Summary
여기에 제시된 것은 다양한 진드기 수명 단계의 부분적 또는 전체 충혈을 허용하기 위해 인공 막 시스템을 통해 시험관 내에서 진드기를 혈액으로 공급하는 방법입니다.
Abstract
진드기 및 관련 질병은 공중 보건 및 수의학 부담으로 인해 중요한 연구 주제입니다. 그러나 연구 및 사육 중 진드기의 먹이 요구 사항은 실험 질문이나 실험실에서 진드기 및 관련 병원체를 연구하는 능력을 제한 할 수 있습니다. 인공 막 사료 공급 시스템은 이러한 문제를 줄이고 전통적인 동물 사료 공급 시스템으로는 불가능했을 수있는 새로운 연구 길을 열 수 있습니다. 이 연구는 모든 Ixodes 견갑골 수명 단계에서 공급 및 충혈 성공을 위해 정제 된 인공 막 공급 시스템을 설명합니다. 더욱이, 본 연구에서 기술된 인공 막 공급 시스템은 원하는 막 두께의 간단한 정제를 통해 다른 진드기 종과 함께 사용하도록 변형될 수 있다. 인공 막 공급 시스템의 이점은 시스템의 노동 집약도, 수유 성공에 영향을 미칠 수있는 추가 환경 요인, 진드기의 새로운 종 및 생활 단계에 대한 기술을 개선해야 할 필요성에 의해 상쇄됩니다.
Introduction
진드기 매개 질병은 전 세계 인간과 동물의 건강에 큰 영향을 미치며 2004년부터 2016년까지 미국에서 발생한 모든 매개체 관련 질병의 2/3 이상을 차지합니다1. 또한 최근 몇 년 동안 사례 수가 증가하고 있으며 더 많은 사람과 가축이 진드기 및 관련 질병의 영향을 받고 있습니다 2,3. 사례 수의 증가 추세에는 여러 가지 원인이있을 수 있지만 기후 변화는 중요한 요소입니다 3,4. 진드기 매개 질병 사례의 지속적인 증가는 진드기와 진드기가 전염시키는 병원체 간의 관계를 조사하기 위한 새로운 도구를 개발해야 할 필요성을 강조합니다.
진드기는 먹이를 먹는 동안 생리학 및 유전자 발현의 변화를 겪고 이러한 변화가 병원체 전파에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있습니다 5,6. 특히 설치류 모델이 특정 병원체에 감염되기 쉽지 않은 상황에서 동물 모델을 사용하여 병원체 전파 및 획득에 대한 전체 및 부분 섭식의 영향을 조사하는 연구를 수행하는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어, Anaplasma phagocytophilum Variant-1 균주는 Ixodes scapularis와 사슴 사이에서 자연적으로 전염되지만 마우스를 감염시킬 수 없으므로 실험실7에서 진드기 감염을 복잡하게 만듭니다. 인공 사료 공급 시스템은 또한 전염 또는 감염을 억제하는 유전자 결실을 갖는 형질 전환 돌연변이의 사용을 통해 Borrelia burgdorferi와 같은 병원체를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다8. 인공 수유 시스템을 사용하면 감염이나 전염이 진드기 측에서만 발생하도록함으로써 연구자가 유전자의 역할을 분리하여 그러한 연구를 혼란스럽게 할 수있는 숙주 반응을 분리하는 데 도움이됩니다.
유사하게, 질병 및 동물 전염과 관련된 진드기의 일부 생활 단계는 일반적인 실험실 모델 종을 먹도록 유도되지 않을 수 있습니다. 예를 들어, Ixodes 견갑골 암컷은 더 큰 동물, 일반적으로 토끼9를 먹여야합니다. 실험실 실험을 위해 종종 접근 할 수 있지만, 토끼를 사용하기위한 관리 및 축산 요구 사항은 작은 설치류의 요구 사항을 초과하며 일부 실험실에서는 금지 될 수 있습니다. 다른 진드기 종, 특히 수의학 우려 종은 대부분의 실험실에서 사용하기에 실용적이지 않은 소나 기타 큰 동물에게 먹여야 합니다. 인공 막 공급과 같은 체외 수유 및 감염 방법은 크거나 이국적인 숙주 동물을 사용하는 대안을 제공합니다.
또한 인공 사료 공급 시스템을 사용하면 전통적인 동물 사료 공급 방법으로는 불가능할 수있는 특정 분석이 가능합니다. 그러한 예 중 하나는 혈액 공급원을 공급 메커니즘으로부터 분리함으로써, 상이한 숙주의 혈액이 B. burgdorferi 전달에서 가질 수있는 역할의 검사가 가능해진다10. 숙주 혈액과 숙주 면역 반응이없는 경우 혈액 자체가하는 역할에 대한 이러한 검사는 병원체 전파주기를 이해하는 데 중요한 요소이며 인공 공급 시스템이 답을 도울 수있는 요소입니다11. 또한 숙주에서 전염 성공 및 확립을 조사하는 대신 사료 공급 중 병원체의 정확한 전달 수를 정량화하는 것이 가능해집니다 8,12.
딱딱한 진드기를 위해 만들어진 최초의 인공 먹이 막 중 일부는 1950 년대와 1960 년대에 동물 가죽이나 동물 유래 막으로 만들어졌습니다13,14. 이러한 멤브레인의 생물학적 특성으로 인해 새로운 멤브레인의 생산과 유통 기한에 문제가있었습니다. 1990 년대에는 실리콘 함침15,16으로 그물, 종이 또는 직물의 뒷면을 사용하는 완전 인공 멤브레인이 개발되었습니다. 실리콘은 물리적 특성이 피부의 신축성과 약간의 점착성과 생체 고유의 특성을 모방하기 때문에 이상적이었습니다. 이를 바탕으로 이 기술의 기반이 된 Krober와 Guerin은 I. ricinus17의 인공 공급을 위한 실리콘 함침 레이온 막 공급 기술을 설명했습니다.
밀접하게 관련된 종인 I. scapularis에 대한 방법의 개선은 막 함침에 사용되는 실리콘의 경도, 막 생산을위한 제조법, 챔버의 치수 및 부착 자극제에 현저한 차이를 가져 왔습니다. 이 연구에서보고 된 개선은 I. 견갑골에 사용하기 위해 Krober 및 Guerin을 기반으로 한 실리콘 기반 멤브레인을 개발 한 Andrade et al.이보고 한 것과 유사한 막 특성을 가져 왔지만, 실리콘 함침 단계에는 차이가 있으며, 이는 I. scapularis15의 미성숙 수명 단계에이 프로토콜을 활용할 수있는 유연성을 허용합니다. 18. 이 연구에서는 또한 이 방법의 반복 사용을 기반으로 한 추가 및 기술 변경, 성공적인 피드를 초래하는 모범 사례 및 발생할 수 있는 문제 해결에 대해 설명합니다. 이 방법은 모든 활성 생활 단계를 먹이고, 진드기를 병원성 박테리아로 감염시키고, 진드기를 여러 용량의 항생제19,20에 노출시키는 데 사용되었습니다. 표시된 인공 막 공급 방법은 I. 견갑골,이 방법은 막 두께를 약간 수정하면 다른 진드기 종에 쉽게 적용 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 진드기 막 챔버 준비
- 유리 평면 또는 암 스탠드의 세라믹 코팅 금속베이스와 같은 평평하고 비 다공성 인 표면을 70 % 에탄올로 닦아서 준비한 다음 플라스틱 랩의 단일 층으로 덮어 플라스틱 랩이 평평하고 기포 나 주름이 없는지 확인하십시오 ( 그림 1A 참조).
- 준비된 표면에 100% 레이온 렌즈 청소지를 테이프로 붙입니다. 용지의 네 면 모두에 테이프로 평평하고 약간 팽팽한지 확인합니다. 렌즈 용지 4인치 x 6인치 두 장을 1.3단계에서 설명한 부피를 사용하여 멤브레인으로 만들 수 있습니다.
알림: 이것은 최대 12개의 공급 챔버를 구성하기에 충분합니다( 그림 1B 참조). 멤브레인이 애벌레 진드기 용인 경우 렌즈 청소용 용지 대신 운류 종이를 사용하십시오. - 일회용 용기에 실리콘 키트의 각 부분 5mL를 측정하여 00-10 경도 실리콘 혼합물을 준비하고 두 액체를 가볍게 혼합한 후 1.5mL의 헥산을 추가합니다. 혼합물이 균질하고 완전히 혼합 될 때까지 계속 혼합하십시오.
알림: 성인 진드기 용 멤브레인을 만드는 경우 00-50 경도 실리콘을 사용하십시오. - 작은 스퀴지를 사용하여 렌즈 용지 위에 실리콘 혼합물을 분배하십시오. 실리콘이 렌즈 용지에 스며들었는지 확인하기 위해 1분 동안 그대로 두십시오. 소량의 하향 압력을 사용하여 스퀴지로 과도한 실리콘을 꾸준히 긁어냅니다. 아래쪽 압력을 가하지 않고 스퀴지로 두 번째 패스를 수행하여 실리콘 라인을 제거하고 매끄러운 층을 생성합니다.
참고 : 절차의이 단계는 각 수명 단계 (성인 : 150-200 μm, 님프 : 90-120 μm, 유충 : 80-100 μm)에 대해 최적의 두께의 멤브레인을 생산하기 위해 약간의 연습이 필요할 수 있습니다. 더 두꺼운 멤브레인(수명 단계의 공급 허용 오차 내)은 일반적으로 챔버의 응축을 줄이고 멤브레인의 자가 치유 특성을 개선하여 더 나은 결과를 생성합니다. - 유충의 경우에만 공급 챔버 상단을 Fluon 불소 중합체 수지(PTFE-30)에 여러 번 담그면 적용 사이에 건조되어 일관된 층을 생성할 수 있습니다.
알림: Fluon을 적용하면 붙지 않는 요리 팬과 유사한 불소 중합체 수지의 붙지 않는 층이 형성됩니다. 이것은 챔버(21)의 상단으로 올라가는 유충의 수를 감소시킬 것이다. - 다음 단계로 넘어가기 전에 밀폐된 화학 물질 또는 생물안전 캐비닛과 같은 먼지가 없는 환경에서 멤브레인을 최소 24시간 동안 경화되도록 두십시오. 실리콘이 건조된 후 레이온 렌즈 용지가 어떻게 보이는지는 그림 1C 를 참조하십시오.
- 실리콘 혼합물 A 및 B의 동일한 부분을 혼합하여 멤브레인에 챔버를 부착하기 위해 30-경도 실리콘 혼합물을 준비합니다.
- 폴리카보네이트 챔버를 실리콘 혼합물에 약 6mm(1/4인치) 정도 담근 다음 테이프가 겹치지 않도록 주의하면서 멤브레인 시트에 놓습니다(그림 1D).
- 부착된 실리콘이 다음 단계로 이동하기 전에 최소 24시간 동안 경화되도록 합니다.
- 메스를 사용하여 부착된 각 챔버 주변의 멤브레인을 조심스럽게 자르고 측면을 많이 긁지 않고 6웰 플레이트의 웰에 부드럽게 맞도록 가장자리를 자릅니다(그림 1E). 멤브레인의 접착력을 최대화하기 위해 챔버 외부에 충분한 재료를 허용하십시오.
알림: 외부 재료가 너무 많이 남아 있는 경우 6웰 플레이트에서 챔버를 반복적으로 제거하면 멤브레인이 챔버에서 부분적으로 분리될 수 있습니다. 분리 된 멤브레인 수리는 섹션 5에 설명되어 있습니다. - 멤브레인 시트의 각 모서리와 중앙에서 남은 멤브레인의 작은 조각을 자릅니다. 각 조각에서 플라스틱 랩을 제거하십시오. 마이크로 미터로 조각을 측정하여 평균 멤브레인 두께를 결정하십시오.
알림: 멤브레인 두께가 수명 단계의 허용 오차 범위에 속하지 않으면 (1.4 단계 참조) 멤브레인을 폐기하고 다시 만들어야합니다. Unryu 종이 두께는 두꺼운 섬유 가닥과 얇은 영역으로 인해 매우 다양합니다. 이 특성을 통해 유충은 최적의 두께 영역을 찾을 수 있지만 실제 막 두께를 결정하기가 어렵습니다. - 챔버당 하나의 O-링과 함께 공급 챔버를 유리 비커에 넣고 121°C에서 최소 20분 동안 오토클레이브하여 멸균합니다. 챔버를 사용하기 전에 식히십시오.
2. 틱 피드 설정
- 조명이 16 시간 동안 켜진 다음 8 시간 동안 꺼지도록 램프 나 방을 준비하십시오. 램프를 사용하는 경우 다음 단계의 수조가 8시간 동안 어둠 속에 있는지 확인하십시오.
- 34 ° C에서 수조를 설치하고 지지대로 6 웰 플레이트가 약간 앉고 떠있을 수 있도록합니다. 수조에 가라앉은 작은 유리 비커를 지지대로 사용하십시오. 진드기에 대한 밝은 어두운주기를 유지하기 위해 수조에 투명한 덮개를 사용하십시오. 필요한 경우 T- 스탠드와 플라스틱 랩을 사용하여 덮개를 만드십시오. 오염 위험을 줄이려면 0.02 % 벤잘 코늄 클로라이드를 수조에 첨가하고 다른 수조를 36 ° C로 설정하여 냉장 혈액을 따뜻하게하십시오.
- 사전 준비된 오토클레이브 멤브레인 챔버를 꺼내 챔버 주위에 O-링을 배치한 다음(그림 1F) 멤브레인을 덮을 만큼 충분한 70% 에탄올로 각 챔버를 채웁니다. 6웰 플레이트 웰에 5분 동안 그대로 둔 다음 챔버와 멤브레인 사이 및 멤브레인 자체에 누출이 있는지 확인합니다.
알림: 멤브레인이 누출되면 에탄올이 우물 바닥에 축적됩니다. 새는 멤브레인은 폐기해야합니다. - 챔버에서 에탄올을 비운 다음 생물 안전 캐비닛 또는 층류 후드 내부에서 자연 건조시킵니다.
알림: 주변 습도에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. - 기다리는 동안 56 ° C에서 40 분 동안 가열하여 혈액의 보체를 열 비활성화시킵니다. 기계적으로 결핍된 소 혈액에 2 g/L 포도당을 보충하십시오.
- 멤브레인이 건조된 후 ~20μL의 식자극제를 챔버 내부에 적용한 다음 챔버를 기울여 표면 주위에 퍼뜨립니다. 진드기 frass에서 식균 자극제를 준비하는 것에 관한 지침은 섹션 6을 참조하십시오.
- 브러시 또는 집게로 진드기를 챔버에 추가하기 전에 식균 자극제가 마를 때까지 기다리십시오. 탈출을 방지하기 위해 진드기를 챔버로 옮길 때 가능한 한 빨리 작업하십시오. 진드기를 얼음 위의 튜브에 1-2 분 동안 넣은 다음 옮기기 전에 탈출 능력을 늦추십시오. 진드기가 옮겨진 후, 파라 필름으로 상단을 밀봉하십시오. 수조의 열로 인해 파라 필름이 찢어 질 수 있으므로 파라 필름을 과도하게 늘리지 마십시오.
알림: 집게는 님팔 및 성인 생활 단계에서 가장 잘 작동하고 브러시는 애벌레 생활 단계에서 가장 잘 작동합니다. - 웰/챔버당 열 불활성화 혈액 5mL를 원뿔형 튜브에 넣고 36°C로 설정된 수조에 넣습니다. 진드기를 노출시키기 전에 식힌 혈액을 적어도 실온으로 가져 오십시오. 챔버를 쉽게 취급할 수 있도록 6웰 플레이트당 4개의 챔버를 따로 두십시오. 플레이트 당 더 많은 챔버는 피해야하지만, 수조의 크기에 따라 더 많은 플레이트를 사용할 수 있습니다.
- 혈액 5mL당 3mM ATP 5μL와 페니실린/스트렙토마이신/곰팡이존 100배 재고 50μL를 튜브에 추가합니다.
- 4.5mL의 혈액을 6웰 플레이트의 웰에 옮긴 다음 챔버를 웰에 부드럽게 넣고 챔버의 O-링 높이를 조정하여 멤브레인이 혈액에 위치하지만 측면 주변의 혈액 농도가 웰을 넘지 않도록 합니다. 혈액과 막 사이에 기포가 형성되지 않도록 우물을 혈액에 비스듬히 놓습니다.
참고: 완성된 플레이트는 그림 2에 나와 있습니다. - 6 웰 플레이트의 뚜껑을 공급 챔버 위에 놓습니다. 그 후, 챔버가 있는 6-웰 플레이트를 준비된 34°C 수조에 넣고 뚜껑을 닫는다.
알림: 상단의 뚜껑은 응축수가 파라 필름과 접촉하여 우물의 혈액을 희석시키는 것을 막는 데 도움이됩니다.
3. 12 시간마다 혈액을 교체하여 먹이 진드기 유지
- 웰당 열 불활성화된 혈액 5mL를 튜브에 분취하고, 36°C 수조에서 예열한다. ATP와 페니실린/스트렙토마이신/곰팡이존을 수조에서 동시에 해동합니다.
- 웰당 5μL의 3mM ATP와 50μL의 100배 페니실린/스트렙토마이신/곰팡이존 재고를 혈액 튜브에 추가합니다. 4.5mL의 혈액을 신선한 6웰 플레이트의 웰에 옮깁니다.
- 수조에서 진드기 챔버가있는 6 웰 플레이트를 꺼냅니다. 웰로부터 챔버를 제거하고, 챔버 및 멤브레인의 외부를 멸균 1x PBS 10mL로 헹구어 혈액을 제거한다.
- 오토클레이브 여과지를 사용하여 멤브레인과 챔버를 부드럽게 두드려 건조시켜 과도한 PBS를 제거합니다. 챔버 상단의 파라 필름을 교체하십시오. 챔버 내부에 많은 응결이 있는 경우 새 파라필름으로 밀봉하기 전에 오토클레이브 여과지로 젖은 부분을 두드려 건조시킵니다.
- 진드기 챔버를 신선한 혈액이 있는 새 6웰 플레이트에 넣고 필요한 경우 O-링 높이를 조정합니다. 플레이트의 각 챔버에 대해 3.3-3.5단계를 반복합니다. 6웰 플레이트의 뚜껑을 챔버 상단 위에 놓습니다. 새로운 6-웰 플레이트를 34°C 수조로 다시 옮깁니다.
- 진드기 피드가 끝날 때까지 12 시간마다 3.1-3.5 단계를 반복하십시오. 진드기가 충혈되었을 때 진드기가 스스로 막에서 분리될 때까지 기다리거나 부분적으로 충혈된 진드기를 얻기 위해 부착된 상태에서 부드러운 터치 핀셋으로 막에서 부드럽게 제거합니다.
4. 항진균제
알림: 막에 곰팡이 성장이 보일 때만 수행하십시오. 곰팡이는 먹이가 충분한 지속 시간이면 막의 혈액 쪽에 형성 될 수 있습니다. 곰팡이 오염의 첫 번째 징후는 막에 보이는 응고 된 혈액의 작은 (1-3mm) 조각입니다. 곰팡이 오염이 발견되면 항진균 처리는 실험 기간을 연장하고 충혈 성공을 향상시킬 수 있습니다.
- 증류수 당 10,000 U nystatin을 증류수, 공급 챔버 당 5 mL에 용해시킨다. 0.1μm 주사기 필터로 필터 멸균합니다.
- 새 6웰 플레이트의 웰당 5mL의 나이스타틴 용액을 각 공급 챔버에 대해 하나의 웰에 추가합니다.
- PBS로 헹군 챔버를 용액에 넣습니다. 10분 동안 그대로 두십시오.
- 신선한 혈액에 다시 넣기 전에 PBS로 처리 된 막을 헹굽니다.
- 실험이 완료 될 때까지 2-3 일마다 (곰팡이 오염 정도에 따라 다름) 항진균 처리를 반복하십시오.
5. 시아 노 아크릴 레이트 접착제로 분리 된 멤브레인 재 접착
알림: 멤브레인 분리가 감지된 경우에만 수행하십시오.
- 멤브레인은 특히 6-웰 플레이트에서 제거하는 동안 공급 챔버에서 부분적으로 분리될 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 PBS로 혈액막을 헹굽니다.
- 감염된 부위를 부드럽게 말리십시오. 완벽하게 건조 할 필요는 없지만 습기가 있으면 접착제가 더 빨리 굳습니다.
알림: 멤브레인을 다시 접착하면 작업 시간이 제한되지만 분리 크기에 따라 더 빠른 경화 시간이 바람직할 수 있습니다. - 멤브레인이 챔버에서 당겨진 틈새에 소량의 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 짜냅니다. 접착제가 굳을 수 있도록 ~2분 동안 제자리에 고정합니다.
- 챔버를 6웰 플레이트의 혈액에 다시 넣습니다.
6. 식자극제 만들기
알림: 공급이 끝날 때 또는 멤브레인 공급이 시작되기 전에 수행하십시오.
- 이전의 막 사료 또는 다른 먹이 진드기 공급원에서 진드기 배설물을 수집하십시오. 식균 자극제를 만들기 전에 대변을 -20 ° C에 보관하십시오. 진드기 배설물의 펠릿을 부수고 물 1mL 당 0.1g을 섞는다. 1mM 트리펩타이드 환원 글루타티온을 넣고 용해하고 볼텍싱하여 완전히 혼합합니다.
- 0.1μm 주사기 필터로 필터 멸균합니다.
- 필요할 때까지 -20 °C에서 얼립니다.
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Representative Results
성공적인 수유는 부분 또는 전체 충혈이 필요한지 여부에 달려 있습니다. 성공적으로 공급 I. 견갑골은 성인을위한 건메탈 그레이의 그늘을 바꾸고 막에서 스스로 분리됩니다. 그러나 적어도 완두콩 크기 인 경우 먹이를 마칠 때 막에서 분리 될 수 있습니다. 미성숙 단계의 경우 I. 견갑골, 완전히 충혈 된 진드기의 크기는 다양하며 성인과 달리 색 변화를 나타내지 않기 때문에 진드기가 완전히 충혈되었는지 확인하는 가장 좋은 방법은 분리입니다. 님팔 I. 견갑골이 사료 공급 중에 어떻게 보일 수 있는지에 대한 예는 그림 3을 참조하십시오. 성인 I. 견갑골 진드기는 막에서 분리되기 시작할 때까지 부착 후 1 주일 이상 걸립니다. 님프는 종종 부착 후 약 5 일 후에 분리되고 유충은 첫 부착 후 ~ 3-4 일 후에 분리되기 시작합니다. 하루에 두 번 혈액 변화를 유지하기를 원하고 곰팡이가 항진균제가 통제 할 수있는 것 이상으로 자라기 시작하지 않는 한 사료는 계속 될 수 있습니다. 부분적으로 충혈 된 진드기는 멤브레인에서 수동으로 분리해야합니다.
스스로 막에서 분리되는 미성숙 진드기 (유충 및 님프)는 거의 항상 다음 생애 단계로 성공적으로 탈피하며, 충분히 충혈되어 충분히 크기가 크다고 가정하면 사료 털갈이가 끝날 때 막에서 수동으로 분리 된 진드기도 마찬가지입니다. 충혈 중에 건메탈 회색으로 변한 암컷 진드기는 일반적으로 성공적으로 알을 낳습니다. 그러나 자연적인 먹이 수단과 달리 막을 먹인 충혈 암컷은 더 작은 알 덩어리를 생산하고 자연적으로 동물을 먹인 암컷보다 크기가 작습니다. 님팔 충혈 및 탈피를 통해 알에서 I. scapularis 유충을 먹인 최근 실험 결과는 표 1에서 볼 수 있습니다. 초기 애벌레 사료에서 생성 된 님프는 탈피 후 2 개월 동안 먹이를 먹였습니다. 그러나 이 실험에는 사슴 기관 균질액이 혈액에 첨가되어 진드기 먹이 성공에 해로운 영향을 미쳤을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
또 다른 실험에서, 60 마리의 암컷과 60 마리의 수컷 I. 견갑골 진드기를 4 개의 먹이 챔버 (챔버 당 30 개의 성 일치 진드기)에 넣고 암컷 진드기를 배가 될 때까지 먹이도록 허용했다. 이 진드기는 사냥꾼이 죽인 사슴에서 수집 한 충혈 된 암컷의 자손으로 시작되었습니다. 평균 난자 질량 및 범위는 충혈 성공 횟수 (충혈 후 알을 낳은 암컷 수) 외에도 표 1에서 볼 수 있습니다. I. 견갑골의 알 질량 무게는 문헌에서 매우 다양하지만 이전에 미네소타에서 사냥꾼이 죽인 사슴에서 수집 한 진드기는 평균 체중이 77mg (19-147mg) 인 알 덩어리를 생성했습니다.22. 진드기 사망률은 인공 막 공급 시스템을 사용하여 낮습니다. 부착되지 않고 먹이를 먹지 않는 진드기는 대부분 그 과정에서 살아남아 생존자들과 함께 추가 막 먹이 실험을 시도 할 가능성을 높입니다.
이 방법은 전통적인 설치류감염 방법을 사용할 수 없는 A. 식균 Variant-1을 포함한 다양한 진드기 매개 병원체로 님팔 I. 견갑골을 감염시키는 데 사용되었습니다7. 박테리아에 의한 진드기의 감염은 qPCR로 확인되었으며, 성공적으로 먹이를 먹은 모든 님팔 진드기는 박테리아 종에 따라 먹이 후 양성이었지만 감염은 경전적으로 지속되거나 지속되지 않을 것입니다19. 이 방법은 또한 암컷 I. 견갑골 시프로플록사신을 먹이기 위해 사용되었습니다. 성공적으로 공급된 진드기는 주입된 진드기20에 필적하는 박테리아 공생 수준의 녹다운을 보여주었습니다.
그림 1: 진드기막 챔버 . (A) 플라스틱 랩으로 덮인 세라믹 코팅 스탠드베이스. (B) 플라스틱 포장 베이스에 테이프로 붙인 렌즈 용지. 파란색 사각형은 패널 C에 사용된 스퀴지입니다. (C) 실리콘을 함침시킨 후 렌즈 용지. (D) 실리콘 레이온 막에 부착 된 챔버. 각 4인치 x 6인치 렌즈 용지 시트는 6개의 챔버를 수용할 수 있습니다. (E) 실리콘-레이온 막을 갖는 완성된 챔버. 분리 된 실리콘 레이온 멤브레인이 오른쪽에 표시됩니다. (F) O- 링이 고정 된 조립 된 완성 된 챔버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 틱 피드 설정. 성인 I. 견갑골이있는 4 개의 챔버 세트가 모든 것이 설정되고 수조에 놓이기 전에 어떻게 보일지에 대한 예입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 부분적으로 충혈 된 Ixodes 견갑골 님프가있는 지속적인 사료. 부착 부위 주변의 검은 색 또는 갈색 점 (예 : 라벨 A 참조)은 식균 자극제를 만들기 위해 사료 공급 중 및 후에 수집 할 수있는 프라스입니다. 부분적으로 충혈 된 I. 견갑골 님프가 막에 부착 된 것으로 보입니다 (라벨 B 참조). 충혈 된 유충 털갈이의 껍질은 레이블 C로 볼 수 있습니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시작 틱 수 | 성공적으로 충혈 된 진드기의 수 | 계란 질량 평균 질량(mg)(범위) | |
| 애벌레 | 부화 한 달걀 덩어리 2 개 | 150 | 해당 없음 |
| 님프 | 150 | 24 | 해당 없음 |
| 성인 여성 | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
표 1 : 진드기 충혈 수와 계란 질량 무게. 유충 및 님팔 충혈 실험 조건에서는 이 프로토콜에 사용된 보충제 외에 사슴 기관 균질액을 혈액에 첨가했습니다. 성체 여성 울혈 실험 조건은 상기 프로토콜에 기재된 바와 같았다. 성공적인 충혈은 다음 생애 단계로 성공적으로 탈피 한 충혈 된 진드기 또는 성공적으로 알을 낳은 충혈 된 암컷으로 정의되었습니다.
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Discussion
진드기의 인공 막 공급은 다양한 실험 절차에 유용한 도구를 제공하지만 모든 응용 분야에서 동물 사료를 대체 할 가능성은 없습니다. 동물 먹이없이 모든 생애 단계에서 진드기의 큰 식민지를 유지하는 것은 일반적으로지지 할 수 없습니다. 대신, 인공 사료 공급 시스템은 모델 숙주에 의해 지원되지 않는 병원체로 진드기를 감염시키거나, 단순화 된 사료 공급 환경에서 진드기에 대한 화합물 또는 미생물의 통제 된 투여 량의 영향을 평가하거나, 실험실에서 쉽게 이용할 수없는 숙주 동물에 의존하는 진드기의 작은 식민지를 사육하는 것과 같은 다른 목적에 유용합니다8, 10,11,23,24,25. 전통적인 동물 사료 공급 방법과 비교할 때 인공 막 사료 공급은 노동 집약적이며 도전 과제15,24를 제시합니다. 이러한 이유로 인공 막 사료 공급은 전통적인 동물 기반 사료 공급 방법을 대체하지 않으며 대신 전통적인 동물 사료 공급으로는 할 수없는 실험을 허용합니다.
먹이실과 진드기 군집 모두에서 위생 상태를 유지하는 것은 곰팡이 및 박테리아 오염을 방지하는 데 중요합니다. 그러나 진드기를 병원체에 노출시키기 위해 인공 먹이를 사용하는 경우 병원균을 죽이지 않도록 페니실린/스트렙토마이신/곰팡이존(P/S/F) 보충제를 혈액에서 피해야 합니다. 혈액에서 시프로플록사신에 진드기가 노출되면 F1 자손의 하위 집합에서 I. 견갑골의 난소 내공생체인 Rickettsia buchneri를 완전히 제거할 수 있지만 혈액에 일상적인 P/S/F를 추가하면 이러한 효과가 없습니다20. 경난소 병원체 전염 연구는 이 시스템을 사용하여 수행되지 않았지만 항생제 노출 대 대조군 실험에서 충혈된 암컷의 번식력에는 변화가 나타나지 않았습니다. 진드기의 먹이와 충혈의 신속한 시작은 곰팡이 오염과 관련된 많은 문제를 피합니다. 이러한 이유로이 시스템은 애벌레와 님팔 진드기가 먹이 시간이 짧기 때문에 더 쉽게 작동하는 경향이 있습니다. nystatin과 같은 항진균제로 오염 된 막을 주기적으로 처리하면 충혈에 사용할 수있는 시간이 며칠 연장 될 수 있습니다. 먹이를 먹기를 열망 할만큼 오랫동안 털갈이 된 진드기를 사용하는 것도 중요합니다. 유충은 알 덩어리의 모든 유충이 출현을 완료 한 후 2 주 후에 준비되지만, 님프와 성인은 탈피 후 최소 10 주 후에 사용하면 더 잘 먹습니다.
이 방법은 실험실 동물을 사용하는 것과 비슷한 진드기 먹이 성공을 보여 주었으며, 일반적으로 암컷의 30 % -50 %와 님팔 I. 견갑골의 약 50 %가 울혈을 완료했으며, 이는 실험실 토끼 또는 마우스 또는 햄스터를 먹인 님프를 먹인 성인의 충혈 성공과 유사합니다19. 유사하게, 인공 수유실을 사용한 다른 연구에서는 I. 견갑골 암컷의 경우 45%의 충혈률과 님프72의 경우 10,18%의 섭식률을 보고했습니다. 한편, 인공 막을 통해 먹이를 먹인 Ixodes ricinus 암컷과 님프의 경우 충혈 율은 각각 71 %와 58 %였습니다25. 따라서 결과는 사용중인 시스템과 조사 된 진드기 종에 따라 달라질 수 있습니다.
멤브레인 두께는 성공적인 공급에 중요한 요소입니다. 더 얇은 멤브레인은 진드기 프로빙 및 부착에 의해 생성 된 작은 구멍 주위를 밀봉 할 수 없습니다. 공급이 시작된 후 더 많은 수분이 챔버로 들어가 습한 상태, 액화 및 프라스 및 곰팡이의 재건조로 이어질 수 있습니다. 따라서 진드기 종과 공급되는 생애 단계의 하이포스토메 길이에 의해 견딜 수 있는 최대 두께로 막을 생산하는 것이 중요합니다(프로토콜 단계 1.1-1.4 참조). I. 견갑골과 Dermacentor variabilis의 님프는 90μm에서 120μm 두께의 막을 먹고 성인은 거의 200μm 두께의 막을 먹습니다. 성인 I. 견갑골 하이포스톰은 길이가 500μm인 반면, 님팔 및 유충 하이포스톰은 길이가 ~100μm로 약간 더 두꺼운 막(15,26)을 관통하기에 충분합니다. 레이온 렌즈 용지는 평균 두께가 ~ 50 μm이고 그것으로 만든 멤브레인의 두께는 최소 50 μm입니다. 그러나 위에서 언급했듯이 두꺼운 멤브레인은 더 나은 결과를 생성합니다. 유충 먹이 막은 매우 가벼운 운류 종이 (10g / m3)를 사용하여 두께가 80-100 μm에서 잘 작동합니다. 이 불규칙한 뽕나무 종이는 장소가 매우 얇은 막을 지지하는 비교적 두꺼운 섬유로 묶여 있어 충분한 유충 부착 부위를 허용합니다.
권장 멤브레인 두께와 챔버 크기에 따라 성인 사료의 암컷 수를 최대 20 명으로 제한하는 것이 가장 좋습니다 (진드기는 프로토콜 단계 2.7에서 챔버에 배치됩니다). 진드기가 서로 매우 밀접하게 부착되는 경향이 있기 때문에 더 많은 암컷이 부착 부위를 과밀 할 위험이 있으며, 이는 지역의 막 무결성을 손상시키고 누출 위험을 증가시킬뿐만 아니라 수유 속도를 늦출 수 있습니다. nymphal 진드기의 경우, 최대 수는 훨씬 높으며 챔버 당 50 마리의 님프를 먹일 때에도 심각한 해로운 영향은 없습니다. 개별 유충을 세는 것은 합리적이지 않고 과밀 문제가 발견되지 않았기 때문에 설치가 쉽도록 챔버당 전체 계란 덩어리의 절반에서 절반이 권장됩니다. 전체 계란 덩어리는 ~ 1,000 개 이상의 유충으로 구성되며, 사료 공급 과정에서 수십에서 ~ 200 개의 충혈 된 유충이 단일 알 덩어리에서 떨어질 수 있습니다. 또한 먹이를 먹지 않는 애벌레 진드기는 죽지 않는 경향이 있으며 나중에 먹이를 먹기 위해 잠재적으로 다시 수용 될 수 있습니다.
다른 플라스틱은 공급 챔버를 생산하는 데 사용되었으며, 그 중 폴리 카보네이트가 가장 내구성이 있고 반응성이 없는 것으로 확인되었습니다. 아크릴과 같은 다른 플라스틱은 세척액에 민감하며, 특히 튜브의 절단 끝에서 균열 및 파손을 유발할 수 있습니다. 폴리 카보네이트는 표백제, 에탄올, 오토 클레이빙 및 자외선 살균에 잘 노출됩니다.
챔버의 진드기는 아래에 있는 따뜻해진 혈액의 열 자극으로 인해 결국 막에 물고 부착될 수 있지만 화학적 식자극제 형태의 추가 자극은 이 과정을 가속화하는 데 도움이 됩니다(레시피는 프로토콜 단계 6 참조). 이 연구에서는 물에 용해 된 진드기 대변을 사용하는 것이 -20 ° C에서 장기간 보존 될 수 있기 때문에 이상적입니다. 또한 진드기 배설물은 후속 사료에서 수집 할 수 있으므로 쉽게 재생할 수 있습니다. 당연히, 첫 번째 막 사료는 진드기 대변 추출물의 제안 된 식균 자극제에 접근 할 수 없으며 향후 사료를 위해 생산하도록 돕기 위해 그것없이 수행 될 수 있습니다. 추가로, 대체 식자극제가 사용될 수 있으며, 다른 연구는 모발 또는 모발 추출물(15,24)과 같은 상이한 화학적 또는 기계적 자극으로 성공을 거둔다.
인공 막 공급은 진드기 및 진드기 매개 병원체 생물학에서 일하는 연구자에게 추가 도구를 제공합니다. 저렴하고 간단하지만 노동 집약적이며 원하는 적용 및 진드기 종 / 생활 단계에 최적화하기 위해 예비 테스트가 필요할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
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