Summary
Hier wird eine Methode vorgestellt, um Zecken in vitro über ein künstliches Membransystem zu ernähren, um eine teilweise oder vollständige Überfüllung einer Vielzahl von Zeckenlebensstadien zu ermöglichen.
Abstract
Zecken und die damit verbundenen Krankheiten sind aufgrund ihrer Belastung für die öffentliche Gesundheit und die Veterinärmedizin ein wichtiges Studienthema. Der Fütterungsbedarf von Zecken sowohl während der Studie als auch während der Aufzucht kann jedoch experimentelle Fragen oder die Fähigkeit von Laboren, Zecken und die damit verbundenen Krankheitserreger zu erforschen, einschränken. Ein künstliches Membranfütterungssystem kann diese Probleme reduzieren und neue Forschungswege eröffnen, die mit herkömmlichen Tierfütterungssystemen möglicherweise nicht möglich gewesen wären. Diese Studie beschreibt ein künstliches Membranfütterungssystem, das für den Fütterungs- und Schwellungserfolg für alle Lebensstadien von Ixodes scapularis verfeinert wurde. Darüber hinaus kann das in dieser Studie beschriebene künstliche Membranfütterungssystem durch einfache Verfeinerung der gewünschten Membrandicke für die Verwendung mit anderen Zeckenarten modifiziert werden. Die Vorteile eines künstlichen Membranfütterungssystems werden durch die Arbeitsintensität des Systems, die zusätzlichen Umweltfaktoren, die sich auf den Fütterungserfolg auswirken können, und die Notwendigkeit, die Technik für jede neue Art und jedes neue Lebensstadium von Zecken zu verfeinern, aufgewogen.
Introduction
Durch Zecken übertragene Krankheiten haben weltweit starke Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch und Tier und waren von 2004 bis 2016 für mehr als zwei Drittel aller vektorassoziierten Erkrankungen in den USA verantwortlich1. Darüber hinaus sind die Fallzahlen in den letzten Jahren gestiegen, wobei immer mehr Menschen und Nutztiere von Zecken und den damit verbundenen Krankheiten betroffen sind 2,3. Während es wahrscheinlich zahlreiche Ursachen für den Aufwärtstrend bei den Fallzahlen gibt, ist der Klimawandel ein wichtiger Faktor 3,4. Der prognostizierte anhaltende Anstieg der Zahl der durch Zecken übertragenen Krankheitsfälle unterstreicht die Notwendigkeit, neue Instrumente zu entwickeln, um die Beziehungen zwischen Zecken und den von ihnen übertragenen Krankheitserregern zu untersuchen.
Es ist bekannt, dass Zecken während der Fütterung Veränderungen in der Physiologie und Genexpression erfahren und dass diese Veränderungen eine Rolle bei der Übertragung von Krankheitserregern spielen 5,6. Es kann schwierig sein, Studien durchzuführen, die die Auswirkungen der vollständigen und teilweisen Fütterung auf die Übertragung und den Erwerb von Krankheitserregern anhand von Tiermodellen untersuchen, insbesondere in Situationen, in denen Nagetiermodelle nicht anfällig für eine Infektion mit einem bestimmten Erreger sind. Zum Beispiel wird der Stamm Anaplasma phagocytophilum Variant-1 auf natürliche Weise zwischen Ixodes scapularis und Hirschen übertragen, ist aber nicht in der Lage, Mäuse zu infizieren, was die Zeckeninfektion im Labor erschwert7. Künstliche Fütterungssysteme können auch eingesetzt werden, um Krankheitserreger wie Borrelia burgdorferi durch den Einsatz transgener Mutanten zu untersuchen, die Gendeletionen aufweisen, die die Übertragung oder Infektion hemmen8. Die Verwendung eines künstlichen Fütterungssystems hilft den Forschern, die Rolle der Gene zu isolieren, indem eine Infektion oder Übertragung nur auf der Seite der Zecke stattfindet und dadurch jede Wirtsreaktion isoliert wird, die solche Studien verwirren könnte.
In ähnlicher Weise können einige Lebensstadien von Zecken, die an der Übertragung von Krankheiten und Tieren beteiligt sind, nicht dazu veranlasst werden, sich von gängigen Labormodellarten zu ernähren. Ixodes scapularis-Weibchen zum Beispiel müssen mit größeren Tieren, typischerweise Kaninchen, gefüttert werden9. Obwohl sie oft für Laborexperimente zugänglich sind, übersteigen die Verwaltungs- und Haltungsanforderungen für die Verwendung von Kaninchen die von kleinen Nagetieren und können für einige Laboratorien unerschwinglich sein. Andere Zeckenarten, insbesondere solche, die tierärztlich bedenklich sind, müssen mit Rindern oder anderen großen Tieren gefüttert werden, die in den meisten Laboratorien nicht praktikabel sind. In-vitro-Fütterungs - und Infektionsmethoden, wie z. B. künstliche Membranfütterung, bieten Alternativen zur Verwendung großer oder exotischer Wirtstiere.
Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines künstlichen Fütterungssystems bestimmte Analysen, die mit herkömmlichen Tierfütterungsmethoden möglicherweise nicht möglich sind. Ein Beispiel dafür ist, dass durch die Trennung der Blutquelle vom Fütterungsmechanismus die Untersuchung der Rolle, die das Blut verschiedener Wirte bei der Übertragung von B. burgdorferi spielen kann, möglich wird10. Diese Untersuchung des Wirtsblutes und der Rolle, die das Blut selbst in Abwesenheit der Immunantwort des Wirts spielt, ist ein wichtiger Faktor, um die Übertragungszyklen von Krankheitserregern zu verstehen, und einer, den künstliche Fütterungssysteme beantworten können11. Es wird auch möglich, die genauen Übertragungszahlen eines Erregers während einer Fütterung zu quantifizieren, anstatt nur den Übertragungserfolg und die Etablierung in einem Wirtzu untersuchen 8,12.
Einige der ersten künstlichen Futtermembranen für harte Zecken wurden in den 1950er und 1960er Jahren aus Tierhäuten oder tierischen Membranen hergestellt13,14. Aufgrund der biologischen Beschaffenheit dieser Membranen gab es Probleme sowohl bei der Herstellung neuer Membranen als auch bei der Haltbarkeit. In den 1990er Jahren wurden vollständig künstliche Membranen entwickelt, die eine Unterlage aus Netz, Papier oder Gewebe mit Silikonimprägnierung verwendeten15,16. Silikon war ideal, da seine physikalischen Eigenschaften die Dehnbarkeit und leichte Klebrigkeit der Haut sowie seine bioinhärente Natur nachahmen. Darauf aufbauend beschrieben Krober und Guerin, auf deren Arbeit diese Technik basierte, eine silikonimprägnierte Viskosemembran-Fütterungstechnik für die künstliche Ernährung von I. ricinus17.
Die Verfeinerung der Methoden für I. scapularis, eine eng verwandte Art, hat zu bemerkenswerten Unterschieden in der Härte von Silikon geführt, das bei der Membranimprägnierung verwendet wird, das Rezept für die Membranherstellung, die Abmessungen der Kammer und das Bindungsstimulans. Während die in dieser Studie berichteten Verfeinerungen zu ähnlichen Membraneigenschaften geführt haben wie die von Andrade et al., die auch eine Membran auf Silikonbasis auf der Basis von Krober und Guerin für den Einsatz in I. scapularis entwickelt haben, gibt es einen Unterschied in den Silikonimprägnierschritten, der die Flexibilität ermöglicht, dieses Protokoll für unreife Lebensstadien von I. scapularis15 zu verwenden. 18. Auflage. Diese Studie beschreibt auch Ergänzungen und technische Änderungen, die auf der wiederholten Anwendung dieser Methode basieren, Best Practices, die zu einem erfolgreichen Feed führen, und die Behebung von Problemen, die auftreten können. Diese Methode wurde verwendet, um alle aktiven Lebensstadien zu füttern, Zecken mit pathogenen Bakterien zu infizieren und Zecken mehreren Dosierungen von Antibiotika auszusetzen19,20. Während die gezeigte künstliche Membranfütterungsmethode für I. scapularis gilt, ist diese Methode mit geringfügigen Änderungen der Membrandicke leicht an andere Zeckenarten anpassbar.
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Protocol
1. Vorbereitung der Zeckenmembrankammer
- Bereiten Sie eine flache, nicht poröse Oberfläche vor, z. B. eine Ebene aus Glas oder eine keramikbeschichtete Metallbasis eines Armständers, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen und dann mit einer einzigen Schicht Plastikfolie abdecken, wobei Sie darauf achten, dass die Kunststofffolie flach und ohne Blasen oder Falten ist (siehe Abbildung 1A).
- Kleben Sie 100% Viskoselinsen-Reinigungspapier auf die vorbereitete Oberfläche. Stellen Sie sicher, dass es flach und leicht gespannt ist, mit Klebeband auf allen vier Seiten des Papiers. Zwei Stücke von 4 Zoll x 6 in Linsenpapier können unter Verwendung der in Schritt 1.3 beschriebenen Volumina zu Membranen verarbeitet werden.
HINWEIS: Dies reicht aus, um bis zu 12 Fütterungskammern herzustellen (siehe Abbildung 1B). Wenn die Membran für Zeckenlarven gedacht ist, verwenden Sie Unryu-Papier anstelle von Linsenreinigungspapier. - Bereiten Sie die Silikonmischung mit der Härte 00-10 vor, indem Sie 5 ml jedes Teils des Silikonkits in einen Einwegbehälter abmessen und die beiden Flüssigkeiten leicht mischen, bevor Sie 1,5 ml Hexan hinzufügen. Mischen Sie weiter, bis die Mischung homogen und gründlich gemischt ist.
HINWEIS: Wenn Sie Membranen für erwachsene Zecken herstellen, verwenden Sie Silikon mit der Härte 00-50. - Verwenden Sie einen kleinen Rakel, um die Silikonmischung über das Linsenpapier zu verteilen. 1 Minute stehen lassen, um sicherzustellen, dass das Silikon in das Linsenpapier eingedrungen ist. Überschüssiges Silikon mit dem Rakel mit etwas Druck nach unten zur Seite kratzen. Führen Sie einen zweiten Durchgang mit dem Rakel durch, ohne Druck nach unten auszuüben, um Silikonlinien zu entfernen und eine glatte Schicht zu erzeugen.
HINWEIS: Dieser Schritt des Verfahrens kann etwas Übung erfordern, um Membranen mit optimaler Dicke für jedes Lebensstadium herzustellen (Erwachsene: 150-200 μm; Nymphen: 90-120 μm; Larven: 80-100 μm). Eine dickere Membran (innerhalb der Fütterungstoleranzen des Lebensstadiums) führt in der Regel zu besseren Ergebnissen, indem sie die Kondensation in der Kammer reduziert und die Selbstheilungseigenschaften der Membran verbessert. - Tauchen Sie nur für Larven die Oberseite der Fütterungskammer mehrmals in Fluon-Fluorpolymerharz (PTFE-30), damit sie zwischen den Anwendungen trocknen kann, um eine gleichmäßige Schicht zu erzeugen.
HINWEIS: Die Anwendung von Fluon bildet eine Antihaftschicht aus Fluorpolymerharz, ähnlich einer antihaftbeschichteten Kochpfanne. Dadurch wird die Anzahl der Larven reduziert, die auf die Oberseite der Kammerklettern 21. - Lassen Sie die Membran mindestens 24 Stunden in einer staubfreien Umgebung, z. B. in einer geschlossenen Chemikalien- oder Biosicherheitswerkbank, aushärten, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. In Abbildung 1C sehen Sie , wie das Viskoselinsenpapier aussieht, nachdem das Silikon getrocknet wurde.
- Bereiten Sie die Silikonmischung mit 30 Härten vor, um die Kammern an der Membran zu befestigen, indem Sie zu gleichen Teilen die Silikonmischung A und B mischen.
- Tauchen Sie die Polycarbonatkammern etwa einen Viertelzoll (6 mm) in die Silikonmischung ein und legen Sie sie dann auf die Membranfolie, wobei darauf zu achten ist, dass sich das Klebeband nicht überlappt (Abbildung 1D).
- Lassen Sie das anhaftende Silikon mindestens 24 Stunden aushärten, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.
- Schneiden Sie die Membran vorsichtig mit einem Skalpell um jede der angebrachten Kammern herum und schneiden Sie die Kanten so ab, dass sie ohne großes Abkratzen an den Seiten problemlos in eine Vertiefung der 6-Well-Platte passt (Abbildung 1E). Lassen Sie ausreichend Material außerhalb der Kammer, um die Haftung der Membran zu maximieren.
HINWEIS: Wenn zu viel Außenmaterial übrig bleibt, kann das wiederholte Entfernen der Kammer von der 6-Well-Platte dazu führen, dass sich die Membran teilweise von der Kammer löst. Die Reparatur abgelöster Membranen wird in Abschnitt 5 beschrieben. - Schneiden Sie ein kleines Stück der übrig gebliebenen Membran aus jeder der Ecken und der Mitte der Membranfolie. Entfernen Sie die Plastikfolie von jedem Stück. Messen Sie die Teile mit einem Mikrometer, um die durchschnittliche Membrandicke zu bestimmen.
HINWEIS: Wenn die Membrandicke nicht innerhalb des Toleranzbereichs für das Lebensstadium liegt (siehe Schritt 1.4), sollten die Membranen verworfen und neu hergestellt werden. Die Dicke des Unryu-Papiers ist aufgrund seiner dicken Faserstränge und dünnen Bereiche sehr variabel. Während diese Eigenschaft es Larven ermöglicht, Regionen mit optimaler Dicke zu finden, ist es schwierig, die tatsächliche Membrandicke zu bestimmen. - Die Fütterungskammern werden zusammen mit einem O-Ring pro Kammer in ein Becherglas gegeben, das bei 121 °C für mindestens 20 Minuten zur Sterilisation autoklaviert wird. Lassen Sie die Kammern abkühlen, bevor Sie sie verwenden.
2. Einrichten des Tick-Feeds
- Bereiten Sie eine Lampe oder einen Raum so vor, dass das Licht für 16 h eingeschaltet und dann für 8 h ausgeschaltet ist. Wenn Sie eine Lampe verwenden, stellen Sie sicher, dass das Wasserbad im nächsten Schritt für diese 8 Stunden im Dunkeln ist.
- Stellen Sie ein Wasserbad bei 34 °C und mit Stützen auf, so dass eine 6-Well-Platte darin sitzen und leicht schwimmen kann. Verwenden Sie kleine Glasbecher, die im Wasserbad versenkt sind, als Stützen. Verwenden Sie eine transparente Abdeckung für das Wasserbad, um einen Hell-Dunkel-Zyklus für die Zecken aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie bei Bedarf einen T-Ständer und eine Plastikfolie, um eine Abdeckung herzustellen. Um das Kontaminationsrisiko zu verringern, geben Sie 0,02% Benzalkoniumchlorid in das Wasserbad und stellen Sie ein weiteres Wasserbad auf 36 °C ein, um das gekühlte Blut zu erwärmen.
- Nehmen Sie die vorbereiteten, autoklavierten Membrankammern heraus, legen Sie den O-Ring um die Kammer herum (Abbildung 1F) und füllen Sie dann jede Kammer mit genügend 70% igem Ethanol, um die Membran zu bedecken. Lassen Sie es 5 Minuten in einer 6-Well-Platte gut sitzen und suchen Sie dann nach Leckagen zwischen der Kammer und der Membran und in der Membran selbst.
HINWEIS: Wenn die Membran undicht ist, sammelt sich Ethanol im Boden des Bohrlochs an. Undichte Membranen sollten entsorgt werden. - Entleeren Sie das Ethanol aus den Kammern und lassen Sie es dann in einer Biosicherheitswerkbank oder einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen.
HINWEIS: Dies kann je nach Luftfeuchtigkeit einige Minuten dauern. - Während der Wartezeit wird das Komplement im Blut durch Erhitzen bei 56 °C für 40 Minuten hitzeinaktiviert. Ergänzen Sie mechanisch defibriniertes Rinderblut mit 2 g/L Glukose.
- Nachdem die Membran trocken ist, tragen Sie ~ 20 μL Phagostimulans auf das Innere der Kammer auf und verteilen Sie es dann auf der Oberfläche, indem Sie die Kammer kippen. Siehe Abschnitt 6 für Anweisungen zur Herstellung eines Phagostimulans aus Zeckenfrass.
- Warten Sie, bis das Phagostimulans trocken ist, bevor Sie die Zecken mit einer Bürste oder einer Pinzette in die Kammer geben. Arbeiten Sie so schnell wie möglich, wenn Sie die Zecken in die Kammer übertragen, um ein Entweichen zu verhindern. Legen Sie die Zecken für 1-2 Minuten in ein Röhrchen auf Eis, bevor Sie sie übertragen, um ihre Fluchtfähigkeit zu verlangsamen. Nachdem die Zecken übertragen wurden, versiegeln Sie die Oberseite mit Parafilm; Überdehnen Sie den Parafilm nicht, da die Hitze des Wasserbades dazu führen kann, dass er reißt.
HINWEIS: Pinzetten funktionieren am besten mit Nymphen- und Erwachsenenlebensstadien und Bürsten funktionieren am besten mit Larvenlebensstadien. - 5 ml des wärmeinaktivierten Blutes pro Vertiefung/Kammer in ein konisches Röhrchen geben und in das bei 36 °C eingestellte Wasserbad geben. Bringen Sie gekühltes Blut mindestens auf Raumtemperatur, bevor Sie die Zecken ihm aussetzen. Stellen Sie vier Kammern pro 6-Well-Platte zur Verfügung, um die Handhabung der Kammern zu erleichtern. Mehr Kammern pro Platte sollten vermieden werden, je nach Größe des Wasserbades können jedoch mehr Platten verwendet werden.
- Geben Sie 5 μL 3 mM ATP und 50 μL 100x Penicillin/Streptomycin/Fungizone pro 5 ml Blut in das Röhrchen.
- Übertragen Sie 4,5 ml des Blutes in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und legen Sie dann die Kammer vorsichtig in die Vertiefung, wobei Sie die Höhe des O-Rings auf der Kammer so einstellen, dass die Membran im Blut sitzt, aber der Blutspiegel um die Seite herum nicht über die Vertiefung hinausragt. Platzieren Sie die Vertiefung in einem Winkel im Blut, um die Bildung von Luftblasen zwischen dem Blut und der Membran zu vermeiden.
HINWEIS: Eine fertige Platte ist in Abbildung 2 dargestellt. - Legen Sie den Deckel der 6-Well-Platte auf die Fütterungskammern. Anschließend die 6-Well-Platte mit den Kammern in das vorbereitete 34 °C warme Wasserbad geben und den Deckel schließen.
HINWEIS: Der Deckel auf der Oberseite verhindert, dass kondensiertes Wasser mit dem Parafilm in Kontakt kommt und das Blut in den Vertiefungen verdünnt.
3. Aufrechterhaltung der fütternden Zecken durch Wechsel des Blutes alle 12 Stunden
- Aliquot 5 ml des wärmeinaktivierten Blutes pro Vertiefung in ein Röhrchen geben und in einem 36 °C warmen Wasserbad erwärmen. Tauen Sie ATP und Penicillin / Streptomycin / Pilzzone gleichzeitig im Wasserbad auf.
- Geben Sie 5 μL 3 mM ATP und 50 μL 100x Penicillin/Streptomycin/Fungizone pro Vertiefung in das Blutröhrchen. Übertragen Sie 4,5 ml Blut in eine Vertiefung einer frischen 6-Well-Platte.
- Nehmen Sie die 6-Well-Platte mit der Zeckenkammer aus dem Wasserbad. Nehmen Sie die Kammer aus dem Brunnen und spülen Sie die Außenseite der Kammer und der Membran mit 10 ml sterilem 1x PBS, um das Blut zu entfernen.
- Tupfen Sie die Membran und die Kammer mit autoklaviertem Filterpapier vorsichtig trocken, um das überschüssige PBS zu entfernen. Setzen Sie den Parafilm auf der Oberseite der Kammer wieder ein. Wenn sich in der Kammer viel Kondenswasser befindet, tupfen Sie die nassen Stellen mit autoklaviertem Filterpapier ab, bevor Sie sie mit frischem Parafilm verschließen.
- Legen Sie die Zeckenkammer in die neue 6-Well-Platte mit frischem Blut und passen Sie bei Bedarf die Höhe des O-Rings an. Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.5 für jede Kammer auf der Platte. Legen Sie den Deckel der 6-Well-Platte über die Oberseite der Kammern. Schieben Sie die neue 6-Well-Platte zurück in das 34 °C warme Wasserbad.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.5 alle 12 Stunden bis zum Abschluss des Zeckenfutters. Warten Sie, bis sich die Zecken von selbst von der Membran lösen, wenn sie geschwollen sind, oder entfernen Sie sie vorsichtig mit einer Soft-Touch-Pinzette, während sie noch befestigt sind, um teilweise verstopfte Zecken zu erhalten.
4. Antimykotische Behandlung
HINWEIS: Nur durchführen, wenn Pilzwachstum auf der Membran zu sehen ist. Es ist wahrscheinlich, dass sich Pilze auf der Blutseite der Membran bilden, wenn die Fütterung von ausreichender Dauer ist. Der erste Hinweis auf eine Pilzkontamination sind kleine (1-3 mm) Flocken aus geronnenem Blut, die auf der Membran sichtbar sind. Wenn eine Pilzkontamination festgestellt wird, können antimykotische Behandlungen die Dauer des Experiments verlängern und den Schwellungserfolg verbessern.
- Lösen Sie 10.000 U Nystatin pro ml in destilliertem Wasser auf, 5 ml pro Fütterungskammer. Filtersterilisieren Sie mit einem 0,1 μm Spritzenvorsatzfilter.
- Fügen Sie 5 ml Nystatinlösung pro Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte hinzu, eine Vertiefung für jede Fütterungskammer.
- Legen Sie PBS-gespülte Kammern in die Lösung. 10 min einwirken lassen.
- Spülen Sie die behandelten Membranen mit PBS ab, bevor Sie sie wieder in frisches Blut geben.
- Wiederholen Sie die antimykotische Behandlung alle 2-3 Tage (abhängig vom Ausmaß der Pilzbefallung) bis zum Abschluss des Experiments.
5. Abgelöste Membranen mit Cyanacrylat-Kleber wieder verkleben
HINWEIS: Nur durchführen, wenn eine Membranablösung bemerkt wird.
- Membranen können sich teilweise von den Zuführkammern lösen, insbesondere während der Entnahme von der 6-Well-Platte. Wenn dies geschieht, spülen Sie die Blutmembran mit PBS.
- Trocknen Sie die betroffene Stelle vorsichtig ab. Es muss nicht perfekt trocken sein, aber das Vorhandensein von Feuchtigkeit führt dazu, dass der Klebstoff schneller aushärtet.
HINWEIS: Das Wiederverkleben der Membran begrenzt die Arbeitszeit, je nach Ablösungsgröße kann jedoch eine schnellere Abbindezeit wünschenswert sein. - Drücken Sie eine kleine Menge Cyanacrylat-Kleber in den Spalt, in dem sich die Membran von der Kammer entfernt hat. Halten Sie es für ~ 2 Minuten an Ort und Stelle, damit der Kleber aushärten kann.
- Legen Sie die Kammer wieder in das Blut in der 6-Well-Platte.
6. Herstellung von Phagostimulans
HINWEIS: Führen Sie die Durchführung am Ende eines Feeds oder vor dem Start eines Membranfeeds durch.
- Sammeln Sie Zeckenkot entweder von einer vorherigen Membranfütterung oder einer anderen Quelle von Zecken. Lagern Sie den Kot bei -20 °C, bevor Sie das Phagostimulans herstellen. Zerkleinern Sie die Pellets von Zeckenkot und mischen Sie 0,1 g pro 1 ml Wasser. Fügen Sie 1 mM Tripeptid reduziertes Glutathion hinzu, lösen Sie es auf und mischen Sie es gründlich durch Vortexen.
- Filtersterilisieren Sie mit einem 0,1 μm Spritzenvorsatzfilter.
- Bei -20 °C einfrieren, bis sie benötigt werden.
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Representative Results
Eine erfolgreiche Fütterung hängt davon ab, ob eine Teil- oder Vollverstopfung gewünscht wird. Erfolgreich gefütterte I. scapularis färben sich für Erwachsene grau und lösen sich von selbst von der Membran. Wenn sie jedoch mindestens erbsengroß sind, können sie sich nach Beendigung der Fütterung von der Membran lösen. Bei unreifen Stadien von I. scapularis variiert die Größe für vollständig geschwollene Zecken, und da sie im Gegensatz zu Erwachsenen keine Farbänderung aufweisen, ist die Ablösung der beste Weg, um festzustellen, ob eine Zecke vollständig geschwollen ist. In Abbildung 3 sehen Sie ein Beispiel dafür, wie die Nymphe I. scapularis während einer Fütterung aussehen kann. Erwachsene I. scapularis-Zecken brauchen 1 Woche oder länger von der Anheftung, bis sie sich von der Membran lösen; Nymphen lösen sich oft etwa 5 Tage nach der Anheftung, und Larven beginnen sich ~ 3-4 Tage nach der ersten Anheftung zu lösen. Die Fütterung kann so lange fortgesetzt werden, wie man die zweimal täglichen Blutveränderungen aufrechterhalten möchte und solange der Schimmel nicht über das hinausgewachsen ist, was eine antimykotische Behandlung kontrollieren kann. Teilweise verstopfte Zecken müssen manuell von der Membran gelöst werden.
Unreife Zecken (Larven und Nymphen), die sich von selbst von der Membran lösen, häuten sich fast immer erfolgreich in ihr nächstes Lebensstadium, und unter der Annahme, dass sie ausreichend geschwollen sind und groß genug sind, auch solche, die sich am Ende einer Futterhäutung manuell von der Membran lösen. Weibliche Zecken, die sich während der Schwellung grau verfärbt haben, legen in der Regel erfolgreich Eier. Im Gegensatz zu natürlichen Fütterungsmethoden produzieren membrangefütterte Weibchen jedoch kleinere Eimassen und sind kleiner als ihre natürlich tierisch gefütterten Gegenstücke. Die Ergebnisse eines kürzlich durchgeführten Experiments, bei dem I. scapularis-Larven aus Eiern durch Nymphenschwellung und Häutung gefüttert wurden, sind in Tabelle 1 zu sehen. Die resultierenden Nymphen aus dem ersten Larvenfutter wurden 2 Monate nach der Häutung gefüttert. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diesem Experiment dem Blut Hirschorganhomogenat zugesetzt wurde, was sich nachteilig auf den Erfolg der Zeckenfütterung ausgewirkt haben könnte.
In einem anderen Experiment wurden 60 weibliche und 60 männliche I. scapularis-Zecken in vier Futterkammern (30 geschlechtsangepasste Zecken pro Kammer) platziert und die weiblichen Zecken durften sich bis zur Sättigung ernähren. Diese Zecken entstanden als Nachkommen von Weibchen, die von Jägern getöteten Hirschen gesammelt wurden. Das mittlere Gewicht und die Reichweite der Eimasse sowie die Anzahl der Schwellerfolge (Anzahl der Weibchen, die nach der Schwellung und -ablösung Eier legten) sind in Tabelle 1 ersichtlich. Das Gewicht der Eimasse für I. scapularis ist in der Literatur sehr variabel, aber Zecken, die zuvor von von Jägern getöteten Hirschen aus Minnesota gesammelt wurden, produzierten Eiermassen mit einem Durchschnittsgewicht von 77 mg (19-147 mg)22. Die Zeckensterblichkeit ist mit dem künstlichen Membranfütterungssystem gering; Zecken, die sich nicht anheften und ernähren, überleben den Prozess meistens, was die Möglichkeit erhöht, weitere Membranfütterungsexperimente mit den Überlebenden zu versuchen.
Diese Methode wurde verwendet, um die Nymphe I. scapularis mit einer Vielzahl von durch Zecken übertragenen Krankheitserregern zu infizieren, einschließlich A. phagocytophilum Variant-1, die keine herkömmlichen Nagetierinfektionsmethoden verwenden können7. Die Infektion der Zecken durch Bakterien wurde mit qPCR bestätigt, und während alle Nymphenzecken, die erfolgreich gefüttert wurden, nach der Fütterung positiv waren, würde die Infektion je nach Bakterienart transstadiell bestehen bleiben oder nicht19. Diese Methode wurde auch verwendet, um weibliche I. scapularis Ciprofloxacin zu füttern; Die erfolgreich gefütterten Zecken zeigten einen vergleichbaren Rückgang der bakteriellen Symbiontenspiegel wie injizierte Zecken20.
Abbildung 1: Die Zeckenmembrankammer . (A) Keramikbeschichteter Ständerfuß, der mit Plastikfolie bedeckt ist. (B) Linsenpapier, das auf eine in Plastikfolie eingewickelte Unterlage geklebt ist. Das blaue Rechteck ist der Rakel, der in Panel C verwendet wird. (C) Linsenpapier nach der Imprägnierung mit Silikon. (D) Kammern, die an der Silikon-Viskose-Membran befestigt sind. Jedes 4 Zoll x 6 Zoll Linsenpapierblatt bietet Platz für sechs Kammern. (E) Eine fertige Kammer mit der Silikon-Viskose-Membran. Rechts ist eine abgelöste Silikon-Viskose-Membran zu sehen. (F) Eine zusammengebaute fertige Kammer, an der ein O-Ring befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Einrichten des Tick-Feeds. Ein Beispiel dafür, wie ein Satz von vier Kammern mit adultem I. scapularis aussehen wird, wenn alles eingerichtet ist und bevor es in das Wasserbad gelegt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Eine laufende Fütterung mit teilweise verstopften Ixodes scapularis-Nymphen . Die schwarzen oder braunen Punkte um die Befestigungsstellen (siehe z. B. Etikett A) sind die Fraße, die während und nach der Fütterung gesammelt werden können, um das Phagostimulans herzustellen. Teilweise verstopfte I. scapularis-Nymphen sind an der Membran befestigt (siehe Etikett B). Eine Schale der Häutung der geschwollenen Larven ist auf dem Etikett C zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Anzahl der Start-Ticks | Anzahl der erfolgreich verstopften Zecken | Durchschnittliche Masse der Eiermasse in mg (Bereich) | |
| Larven | 2 ausgebrütete Eimassen | 150 | N/A |
| Nymphen | 150 | 24 | N/A |
| Erwachsene Weibchen | 60 | 18 | 42.5 (5.3-77.8) |
Tabelle 1: Zeckenschwellungszahlen und Eimassengewichte. Unter den experimentellen Bedingungen der Larven- und Nymphenverstopfung wurde dem Blut zusätzlich zu den in diesem Protokoll verwendeten Ergänzungen ein Hirschorganhomogenat zugesetzt. Die experimentellen Bedingungen für die adulte weibliche Engorgement waren wie im obigen Protokoll beschrieben. Erfolgreiche Verstopfung wurde definiert als entweder verstopfte Zecken, die sich erfolgreich zum nächsten Lebensstadium häuteten, oder verstopfte Weibchen, die erfolgreich Eier legten.
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Discussion
Die künstliche Membranfütterung von Zecken ist ein nützliches Werkzeug für eine Vielzahl von experimentellen Verfahren, wird aber wahrscheinlich nicht für alle Anwendungen die Tierfütterung ersetzen. Die Erhaltung großer Zeckenkolonien in allen Lebensstadien ohne Tierfütterung ist in der Regel unhaltbar. Stattdessen ist das künstliche Fütterungssystem für andere Zwecke wertvoll, wie z. B. die Infektion von Zecken mit Krankheitserregern, die nicht von Modellwirten unterstützt werden, die Bewertung der Auswirkungen kontrollierter Dosierungen von Verbindungen oder Mikroorganismen auf die Zecken in einer vereinfachten Fütterungsumgebung oder die Aufzucht kleiner Zeckenkolonien, die auf Wirtstiere angewiesen sind, die im Labor nicht ohne weiteres verfügbar sind8. 10,11,23,24,25. Im Vergleich zu herkömmlichen Tierfütterungsmethoden ist die künstliche Membranfütterung arbeitsintensiv und stellt eine Herausforderungdar 15,24. Aus diesen Gründen ist die künstliche Membranfütterung kein Ersatz für traditionelle tierische Fütterungsmethoden, sondern ermöglicht Experimente, die mit der traditionellen Tierfütterung nicht durchgeführt werden können.
Die Aufrechterhaltung hygienischer Bedingungen sowohl in den Futterkammern als auch in der Zeckenkolonie ist von entscheidender Bedeutung, um eine Pilz- und Bakterienkontamination zu vermeiden. Bei der künstlichen Fütterung von Zecken gegenüber Krankheitserregern sollten jedoch Penicillin/Streptomycin/Fungizone (P/S/F)-Präparate aus dem Blut vermieden werden, um eine Abtötung der Krankheitserreger zu vermeiden. Die Zeckenexposition gegenüber Ciprofloxacin im Blut kann Rickettsia buchneri, den Ovarialendosymbionten von I. scapularis , vollständig aus einer Untergruppe der F1-Nachkommen eliminieren, während die routinemäßige P / S / F-Zugabe zum Blut diesen Effekt nicht hat20. Transovarielle Erregerübertragungsstudien wurden mit diesem System nicht durchgeführt, aber es wurden keine Veränderungen in der Fruchtbarkeit von verstopften Weibchen in Antibiotika-exponierten versus Kontrollexperimenten festgestellt. Der schnelle Beginn der Fütterung und Anschwellung von Zecken vermeidet viele der Probleme, die mit der Pilzkontamination verbunden sind. Aus diesem Grund neigt das System dazu, leichter mit Larven- und Nymphenzecken zu arbeiten, da sie kürzere Fütterungszeiten haben. Die regelmäßige Behandlung von kontaminierten Membranen mit Antimykotika wie Nystatin kann die für die Schwellung verfügbare Zeit um einige Tage verlängern. Es ist auch wichtig, Zecken zu verwenden, die lange genug gehäutet wurden, um eifrig zu füttern. Larven sind 2 Wochen nach Abschluss des Auftauchens aller Larven in der Eimasse fertig, aber Nymphen und Erwachsene schneiden besser ab, wenn sie mindestens 10 Wochen nach der Häutung verwendet werden.
Diese Methode hat einen vergleichbaren Zeckenfütterungserfolg wie bei der Verwendung von Labortieren gezeigt, wobei typischerweise 30 % bis 50 % der weiblichen und etwa 50 % der Nymphe I. scapularis die Schwellung abschließen, vergleichbar mit dem Schwellungserfolg von Erwachsenen, die mit Laborkaninchen gefüttert wurden, oder Nymphen, die mit Mäusen oder Hamstern gefüttert wurden19. In ähnlicher Weise haben andere Studien mit künstlichen Futterkammern eine Schwellungsrate von 45% für I. scapularis-Weibchen und 72% für Nymphen berichtet10,18. Bei Ixodes ricinus-Weibchen und Nymphen, die über eine künstliche Membran gefüttert wurden, betrugen die Schwellungsraten 71% bzw. 58%25. Daher können die Ergebnisse je nach verwendetem System und untersuchter Zeckenart variieren.
Die Membrandicke ist ein wichtiger Faktor für den Fütterungserfolg. Dünnere Membranen sind weniger in der Lage, die winzigen Löcher abzudichten, die durch Zeckensondierung und -anheftung entstehen. Nach Beginn der Fütterung gelangt mehr Feuchtigkeit in die Kammer, was zu Nässe, Verflüssigung und anschließendem Nachtrocknen von Frass und Schimmel führen kann. Es ist daher wichtig, Membranen in der maximalen Dicke zu produzieren, die für die Zeckenart und die Hypostomlänge des Lebensstadiums, die gefüttert werden soll, tolerierbar ist (siehe Protokollschritte 1.1-1.4). Nymphen von I. scapularis und Dermacentor variabilis ernähren sich von Membranen zwischen 90 μm und 120 μm Dicke, während sich Erwachsene von Membranen bis zu einer Dicke von fast 200 μm ernähren. Das adulte Hypostom I. scapularis ist 500 μm lang, während Nymphen- und Larvenhypostome ~100 μm lang sind, was sich als ausreichend erweist, um eine etwas dickere Membran zu durchdringen15,26. Viskoselinsenpapier ist im Durchschnitt ~ 50 μm dick und Membranen aus ihm haben eine Dicke von mindestens 50 μm; Wie bereits erwähnt, führen dickere Membranen jedoch zu besseren Ergebnissen. Larvenfütterungsmembranen funktionieren gut bei einer Dicke von 80-100 μm mit einem sehr leichten Unryu-Papier (10 g/m3). Dieses unregelmäßige Maulbeerpapier ist mit relativ dicken Fasern geschnürt, die eine Membran stützen, die stellenweise sehr dünn ist und reichlich Larvenanhaftungsstellen ermöglicht.
Basierend auf der empfohlenen Membrandicke und Kammergröße ist es am besten, die Anzahl der Weibchen in erwachsenen Futtermitteln auf maximal 20 Weibchen zu begrenzen (Zecken werden in Protokollschritt 2.7 in Kammern gesetzt). Mehr Weibchen riskieren, die Befestigungsstellen zu überfüllen, da die Zecken dazu neigen, sich sehr eng aneinander zu heften, was die Integrität der Membran in der Umgebung beeinträchtigen und das Risiko eines Lecks erhöhen sowie die Fütterungsrate verlangsamen kann. Für Nymphenzecken sind die maximalen Zahlen viel höher und es werden keine signifikanten nachteiligen Auswirkungen festgestellt, selbst wenn 50 Nymphen pro Kammer gefüttert werden. Da das Zählen einzelner Larven nicht sinnvoll ist und keine Überbelegungsprobleme festgestellt wurden, wird eine halbe bis eine ganze Eimasse pro Kammer empfohlen, um die Einrichtung zu erleichtern. Ganze Eimassen bestehen aus ~ 1.000 oder mehr Larven, und im Laufe einer Fütterung können Dutzende bis ~ 200 verstopfte Larven von einer einzigen Eimasse abfallen. Darüber hinaus neigen Larvenzecken, die sich nicht ernähren, dazu, nicht zu sterben und können möglicherweise für eine spätere Fütterung umgesiedelt werden.
Für die Herstellung der Zuführkammern wurden andere Kunststoffe verwendet, von denen Polycarbonat als das langlebigste und nicht reaktive Polycarbonat eingestuft wurde. Andere Kunststoffe, wie z. B. Acryl, reagieren empfindlich auf Reinigungslösungen, die zu Rissen und Brüchen führen können, insbesondere an den abgeschnittenen Enden der Schläuche. Polycarbonat hält Bleichmittel, Ethanol, Autoklavieren und UV-Sterilisation stand.
Während Zecken in einer Kammer aufgrund des Wärmereizes des erwärmten Blutes darunter schließlich beißen und sich an der Membran festsetzen können, helfen zusätzliche Reize in Form von chemischen Phagostimulanzien, diesen Prozess zu beschleunigen (für das Rezept siehe Protokollschritt 6). Für diese Studie ist die Verwendung von Zeckenkot, der in Wasser gelöst wurde, ideal, da er bei -20 °C über lange Zeiträume haltbar ist. Sie sind auch leicht erneuerbar, da Zeckenkot aus nachfolgenden Futtermitteln gesammelt werden kann. Natürlich hat das erste Membranfutter möglicherweise keinen Zugang zu dem vorgeschlagenen Phagostimulans aus Zeckenkotextrakt und kann ohne es durchgeführt werden, um es für zukünftige Futtermittel zu produzieren. Darüber hinaus können alternative Phagostimulanzien verwendet werden, wobei andere Studien mit verschiedenen chemischen oder mechanischen Stimuli wie Haaren oder Haarextrakten erfolgreich waren15,24.
Die künstliche Membranfütterung bietet Forschern, die in der Biologie von Zecken und durch Zecken übertragenen Krankheitserregern arbeiten, zusätzliche Werkzeuge. Es ist erschwinglich und einfach, aber auch arbeitsintensiv und erfordert wahrscheinlich einige vorläufige Tests, um für die gewünschte Anwendung und die Zeckenarten / das Lebensstadium zu optimieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
| 00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
| 30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
| 6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
| Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
| Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
| Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
| Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
| Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
| Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
| Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
| Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
| Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
| Super glue | cyanoacrylate glue | ||
| Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |
References
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