Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מבוססי ציפה מדגימות תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים באמצעות מיקרו-בועות

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64573
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

Summary

מטרת מחקר זה היא להדגים את ההיתכנות של הפרדה מבוססת ציפה כדי לבודד, להפעיל ולהרחיב תאי T אנושיים ראשוניים.

Abstract

התהליך של בידוד תאי T מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי (PBMCs) כדי להקים תרביות ex vivo הוא חיוני למחקר, בדיקות קליניות וטיפולים מבוססי תאים. במחקר זה מוצג פרוטוקול פשוט וחדשני לבידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מ-PBMCs ex vivo. מחקר זה משתמש בטכנולוגיית מיון תאים המופעלת על ידי ציפה פונקציונלית (BACS) כדי לבודד ולהפעיל תאי T. בקצרה, הפרוטוקול כולל בחירה חיובית של תאי CD3+ מ-PBMCs שמקורם בלוקופאק, ולאחר מכן גירוי משותף של 48 שעות עם מיקרו-שבבים של סטרפטווידין (SAMBs) הקשורים מראש נגד CD28 לפני ההתמרה בלוחות של 24 בארות. מיקרו-שבבים פונקציונליים מציעים הזדמנות ייחודית להפעיל תאים באופן צף, מה שמוביל לפנוטיפים מתרבים המאפשרים התרחבות עם תשישות מינימלית. טכניקה זו מציעה תשישות מופחתת מכיוון שהמיקרו-בועות הממריצות נשארות צפות וחוזרות לחלק העליון של מדיום התרבית, ובכך מפחיתות את משך הזמן שהתאים המתרחבים נמצאים במגע עם גורמי הגירוי המשותף. התוצאות מצביעות על כך שתאי ה-T המבודדים והתרבית מקבלים מספיק גירוי כדי להפעיל ולהתרבות, אך לא במידה שמובילה להפעלת יתר, מה שמוביל לאחר מכן לתשישות, כפי שמודגם על ידי נוכחות של PD-1 מוגזם.

Introduction

יותר מ-500 ניסויים קליניים בקולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T נערכים כיום ברחבי העולם, וארבעה מוצרים לטיפול בתאי CAR-T זמינים בשוק1. עם זאת, עדיין קיימים צרכי מחקר וייצור רבים של תאי CAR-T שיש לטפל בהם כדי לשפר את היעילות, המדרגיות וההצלחה ארוכת הטווח של טיפולים אלהשעשויים לרפא 2,3,4,5. המחקר והייצור הקליניים המאמצים של תאי CAR-T מתחילים בבידוד תאי T מדגימת דם היקפית ובגירוי, התמרה והרחבה של התאים המבודדים לאחר מכן. פרמטרים כגון התאוששות תאי T, טוהר ואותות הפעלה/תשישות דורשים שיקול דעת זהיר בעת בחירת טכניקות הבידוד והגירוי של התאים למחקר וייצור תאי CAR-T 3,4,6. חשוב לציין כי יש צורך בשיפור ההתמדה הטיפולית של טיפולים בתאי CAR-T על ידי מזעור המכשולים הביולוגיים הנובעים מתהליכי הייצור הנוכחיים, כגון תשישות תאי T, כדי לשפר את היעילות הטיפולית 6,7.

כחלופה לשיטות בידוד תאים מסורתיות כגון מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) ומיון תאים המופעלים על ידי מגנט (MACS), כאן, מודגם מיון תאים המופעל על ידי ציפה (BACS) עם מיקרו-בועות לבידוד תאי T. הפרדת מיקרו-בועות משתמשת במיקרו-כדורים צפים וחלולים (microbubbles) כדי לקשור את המטרות ולהציף אותן אל פני השטח של דגימות נוזלים 8,9. על ידי תפקוד מיקרו-שבבים עם נוגדנים (כלומר, אנטי-CD3), ניתן לבחור באופן חיובי את אוכלוסיות תאי ה-T הרצויות מדגימות דם היקפיות. לאחר מכן, השימוש באוכלוסייה שונה של מיקרו-שבבים מתפקדי נוגדנים (כלומר, אנטי-CD28) כדי לעורר ולהפעיל תאי T שנבחרו באופן חיובי בהשעיה מודגם בעבודה זו. Microbubbles מציעים זרימת עבודה פשוטה וניתנת לכוונון של בידוד והפעלה שמייצרת תאי T מוכנים לתרבית תאים מושהית וליישומים במורד הזרם כגון שינוי גנטי והרחבה. באופן קריטי, הפעלת תאים צפים עם מיקרו-שבבים מקדמת גירוי תאים מאופק כדי למנוע תשישות מוגזמת של תאי T7.

עבור מחקר זה, ציטומטריה של זרימה הייתה הכלי העיקרי ששימש לניתוח הצלחת הבידוד, ההפעלה וההתמרה של המיקרו-בועות הפונקציונליות, כמו גם כדי לספק מידע מפורט על תת-האוכלוסיות הספציפיות הקיימות בשלבי הצמיחה וההתרחבות שלאחר הטרנסדוקציה. בנוסף לציטומטריה של זרימה, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של שדה בהיר ופלואורסצנטי כדי לאשר את בריאות התא, המורפולוגיה והצלחת ההתמרת. בהתבסס על תוצאות אלה, הטכנולוגיה והפרוטוקול של microbubble מספקים חלופה מתכווננת ועדינה יותר לשיטות הבידוד וההפעלה המסורתיות הנמצאות כיום בשימוש; בפרט, תאים המופעלים על-ידי מיקרו-בועות מראים ביטוי נמוך יותר באופן ניכר של סמני תשישות של תאי T בהשוואה לתאים הנצפים בדרך כלל בכלים ובערכות המקובלים בתעשייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד של תאי T עם microbubbles באמצעות בחירה חיובית

הערה: פרוטוקול זה מפרט גישת בחירה חיובית של CD3+ בקנה מידה קטן באמצעות SAMBs.

  1. דגירה 3 x 108 PBMCs שהושגו באופן מסחרי ב-2.5 מ"ל של חיץ הפרדה עם נוגדן אנטי-CD3 (OKT3) שעבר ביוטינילציה בריכוז של 25 ננוגרם נוגדן למיליון תאים (25 ננוגרם/מ'). מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  2. הוסף מיקרו-שבבים של סטרפטווידין (SAMBs) ביחס של 0.5 (כמות SAMB):1 (כמות תאים) בהתאם לריכוז ה-SAMB המדווח של היצרן.
  3. מערבבים באמצעות רוטטור מסחרי מקצה לקצה (EOE) ב-20 סל"ד למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר.
  4. לאחר צנטריפוגה, התאים שנבחרו באופן חיובי יהיו בחלק העליון של המתלה עם ה- SAMBs. שאר התאים שלא נבחרו יהיו בכדור התא בתחתית הצינור. באמצעות פיפטה זכוכית 9 אינץ ', הכנס את הקצה שמתחת לשכבת תא הבועה לתחתית הצינור, שאף את כדור התא ואת subnatant עם פיפטה אלקטרונית ולהעביר אותם לצינור חדש.

2. גירוי משותף (הפעלה) של תאי T שנבחרו באופן חיובי

  1. יש להשעות את שכבת תאי הבועה שנותרה בצינור המקורי ב-1 מ"ל של מדיום שלם של תאי T (או מדיום רצוי אחר).
  2. ספירת התאים בתת-התא באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר באמצעות מונה תאים אוטומטי, והפחת ערך זה ממספר התא ההתחלתי כדי לקבוע את מספר התאים שנלכדו בשכבת תאי הבועה.
  3. לפני שלב זה, יש לערבב את הנוגדן הביוטינילי נגד CD28 עם SAMBs מסחריים למשך שעתיים לפחות כדי ליצור את ה-SAMBs המצומדים נגד CD28. פנה ליצרן ה-SAMBs כדי לקבוע את כמות הנוגדן נגד CD28 הדרושה להצמדה. הוסף את ה-SAMBs המצומדים נגד CD28 לתרחיף תאי הבועה כתוצאה משלב 2.1 באמצעות יחס של 1.5 (אנטי-CD28 SAMBs):1 (תאים).
  4. מערבבים באמצעות סיבוב EOE במשך 15 דקות, ולאחר מכן מתאימים את הנפח הכולל ל-2 מיליון תאים למ"ל עם מדיום שלם של תאי T או מדיום רצוי אחר בהתאם למספר התא המתקבל בשלב 2.2.

3. הרחבת התאים המעוררים במדיום תרבית התאים

  1. יש לפזר 1 מ"ל של תאים פעילים משלב 2.4 בריכוז של 2 M/mL לכל באר בצלחת של 24 בארות. דגירה בחממה לחה 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר 24 שעות, יש להוסיף 50 U/mL של IL-2 ו-25 נ"ג/מ' של אנטי-CD3 מסיס (OKT3) כדי לעודד עוד יותר את ההתרחבות, כפי שחושב באמצעות המספר הראשוני של התאים המצופים ביום 0. החזירו את לוחית התא לאינקובטור CO2 הלח, ותנו לה לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

4. אופציונלי: התמרה של תאי T פעילים עם lentivirus

הערה: הגישה המשמשת כאן מותאמת מ- Prommersberger et al. 10.

  1. מפשירים את נגיף הלנטי בטמפרטורת החדר, ומערבבים לזמן קצר על ידי פיפטציה.
  2. הסירו בעדינות את ה-mid-natant, 600 μL מכל באר, מבלי לגעת בתאי הבת שנמצאים כעת בתחתית הבאר או בשכבת הבועה שנשארה על פני השטח של התמיסה.
  3. יש להוסיף 5 מיקרוגרם/מ"ל הקסדימתרין ברומיד לכל באר כדי לשפר את ההתמרה הנגיפית. הוסף את החלקיקים הלנטי-ויראליים בריבוי של זיהום (MOI) של 3 (חלקיקים לנטי-ויראליים לכל תא).
  4. צנטריפוגה את הצלחת במשך 45 דקות ב 800 x g ו 32 °C באמצעות האצה איטית וללא הפסקה להאטה. דגירה של התאים במשך 4 שעות באינקובטור CO2 לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר 4 שעות, הוסיפו 600 μL של מדיום תאי T שלמים וטריים הזמינים מסחרית ו-50 U/mL של IL-2 לכל באר, והחזירו את צלחת התא לחממת CO2 הלחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להרחבת תאי T.

5. הרחבת תאי T (עם או בלי התמרה מוקדמת)

  1. כל יומיים, יש להסיר מחצית מהמדיום מהמדיום, להחליף אותו במדיום טרי ושלם של תאי T, ולהוסיף IL-2 בריכוז של 50 U/mL.
  2. ספרו את תאי ה-T פעמיים בשבוע כדי להעריך את צפיפות התאים. כאשר צפיפות התאים עולה על 2 x 10 6-2.5 x 106 תאים / מ"ל, להעביר את התאים לתוך כלי גדול יותר, לדלל אותם ל 5 x 105 תאים / מ"ל.

6. קצירת תאי T וציטומטריה של זרימה

  1. מערבבים בעדינות את תכולת כל באר על ידי צנרת למעלה ולמטה. הסר את כל התוכן של הבאר, כולל microbubbles, ולהעביר אותם לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  2. יש לשטוף כל באר ב-400 מיקרו-ליטר של DPBS נטולי סידן ומגנזיום (−/−), ולהעביר את התמיסה לצינור של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה בגודל 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לשאוף את supernatant, ולהשהות את גלולת התא ב 50 μL של חיץ הפרדה.
  4. כתם עם נוגדן הפעלה ותשישות / קוקטייל מכתים, ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הכינו את הקוקטיילים המכתימים באופן הבא- קוקטייל הפעלה: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; קוקטייל תשישות: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
  5. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ הפרדה ומערבבים בעדינות. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשטוף נוגדנים עודפים. שאפו את הסופר-נאטנט לחלוטין.
  6. יש לתלות את כדור התא ב-1 מ"ל של חיץ הפרדה, ולהעביר לכלי מתאים (למשל, צינור FACS, צלחת 96 בארות וכו') לצורך ניתוח ציטומטריה של זרימה. ערכת ניתוח הציטומטריה המומלצת של זרימה מפורטת באיור 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאי T בודדו מ-PBMCs שנרכשו וצופו להפעלה כמתואר בפרוטוקול. דגימות הבקרה השליליות (PBMCs שנרכשו) לא הופעלו. דגימות בקרה אלה נכללו כדי להדגים את ההשפעה שהייתה לתהליך ההפעלה של microbubble על דגימות הניסוי בהשוואה לבקרות תאי T שלא נגעו בהן ולא עוררו, והבטיחו כי סמני ההפעלה שנצפו היו תוצאה של גורמי ההפעלה הנוספים ולא היו טבועים בתאי ה-T עצמם. לפי מתווה הניסוי באיור 2, התאים נזרעו ב-2 x 106 תאים למ"ל במדיום תאי T, ולא נגעו/לא עוררו אותם או עוררו אותם יחד עם אנטי-CD3 (שיבוט OKT3) ואנטי-CD28 (שיבוט 28.2) SAMBs. לאחר 48 שעות של גירוי בתרבית, התאים הומרו עם קידוד החלקיקים הלנטי-ויראליים עבור zsGreen. לאחר 4 ימים ו-6 ימים לאחר ההתמרת, התאים צולמו, נקטפו והוכתמו על פני השטח באמצעות AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (או PE-CD69, תלוי אם נעשה שימוש בלוחות התשישות או ההפעלה, בהתאמה) ו-7-AAD. הטרנסגן zsGreen היה ניתן לזיהוי בערוץ FITC. גישת הציטומטריה של הזרימה מפורטת באיור 1. נצפו עליות במספר תאי T בני קיימא ובתאי T טרנסגנים חיוביים בין דגימת הביקורת לבין התאים שקיבלו גירוי משותף של מיקרו-בועות (איור 3). אוכלוסיות מוגברות של תאי השפעה נצפו גם בדגימות של מיקרו-בועות (איור 4). תאי T המבטאים סמני הפעלה ותשישות מוגברים נצפו בין דגימות התאים שקיבלו גירוי משותף של מיקרו-בועות (איור 5 ואיור 6). התפשטות התאים נצפתה בין נקודות הזמן של היום ה-4 ליום ה-6 של הדגימות המגורות, מה שמצביע על כך שהתאים היו פעילים, מתרבים ועוברים את הטרנסגן ככל שהם מתרחבים.

Figure 1
איור 1: דוגמה לדגימת בקרה שלילית/לא נגועה בסכימה. החל מהסינגלטים, תאי האוכלוסייה היו מגודרים לאחר מכן באמצעות SSC-A/FSC-A. סך כל תאי CD3+ היו מגודרים, ולאחר מכן CD3+ קיימא gating באמצעות 7-AAD כדי לקבוע את הכדאיות של האוכלוסייה. כל האוכלוסיות והחישובים הבאים נקבעו מתוך האוכלוסייה בת הקיימא 7-AAD(−)/CD3+(+), כפי שמוצג באמצעות החצים המציינים את שערי תת-האוכלוסייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: סקירה כללית של ציר הזמן הניסויי. ימי הפרוטוקול מצוינים לעיל, והימים המתאימים לאחר ההתמרה (D0-D6) משמשים באיורים שלהלן. התאים היו מצופים מיד לאחר הבחירה וההפעלה. בארות הבקרה נוצרו באמצעות פרוטוקול בחירה שלילית microbubble. תאי הבקרה T לא קיבלו חומרי גירוי משותף ולא עברו טרנסדוקציה, אם כי הם כן קיבלו IL-2 כדי להבטיח שהתאים נשמרו בריאים מספיק כדי לשמור על כדאיות סבירה לאורך כל הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הערכה של תאים בני קיימא שעברו התמרות מוצלחות לאחר הטרנסדוקציה . (A) תאי CD3+ בני קיימא 4 ימים ו-6 ימים לאחר ההתמרת. הכדאיות נקבעה באמצעות ניתוח ציטומטריה של זרימה, שבו כומתה האוכלוסייה על ידי חישוב על תאי 7-AAD(−)/CD3+(+). (B) מספר התאים שעברו טרנספורמציה מוצלחת עם rLV.EF1.zsGreen נקבע באמצעות ציטומטריה של זרימה, שבה האוכלוסייה בת הקיימא 7-AAD(−)/CD3+(+) הייתה מגודרת עוד יותר לתאי zsGreen(+). כל התנאים בוצעו במשולש (n = 3). הנתונים מייצגים ממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תאי CD4+ ו-CD8+ T בני קיימא. תת-האוכלוסיות של תאי CD4+ ו-CD8+ T כומתו על-ידי חישוב אוכלוסיית CD3+ בת-קיימא (CD3+ [+]/7-AAD[−]) ומדידת הביטוי של (A) CD4+ ו-(B) CD8+. כל התנאים בוצעו במשולש (n = 3). הנתונים מייצגים ממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תאי T מופעלים בני קיימא. אוכלוסיית CD3+ בת קיימא נותחה גם עבור סמני הפעלה ספציפיים כפי שצוין בנתונים לעיל. (A) CD69 הוא סמן מוקדם של הפעלה; (B) CD25 הוא סמן הפעלה בינוני עד מאוחר. האחוזים מעל קווי השגיאה מייצגים את אחוז תאי CD3+ בני הקיימא המבטאים את הסמן המתאים. כל התנאים בוצעו במשולש (n = 3). הנתונים מייצגים ממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תאי T מותשים. אוכלוסיית CD3+ בת קיימא נותחה גם עבור סמני תשישות (PD-1). (A) המספר הכולל של 7-AAD(−)/CD3+(+)/PD-1+(+) תאים ביום 4 וביום 6 לאחר ההתמרת. (B) אחוז תאי PD-1+. ביום 4 וביום 6, אוכלוסיית המדגם המופעל/מומר הייתה בעלת ~25% תאי CD3+/PD-1+ בני קיימא, בעוד שבאוכלוסיית דגימת הבקרה היו ~2% תאי CD3+/PD-1+ בני קיימא. יש לציין כי בחומר ההתחלתי/מבודד היו תאי CD3+/PD-1+ בני קיימא של <~15% (נתונים לאחר בידוד/טרום-תרבית לא מוצגים). כל התנאים בוצעו במשולש (n = 3). הנתונים מייצגים ממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד של תאי T מדגימות PBMC והפעלה של תאי T מרחפים במדיית תרבית עם מיקרו-בועות. שיטה זו מסתמכת על מיקרו-שבבים פונקציונליים שהציפה הטבועה בהם מציעה הזדמנות ייחודית להכניס אותות מגרים משותפים לתאים ולהפעיל אותם בזמן שהם תלויים בתווך תרבית, ובכך להפחית את החשיפה של התאים המתרחבים לגירוי ממושך; גירוי יתר כזה יכול לגרום לביטוי מוגבר של סמני תשישות של תאי T וליעילות טיפולית מופחתת11. תאי T מגורים המחוברים באופן צף למיקרו-שבבים פונקציונליים מייצרים תאי בת שלא נגעו בהם, אשר צונחים לתחתית צלחת תרבית התאים לצורך התרחבות, ומאפשרים תקופת גדילה הרחק מגורמי הגירוי הצף. בספרות מפורט כיצד חשיפה ממושכת של תאי T מבודדים לגורמי גירוי - כגון פרוטוקולים מבוססי חרוזים מגנטיים12 - יכולה להשפיע לרעה על ההרחבה והיעילות הטיפולית 6,7,11.

מכיוון שפרוטוקול מדווח זה מסתמך על הבחירה החיובית של תאי CD3+ , חיוני להסיר את הסובנטנט שמתחת לשכבת תאי הבועה בזהירות אך ביסודיות במהלך שלב הבידוד של פרוטוקול זה. זה מבטיח שרק אוכלוסיית תאי ה-T שנבחרה באופן חיובי מגורה ומצופה עוד יותר. זהו גם צעד חשוב לקביעת מספר התאים שנבחרו מדגימת PBMC ההתחלתית, הנחוצה לחישובי גירוי וציפוי מדויקים.

פעילויות אלה של פיתוח פרוטוקול microbubble עבור הפעלה והרחבה של תאי T מינפו מגוון רחב של סמנים במהלך ניתוח ציטומטריה של זרימה, ואפשרו אפיון יסודי של אוכלוסיית תאי T המבודדים והמגורה כדי להעריך פרמטרים קריטיים של תאי T, כולל הפעלה, תשישות והרחבת הגולגולת. בהשוואה לטכנולוגיות נפוצות של בידוד וגירוי תאי T, כגון פרוטוקולים מבוססי חרוזים מגנטיים, פרוטוקול microbubble זה נועד למזער את גירוי היתר של התאים מבלי להקריב את יכולות ההתפשטות ותפקוד האפקטים המתאימים של תאי T המבודדים. יישומים עתידיים של טכניקת microbubble זו יכללו פרוטוקולים שונים לבחירה חיובית של תאי T, גירוי משותף ותרביות תאי microbubble עוקבות כדי לענות על מגוון צרכי זרימת עבודה עבור קהילות מחקר וייצור של טיפול בתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים, בעת ההגשה, הם עובדי Akadeum Life Sciences, המייצרת ומוכרת מוצרי הפרדת מיקרו-בועות.

Acknowledgments

ללא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023 CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates VWR  76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody Biolegend 302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody Biolegend 317320
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IL2  BioVision (vwr) 10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 Takara Bio 0038VCT
Leukopak BioIVT HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs BioIVT HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture VWR 97063-708 CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated Innovative Research ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES Gibco 72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) Akadeum 11110-000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 190
בידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מבוססי ציפה מדגימות תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים באמצעות מיקרו-בועות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snow, T., Roussey, J., Wegner, C.,… More

Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter