します。この方法は、すべての活動的なライフステージに栄養を与え、ダニに病原菌を感染させ、ダニを抗生物質の複数投与量にさらすために使用されてきました19,20。示されている人工膜供給法は肩甲骨多角形菌用ですが、この方法は膜の厚さをわずかに変更するだけで他の種のダニにも容易に適応できます。
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Protocol
1.ティック膜チャンバーの準備
- アームスタンドのガラス面やセラミックコーティングされた金属ベースなどの平らな非多孔質の表面を70%エタノールで拭き取って準備し、次にラップの単層で覆い、ラップが平らで気泡やしわがないことを確認します( 図1Aを参照)。
- 準備した面に100%レーヨンレンズのクリーニングペーパーをテープで留めます。用紙の4面すべてにテープで平らで少しぴんと張っていることを確認します。レンズペーパーの4 x 6 の 2 つのピースは、手順 1.3 で説明したボリュームを使用して膜にすることができます。
注意: これは、最大12の供給チャンバーを作成するのに十分です( 図1Bを参照)。メンブレンが幼虫ダニ用である場合は、レンズクリーニングペーパーの代わりに雲龍紙を使用してください。 - シリコンキットの各部分5 mLを使い捨て容器に測定し、1.5 mLのヘキサンを加える前に2つの液体を軽く混合することにより、硬度00〜10のシリコーン混合物を調製します。混合物が均質で完全に混合されるまで混合を続けます。
注:成虫ダニ用の膜を作る場合は、硬度00〜50のシリコーンを使用してください。 - 小さなスキージを使用して、シリコンミックスをレンズペーパー上に分散させます。1分間放置して、シリコンがレンズペーパーに染み込んでいることを確認します。少量の下向きの圧力を使用して、スキージで余分なシリコーンを側面に着実にこすり落とします。スキージで2回目のパスを実行し、下向きの圧力をかけずに、シリコーンのラインを取り除き、滑らかな層を生成します。
注:手順のこのステップでは、各ライフステージ(成虫:150〜200 μm、ニンフ:90〜120 μm、幼虫:80〜100 μm)に最適な厚さの膜を生成するために、ある程度の練習が必要になる場合があります。より厚い膜(ライフステージの供給許容範囲内)は、通常、チャンバー内の結露を減らし、膜の自己修復特性を改善することにより、より良い結果を生み出します。 - 幼虫の場合のみ、給餌チャンバーの上部をフルオンフルオロポリマー樹脂(PTFE-30)に数回浸し、アプリケーション間で乾燥させて一貫した層を生成します。
注意: Fluonを適用すると、焦げ付き防止の調理鍋に似たフルオロポリマー樹脂の焦げ付き防止層が形成されます。これにより、チャンバー21の上部に登る幼虫の数が減少します。 - 次のステップに進む前に、閉じた化学薬品やバイオセーフティキャビネットなどのほこりのない環境でメンブレンを少なくとも24時間硬化させたままにします。シリコーンを乾燥させた後のレーヨンレンズ紙の外観については、 図1C を参照してください。
- シリコーンミックスAとBを等量混合してチャンバーを膜に取り付けるために、30硬度のシリコーン混合物を準備します。
- ポリカーボネートチャンバーを約4分の1インチ(6 mm)のシリコーン混合物に浸し、テープが重ならないように注意しながらメンブレンシートの上に置きます(図1D)。
- 次の手順に進む前に、取り付けたシリコーンを少なくとも24時間硬化させます。
- メスを使用して、取り付けられた各チャンバーの周りのメンブレンを慎重に切断し、側面をあまりこすらずに6ウェルプレートのウェルにスムーズに収まるように端をトリミングします(図1E)。膜の接着性を最大化するために、チャンバーの外側に十分な材料を確保してください。
注意: 残っている外装材が多すぎる場合、6ウェルプレートからチャンバーを繰り返し取り外すと、メンブレンがチャンバーから部分的に剥がれる可能性があります。剥離した膜の修復については、セクション5で説明します。 - メンブレンシートの各コーナーと中央から残ったメンブレンの小片を切り取ります。各部分からラップを取り外します。マイクロメーターでピースを測定し、平均膜の厚さを決定します。
注意: 膜の厚さがライフステージの許容範囲内にない場合は(ステップ1.4を参照)、膜を廃棄して作り直す必要があります。雲龍紙の厚さは、繊維の太いストランドと薄い領域のために非常に変動します。この特性により、幼虫は最適な厚さの領域を見つけることができますが、実際の膜の厚さを決定することは困難です。 - チャンバーごとに1つのOリングとともに供給チャンバーをガラスビーカーに入れ、121°Cで少なくとも20分間オートクレーブ滅菌します。チャンバーを使用する前に、チャンバーを冷ましてください。
2. ティックフィードの設定
- ランプを準備しますamp ライトが16時間点灯してから8時間消灯するように部屋。ランプを使用する場合は、次のステップの水浴が8時間暗闇の中にあることを確認してください。
- 34°Cの水浴を設置し、6ウェルプレートがその中にわずかに浮かぶようにサポートを付けます。水浴に浸した小さなガラスビーカーを支柱として使用します。ダニの明暗サイクルを維持するために、水浴に透明なカバーを使用してください。必要に応じて、Tスタンドとラップを使用してカバーを作成します。汚染のリスクを減らすために、0.02%塩化ベンザルコニウムを水浴に加え、冷えた血液を温めるために別の水浴を36°Cに設定します。
- 事前に準備されたオートクレーブ処理されたメンブレンチャンバーを取り出し、チャンバーの周りにOリングを配置し(図1F)、各チャンバーにメンブレンを覆うのに十分な70%エタノールを入れます。6ウェルプレートウェルに5分間置いてから、チャンバーとメンブレンの間、およびメンブレン自体に漏れがないか探します。
注:膜が漏れている場合、エタノールは井戸の底に蓄積します。漏れのある膜は廃棄する必要があります。 - チャンバーからエタノールを空にし、バイオセーフティキャビネットまたは層流フード内で風乾させます。
注意: 周囲の湿度によっては、数分かかる場合があります。 - 待っている間、56°Cで40分間加熱することにより、血液中の補体を熱失活させます。機械的に除細された牛の血液に2 g / Lのグルコースを補給します。
- 膜が乾いたら、~20μLの食刺激剤をチャンバーの内側に塗布し、チャンバーを傾けて表面全体に広げます。ダニフラスから食覚剤を調製する手順については、セクション6を参照してください。
- 食刺激剤が乾くまで待ってから、ブラシまたは鉗子でダニをチャンバーに追加します。逃げないようにダニをチャンバーに移すときは、できるだけ早く作業してください。ダニを氷上のチューブに1〜2分間入れてから、ダニを移して逃げる能力を遅くします。ダニが移ったら、上部をパラフィルムで密封します。水浴からの熱がパラフィルムを裂ける可能性があるため、パラフィルムを伸ばしすぎないでください。
注:鉗子は幼虫と成虫のライフステージで最適に機能し、ブラシは幼虫のライフステージで最適に機能します。 - ウェル/チャンバーあたり5 mLの熱不活性化血液を円錐形のチューブに加え、36°Cに設定したウォーターバスに入れます。 ダニをさらす前に、冷やした血液を少なくとも室温まで上げてください。チャンバーの取り扱いを容易にするために、6ウェルプレートごとに4つのチャンバーを確保してください。プレートあたりのチャンバーを増やすことは避けるべきですが、水浴のサイズによっては、より多くのプレートを使用できます。
- 血液5 mLあたり5 μLの3 mM ATPと50 μLの100倍ストックのペニシリン/ストレプトマイシン/真菌をチューブに追加します。
- 4.5 mLの血液を6ウェルプレートのウェルに移し、チャンバーをウェルにそっと置き、膜が血液中に収まるが側面の血液濃度がウェルを上回らないようにチャンバーのOリングの高さを調整します。血液と膜の間に気泡が形成されないように、ウェルを斜めに血液に入れます。
注:完成したプレートを 図2に示します。 - 6ウェルプレートの蓋を給餌チャンバーの上に置きます。次いで、チャンバー付き6ウェルプレートを用意した34°Cの水浴に入れ、蓋を閉めた。
注意: 上部の蓋は、凝縮水がパラフィルムに接触してウェル内の血液を希釈するのを防ぐのに役立ちます。
3. 12時間ごとに血液を交換することにより、摂食ダニを維持する
- ウェルあたり5 mLの熱不活性化血液をチューブに分注し、36°Cの水浴で温めます。ATPとペニシリン/ストレプトマイシン/真菌ゾンを同時に水浴で解凍します。
- ウェルあたり5 μLの3 mM ATPと50 μLの100倍ストックのペニシリン/ストレプトマイシン/真菌を血液チューブに追加します。4.5 mLの血液を新鮮な6ウェルプレートのウェルに移します。
- ダニチャンバー付きの6ウェルプレートを水浴から取り出します。チャンバーをウェルから取り出し、チャンバーとメンブレンの外側を10 mLの滅菌1x PBSですすぎ、血液を除去します。
- オートクレーブ処理したろ紙を使用して、メンブレンとチャンバーを軽くたたいて乾かし、余分なPBSを取り除きます。チャンバー上部のパラフィルムを交換してください。チャンバー内に結露が多い場合は、オートクレーブ滅菌したろ紙で濡れた部分を軽くたたいてから、新鮮なパラフィルムで密封してください。
- ティックチャンバーを新鮮な血液を入れた新しい6ウェルプレートに入れ、必要に応じてOリングの高さを調整します。プレート上のチャンバーごとに手順3.3〜3.5を繰り返します。6ウェルプレートの蓋をチャンバーの上部に置きます。新しい6ウェルプレートを34°Cの水浴に戻します。
- ダニフィードが終了するまで、12時間ごとに手順3.1〜3.5を繰り返します。ダニが充血したときに膜から自然に剥がれるのを待つか、取り付けたままソフトタッチピンセットで膜からそっと取り除き、部分的に充血したダニを取得します。
4.抗真菌治療
注意: 真菌の成長が膜に見られる場合にのみ実行してください。摂食が十分な期間であれば、真菌は膜の血液側に形成される可能性があります。真菌汚染の最初の兆候は、膜上に見える凝固血液の小さな(1〜3 mm)フレークです。真菌汚染が認められた場合、抗真菌処理は実験の期間を延長し、充血の成功を改善することができます。
- 1mLあたり10,000 Uのナイスタチンを蒸留水に溶解し、供給チャンバーあたり5 mLにします。0.1μmシリンジフィルターでフィルター滅菌します。
- 新しい6ウェルプレートのウェルあたり5 mLのナイスタチン溶液を、各供給チャンバーに1ウェルずつ加えます。
- PBSですすいだチャンバーを溶液に入れます。10分間座ってみましょう。
- 新鮮な血液に戻す前に、処理した膜をPBSですすいでください。
- 実験が完了するまで、2〜3日ごとに(真菌汚染の程度に応じて)抗真菌治療を繰り返します。
5.シアノアクリレート接着剤による剥離膜の再接着
注意: 膜の剥離に気付いた場合にのみ実行してください。
- メンブレンは、特に6ウェルプレートからの取り外し中に、供給チャンバーから部分的に剥離する場合があります。このような場合は、血液の膜をPBSですすいでください。
- 患部をやさしく乾かします。完全に乾燥している必要はありませんが、湿気があると接着剤の硬化が速くなります。
注意: メンブレンを再接着すると作業時間が制限されますが、剥離サイズによっては、より速い硬化時間が望ましい場合があります。 - 膜がチャンバーから引き離された隙間に少量のシアノアクリレート接着剤を絞ります。接着剤が固まるまで、~2分間所定の位置に保持します。
- チャンバーを6ウェルプレートの血液に戻します。
6.食覚剤を作る
注意: フィードの終了時、またはメンブレンフィードの開始前に実行してください。
- 以前の膜飼料または別のダニの餌源からダニの糞を収集します。食覚剤を作る前に糞便を-20°Cで保存してください。ダニの糞のペレットを粉砕し、水1 mLあたり0.1 gを混合します。1 mMトリペプチド還元グルタチオンを加え、溶解し、ボルテックスによって完全に混合します。
- 0.1μmシリンジフィルターでフィルター滅菌します。
- 必要になるまで-20°Cで凍結します。
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Representative Results
給餌の成功は、部分的または完全な充血が望まれるかどうかによって異なります。正常に給餌されたI.肩甲骨は、成虫の場合はガンメタルグレーの色合いに変わり、膜から自然に剥離します。しかしながら、それらが少なくともエンドウ豆サイズであるならば、それらは給餌を終えるときに膜から剥離され得る。I. scapularisの未熟な段階では、完全に充血したダニのサイズはさまざまであり、成虫とは異なり、色の変化を示さないため、ダニが完全に充血しているかどうかを判断するには剥離が最良の方法です。幼虫I.肩甲骨が飼料中にどのように見えるかの例については、図3を参照してください。成虫I.肩甲骨ダニは、膜から剥離し始めるまで、付着から1週間以上かかります。幼虫は付着後約5日で剥離することが多く、幼虫は最初の付着後~3〜4日で剥離を開始する。1日2回の血液変化を維持したい限り、そしてカビが抗真菌治療で制御できる範囲を超えて成長し始めていない限り、飼料は継続することができます。部分的に充血したダニは手動で膜から切り離さなければならない。
未熟ダニ(幼虫およびニンフ)は、ほとんどの場合、次のライフステージにうまく脱皮し、十分に充血し、十分に大きいサイズであると仮定すると、飼料脱皮の終わりに手動で膜から剥離されるものでさえも。充血中にガンメタルグレーに変わったメスのダニは、通常、卵を産むことに成功します。しかし、自然の摂食手段とは異なり、膜で飼育された充血した雌は、自然に飼育された雌よりも卵塊が小さく、サイズが小さくなります。 I. scapularis 幼虫に幼虫を卵から幼虫の充血および脱皮を通して与えた最近の実験の結果は、 表1に見ることができる。最初の幼虫の飼料から得られたニンフは、脱皮の2ヶ月後に給餌された。ただし、この実験では、シカの臓器ホモジネートが血液に添加されており、ダニの摂食の成功に悪影響を及ぼした可能性があることに注意することが重要です。
別の実験では、60匹の雌と60匹の 雄のI.肩甲骨マ ダニを4つの給餌室(チャンバーあたり30匹の性一致したダニ)に入れ、雌のダニを補充するまで給餌させました。これらのダニは、ハンターが殺した鹿から集められた充血した雌の子孫として始まりました。平均卵質量重量と範囲は、充血成功数(充血後および剥離後に産卵した雌の数)に加えて、 表1に見ることができます。 I. scapularis の卵質量重量は文献では非常に変動していますが、ミネソタ州のハンターが殺した鹿から以前に収集されたダニは、平均重量77 mg(19-147 mg)の卵塊を生成しました22。ダニの死亡率は、人工膜供給システムを使用して低いです。付着して餌を与えないダニは、ほとんどがこのプロセスを生き延び、生存者とのさらなる膜摂食実験を試みる可能性を高めます。
この方法は、従来のげっ歯類感染法を使用できないA.ファゴサイトフィラムバリアント-1を含むさまざまなダニ媒介病原体でニンファルI.肩甲骨を感染させるために使用されてきました7。細菌によるマダニの感染はqPCRで確認され、摂食に成功したすべての幼虫マダニは摂食後に陽性でしたが、細菌種に応じて、感染は経常的に持続する場合と持続しない19。この方法は、雌のI.肩甲骨シプロフロキサシンの給餌にも利用されています。正常に給餌されたマダニは、注入されたダニ20に匹敵する細菌共生レベルのノックダウンを示した。
図1:ダニ膜チャンバー 。 (A)セラミックコーティングされたスタンドベースはラップで覆われています。(B)プラスチックで包まれたベースにテープで留められたレンズペーパー。青い長方形は、パネル Cで使用されるスキージです。(C)シリコーンを含浸させた後のレンズペーパー。(d)シリコーンレーヨン膜に取り付けられたチャンバー。レンズ紙シートの各4インチx6は、6つのチャンバーを収容できます。(E)シリコーンレーヨン膜を備えた完成したチャンバー。剥離したシリコーンレーヨン膜を右側に示します。(F)組み立てられた完成したチャンバーで、Oリングが固定されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ティックフィードの設定 成虫 I. scapularis を含む4つのチャンバーのセットが、すべてがセットアップされた後、それが水浴中に入れられる前にどのように見えるかの例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:部分的に充血した Ixodes scapularis ニンフを含む進行中の飼料。 付着部位の周りの黒または茶色の点(たとえば、ラベルAを参照)は、食刺激剤を作るために飼料中および飼料後に収集できるフラスです。部分的に充血した I.肩甲骨ニン フが膜に付着しているのが見られます(ラベルBを参照)。充血した幼虫の脱皮の殻はラベルCで見ることができます。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 開始ティック数 | 正常に充血したティックの数 | 卵質量平均質量(mg単位)(範囲) | |
| 幼生 | 2つの孵化した卵塊 | 150 | 該当なし |
| ニンフ | 150 | 24 | 該当なし |
| 成人女性 | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
表1:充血数と卵質量重量。 幼虫および幼虫の充血実験条件では、このプロトコルで使用されるサプリメントに加えて、シカ器官ホモジネートが血液に添加されました。成体雌充血実験条件は、上記のプロトコールに記載の通りとした。成功した充血は、次のライフステージへの脱皮に成功した充血したダニ、または産卵に成功した充血した雌のいずれかとして定義されました。
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Discussion
ダニの人工膜給餌は、様々な実験手順に有用なツールを提供するが、すべての用途において動物給餌に取って代わる可能性は低い。動物の餌を与えずにすべてのライフステージでダニの大きなコロニーを維持することは、一般的に受け入れられません。代わりに、人工給餌システムは、モデル宿主によってサポートされていない病原体でダニを感染させる、単純化された給餌環境で化合物または微生物の制御された投与量がダニに与える影響を評価する、または実験室で容易に入手できない宿主動物に依存するダニの小さなコロニーを飼育するなどの他の目的に価値があります8、 10,11,23,24,25。従来の動物給餌方法と比較して、人工膜給餌は労働集約的であり、課題を提示します15,24。これらの理由から、人工膜給餌は従来の動物ベースの給餌方法に代わるものではなく、代わりに従来の動物給餌では不可能な実験を可能にします。
給餌室とダニのコロニーの両方で衛生状態を維持することは、真菌や細菌の汚染を避けるために不可欠です。ただし、人工栄養を使用してダニを病原体にさらす場合は、病原体を殺すことを避けるために、ペニシリン/ストレプトマイシン/真菌ゾーン(P / S / F)サプリメントを血液から避ける必要があります。血中のシプロフロキサシンへのダニ曝露は、F1子孫のサブセットからI.肩甲骨の卵巣内部共生生物であるリケッチア・ブフネリを完全に排除することができますが、血液への定期的なP / S / F添加はこの効果がありません20。経卵巣病原体感染研究はこのシステムを使用して実施されなかったが、抗生物質曝露実験と対照実験では充血した雌の繁殖力に変化は見られなかった。ダニの摂食と充血の迅速な開始は、真菌汚染に関連する問題の多くを回避します。このため、幼虫や幼虫のダニは給餌時間が短いため、システムはより簡単に機能する傾向があります。ナイスタチンなどの抗真菌剤で汚染された膜を定期的に処理すると、充血に利用できる時間を数日延長できます。餌をやりたがるのに十分な長さの間脱皮されてきたダニを使用することも重要です。幼虫は、卵塊のすべての幼虫が出現を完了してから2週間後に準備ができていますが、ニンフと成虫は、脱皮後少なくとも10週間で使用すると、よりうまくいきます。
この方法は、実験動物を使用した場合と同等のダニの摂食成功を示しており、通常、雌の30%〜50%、幼虫の約50%が充血を完了し、実験用ウサギまたはマウスまたはハムスターを給餌したニンフを給餌した成虫の充血の成功に匹敵します19。同様に、人工栄養チャンバーを使用した他の研究では、肩甲骨の雌では45%の充血率、ニンフでは72%の摂食率が報告されています10,18。一方、人工膜を介して給餌されたIxodes ricinusの雌とニンフでは、充血率はそれぞれ71%と58%でした25。したがって、結果は、使用中のシステムと調査されたダニ種に応じて変動する可能性があります。
膜の厚さは、給餌の成功の重要な要素です。薄い膜は、ダニのプロービングと取り付けによって生成された小さな穴の周りを密閉することができません。供給が始まった後、より多くの水分がチャンバーに入り込み、それが湿った状態、液化およびそれに続くフラスの再乾燥、およびカビにつながる可能性があります。したがって、供給されるダニ種とライフステージのハイポストームの長さによって許容できる最大厚さで膜を製造することが重要です(プロトコルステップ1.1〜1.4を参照)。肩甲骨菌と皮膚動脈の幼虫は厚さ90μmから120μmの膜を食べますが、成虫は200μm近くの厚さまでの膜を食べます。成虫の肩甲骨下頭筋の長さは500μmですが、幼虫と幼虫の小柱の長さは~100μmで、わずかに厚い膜を貫通するのに十分であることが証明されています15,26。レーヨンレンズ紙の厚さは平均~50μmで、レーヨンレンズ紙から作られた膜の厚さは最低50μmです。ただし、前述のように、膜が厚いほど良い結果が得られます。幼虫の摂食膜は、非常に軽い雲龍紙(10 g / m3)を使用して、厚さ80〜100 μmでうまく機能します。この不規則な桑の紙は、場所によって非常に薄い膜をサポートする比較的太い繊維でひもで締められており、十分な幼虫の付着部位を可能にします。
推奨される膜の厚さとチャンバーサイズに基づいて、成体飼料中の雌の数を最大20雌に制限するのが最善です(ティックはプロトコルステップ2.7でチャンバーに配置されます)。ダニは非常に密接に付着する傾向があり、局所領域の膜の完全性を損ない、漏れのリスクを高め、摂食速度を低下させる可能性があるため、より多くの雌が付着部位を過密にするリスクがあります。幼虫ダニの場合、最大数ははるかに多く、チャンバーあたり50匹のニンフを供給しても、重大な有害な影響は認められません。個々の幼虫を数えることは合理的ではなく、過密の問題は見られなかったので、セットアップを容易にするために、チャンバーごとに半分から全卵の質量が推奨されます。全卵塊は~1,000匹以上の幼虫で構成され、飼料の過程で数十から~200匹の充血した幼虫が単一の卵塊から脱落する可能性があります。さらに、餌を与えない幼虫のダニは死なない傾向があり、後の餌のために再収容される可能性があります。
供給チャンバーの製造には他のプラスチックが使用されており、その中でポリカーボネートが最も耐久性があり、非反応性であると判断されています。アクリルなどの他のプラスチックは洗浄液に敏感であり、特にチューブの切断端でひび割れや破損を引き起こす可能性があります。ポリカーボネートは、漂白剤、エタノール、オートクレーブ、および紫外線滅菌への暴露によく耐えます。
チャンバー内のダニは、下の温められた血液の熱刺激のために最終的に噛み付き、膜に付着する可能性がありますが、化学食刺激剤の形での追加刺激は、このプロセスをスピードアップするのに役立ちます(レシピについては、プロトコルステップ6を参照してください)。この研究では、水に溶解したダニの糞を使用することは、-20°Cで長期間保存できるため理想的です。ダニの糞は後続の飼料から収集できるため、それらは簡単に再生可能です。当然のことながら、最初の膜飼料は、ダニ糞抽出物の提案された食刺激剤にアクセスできない可能性があり、将来の飼料のためにそれを生産するのに役立つようにそれなしで実行することができます。さらに、代替の食刺激剤を使用することができ、他の研究では、毛髪または毛髪抽出物などの異なる化学的または機械的刺激で成功している15,24。
人工膜給餌は、ダニおよびダニ媒介性病原体生物学に取り組む研究者に追加のツールを提供します。手頃な価格でシンプルですが、労働集約的であり、目的のアプリケーションとダニの種/ライフステージを最適化するために、いくつかの予備テストが必要になる可能性があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
- Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
- Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
- Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
- Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
- Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
- Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
- Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
- Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
- Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
- Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
- Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
- Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
- Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
- Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
- Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
- González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
- Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
