Summary
L'obiettivo di questo studio è dimostrare la fattibilità della separazione basata sulla flottazione per isolare, attivare ed espandere le cellule T umane primarie.
Abstract
Il processo di isolamento delle cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per stabilire colture ex vivo è cruciale per la ricerca, i test clinici e le terapie basate sulle cellule. In questo studio, viene presentato un protocollo semplice e nuovo per isolare, attivare ed espandere le cellule T dalle PBMC ex vivo . Questo studio utilizza la tecnologia di selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità (BACS) funzionalizzata per isolare e attivare le cellule T. In breve, il protocollo prevede la selezione positiva di cellule CD3+ da PBMC derivate da leukopak, seguita da una co-stimolazione di 48 ore con microbolle di streptavidina pre-coniugate anti-CD28-legate (SAMB) prima della trasduzione in piastre a 24 pozzetti. Le microbolle funzionalizzate offrono un'opportunità unica per attivare le cellule, portando a fenotipi proliferativi che consentono l'espansione con un esaurimento minimo. Questa tecnica offre un esaurimento ridotto perché le microbolle co-stimolatorie rimangono galleggianti e ritornano in cima al terreno di coltura, riducendo così la quantità di tempo in cui le cellule in espansione sono in contatto con i fattori co-stimolatori. I risultati indicano che le cellule T isolate e coltivate ricevono una stimolazione sufficiente per attivarsi e proliferare ma non in misura tale da portare a una sovraattivazione, che porta quindi all'esaurimento, come dimostrato dalla presenza di PD-1 eccessivo.
Introduction
Più di 500 studi clinici sulla terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-T sono attualmente condotti in tutto il mondo e quattro prodotti di terapia cellulare CAR-T sono disponibili sul mercato1. Tuttavia, esistono ancora numerose esigenze di ricerca e produzione di cellule CAR-T che devono essere affrontate per migliorare l'efficacia, la scalabilità e il successo a lungo termine di queste terapie potenzialmente curative 2,3,4,5. La ricerca clinica e la produzione di cellule CAR-T adottive inizia con l'isolamento delle cellule T da un campione di sangue periferico e la successiva stimolazione, trasduzione ed espansione delle cellule isolate. Parametri come il recupero delle cellule T, la purezza e i segnali di attivazione/esaurimento richiedono un'attenta considerazione quando si scelgono le tecniche di isolamento e stimolazione cellulare per la ricerca e la produzione di cellule CAR-T 3,4,6. È importante sottolineare che è necessario migliorare la persistenza terapeutica delle terapie cellulari CAR-T riducendo al minimo gli impedimenti biologici derivanti dagli attuali processi di produzione, come l'esaurimento delle cellule T, per migliorare l'efficacia terapeutica 6,7.
In alternativa ai tradizionali metodi di isolamento cellulare come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS), qui viene dimostrata la selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità (BACS) con microbolle per l'isolamento delle cellule T. La separazione delle microbolle utilizza microsfere galleggianti e cave (microbolle) per legare i bersagli e farli galleggiare sulla superficie dei campioni di fluido 8,9. Funzionalizzando le microbolle con anticorpi (cioè anti-CD3), le popolazioni di cellule T desiderate possono essere selezionate positivamente da campioni di sangue periferico. Successivamente, in questo lavoro viene dimostrato l'uso di una diversa popolazione di microbolle funzionalizzate con anticorpi (cioè anti-CD28) per co-stimolare e attivare cellule T selezionate positivamente in sospensione. Le microbolle offrono un flusso di lavoro di isolamento e attivazione semplice e altamente sintonizzabile che genera cellule T pronte per la coltura cellulare sospesa e applicazioni a valle come la modificazione genetica e l'espansione. Criticamente, l'attivazione cellulare galleggiante con microbolle promuove la stimolazione cellulare trattenuta per prevenire un eccessivo esaurimento delle cellule T7.
Per questo studio, la citometria a flusso è stato lo strumento principale utilizzato per analizzare l'isolamento, l'attivazione e il successo della trasduzione delle microbolle funzionalizzate, nonché per fornire informazioni dettagliate sulle sottopopolazioni specifiche presenti durante le fasi di crescita ed espansione post-trasduzione. Oltre alla citometria a flusso, sono stati utilizzati microscopi a campo chiaro e a fluorescenza per confermare la salute cellulare, la morfologia e il successo della trasduzione. Sulla base di questi risultati, la tecnologia e il protocollo a microbolle forniscono un'alternativa più sintonizzabile e delicata ai tradizionali metodi di isolamento e attivazione attualmente in uso; in particolare, le cellule attivate da microbolle mostrano un'espressione notevolmente inferiore dei marcatori di esaurimento delle cellule T rispetto a quella tipicamente osservata con strumenti e kit standard del settore.
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Protocol
1. Isolamento delle cellule T con microbolle mediante selezione positiva
NOTA: questo protocollo descrive in dettaglio un approccio di selezione positiva CD3+ su piccola scala utilizzando SAMB.
- Incubare 3 x 108 PBMC ottenute commercialmente in 2,5 mL di tampone di separazione con anticorpo anti-CD3 biotinilato (OKT3) ad una concentrazione di 25 ng di anticorpo per 1 milione di cellule (25 ng/M). Mescolare delicatamente pipettando su e giù e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Aggiungere microbolle di streptavidina (SAMB) in un rapporto di 0,5 (quantità SAMB): 1 (quantità di celle) in base alla concentrazione SAMB riportata dal produttore.
- Miscelare utilizzando un rotatore end-over-end commerciale (EOE) a 20 giri/min per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare per 5 minuti a 400 x g a temperatura ambiente.
- Dopo la centrifugazione, le celle selezionate positivamente saranno nella parte superiore della sospensione con i SAMB. Le restanti celle non selezionate saranno nel pellet cellulare sul fondo del tubo. Utilizzando una pipetta di vetro da 9 pollici, inserire la punta sotto lo strato di bubble-cell sul fondo del tubo, aspirare il pellet cellulare e il subnatante con una pipetta elettronica e trasferirli in un nuovo tubo.
2. Co-stimolazione (attivazione) delle cellule T selezionate positivamente
- Risospendere lo strato di bubble-cell rimanente nel tubo originale in 1 mL di mezzo completo di cellule T (o un altro mezzo desiderato).
- Contare le cellule nel subnatante con microscopia a campo chiaro utilizzando un contatore automatico delle celle e sottrarre questo valore dal numero di cella iniziale per determinare il numero di cellule catturate nello strato di cellule a bolle.
- Prima di questa fase, mescolare l'anticorpo anti-CD28 biotinilato con SAMB commerciali per un minimo di 2 ore per creare i SAMB anti-CD28 coniugati. Contattare il produttore SAMBs per determinare la quantità di anticorpi anti-CD28 necessari per la coniugazione. Aggiungere i SAMB coniugati anti-CD28 alla sospensione a celle a bolle risultante dal punto 2.1 utilizzando un rapporto di 1,5 (SAMB anti-CD28):1 (celle).
- Miscelare utilizzando la rotazione EOE per 15 minuti, quindi regolare il volume totale a 2 milioni di cellule per ml con mezzo di cellule T completo o un altro mezzo desiderato in base al numero di cellule ottenuto al punto 2.2.
3. Espansione delle cellule co-stimolate in terreno di coltura cellulare
- Distribuire 1 mL di cellule attivate dalla fase 2.4 ad una concentrazione di 2 M/mL per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Incubare in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C.
- Dopo 24 ore, aggiungere 50 U/mL di IL-2 e 25 ng/M di anti-CD3 solubile (OKT3) per favorire ulteriormente l'espansione, come calcolato utilizzando il numero iniziale di cellule placcate il giorno 0. Riporre la piastra cellulare nell'incubatore a CO2 umidificata e lasciarla incubare per una notte a 37 °C.
4. Opzionale: Trasduzione delle cellule T attivate con lentivirus
NOTA: L'approccio utilizzato qui è adattato da Prommersberger et al. 10.
- Scongelare il lentivirus a temperatura ambiente e mescolare brevemente mediante pipettaggio.
- Rimuovere delicatamente il mid-natante, 600 μL da ciascun pozzetto, senza toccare le cellule figlie che ora si trovano sul fondo del pozzetto o lo strato di bolle che è rimasto sulla superficie della soluzione.
- Aggiungere 5 μg/mL di bromuro di esadimetrina per pozzetto per migliorare la trasduzione virale. Aggiungere le particelle lentivirali a una molteplicità di infezione (MOI) di 3 (particelle lentivirali per cellula).
- Centrifugare la piastra per 45 minuti a 800 x g e 32 °C utilizzando un'accelerazione lenta e nessuna interruzione per la decelerazione. Incubare le cellule per 4 ore in un incubatore a CO2 umidificato a 37 °C.
- Dopo 4 ore, aggiungere 600 μL di terreno di coltura T fresco e completo disponibile in commercio e 50 U/ml di IL-2 a ciascun pozzetto, e riposizionare la piastra cellulare nell'incubatore di CO2 umidificata a 37 °C per l'espansione delle cellule T.
5. Espansione delle cellule T (con o senza trasduzione precedente)
- Ogni 2 giorni, rimuovere metà del terreno dal mid-natante, sostituirlo con un mezzo di cellule T fresco e completo e aggiungere IL-2 ad una concentrazione di 50 U / mL.
- Contare le cellule T due volte alla settimana per valutare la densità cellulare. Quando la densità cellulare supera 2 x 10 6-2,5 x 106 cellule / ml, trasferire le cellule in un recipiente più grande, diluendoli a 5 x 105 cellule / ml.
6. Raccolta delle cellule T e citometria a flusso
- Mescolare delicatamente il contenuto di ciascun pozzetto pipettando su e giù. Rimuovere l'intero contenuto del pozzetto, comprese le microbolle, e trasferirle in un tubo da 1,5 ml.
- Lavare ogni pozzetto con 400 μL di DPBS senza calcio e magnesio (−/−) e trasferire la soluzione in un tubo da 1,5 ml. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 50 μL di tampone di separazione.
- Colorare con un cocktail anticorpale/colorante di attivazione e esaurimento e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Preparare i cocktail di colorazione come segue: cocktail di attivazione: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; cocktail di esaurimento: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
- Aggiungere 1 mL di tampone di separazione e mescolare delicatamente. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per lavare gli anticorpi in eccesso. Aspirare completamente il surnatante
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di separazione e trasferirlo in un recipiente appropriato (ad esempio, un tubo FACS, una piastra a 96 pozzetti, ecc.) per l'analisi della citometria a flusso. Lo schema di gating raccomandato per l'analisi della citometria a flusso è dettagliato nella Figura 1.
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Representative Results
Le cellule T sono state isolate dalle PBMC acquistate e placcate per l'attivazione come descritto nel protocollo. I campioni di controllo negativi (PBMC acquistati) non sono stati attivati. Questi campioni di controllo sono stati inclusi per dimostrare l'effetto che il processo di attivazione delle microbolle ha avuto sui campioni sperimentali rispetto ai controlli delle cellule T non toccati e non stimolati, assicurando che i marcatori di attivazione osservati fossero il risultato dei fattori di attivazione aggiunti e non fossero inerenti alle cellule T stesse. Secondo lo schema sperimentale in Figura 2, le cellule sono state seminate a 2 x 106 cellule / ml in mezzo di cellule T ed erano non toccate / non stimolate o co-stimolate con SAMB anti-CD3 (clone OKT3) e anti-CD28 (clone 28.2). Dopo 48 ore di stimolazione in coltura, le cellule sono state trasdotte con la particella lentivirale che codifica per zsGreen. A 4 giorni e 6 giorni dopo la trasduzione, le cellule sono state riprese, raccolte e colorate in superficie utilizzando AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (o PE-CD69 a seconda che siano stati utilizzati rispettivamente i pannelli di esaurimento o attivazione) e 7-AAD. Il transgene zsGreen era rilevabile nel canale FITC. L'approccio di gating della citometria a flusso è dettagliato nella Figura 1. Sono stati osservati aumenti del numero di cellule T vitali e delle cellule T transgene-positive tra il campione di controllo e le cellule che hanno ricevuto la costimolazione delle microbolle (Figura 3). Un aumento delle popolazioni di cellule effettrici è stato osservato anche nei campioni di microbolle (Figura 4). Le cellule T che esprimono un aumento dei marcatori di attivazione e esaurimento sono state osservate tra i campioni cellulari che hanno ricevuto la co-stimolazione delle microbolle (Figura 5 e Figura 6). L'espansione cellulare è stata osservata tra i punti temporali del giorno 4 e del giorno 6 dei campioni co-stimolati, indicando che le cellule erano attive, proliferative e passavano il transgene mentre si espandevano.
Figura 1: Esempio di schema di gating-campione di controllo non toccato/negativo. A partire dai singoletti, le cellule della popolazione sono state successivamente controllate utilizzando SSC-A/FSC-A. Le cellule CD3+ totali sono state recintate, seguite da un gating CD3+ vitale utilizzando 7-AAD per determinare la vitalità della popolazione. Tutte le popolazioni e i calcoli successivi sono stati determinati dalla popolazione vitale 7-AAD(−)/CD3+(+), come mostrato usando le frecce che indicano le porte della sottopopolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Panoramica della sequenza temporale sperimentale. I giorni del protocollo sono indicati sopra e i giorni corrispondenti dopo la trasduzione (D0-D6) sono usati nelle figure seguenti. Le cellule sono state placcate immediatamente dopo la selezione e l'attivazione. I pozzetti di controllo sono stati generati utilizzando un protocollo di selezione negativa a microbolle. Le cellule T di controllo non hanno ricevuto agenti di co-stimolazione e non hanno subito trasduzione, sebbene abbiano ricevuto IL-2 per garantire che le cellule fossero mantenute abbastanza sane da mantenere una ragionevole vitalità durante l'esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Valutazione delle cellule vitali e trasdotte con successo dopo la trasduzione. (A) Cellule CD3+ vitali 4 giorni e 6 giorni dopo la trasduzione. La vitalità è stata determinata attraverso l'analisi della citometria a flusso, in cui la popolazione è stata quantificata mediante gating su cellule 7-AAD(−)/CD3+(+). (B) Il numero di cellule trasdotte con successo con rLV.EF1.zsGreen è stato determinato mediante citometria a flusso, in cui la popolazione vitale 7-AAD(−)/CD3+(+) è stata ulteriormente trasformata in cellule zsGreen(+). Tutte le condizioni sono state eseguite in triplice copia (n = 3). I dati rappresentano la media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Cellule T vitali CD4+ e CD8+. Le sottopopolazioni di cellule T CD4+ e CD8+ sono state quantificate mediante gating sulla popolazione vitale CD3+ (CD3+ [+]/7-AAD[−]) e misurando l'espressione di (A) CD4+ e (B) CD8+. Tutte le condizioni sono state eseguite in triplice copia (n = 3). I dati rappresentano la media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Cellule T attivate vitali. La popolazione vitale CD3+ è stata anche analizzata per specifici marcatori di attivazione, come indicato nelle figure sopra. (A) CD69 è un marcatore precoce di attivazione; (B) CD25 è un marcatore di attivazione medio-tardiva. Le percentuali sopra le barre di errore rappresentano la percentuale di cellule CD3+ vitali che esprimono il rispettivo marcatore. Tutte le condizioni sono state eseguite in triplice copia (n = 3). I dati rappresentano la media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Cellule T esaurite. La popolazione vitale CD3+ è stata anche analizzata per i marcatori di esaurimento (PD-1). (A) Il numero totale di cellule 7-AAD(−)/CD3+(+)/PD-1+(+) al giorno 4 e al giorno 6 dopo la trasduzione. (B) La percentuale di cellule PD-1+. Il giorno 4 e il giorno 6, la popolazione campione attivata/trasdotta aveva ~ 25% di cellule CD3 + / PD-1 + vitali, mentre la popolazione campione di controllo aveva ~ 2% cellule CD3 + / PD-1 + vitali. Da notare, il materiale iniziale / isolato aveva < ~ 15% di cellule CD3 + / PD-1 + vitali (i dati post-isolamento / pre-coltura non mostrati). Tutte le condizioni sono state eseguite in triplice copia (n = 3). I dati rappresentano la media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto consente l'isolamento delle cellule T da campioni di PBMC e l'attivazione di cellule T sospese in terreni di coltura con microbolle. Questo metodo si basa su microbolle funzionalizzate la cui galleggiabilità intrinseca offre un'opportunità unica per introdurre segnali co-stimolatori alle cellule e attivarli mentre sono sospesi in un terreno di coltura, riducendo così l'esposizione delle cellule in espansione alla stimolazione prolungata; tale sovrastimolazione può comportare un aumento dell'espressione dei marcatori di esaurimento delle cellule T e una ridotta efficacia terapeutica11. Le cellule T stimolate che sono attaccate galleggiantemente a microbolle funzionalizzate producono cellule figlie intatte che cadono sul fondo della piastra di coltura cellulare per l'espansione, consentendo un periodo di crescita lontano dai fattori di stimolazione galleggianti. È stato dettagliato in letteratura come l'esposizione prolungata di cellule T isolate a fattori di stimolazione - come i protocolli basati su sfere magnetiche12 - possa influire negativamente sull'espansione e sull'efficacia terapeutica 6,7,11.
Poiché questo protocollo riportato si basa sulla selezione positiva delle cellule CD3 + , è fondamentale rimuovere il subnatante sotto lo strato di cellule bolle con attenzione ma accuratamente durante la fase di isolamento di questo protocollo. Ciò garantisce che solo la popolazione di cellule T selezionata positivamente sia ulteriormente stimolata e placcata. Questo è anche un passo importante per determinare il numero di cellule selezionate dal campione PBMC di partenza, necessario per calcoli accurati di co-stimolazione e placcatura.
Queste attività di sviluppo del protocollo a microbolle per l'attivazione e l'espansione delle cellule T hanno sfruttato una vasta gamma di marcatori durante l'analisi della citometria a flusso, consentendo la caratterizzazione approfondita della popolazione di cellule T isolate e stimolate per valutare i parametri critici delle cellule T, tra cui attivazione, esaurimento ed espansione clonale. Rispetto alle tecnologie di isolamento e stimolazione delle cellule T comunemente usate, come i protocolli basati su sfere magnetiche, questo protocollo a microbolle mira a ridurre al minimo la sovrastimolazione delle cellule senza sacrificare l'espansione e le corrispondenti capacità di funzione effettrice delle cellule T isolate. Le applicazioni future di questa tecnica a microbolle includeranno vari protocolli per la selezione positiva delle cellule T, la co-stimolazione e le successive colture cellulari di microbolle per soddisfare una varietà di esigenze di flusso di lavoro per la ricerca sulla terapia cellulare e le comunità di produzione.
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Disclosures
Tutti gli autori, al momento della presentazione, sono dipendenti di Akadeum Life Sciences, che produce e vende prodotti per la separazione delle microbolle.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
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