Summary
Här presenteras en metod för blodmatning av fästingar in vitro via ett artificiellt membransystem för att möjliggöra partiell eller fullständig mjölkstockning av en mängd olika fästinglivsstadier.
Abstract
Fästingar och deras associerade sjukdomar är ett viktigt ämne för studier på grund av deras folkhälsa och veterinärbörda. Utfodringskraven för fästingar under både studier och uppfödning kan dock begränsa experimentella frågor eller laboratoriernas förmåga att undersöka fästingar och deras associerade patogener. Ett artificiellt membranmatningssystem kan minska dessa problem och öppna nya forskningsvägar som kanske inte har varit möjliga med traditionella djurfodersystem. Denna studie beskriver ett artificiellt membranmatningssystem som har förfinats för utfodring och mjölkstockningsframgång för alla Ixodes scapularis-livsstadier . Dessutom kan det artificiella membranmatningssystemet som beskrivs i denna studie modifieras för användning med andra fästingarter genom enkel förfining av den önskade membrantjockleken. Fördelarna med ett artificiellt membranmatningssystem uppvägs av systemets arbetsintensitet, de ytterligare miljöfaktorer som kan påverka utfodringsframgången och behovet av att förfina tekniken för varje ny art och livsstadium av fästingar.
Introduction
Fästingburna sjukdomar påverkar starkt människors och djurs hälsa över hela världen och ansvarar för mer än två tredjedelar av alla vektorassocierade sjukdomar i USA från 2004 till 20161. Dessutom har antalet fall ökat de senaste åren, med fler människor och boskap som drabbats av fästingar och deras associerade sjukdomar 2,3. Även om det sannolikt finns många orsaker till den uppåtgående trenden i antalet fall, är det förändrade klimatet en viktig faktor 3,4. Den förutspådda pågående ökningen av antalet fästingburna sjukdomsfall understryker behovet av att utveckla nya verktyg för att undersöka relationerna mellan fästingar och de patogener de överför.
Det är känt att fästingar genomgår förändringar i fysiologi och genuttryck under utfodring och att dessa förändringar spelar en roll i patogenöverföring 5,6. Det kan vara svårt att utföra studier som undersöker effekterna av fullständig och partiell utfodring på överföring och förvärv av patogener med hjälp av djurmodeller, särskilt i situationer där gnagarmodeller inte är mottagliga för infektion av en viss patogen. Till exempel överförs Anaplasma phagocytophilum Variant-1-stammen naturligt mellan Ixodes scapularis och rådjur men kan inte infektera möss, vilket komplicerar fästinginfektion i labbet7. Konstgjorda matningssystem kan också användas för att studera patogener som Borrelia burgdorferi via användning av transgena mutanter som har gendeletioner som hämmar överföring eller infektion8. Att använda ett artificiellt matningssystem hjälper forskare att isolera genernas roll genom att tillåta infektion eller överföring att endast ske på fästingens sida och därigenom isolera eventuella värdsvar som kan förvirra sådana studier.
På samma sätt kan vissa livsstadier av fästingar som är involverade i sjukdom och djuröverföring inte induceras att mata på vanliga laboratoriemodellarter. Ixodes scapularis honor, till exempel, måste matas på större djur, vanligtvis kaniner9. Även om de ofta är tillgängliga för laboratorieförsök, överstiger de administrativa och djurhållningskraven för att använda kaniner de för små gnagare och kan vara oöverkomliga för vissa laboratorier. Andra fästingarter, särskilt de som är av veterinärmedicinsk betydelse, måste utfodras med nötkreatur eller andra stora djur som inte är praktiska att använda i de flesta laboratorier. In vitro-utfodrings - och infektionsmetoder, såsom artificiell membranmatning, ger alternativ till att använda stora eller exotiska värddjur.
Dessutom möjliggör användningen av ett artificiellt utfodringssystem vissa analyser som kanske inte är möjliga med traditionella djurfodermetoder. Ett sådant exempel är att genom att separera blodkällan från matningsmekanismen blir undersökning av den roll som olika värdars blod kan ha vid B. burgdorferi-överföring möjlig10. Denna undersökning av värdblod och den roll blodet själv spelar i frånvaro av värdens immunsvar är en viktig faktor för att kunna förstå patogenöverföringscykler och en som artificiella matningssystem kan hjälpa till att svarapå 11. Det blir också möjligt att kvantifiera de exakta överföringsnumren för en patogen under en matning snarare än att bara undersöka överföringsframgång och etablering i en värd 8,12.
Några av de första konstgjorda matningsmembranen gjorda för hårda fästingar gjordes av djurskinn eller membran av animaliskt ursprung på 1950- och 1960-talet13,14. På grund av dessa membrans biologiska natur fanns det problem med både produktion av nya membran och hållbarhet. På 1990-talet utvecklades helt konstgjorda membran som använde en baksida av nät, papper eller tyg med silikonimpregnering15,16. Silikon var idealiskt eftersom dess fysikaliska egenskaper efterliknar hudens stretchighet och lätt klibbighet, tillsammans med dess bioinneboende natur. Baserat på detta beskrev Krober och Guerin, vars arbete denna teknik baserades på, en silikonimpregnerad rayonmembranmatningsteknik för artificiell utfodring av I. ricinus17.
Förfining av metoderna för I. scapularis, en närbesläktad art, har lett till anmärkningsvärda skillnader i hårdheten hos silikon som används vid membranimpregnering, receptet för membranproduktion, kammarens dimensioner och fäststimulansen. Medan de förbättringar som rapporterats i denna studie har resulterat i liknande membranegenskaper som de som rapporterats av Andrade et al., som också utvecklade ett silikonbaserat membran baserat på Krober och Guerin för användning i I. scapularis, finns det en skillnad i silikonimpregneringsstegen, vilket möjliggör flexibiliteten att använda detta protokoll för omogna livsstadier av I. scapularis15, 18. Denna studie beskriver också tillägg och tekniska ändringar baserat på upprepad användning av denna metod, bästa praxis som resulterar i ett framgångsrikt flöde och felsökning av problem som kan uppstå. Denna metod har använts för att mata alla aktiva livsstadier, infektera fästingar med patogena bakterier och utsätta fästingar för flera doser antibiotika19,20. Medan den konstgjorda membranmatningsmetoden som visas är för I. scapularis, är denna metod lätt anpassningsbar till andra arter av fästingar med mindre modifieringar i membrantjocklek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda fästmembrankammaren
- Förbered en plan, icke-porös yta, t.ex. ett plan av glas eller en keramiskt belagd metallbas på ett armstativ genom att torka av det med 70% etanol och täck det sedan med ett enda lager plastfolie, se till att plastfolien är platt och utan bubblor eller rynkor (se figur 1A).
- Tejpa fast 100 % av rengöringspapperet för rayonlinser på den förberedda ytan. Se till att den är platt och något spänd med tejp över alla fyra sidor av papperet. Två stycken 4 i x 6 i linspapper kan göras till membran med hjälp av de volymer som beskrivs i steg 1.3.
OBS: Detta är tillräckligt för att utgöra upp till 12 matningskammare (se figur 1B). Om membranet är för larvfästingar, använd unryu-papper istället för linsrengöringspapper. - Förbered 00-10 hårdhet silikonblandningen genom att mäta upp 5 ml av varje del av silikonsatsen i en engångsbehållare, blanda de två vätskorna lätt innan du tillsätter 1,5 ml hexan. Fortsätt blanda tills blandningen är homogen och noggrant blandad.
OBS: Om du gör membran för vuxna fästingar, använd 00-50 hårdhet silikon. - Använd en liten skrapa för att fördela silikonblandningen över linspapperet. Låt stå i 1 minut för att säkerställa att silikonet har blött in i linspapperet. Skrapa stadigt överflödigt silikon åt sidan med skrapan med en liten mängd nedåttryck. Utför ett andra pass med skrapan, utan att utöva något nedåtriktat tryck, för att ta bort eventuella silikonlinjer och producera ett jämnt lager.
OBS: Detta steg i proceduren kan kräva viss övning för att producera membran med optimal tjocklek för varje livsstadium (vuxna: 150-200 μm; nymfer: 90-120 μm; larver: 80-100 μm). Ett tjockare membran (inom matningstoleranserna i livsstadiet) ger vanligtvis bättre resultat genom att minska kondens i kammaren och förbättra membranets självläkande egenskaper. - Endast för larver, doppa toppen av matningskammaren i Fluon-fluorpolymerharts (PTFE-30) flera gånger, så att den kan torka mellan appliceringarna för att producera ett konsekvent skikt.
OBS: Appliceringen av Fluon kommer att bilda ett non-stick lager av fluorpolymerharts som liknar en non-stick kokpanna. Detta kommer att minska antalet larver som klättrar till toppen av kammaren21. - Låt membranet härda i minst 24 timmar i en dammfri miljö, till exempel ett slutet kemikalie- eller biosäkerhetsskåp, innan du går vidare till nästa steg. Se figur 1C för hur rayonlinspapperet ser ut efter att silikonet har fått torka.
- Förbered silikonblandningen med 30 hårdhet för att fästa kamrarna på membranet genom att blanda lika delar silikonblandning A och B.
- Doppa polykarbonatkamrarna ungefär en kvarts tum (6 mm) i silikonblandningen och placera sedan på membranarket, var försiktig så att du inte överlappar någon av tejpen (figur 1D).
- Låt den fästande silikonen härda i minst 24 timmar innan du går vidare till nästa steg.
- Skär försiktigt membranet runt var och en av de bifogade kamrarna med en skalpell och trimma ner kanterna så att det kan passa smidigt i en brunn på 6-brunnsplattan utan mycket skrapning på sidorna (figur 1E). Låt tillräckligt med material utanför kammaren för att maximera vidhäftningen av membranet.
OBS: Om för mycket yttre material kvarstår kan upprepat avlägsnande av kammaren från 6-brunnsplattan orsaka att membranet delvis lossnar från kammaren. Reparation av avskilda membran beskrivs i avsnitt 5. - Skär en liten bit av det kvarvarande membranet från vart och ett av hörnen och mitten av membranarket. Ta bort plastfolien från varje bit. Mät bitarna med en mikrometer för att bestämma den genomsnittliga membrantjockleken.
OBS: Om membrantjockleken inte faller inom toleransområdet för livsstadiet (se steg 1.4), ska membranen kasseras och göras om. Unryu papperstjocklek är mycket varierande på grund av dess tjocka fibersträngar och tunna områden. Även om denna egenskap gör det möjligt för larver att hitta regioner med optimal tjocklek, gör det svårt att bestämma den faktiska membrantjockleken. - Placera matarkamrarna tillsammans med en O-ring per kammare i en glasbägare som ska autoklaveras vid 121 °C i minst 20 minuter för sterilisering. Låt kamrarna svalna innan du använder dem.
2. Ställa in fästmatningen
- Förbered en lampa eller ett rum så att lamporna lyser i 16 timmar och sedan släcks i 8 timmar. Om du använder en lampa, se till att vattenbadet i nästa steg är i mörkret under de 8 timmarna.
- Ställ in ett vattenbad vid 34 ° C och med stöd så att en 6-brunnsplatta kan sitta och flyta något i den. Använd små glasbägare nedsänkta i vattenbadet som stöd. Använd ett genomskinligt lock för vattenbadet för att upprätthålla en ljus-mörk cykel för fästingarna; om det behövs, använd ett T-stativ och plastfolie för att göra ett lock. För att minska risken för kontaminering, tillsätt 0,02% bensalkoniumklorid till vattenbadet och ställ in ett annat vattenbad till 36 ° C för uppvärmning av kylt blod.
- Ta ut de förberedda, autoklaverade membrankamrarna, placera O-ringen runt kammaren (figur 1F) och fyll sedan varje kammare med tillräckligt med 70% etanol för att täcka membranet. Låt sitta i en 6-brunnsplatta väl i 5 minuter och leta sedan efter eventuella läckor mellan kammaren och membranet och i själva membranet.
OBS: Om membranet läcker ackumuleras etanol i brunnens botten. Läckande membran ska kasseras. - Töm ut etanolen från kamrarna och låt den sedan lufttorka inuti ett biosäkerhetsskåp eller laminär flödeshuv.
OBS: Detta kan ta flera minuter beroende på omgivande luftfuktighet. - Medan du väntar, värmeinaktivera komplementet i blodet genom uppvärmning vid 56 °C i 40 minuter. Komplettera mekaniskt definerat bovint blod med 2 g / L glukos.
- När membranet är torrt, applicera ~ 20 μL fagostimulant på insidan av kammaren och sprid den sedan runt ytan genom att luta kammaren. Se avsnitt 6 för instruktioner om beredning av ett fagostimulantia från fästingfrass.
- Vänta tills fagostimulanten är torr innan du lägger fästingarna i kammaren med antingen en borste eller pincett. Arbeta så snabbt som möjligt när du överför fästingarna till kammaren för att förhindra flykt. Lägg fästingarna i ett rör på is i 1-2 minuter innan du överför dem för att sakta ner deras förmåga att fly. Efter att fästingarna har överförts, försegla toppen med parafilm; Översträck inte parafilmen, eftersom värmen från vattenbadet kan få den att riva.
OBS: Tång fungerar bäst med nymphal och vuxna livsstadier och borstar fungerar bäst med larvala livsstadier. - Tillsätt 5 ml av det värmeinaktiverade blodet per brunn/kammare i ett koniskt rör och placera det i vattenbadet vid 36 °C. Ta kylt blod upp till minst rumstemperatur innan du utsätter fästingarna för det. Avsätt fyra kammare per 6-brunnsplatta för enkel hantering av kamrar. Fler kammare per platta bör undvikas, men beroende på vattenbadets storlek kan fler plattor användas.
- Tillsätt 5 μL 3 mM ATP och 50 μL 100x lager penicillin/streptomycin/fungizone per 5 ml blod till röret.
- Överför 4,5 ml av blodet till en brunn på en 6-brunnsplatta och placera sedan försiktigt kammaren i brunnen, justera O-ringhöjden på kammaren så att membranet sitter i blodet men blodnivån runt sidan inte överträffar brunnen. Placera brunnen i blodet i en vinkel för att undvika luftbubbelbildning mellan blodet och membranet.
Anmärkning: En färdig skylt visas i figur 2. - Placera locket på 6-brunnsplattan ovanpå matningskamrarna; Lägg sedan 6-brunnsplattan med kammare i det förberedda 34 °C vattenbadet och stäng locket.
OBS: Locket på toppen hjälper till att stoppa kondenserat vatten från att komma i kontakt med parafilmen och späda blodet i brunnarna.
3. Underhålla matningsfästingarna genom att byta blod var 12: e timme
- Alikvot 5 ml värmeinaktiverat blod per brunn i röret och värm upp det i ett 36 °C vattenbad. Tina ATP och penicillin/streptomycin/fungizone i vattenbadet samtidigt.
- Tillsätt 5 μL 3 mM ATP och 50 μl 100x lager penicillin/streptomycin/fungizone per brunn till blodröret. Överför 4,5 ml blod till en brunn på en ny 6-brunnsplatta.
- Ta ut 6-brunnsplattan med fästkammaren från vattenbadet. Ta bort kammaren från brunnen och skölj utsidan av kammaren och membranet med 10 ml steril 1x PBS för att avlägsna blodet.
- Använd autoklaverat filterpapper, torka försiktigt membranet och kammaren för att ta bort överflödigt PBS. Byt ut parafilmen på toppen av kammaren. Om det finns mycket kondens inuti kammaren, torka de våta fläckarna med autoklaverat filterpapper innan du förseglar med ny parafilm.
- Placera fästkammaren i den nya 6-brunnsplattan med färskt blod, justera O-ringens höjd om det behövs. Upprepa steg 3.3-3.5 för varje kammare på plattan. Placera locket på 6-brunnsplattan över kamrarnas toppar. Flytta tillbaka den nya 6-brunnsplattan till 34 °C vattenbad.
- Upprepa steg 3.1-3.5 var 12: e timme tills fästmatningen avslutas. Vänta tills fästingarna lossnar från membranet av sig själva när de är uppsvällda eller ta försiktigt bort dem från membranet med en pincett med mjuk pincett medan de fortfarande är fästa för att få delvis engorged fästingar.
4. Svampdödande behandling
OBS: Utför endast när svamptillväxt ses på membranet. Svamp kommer sannolikt att bildas på membranets blodsida om utfodringen är av tillräcklig varaktighet. Den första indikationen på svampförorening är små (1-3 mm) flingor av koagulerat blod synligt på membranet. När svampförorening noteras kan svampdödande behandlingar förlänga experimentets varaktighet och förbättra engorgement framgång.
- Lös 10 000 U nystatin per ml i destillerat vatten, 5 ml per matningskammare. Filtersterilisera med ett 0,1 μm sprutfilter.
- Tillsätt 5 ml nystatinlösning per brunn av en ny 6-brunnsplatta, en brunn för varje matningskammare.
- Placera PBS-sköljda kamrar i lösningen. Låt sitta i 10 min.
- Skölj de behandlade membranen med PBS innan du sätter tillbaka i färskt blod.
- Upprepa den antifungala behandlingen var 2-3: e dag (beroende på omfattningen av svampförorening) tills experimentet är klart.
5. Vidhäftning av fristående membran med cyanoakrylatlim
OBS: Utför endast när membranavskiljning märks.
- Membran kan delvis lossna från matningskamrarna, särskilt vid avlägsnande från 6-brunnsplattan. Om detta händer, skölj blodmembranet med PBS.
- Torka försiktigt det drabbade området. Det behöver inte vara helt torrt, men närvaron av fukt gör att limet stelnar snabbare.
OBS: Att fästa membranet igen begränsar arbetstiden, men beroende på avskiljningsstorlek kan en snabbare inställningstid vara önskvärd. - Pressa ut en liten mängd cyanoakrylatlim i gapet där membranet har dragit sig bort från kammaren. Håll på plats i ~ 2 minuter så att limet kan stelna.
- Placera kammaren tillbaka i blodet i 6-brunnsplattan.
6. Göra fagostimulant
OBS: Utför i slutet av en matning eller innan en membranmatning har startat.
- Samla fästing avföring från antingen en tidigare membranmatning eller en annan källa till utfodring av fästingar. Förvara avföringen vid -20 °C innan du gör fagostimulanten. Krossa pellets av fästing avföring och blanda 0,1 g per 1 ml vatten. Tillsätt 1 mM tripeptidreducerad glutation, lös upp och blanda noggrant genom virvelning.
- Filtersterilisera med ett 0,1 μm sprutfilter.
- Frys vid -20 °C tills det behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En lyckad utfodring beror på om en partiell eller fullständig engorgement önskas. Framgångsrikt matad I. scapularis blir en nyans av gunmetal grå för vuxna och lossnar på egen hand från membranet. Men om de är minst ärtstorlek kan de lossna från membranet när utfodringen avslutas. För omogna stadier av I. scapularis varierar storleken för helt engorged fästingar, och eftersom de, till skillnad från vuxna, inte uppvisar en färgförändring, är lossning det bästa sättet att avgöra om en fästing är helt engorged. Se figur 3 för ett exempel på hur nymphal I. scapularis kan se ut under ett flöde. Vuxna I. scapularis fästingar tar 1 vecka eller mer från fästet tills de börjar lossna från membranet; Nymfer lossnar ofta ungefär 5 dagar efter fastsättning, och larver börjar lossna ~ 3-4 dagar efter den första bilagan. Foder kan fortsätta så länge man vill behålla två gånger dagliga blodförändringar och så länge mögel inte har börjat växa utöver vad svampdödande behandling kan kontrollera. Delvis engorged fästingar måste lossas manuellt från membranet.
Omogna fästingar (larver och nymfer) som lossnar från membranet på egen hand smälter nästan alltid framgångsrikt in i nästa livsstadium, och förutsatt att de har engorged tillräckligt och är av tillräckligt stor storlek, även de som lossnar manuellt från membranet i slutet av en matningsmolt. Kvinnliga fästingar som har blivit gråa under mjölkstockning lägger vanligtvis framgångsrikt ägg. Men till skillnad från naturliga sätt att mata, producerar membranmatade engorged honor mindre äggmassor och är av mindre storlek än deras naturligt djurmatade motsvarigheter. Resultat från ett nyligen genomfört experiment som matade I. scapularis-larver från ägg genom nymphal engorgement och smältning kan ses i tabell 1. De resulterande nymferna från det ursprungliga larvfoderet matades 2 månader efter molt. Det är dock viktigt att notera att detta experiment hade hjortorganhomogenat tillsatt blodet, vilket kan ha haft skadliga effekter på fästingmatningsframgången.
I ett annat experiment placerades 60 kvinnliga och 60 manliga I. scapularis-fästingar i fyra matningskammare (30 könsmatchade fästingar per kammare) och honfästingarna fick mata till fylla. Dessa fästingar har sitt ursprung som avkommor till engorged honor samlade från jägare-dödade rådjur. Den genomsnittliga äggmassans vikt och intervall, förutom framgångssiffror för mjölkstockning (antal honor som lagt ägg efter mjölkstockning och -lossning), kan ses i tabell 1. Äggvikterna för I. scapularis är mycket varierande i litteraturen, men fästingar som tidigare samlats in från jägardödade rådjur från Minnesota producerade äggmassor med en medelvikt på 77 mg (19-147 mg)22. Fästingdödligheten är låg med hjälp av det konstgjorda membranmatningssystemet; Fästingar som inte fäster och matar överlever mestadels processen, vilket ökar möjligheten att försöka ytterligare membranmatningsexperiment med de överlevande.
Denna metod har använts för att infektera nymphal I. scapularis med en mängd olika fästingburna patogener, inklusive A. phagocytophilum Variant-1, som inte kan använda traditionella gnagarinfektionsmetoder7. Infektion av fästingarna av bakterier bekräftades med qPCR, och medan alla nymphalfästingar som framgångsrikt matades var positiva efter utfodring, beroende på bakterieart, skulle infektionen kvarstå transstadiellt19. Denna metod har också använts för att mata kvinnliga I. scapularis ciprofloxacin; De framgångsrikt matade fästingarna visade en jämförbar knockdown av bakteriella symbiontnivåer med injicerade fästingar20.
Figur 1: Fästingmembrankammaren . a) Beståndsbelagd stativbas med plastfolie. (B) Linspapper fasttejpat på den plastförpackade basen. Den blå rektangeln är skrapan som används i panel C. (C) Linspapper efter impregnering med silikon. d) Kammare fästa vid silikon-rayonmembranet. Varje 4 i x 6 i linspappersark rymmer sex kamrar. (E) En färdig kammare med silikon-rayonmembran. Ett fristående silikon-rayonmembran visas till höger. (F) En monterad färdig kammare, med en O-ring fäst på den. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Ställa in fästmatningen. Ett exempel på hur en uppsättning av fyra kamrar med vuxen I. scapularis kommer att se ut när allt är inställt och innan det placeras i vattenbadet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ett pågående foder med delvis uppsvällda Ixodes scapularis-nymfer . De svarta eller bruna prickarna runt fästplatserna (se etikett A till exempel) är frass som kan samlas in under och efter matningen för att göra fagostimulanten. Delvis uppsvällda I. scapularis-nymfer ses fästa på membranet (se etikett B). Ett skal av engorged larver molt kan ses på etikett C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Antal startfästingar | Antal framgångsrikt uppsvällda fästingar | Äggmassa genomsnittlig massa i mg (intervall) | |
| Larver | 2 kläckta äggmassor | 150 | Ej tillämpligt |
| Nymfer | 150 | 24 | Ej tillämpligt |
| Vuxna kvinnor | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
Tabell 1: Tick engorgement nummer och ägg massa vikter. Larv- och nymphal engorgement experimentella betingelser hade hjortorganhomogenat tillsatt till blodet utöver de kosttillskott som används i detta protokoll. Vuxna kvinnliga engorgement experimentella betingelser var som beskrivs i protokollet ovan. Framgångsrik engorgement definierades som antingen engorged fästingar som framgångsrikt smälte till nästa livsstadium eller engorged honor som framgångsrikt lade ägg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artificiell membranmatning av fästingar ger ett användbart verktyg för en mängd olika experimentella förfaranden, men kommer sannolikt inte att ersätta djurfoder för alla applikationer. Att upprätthålla stora kolonier av fästingar i alla livsstadier utan djurfoder är i allmänhet ohållbart. I stället är det artificiella utfodringssystemet värdefullt för andra ändamål, såsom att infektera fästingar med patogener som inte stöds av modellvärdar, utvärdera effekterna av kontrollerade doser av föreningar eller mikroorganismer på fästingarna i en förenklad utfodringsmiljö eller föda upp små kolonier av fästingar som är beroende av värddjur som inte är lätt tillgängliga i laboratoriet8, 10,11,23,24,25. Jämfört med traditionella djurfodermetoder är artificiell membranmatning arbetsintensiv och presenterar utmaningar15,24. Det är av dessa skäl som artificiell membranmatning inte ersätter traditionella djurbaserade utfodringsmetoder och istället möjliggör experiment som inte kan göras med traditionell djurfoder.
Att upprätthålla hygieniska förhållanden både i matningskamrarna och fästingkolonin är avgörande för att undvika svamp- och bakteriekontaminering. Men när man använder konstgjord utfodring för att utsätta fästingar för patogener, bör penicillin / streptomycin / fungizone (P / S / F) tillskott undvikas från blodet för att undvika att döda patogenerna. Fästingexponering för ciprofloxacin i blodet kan helt eliminera Rickettsia buchneri, äggstocksendosymbiont av I. scapularis , från en delmängd av F1-avkomman, medan rutinmässig P / S / F-tillsats till blod inte har denna effekt20. Transovariella patogenöverföringsstudier utfördes inte med detta system, men inga förändringar noterades i fecunditeten hos engorged honor i antibiotikaexponerade kontra kontrollexperiment. Snabb initiering av utfodring och mjölkstockning av fästingar undviker många av de problem som är förknippade med svampförorening. Av denna anledning tenderar systemet att fungera lättare med larv- och nymphalfästingar, eftersom de har kortare utfodringstider. Periodisk behandling av förorenade membran med antimykotika som nystatin kan förlänga den tillgängliga tiden för mjölkstockning med några dagar. Det är också viktigt att använda fästingar som har smälts tillräckligt länge för att vara ivriga att mata. Larver är klara 2 veckor efter att alla larver i äggmassan har avslutat uppkomsten, men nymfer och vuxna klarar sig bättre om de används minst 10 veckor efter smältning.
Denna metod har visat jämförbar fästingmatningsframgång med att använda laboratoriedjur, med typiskt 30% -50% av honan och cirka 50% av nymphal I. scapularis som fullbordar engorgement, jämförbar med engorgementframgången hos vuxna som matas på labbkaniner eller nymfer som matas på möss eller hamstrar19. På samma sätt har andra studier med konstgjorda matningskammare rapporterat en 45% mjölkstockningsgrad för I. scapularis-honor och 72% matningshastighet för nymfer10,18. Under tiden, för Ixodes ricinus honor och nymfer som matas via ett konstgjort membran, var mjölkstockningsgraden 71% respektive58%, 25. Därför kan resultaten variera beroende på vilket system som används och vilka fästingarter som undersöks.
Membrantjocklek är en viktig faktor för utfodringsframgång; Tunnare membran är mindre kapabla att täta runt de små hålen som produceras genom fästingprobning och fastsättning. Efter matning börjar mer fukt komma in i kammaren, vilket kan leda till våta förhållanden, kondensering och efterföljande retorkning av frass och mögel. Det är därför viktigt att producera membran med den maximala tjocklek som kan tolereras av fästingarten och livsstadiets hypostomlängd som ska matas (se protokollsteg 1.1-1.4). Nymfer av I. scapularis och Dermacentor variabilis matar på membran mellan 90 μm och 120 μm tjocklek, medan vuxna matar på membran upp till tjocklekar på nästan 200 μm. Den vuxna I. scapularis-hypostomen är 500 μm lång, medan nymphal och larval hypostomes är ~ 100 μm lång, vilket visar sig vara tillräckligt för att penetrera ett något tjockare membran15,26. Rayonlinspapper är i genomsnitt ~ 50 μm i tjocklek och membran tillverkade av det har minst 50 μm tjocklek; Men som nämnts ovan ger tjockare membran bättre resultat. Larvens matningsmembran fungerar bra vid 80-100 μm tjocklek med ett mycket lätt unryu-papper (10 g/m3). Detta oregelbundna mullbärspapper är spetsat med relativt tjocka fibrer som ger stöd till ett membran som är mycket tunt på platser, vilket möjliggör gott om larvfästplatser.
Baserat på den rekommenderade membrantjockleken och kammarstorlekarna är det bäst att begränsa antalet honor i vuxna matar till högst 20 honor (fästingar placeras i kamrar i protokollsteg 2.7). Fler honor riskerar att överbefolka fästplatserna, eftersom fästingarna tenderar att fästa mycket nära varandra, vilket kan äventyra membranintegriteten i det lokala området och öka risken för läckage, samt sakta ner matningshastigheten. För nymphalfästingar är det maximala antalet mycket högre och inga signifikanta skadliga effekter noteras, även när man matar 50 nymfer per kammare. Eftersom det inte är rimligt att räkna enskilda larver och inga överbeläggningsproblem noterades, rekommenderas en halv till en hel äggmassa per kammare för enkel installation. Hela äggmassor består av ~ 1,000 eller fler larver, och under ett foder var som helst från dussintals till ~ 200 engorged larver kan släppa av från en enda äggmassa. Dessutom tenderar larvfästingar som inte matar att inte dö och kan eventuellt omplaceras för senare utfodring.
Andra plaster har använts för att producera matningskamrarna, varav polykarbonat har fastställts vara den mest hållbara och icke-reaktiva. Andra plaster, såsom akryl, är känsliga för rengöringslösningar, vilket kan orsaka krackelering och brott, särskilt vid slangens skurna ändar. Polykarbonat håller sig väl för exponering för blekmedel, etanol, autoklavering och ultraviolett sterilisering.
Medan fästingar i en kammare så småningom kan bita och fästa vid membranet på grund av värmestimulansen hos det uppvärmda blodet under, hjälper ytterligare stimuli i form av kemiska fagostimulantia att påskynda denna process (för receptet, se protokollsteg 6). För denna studie är användningen av fästing avföring som har lösts i vatten idealisk på grund av deras förmåga att bevaras vid -20 ° C under långa perioder. De är också lätt förnybara, eftersom fästing avföring kan samlas in från efterföljande flöden. Naturligtvis kan det första membranmatningen inte ha tillgång till den föreslagna fagostimulanten av fästing avföring extrakt och kan utföras utan det för att hjälpa till att producera det för framtida matar. Dessutom kan alternativa fagostimulantia användas, med andra studier som har framgång med olika kemiska eller mekaniska stimuli såsom hår eller hårextrakt15,24.
Artificiell membranmatning ger ytterligare verktyg för forskare som arbetar med fästing- och fästingburen patogenbiologi. Det är prisvärt och enkelt, men också arbetsintensivt, och kommer sannolikt att kräva några preliminära tester för att optimera för önskad applikation och fästing arter / livsstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
- Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
- Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
- Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
- Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
- Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
- Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
- Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
- Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
- Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
- Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
- Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
- Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
- Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
- Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
- Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
- González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
- Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
