Summary
Hier wordt een methode gepresenteerd om teken in vitro te voeden via een kunstmatig membraansysteem om gedeeltelijke of volledige stuwing van een verscheidenheid aan tekenlevensfasen mogelijk te maken.
Abstract
Teken en de bijbehorende ziekten zijn een belangrijk onderwerp van studie vanwege hun volksgezondheid en veterinaire last. De voedingsbehoeften van teken tijdens zowel studie als opfok kunnen echter experimentele vragen of het vermogen van laboratoria om teken en hun bijbehorende pathogenen te onderzoeken, beperken. Een kunstmatig membraanvoedingssysteem kan deze problemen verminderen en nieuwe onderzoeksmogelijkheden openen die misschien niet mogelijk waren met traditionele diervoedersystemen. Deze studie beschrijft een kunstmatig membraanvoedingssysteem dat is verfijnd voor voedings- en stuwingssucces voor alle ixodes scapularis-levensfasen . Bovendien kan het kunstmatige membraanvoedingssysteem dat in deze studie wordt beschreven, worden aangepast voor gebruik met andere tekensoorten door eenvoudige verfijning van de gewenste membraandikte. De voordelen van een kunstmatig membraanvoedingssysteem worden gecompenseerd door de arbeidsintensiviteit van het systeem, de extra omgevingsfactoren die van invloed kunnen zijn op het voedingssucces en de noodzaak om de techniek voor elke nieuwe soort en levensfase van teken te verfijnen.
Introduction
Door teken overgedragen ziekten hebben een sterke invloed op de gezondheid van mens en dier over de hele wereld en zijn verantwoordelijk voor meer dan tweederde van alle vectorgerelateerde ziekten in de VS van 2004 tot 20161. Bovendien is het aantal gevallen de afgelopen jaren toegenomen, waarbij meer mensen en vee worden getroffen door teken en de bijbehorende ziekten 2,3. Hoewel er waarschijnlijk tal van oorzaken zijn voor de stijgende trend in het aantal gevallen, is het veranderende klimaat een belangrijke factor 3,4. De voorspelde voortdurende toename van het aantal door teken overgedragen ziektegevallen onderstreept de noodzaak om nieuwe hulpmiddelen te ontwikkelen om de relaties tussen teken en de ziekteverwekkers die ze overbrengen te onderzoeken.
Het is bekend dat teken tijdens het voeden veranderingen in fysiologie en genexpressie ondergaan en dat deze veranderingen een rol spelen bij de overdracht van ziekteverwekkers 5,6. Het kan moeilijk zijn om studies uit te voeren die de effecten van volledige en gedeeltelijke voeding op de overdracht en verwerving van pathogenen onderzoeken met behulp van diermodellen, met name in situaties waarin knaagdiermodellen niet vatbaar zijn voor infectie door een bepaald pathogeen. Anaplasma phagocytophilum Variant-1 stam wordt bijvoorbeeld van nature overgedragen tussen Ixodes scapularis en herten, maar is niet in staat om muizen te infecteren, wat de tekeninfectie in het laboratorium bemoeilijkt7. Kunstmatige voedingssystemen kunnen ook worden toegepast om pathogenen zoals Borrelia burgdorferi te helpen bestuderen via het gebruik van transgene mutanten met gendeleties die transmissie of infectie remmen8. Het gebruik van een kunstmatig voedingssysteem helpt onderzoekers de rol van de genen te isoleren door infectie of overdracht alleen aan de kant van de teek toe te staan, waardoor elke gastheerrespons wordt geïsoleerd die dergelijke studies kan verstoren.
Evenzo kunnen sommige levensfasen van teken die betrokken zijn bij ziekte en overdracht van dieren mogelijk niet worden geïnduceerd om zich te voeden met gemeenschappelijke laboratoriummodelsoorten. Ixodes scapularis-vrouwtjes moeten bijvoorbeeld worden gevoed met grotere dieren, meestal konijnen9. Hoewel vaak toegankelijk voor laboratoriumexperimenten, overtreffen de administratieve en houderijvereisten voor het gebruik van konijnen die van kleine knaagdieren en kunnen ze voor sommige laboratoria onbetaalbaar zijn. Andere tekensoorten, met name die welke van veterinair belang zijn, moeten worden gevoederd met runderen of andere grote dieren die in de meeste laboratoria niet praktisch te gebruiken zijn. In vitro voeding en infectiemethoden, zoals kunstmatige membraanvoeding, bieden alternatieven voor het gebruik van grote of exotische gastheerdieren.
Bovendien maakt het gebruik van een kunstmatig voersysteem bepaalde analyses mogelijk die mogelijk niet mogelijk zijn met traditionele diervoedingsmethoden. Een voorbeeld hiervan is dat, door de bloedbron van het voedingsmechanisme te scheiden, onderzoek van de rol die het bloed van verschillende gastheren kan hebben in B. burgdorferi-transmissie mogelijk wordt10. Dit onderzoek van gastheerbloed en de rol die bloed zelf speelt in afwezigheid van de immuunrespons van de gastheer is een belangrijke factor bij het kunnen begrijpen van pathogeentransmissiecycli en een die kunstmatige voedingssystemen kunnen helpen beantwoorden11. Het wordt ook mogelijk om de exacte transmissieaantallen van een pathogeen tijdens een feed te kwantificeren in plaats van alleen het overdrachtssucces en de vestiging in een gastheer 8,12 te onderzoeken.
Sommige van de eerste kunstmatige voedingsmembranen gemaakt voor harde teken werden gemaakt van dierenhuiden of van dieren afgeleide membranen in de jaren 1950 en 196013,14. Vanwege de biologische aard van deze membranen waren er problemen met zowel de productie van nieuwe membranen als de houdbaarheid. In de jaren 1990 werden volledig kunstmatige membranen ontwikkeld die gebruik maakten van een backing van gaas, papier of stof met siliconenimpregnatie15,16. Siliconen waren ideaal omdat de fysieke eigenschappen de rekbaarheid en lichte kleverigheid van de huid nabootsen, samen met de bio-inherente aard. Voortbouwend hierop beschreven Krober en Guerin, op wiens werk deze techniek was gebaseerd, een met siliconen geïmpregneerde rayonmembraanvoedingstechniek voor de kunstmatige voeding van I. ricinus17.
Verfijning van de methoden voor I. scapularis, een nauw verwante soort, heeft geleid tot opmerkelijke verschillen in de hardheid van siliconen die worden gebruikt bij membraanimpregnatie, het recept voor membraanproductie, afmetingen van de kamer en het aanhechtingsstimulerend middel. Hoewel de verfijningen die in deze studie zijn gerapporteerd, hebben geresulteerd in vergelijkbare membraankenmerken als die gerapporteerd door Andrade et al., die ook een op siliconen gebaseerd membraan op basis van Krober en Guerin ontwikkelden voor gebruik in I. scapularis, is er een verschil in de siliconenimpregnatiestappen, wat de flexibiliteit biedt om dit protocol te gebruiken voor onrijpe levensfasen van I. scapulularis15, 18. Deze studie beschrijft ook toevoegingen en technische wijzigingen op basis van herhaald gebruik van deze methode, best practices die resulteren in een succesvolle feed en het oplossen van problemen die zich kunnen voordoen. Deze methode is gebruikt om alle actieve levensfasen te voeden, teken te infecteren met pathogene bacteriën en teken bloot te stellen aan meerdere doseringen antibiotica 19,20. Hoewel de getoonde kunstmatige membraanvoedingsmethode voor I. scapularis is, is deze methode gemakkelijk aan te passen aan andere soorten teken met kleine wijzigingen in de membraandikte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het voorbereiden van de tekenmembraankamer
- Bereid een plat, niet-poreus oppervlak voor, zoals een glasvlak of een keramisch gecoate metalen basis van een armstandaard door het af te vegen met 70% ethanol en bedek het vervolgens met een enkele laag plasticfolie, waarbij u ervoor zorgt dat de plasticfolie vlak is en zonder bubbels of rimpels (zie figuur 1A).
- Plak 100% rayon lens reinigingspapier vast op het voorbereide oppervlak. Zorg ervoor dat het plat en enigszins strak is met tape over alle vier de zijden van het papier. Van twee stukken van 4 in x 6 in lenspapier kunnen membranen worden gemaakt met behulp van de volumes die in stap 1.3 worden beschreven.
OPMERKING: Dit is voldoende om tot 12 voerkamers te maken (zie figuur 1B). Als het membraan voor larvale teken is, gebruik dan unryu-papier in plaats van lensreinigingspapier. - Bereid het 00-10 hardheid siliconenmengsel door 5 ml van elk deel van de siliconenkit in een wegwerpcontainer te meten, de twee vloeistoffen licht te mengen voordat u 1,5 ml hexaan toevoegt. Blijf mengen totdat het mengsel homogeen en grondig gemengd is.
OPMERKING: Als u membranen maakt voor volwassen teken, gebruik dan siliconen met een hardheid van 00-50. - Gebruik een kleine wisser om het siliconenmengsel over het lenspapier te verdelen. Laat 1 minuut staan om er zeker van te zijn dat de siliconen in het lenspapier zijn gedrenkt. Schraap gestaag overtollige siliconen naar de zijkant met de wisser met behulp van een kleine hoeveelheid neerwaartse druk. Voer een tweede pass uit met de wisser, oefen geen neerwaartse druk uit, om eventuele lijnen van siliconen te verwijderen en een gladde laag te produceren.
OPMERKING: Deze stap van de procedure kan enige oefening vereisen om membranen van optimale dikte te produceren voor elke levensfase (volwassenen: 150-200 μm; nimfen: 90-120 μm; larven: 80-100 μm). Een dikker membraan (binnen de voedingstoleranties van de levensfase) zal meestal betere resultaten opleveren door condensatie in de kamer te verminderen en de zelfherstellende eigenschap van het membraan te verbeteren. - Alleen voor larven, dompel de bovenkant van de voedingskamer meerdere keren in Fluon fluorpolymeerhars (PTFE-30), zodat deze tussen de toepassingen kan drogen om een consistente laag te produceren.
OPMERKING: De toepassing van Fluon vormt een antiaanbaklaag van fluorpolymeerhars vergelijkbaar met een antiaanbakpan. Dit vermindert het aantal larven dat naar de top van de kamer21 klimt. - Laat het membraan minstens 24 uur uitharden in een stofvrije omgeving, zoals een gesloten chemische of bioveiligheidskast, voordat u doorgaat naar de volgende stap. Zie figuur 1C voor hoe het rayonlenspapier eruitziet nadat de siliconen zijn opgedroogd.
- Bereid het 30-hardheid siliconenmengsel om de kamers aan het membraan te bevestigen door gelijke delen siliconenmengsel A en B te mengen.
- Dompel de polycarbonaatkamers ongeveer een kwart inch (6 mm) in het siliconenmengsel en plaats ze vervolgens op het membraanvel, waarbij u ervoor zorgt dat u geen van de tape overlapt (figuur 1D).
- Laat de bevestigende siliconen minstens 24 uur uitharden voordat u naar de volgende stappen gaat.
- Snijd met behulp van een scalpel voorzichtig het membraan rond elk van de aangesloten kamers en snijd de randen af zodat het soepel in een put van de 6-wellplaat past zonder veel schrapen aan de zijkanten (figuur 1E). Laat voldoende materiaal buiten de kamer om de hechting van het membraan te maximaliseren.
OPMERKING: Als er te veel buitenmateriaal overblijft, kan herhaalde verwijdering van de kamer uit de 6-wellsplaat ervoor zorgen dat het membraan gedeeltelijk loskomt van de kamer. Het repareren van losse membranen wordt beschreven in rubriek 5. - Snijd een klein stukje van het overgebleven membraan uit elk van de hoeken en het midden van het membraanvel. Verwijder de plasticfolie van elk stuk. Meet de stukken met een micrometer om de gemiddelde membraandikte te bepalen.
OPMERKING: Als de membraandikte niet binnen het tolerantiebereik voor de levensfase valt (zie stap 1.4), moeten de membranen worden weggegooid en opnieuw worden gemaakt. De papierdikte van Unryu is zeer variabel vanwege de dikke strengen vezels en dunne gebieden. Hoewel deze eigenschap larven in staat stelt om gebieden van optimale dikte te vinden, maakt het het moeilijk om de werkelijke membraandikte te bepalen. - Plaats de voedingskamers samen met één O-ring per kamer in een glazen bekerglas dat gedurende ten minste 20 minuten bij 121 °C moet worden geautoclaveerd om te steriliseren. Laat de kamers afkoelen voordat u ze gebruikt.
2. De tekenfeed instellen
- Bereid een lamp of kamer zo voor dat de lichten 16 uur branden en vervolgens 8 uur uit zijn. Als u een lamp gebruikt, zorg er dan voor dat het waterbad in de volgende stap in het donker is voor die 8 uur.
- Zet een waterbad op 34 °C en met steunen zodat een 6-well plaat er lichtjes in kan zitten en drijven. Gebruik kleine glazen bekers verzonken in het waterbad als ondersteuning. Gebruik een transparante hoes voor het waterbad om een licht-donkercyclus voor de teken te behouden; gebruik indien nodig een T-standaard en plasticfolie om een hoes te maken. Om het risico op besmetting te verminderen, voegt u 0,02% benzalkoniumchloride toe aan het waterbad en stelt u een ander waterbad in op 36 °C voor het verwarmen van gekoeld bloed.
- Verwijder de voorbereide, geautoclaveerde membraankamers, plaats de O-ring rond de kamer (figuur 1F) en vul vervolgens elke kamer met voldoende 70% ethanol om het membraan te bedekken. Laat 5 minuten in een 6-wells plaat zitten en zoek dan naar eventuele lekken tussen de kamer en het membraan en in het membraan zelf.
OPMERKING: Als het membraan lekt, zal ethanol zich ophopen in de basis van de put. Lekkende membranen moeten worden weggegooid. - Leeg de ethanol uit de kamers en laat het vervolgens aan de lucht drogen in een bioveiligheidskast of laminaire stromingskap.
OPMERKING: Dit kan enkele minuten duren, afhankelijk van de luchtvochtigheid. - Tijdens het wachten, warmte-inactiveer het complement in het bloed door gedurende 40 minuten te verwarmen op 56 °C. Vul mechanisch gedefibrineerd runderbloed aan met 2 g/L glucose.
- Nadat het membraan droog is, brengt u ~ 20 μL phagostimulant aan op de binnenkant van de kamer en verspreidt u het vervolgens over het oppervlak door de kamer te kantelen. Zie rubriek 6 voor instructies met betrekking tot het bereiden van een phagostimulant uit tekenfrass.
- Wacht tot de phagostimulant droog is voordat u de teken met een borstel of tang aan de kamer toevoegt. Werk zo snel mogelijk bij het overbrengen van de teken naar de kamer om ontsnapping te voorkomen. Zet de teken in een buis op ijs gedurende 1-2 minuten voordat je ze overbrengt om hun vermogen om te ontsnappen te vertragen. Nadat de teken zijn overgebracht, verzegelt u de bovenkant met parafilm; span de parafilm niet te veel uit, omdat de warmte van het waterbad ervoor kan zorgen dat deze scheurt.
OPMERKING: Tangen werken het beste met nimf- en volwassen levensfasen en borstels werken het beste met larvale levensfasen. - Voeg 5 ml van het warmte-geïnactiveerde bloed per put/kamer toe aan een conische buis en plaats in het waterbad ingesteld op 36 °C. Breng gekoeld bloed op zijn minst op kamertemperatuur voordat je de teken eraan blootstelt. Zet vier kamers per 6-well plaat opzij voor eenvoudige bediening van kamers. Meer kamers per plaat moeten worden vermeden, maar afhankelijk van de grootte van het waterbad kunnen meer platen worden gebruikt.
- Voeg 5 μL 3 mM ATP en 50 μL 100x voorraad penicilline/streptomycine/fungizone per 5 ml bloed toe aan de buis.
- Breng 4,5 ml van het bloed over in een putje van een 6-wellsplaat en plaats de kamer vervolgens voorzichtig in de put, waarbij de O-ringhoogte op de kamer wordt aangepast, zodat het membraan in het bloed zit, maar de bloedspiegel rond de zijkant niet over de put heen komt. Plaats de put in het bloed onder een hoek om luchtbelvorming tussen het bloed en het membraan te voorkomen.
OPMERKING: Een voltooide plaat is weergegeven in figuur 2. - Plaats het deksel van de 6-wells plaat bovenop de voedingskamers; plaats vervolgens de 6-wellsplaat met kamers in het voorbereide waterbad van 34 °C en sluit het deksel.
OPMERKING: Het deksel aan de bovenkant helpt voorkomen dat gecondenseerd water in contact komt met de parafilm en het bloed in de putten verdunt.
3. Het onderhouden van de voedende teken door het bloed elke 12 uur te vervangen
- Aliquot 5 ml van het warmte-geïnactiveerde bloed per put in een buis en warm het op in een waterbad van 36 °C. Ontdooi de ATP en penicilline/streptomycine/fungizone tegelijkertijd in het waterbad.
- Voeg 5 μL 3 mM ATP en 50 μL 100x voorraad penicilline/streptomycine/fungizone per put toe aan de bloedbuis. Breng 4,5 ml bloed over in een putje van een verse 6-wells plaat.
- Haal de 6-wells plaat met de tekenkamer uit het waterbad. Verwijder de kamer uit de put en spoel de buitenkant van de kamer en het membraan af met 10 ml steriele 1x PBS om het bloed te verwijderen.
- Gebruik geautoclaveerd filterpapier en dep het membraan en de kamer voorzichtig om het overtollige PBS te verwijderen. Vervang de parafilm aan de bovenkant van de kamer. Als er veel condensatie in de kamer is, dep dan de natte plekken af met geautoclaveerd filterpapier voordat u ze afsluit met verse parafilm.
- Plaats de tekenkamer in de nieuwe 6-wells plaat met vers bloed en pas indien nodig de O-ringhoogte aan. Herhaal stap 3.3-3.5 voor elke kamer op de plaat. Plaats het deksel van de 6-wells plaat over de bovenkanten van de kamers. Verplaats de nieuwe 6-wells plaat terug naar het waterbad van 34 °C.
- Herhaal stap 3.1-3.5 elke 12 uur tot het einde van de tekenvoeding. Wacht tot de teken zelf loskomen van het membraan wanneer ze worden opgezwollen of verwijder ze voorzichtig van het membraan met een zacht aanvoelend pincet terwijl ze nog steeds zijn bevestigd om gedeeltelijk opgezwollen teken te verkrijgen.
4. Antischimmelbehandeling
OPMERKING: Voer alleen uit wanneer schimmelgroei op het membraan wordt gezien. Schimmel zal zich waarschijnlijk vormen aan de bloedkant van het membraan als de voeding van voldoende duur is. De eerste indicatie van schimmelbesmetting is kleine (1-3 mm) vlokken van gecoaguleerd bloed zichtbaar op het membraan. Wanneer schimmelbesmetting wordt opgemerkt, kunnen antischimmelbehandelingen de duur van het experiment verlengen en het stuwingssucces verbeteren.
- Los 10.000 U nystatine per ml op in gedestilleerd water, 5 ml per voedingskamer. Filter-steriliseer met een spuitfilter van 0,1 μm.
- Voeg 5 ml nystatine-oplossing toe per put van een nieuwe 6-wellsplaat, één put voor elke voedingskamer.
- Plaats PBS-gespoelde kamers in de oplossing. Laat 10 min zitten.
- Spoel de behandelde membranen met PBS voordat u ze terugbrengt in vers bloed.
- Herhaal de antischimmelbehandeling om de 2-3 dagen (afhankelijk van de mate van schimmelbesmetting) tot de voltooiing van het experiment.
5. Losgemaakte membranen opnieuw hechten met cyanoacrylaatlijm
OPMERKING: Voer alleen uit wanneer membraanloslating wordt opgemerkt.
- Membranen kunnen gedeeltelijk loskomen van de voedingskamers, vooral tijdens het verwijderen van de 6-wellsplaat. Als dit gebeurt, spoel dan het bloedmembraan met PBS.
- Droog het getroffen gebied voorzichtig af. Het hoeft niet perfect droog te zijn, maar de aanwezigheid van vocht zorgt ervoor dat de lijm sneller uitzet.
OPMERKING: Het opnieuw hechten van het membraan beperkt de werktijd, maar afhankelijk van de loslatingsgrootte kan een snellere insteltijd wenselijk zijn. - Knijp een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm in de opening waar het membraan uit de kamer is getrokken. Houd ~2 min op zijn plaats om de lijm te laten uitharden.
- Plaats de kamer terug in het bloed in de 6-well plaat.
6. Phagostimulant maken
OPMERKING: Voer uit aan het einde van een feed of voordat een membraanfeed is gestart.
- Verzamel tekenuitwerpselen van een eerder membraanvoer of een andere bron van het voeren van teken. Bewaar de ontlasting bij -20 °C voordat u de fagostimulant maakt. Plet de pellets van tekenuitwerpselen en meng 0,1 g per 1 ml water. Voeg 1 mM tripeptide gereduceerd glutathion toe, los op en meng grondig door vortexing.
- Filter-steriliseer met een spuitfilter van 0,1 μm.
- Vries in bij -20 °C totdat het nodig is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvolle voeding hangt af van het feit of een gedeeltelijke of volledige stuwing gewenst is. Succesvol gevoede I. scapularis worden een tint gunmetal grijs voor volwassenen en maken zich zelfstandig los van het membraan. Als ze echter ten minste erwtengroot zijn, kunnen ze bij het afronden van de voeding van het membraan worden losgemaakt. Voor onvolwassen stadia van I. scapularis varieert de grootte voor volledig gezwollen teken, en omdat ze, in tegenstelling tot volwassenen, geen kleurverandering vertonen, is onthechting de beste manier om te bepalen of een teek volledig is gezwollen. Zie figuur 3 voor een voorbeeld van hoe nymphal I. scapularis eruit kan zien tijdens een feed. Volwassen I. scapularis teken nemen 1 week of langer vanaf de aanhechting totdat ze zich beginnen los te maken van het membraan; nimfen maken vaak ongeveer 5 dagen na aanhechting los en larven beginnen ~ 3-4 dagen na de eerste aanhechting los te maken. Feeds kunnen doorgaan zolang men de tweemaal daagse bloedveranderingen wil behouden en zolang schimmel niet verder is gaan groeien dan wat antischimmelbehandeling kan beheersen. Gedeeltelijk opgezwollen teken moeten handmatig van het membraan worden losgemaakt.
Onvolgroeide teken (larven en nimfen) die zich van het membraan losmaken, vervellen bijna altijd met succes in hun volgende levensfase, en ervan uitgaande dat ze voldoende zijn opgezwollen en groot genoeg zijn, zelfs degenen die handmatig van het membraan worden losgemaakt aan het einde van een voervervelling. Vrouwelijke teken die tijdens de stuwing een gunmetal grey hebben gemaakt, leggen meestal met succes eieren. In tegenstelling tot natuurlijke voedingswijzen, produceren membraangevoede gezwollen vrouwtjes echter kleinere eimassa's en zijn ze kleiner dan hun van nature door dieren gevoede tegenhangers. Resultaten van een recent experiment dat I. scapularislarven uit eieren voedde door middel van nimfvormige stuwing en rui zijn te zien in tabel 1. De resulterende nimfen uit het oorspronkelijke larvale voer werden 2 maanden na de vervelling gevoerd. Het is echter belangrijk op te merken dat dit experiment hertenorgaanhomogenaat aan het bloed had toegevoegd, wat mogelijk schadelijke effecten had op het succes van de tekenvoeding.
In een ander experiment werden 60 vrouwelijke en 60 mannelijke I. scapularis-teken in vier voederkamers geplaatst (30 geslachtsgematchte teken per kamer) en de vrouwelijke teken mochten zich voeden om te repletie. Deze teken zijn ontstaan als de nakomelingen van gezwollen vrouwtjes verzameld van door jagers gedood hert. Het gemiddelde gewicht en bereik van de eimassa, naast de succescijfers van de stuwing (aantal vrouwtjes dat eieren legde na het stuwen en -detachement), is te zien in tabel 1. Het massagewicht van eieren voor I. scapularis is zeer variabel in de literatuur, maar teken die eerder werden verzameld van door jagers gedood hert uit Minnesota produceerden eiermassa's met een gemiddeld gewicht van 77 mg (19-147 mg)22. Tekensterfte is laag met behulp van het kunstmatige membraanvoedingssysteem; teken die zich niet hechten en voeden, overleven meestal het proces, waardoor de mogelijkheid ontstaat om verdere membraanvoedingsexperimenten met de overlevenden te proberen.
Deze methode is gebruikt om nymphal I. scapularis te infecteren met een verscheidenheid aan door teken overgedragen pathogenen, waaronder A. phagocytophilum Variant-1, die geen traditionele knaagdierinfectiemethoden kan gebruiken7. Infectie van de teken door bacteriën werd bevestigd met qPCR, en hoewel alle nimfteken die met succes werden gevoed positief waren na het voeden, zou de infectie, afhankelijk van de bacteriesoort, al dan niet transstadiaal aanhouden19. Deze methode is ook gebruikt om vrouwelijke I. scapularis ciprofloxacine te voeden; de met succes gevoede teken vertoonden een vergelijkbare knockdown van bacteriële symbiontniveaus als geïnjecteerde teken20.
Figuur 1: De tekenmembraankamer. (A) Keramisch gecoate standaardbasis bedekt met plasticfolie. (B) Lenspapier geplakt op een in plastic verpakte basis. De blauwe rechthoek is de wisser die in paneel C wordt gebruikt. (C) Lenspapier na geïmpregneerd te zijn met siliconen. (D) Kamers bevestigd aan het siliconen-rayonmembraan. Elke 4 in x 6 in lenspapier vel is geschikt voor zes kamers. (E) Een voltooide kamer met het siliconen-rayonmembraan. Een losgemaakt siliconen-rayonmembraan wordt aan de rechterkant weergegeven. (F) Een geassembleerde voltooide kamer, met daarop een O-ring bevestigd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het instellen van de tick feed. Een voorbeeld van hoe een set van vier kamers met volwassen I. scapularis eruit zal zien zodra alles is opgezet en voordat het in het waterbad wordt geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een doorlopend voer met gedeeltelijk gezwollen Ixodes scapularis nimfen. De zwarte of bruine stippen rond de aanhechtingsplaatsen (zie bijvoorbeeld label A) zijn de frass die tijdens en na de voeding kunnen worden verzameld om de phagostimulant te maken. Gedeeltelijk gezwollen I. scapularis nimfen worden gezien bevestigd aan het membraan (zie label B). Een schil van de opgezwollen larven vervellen is te zien op label C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Aantal startende teken | Aantal succesvol gezwollen teken | Gemiddelde massa van het ei in mg (bereik) | |
| Larven | 2 uitgekomen eimassa's | 150 | N.V.T |
| Nimfen | 150 | 24 | N.V.T |
| Volwassen vrouwtjes | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
Tabel 1: Tekenomgiftenummers en massagewichten van eieren. Larvale en nymphale stuwkracht experimentele omstandigheden hadden hertenorgaanhomogenaat toegevoegd aan het bloed naast de supplementen die in dit protocol worden gebruikt. Experimentele omstandigheden voor volwassen vrouwelijke stuwstoffen waren zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Succesvolle stuwing werd gedefinieerd als ofwel gezwollen teken die met succes vervellen naar de volgende levensfase of gezwollen vrouwtjes die met succes eieren legden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kunstmatige membraanvoeding van teken biedt een nuttig hulpmiddel voor een verscheidenheid aan experimentele procedures, maar zal waarschijnlijk niet voor alle toepassingen het voeren van dieren vervangen. Het onderhouden van grote kolonies teken in alle levensfasen zonder diervoeding is over het algemeen onhoudbaar. In plaats daarvan is het kunstmatige voedingssysteem waardevol voor andere doeleinden, zoals het infecteren van teken met pathogenen die niet worden ondersteund door modelgastheersers, het evalueren van de effecten van gecontroleerde doseringen van verbindingen of micro-organismen op de teken in een vereenvoudigde voedingsomgeving, of het fokken van kleine kolonies teken die afhankelijk zijn van gastheerdieren die niet direct beschikbaar zijn in het laboratorium8, 10,11,23,24,25. Vergeleken met traditionele diervoedingsmethoden is kunstmatige membraanvoeding arbeidsintensief en biedt het uitdagingen15,24. Het is om deze redenen dat kunstmatige membraanvoeding geen vervanging is voor traditionele dierlijke voedingsmethoden en in plaats daarvan experimenten mogelijk maakt die niet kunnen worden gedaan met traditionele diervoeding.
Het handhaven van hygiënische omstandigheden, zowel in de voederkamers als in de tekenkolonie, is van vitaal belang om schimmel- en bacteriële besmetting te voorkomen. Bij het gebruik van kunstmatige voeding om teken bloot te stellen aan pathogenen, moeten penicilline / streptomycine / fungizone (P / S / F) supplementen echter uit het bloed worden vermeden om te voorkomen dat de ziekteverwekkers worden gedood. Blootstelling van teken aan ciprofloxacine in het bloed kan Rickettsia buchneri, de ovariële endosymbiont van I. scapularis, volledig elimineren uit een subset van F1-nakomelingen, terwijl routinematige P / S / F-toevoeging aan bloed dit effect niet heeft20. Transovariale pathogene transmissiestudies werden niet uitgevoerd met behulp van dit systeem, maar er werden geen veranderingen opgemerkt in de vruchtbaarheid van gezwollen vrouwtjes in antibiotica-blootgestelde versus controle-experimenten. Snelle initiatie van voeding en stuwgement van teken vermijdt veel van de problemen in verband met schimmelbesmetting; om deze reden heeft het systeem de neiging om gemakkelijker te werken met larvale en nimfachtige teken, omdat ze kortere voedingstijden hebben. Periodieke behandeling van verontreinigde membranen met antischimmelmiddelen zoals nystatine kan de beschikbare tijd voor stuwing met een paar dagen verlengen. Het is ook belangrijk om teken te gebruiken die lang genoeg zijn vermolmd om gretig te zijn om te voeden. Larven zijn klaar 2 weken nadat alle larven in de eimassa de opkomst hebben voltooid, maar nimfen en volwassenen doen het beter als ze minstens 10 weken na de rui worden gebruikt.
Deze methode heeft een vergelijkbaar tekenvoedingssucces aangetoond als het gebruik van proefdieren, met typisch 30% -50% van de vrouwelijke en ongeveer 50% van de nymphale I. scapularis die de stuwproductie voltooit, vergelijkbaar met het stuwingssucces van volwassenen gevoed met laboratoriumkonijnen of nimfen gevoed met muizen of hamsters19. Evenzo hebben andere studies met behulp van kunstmatige voedingskamers een stuwingspercentage van 45% gemeld voor I. scapularis-vrouwtjes en 72% voedingssnelheid voor nimfen10,18. Ondertussen waren voor Ixodes ricinus-vrouwtjes en nimfen die via een kunstmatig membraan werden gevoed, de stuwingspercentages respectievelijk 71% en 58%,25. Daarom kunnen de resultaten variabel zijn, afhankelijk van het gebruikte systeem en de onderzochte tekensoort.
Membraandikte is een belangrijke factor in voedingssucces; dunnere membranen zijn minder goed in staat om de kleine gaatjes af te dichten die worden geproduceerd door tekenonderzoek en bevestiging. Nadat het voeren begint, komt er meer vocht in de kamer, wat kan leiden tot natte omstandigheden, de vloeibaarmaking en daaropvolgende herkleuring van frass en schimmel. Het is daarom belangrijk om membranen te produceren met de maximale dikte die aanvaardbaar is voor de tekensoort en de hypostomelengte van de levensfase die moet worden gevoed (zie protocolstappen 1.1-1.4). Nimfen van I. scapularis en Dermacentor variabilis voeden zich met membranen tussen 90 μm en 120 μm dikte, terwijl volwassenen zich voeden met membranen tot diktes van bijna 200 μm. Het volwassen I. scapularis hypostome is 500 μm lang, terwijl nimf- en larvale hypostomen ~ 100 μm lang zijn, wat voldoende blijkt om een iets dikker membraanvan 15,26 te penetreren. Rayon lens papier gemiddeld is ~ 50 μm in dikte en membranen gemaakt van het hebben een minimum van 50 μm dikte; zoals hierboven vermeld, produceren dikkere membranen echter betere resultaten. Larvale voedingsmembranen werken goed bij een dikte van 80-100 μm met behulp van een zeer licht unryu-papier (10 g / m3). Dit onregelmatige moerbeipapier is doorspekt met relatief dikke vezels die ondersteuning bieden aan een membraan dat op sommige plaatsen erg dun is, waardoor er voldoende larven kunnen worden gehecht.
Op basis van de aanbevolen membraandikte en kamergroottes is het het beste om het aantal vrouwtjes in volwassen feeds te beperken tot maximaal 20 vrouwtjes (teken worden in protocolstap 2.7 in kamers geplaatst). Meer vrouwtjes lopen het risico de hechtingsplaatsen te overbevolken, omdat de teken de neiging hebben om zeer dicht bij elkaar te hechten, wat de membraanintegriteit in de omgeving in gevaar kan brengen en het risico op een lek kan verhogen, evenals de voedingssnelheid kan vertragen. Voor nimfteken zijn de maximale aantallen veel hoger en worden er geen significante nadelige effecten opgemerkt, zelfs bij het voeren van 50 nimfen per kamer. Omdat het tellen van individuele larven niet redelijk is en er geen overbevolkingsproblemen werden opgemerkt, wordt een halve tot een hele eimassa per kamer aanbevolen voor het gemak van de installatie. Hele eimassa's bestaan uit ~ 1.000 of meer larven, en in de loop van een voer kunnen overal van tientallen tot ~ 200 gezwollen larven afvallen van een enkele eimassa. Bovendien hebben larvale teken die niet voeden de neiging om niet te sterven en kunnen ze mogelijk opnieuw worden gehuisvest voor een latere voeding.
Andere kunststoffen zijn gebruikt om de voedingskamers te produceren, waarvan is vastgesteld dat polycarbonaat het meest duurzaam en niet-reactief is. Andere kunststoffen, zoals acryl, zijn gevoelig voor reinigingsoplossingen, die crazing en breuk kunnen veroorzaken, vooral aan de gesneden uiteinden van de buis. Polycarbonaat houdt goed stand tegen blootstelling aan bleekmiddel, ethanol, autoclaveren en ultraviolette sterilisatie.
Terwijl teken in een kamer uiteindelijk kunnen bijten en zich hechten aan het membraan als gevolg van de warmteprikkel van het verwarmde bloed eronder, helpen extra stimuli in de vorm van chemische fagostimulantia dit proces te versnellen (voor het recept, zie protocol stap 6). Voor deze studie is het gebruik van tekenuitwerpselen die zijn opgelost in water ideaal vanwege hun vermogen om gedurende lange perioden bij -20 °C te worden bewaard. Ze zijn ook gemakkelijk hernieuwbaar, omdat tekenuitwerpselen kunnen worden verzameld uit volgende feeds. Natuurlijk heeft het eerste membraanvoer mogelijk geen toegang tot de voorgestelde fagostimulant van tekenuitwerpselenextract en kan het zonder het worden uitgevoerd om het te helpen produceren voor toekomstige feeds. Bovendien kunnen alternatieve fagostimulantia worden gebruikt, waarbij andere studies succes hebben met verschillende chemische of mechanische stimuli zoals haar- of haarextracten15,24.
Kunstmatige membraanvoeding biedt extra hulpmiddelen voor onderzoekers die werken in de biologie van teken- en tekenpathogenen. Het is betaalbaar en eenvoudig, maar ook arbeidsintensief en vereist waarschijnlijk enkele voorlopige tests om te optimaliseren voor hun gewenste toepassing en tekensoorten / levensfase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
- Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
- Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
- Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
- Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
- Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
- Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
- Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
- Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
- Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
- Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
- Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
- Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
- Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
- Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
- Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
- Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
- González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
- Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
- Anderson, J. F., Magnarelli, L. A.
