Summary
이 연구의 목적은 일차 인간 T 세포를 분리, 활성화 및 확장하기 위한 부유 기반 분리의 타당성을 입증하는 것입니다.
Abstract
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 T 세포를 분리하여 생체 외 배양을 확립하는 과정은 연구, 임상 테스트 및 세포 기반 치료에 매우 중요합니다. 이 연구에서, 생체외 PBMCs로부터 T 세포를 분리, 활성화 및 확장하기 위한 간단하고 신규한 프로토콜이 제시된다. 이 연구는 기능화 된 부력 활성화 세포 분류 (BACS) 기술을 활용하여 T 세포를 분리하고 활성화합니다. 간단히 말해서, 이 프로토콜은 백혈구 유래 PBMC에서 CD3+ 세포의 양성 선택을 포함하고, 24웰 플레이트에서 형질도입하기 전에 사전 접합된 항-CD28 결합 스트렙타비딘 마이크로버블(SAMB)을 사용한 48시간 공동 자극을 포함합니다. 기능화된 마이크로버블은 세포를 부력적으로 활성화할 수 있는 독특한 기회를 제공하여 최소한의 피로로 확장을 허용하는 증식성 표현형을 유도합니다. 이 기술은 공동 자극 마이크로 버블이 부력을 유지하고 배양 배지의 상단으로 돌아가기 때문에 피로를 줄여 팽창 세포가 공동 자극 인자와 접촉하는 시간을 줄입니다. 상기 결과는 단리되고 배양된 T 세포가 활성화 및 증식하기에 충분한 자극을 받지만 과도한 PD-1의 존재에 의해 입증된 바와 같이, 과잉활성화로 이어지는 과활성화로 이어지는 정도는 아님을 나타낸다.
Introduction
현재 전 세계적으로 500개 이상의 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 치료 임상 시험이 진행 중이며 4개의 CAR-T 세포 치료제품이 시판되고 있습니다1. 그러나, 이러한 잠재적 치유 요법 2,3,4,5의 효능, 확장성 및 장기적인 성공을 개선하기 위해 해결되어야 하는 수많은 CAR-T 세포 연구 및 제조 요구가 여전히 존재한다. 입양 CAR-T 세포 임상 연구 및 제조는 말초 혈액 샘플로부터 T 세포를 분리하고 분리된 세포의 후속 자극, 형질도입 및 확장으로 시작됩니다. T 세포 회수, 순도 및 활성화/고갈 신호와 같은 파라미터는 CAR-T 세포 연구 및 제조 3,4,6을 위한 세포 분리 및 자극 기술을 선택할 때 신중한 고려가 필요합니다. 중요하게도, 치료 효능을 향상시키기 위해서는 T 세포 고갈과 같은 현재 제조 공정으로부터 발생하는 생물학적 장애를 최소화함으로써 CAR-T 세포 요법의 치료 지속성을 개선할 필요가 있다6,7.
형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 자기 활성화 세포 분류(MACS)와 같은 기존 세포 분리 방법의 대안으로 여기에서 T 세포 분리를 위한 마이크로버블을 사용한 부력 활성화 세포 분류(BACS)가 시연됩니다. 마이크로버블 분리는 부력, 중공 마이크로스피어(마이크로버블)를 사용하여 타겟을 결합하고 유체 샘플(8,9)의 표면에 부유시킨다. 마이크로버블을 항체 (즉, 항-CD3)로 기능화함으로써, 목적하는 T 세포 집단을 말초 혈액 샘플로부터 양성으로 선택할 수 있다. 이어서, 현탁액에서 양성으로 선택된 T 세포를 공동-자극하고 활성화시키기 위한 항체-작용화된 마이크로버블 (즉, 항-CD28)의 상이한 집단의 사용이 본 연구에서 입증된다. 마이크로버블은 단순하고 고도로 조정 가능한 분리 및 활성화 워크플로우를 제공하여 부유 세포 배양 및 유전자 변형 및 확장과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있는 T 세포를 생성합니다. 비판적으로, 마이크로버블을 이용한 부력 세포 활성화는 억제된 세포 자극을 촉진하여 과도한 T 세포 고갈을 방지합니다7.
이 연구에서 유세포 분석은 기능화 된 마이크로 버블의 분리, 활성화 및 형질 도입 성공을 분석하고 형질 도입 후 성장 및 확장 단계에서 존재하는 특정 하위 집단에 대한 자세한 정보를 제공하는 데 사용되는 주요 도구였습니다. 유세포분석 외에도 명시야 및 형광 현미경을 사용하여 세포 건강, 형태 및 형질도입 성공을 확인했습니다. 이러한 결과를 바탕으로 마이크로버블 기술 및 프로토콜은 현재 사용되는 기존의 분리 및 활성화 방법에 대한 보다 조정 가능하고 부드러운 대안을 제공합니다. 특히, 마이크로버블-활성화된 세포는 산업 표준 도구 및 키트에서 전형적으로 관찰되는 것보다 T 세포 고갈 마커의 발현이 현저히 낮게 나타난다.
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Protocol
1. 양성 선택을 이용한 마이크로버블로 T 세포 분리
참고: 이 프로토콜은 SAMB를 사용하는 소규모 CD3+ 양성 선택 접근 방식을 자세히 설명합니다.
- 100만 세포당 항체 25ng(25ng/M) 농도의 비오틴화 항-CD3(OKT3) 항체와 함께 2.5mL의 분리 완충액에 3 x 10 8개의 상업적으로 입수한PBMC 를 배양합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 스트렙타비딘 마이크로버블(SAMB)을 제조업체에서 보고한 SAMB 농도에 따라 0.5(SAMB 수량):1(세포 수량)의 비율로 추가합니다.
- 상업용 EOE(엔드 오버 엔드) 회전 장치를 사용하여 20rpm에서 실온에서 10-15분 동안 혼합합니다. 실온에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 원심분리 후, 양성으로 선택된 세포는 SAMB와 함께 현탁액의 맨 위에 놓일 것입니다. 선택되지 않은 나머지 세포는 튜브 바닥의 셀 펠릿에 있습니다. 9인치 유리 피펫을 사용하여 버블 셀 층 아래의 팁을 튜브 바닥에 삽입하고 전자 피펫으로 세포 펠릿과 부탄산액을 흡입하여 새 튜브로 옮깁니다.
2. 양성으로 선택된 T 세포의 공동 자극 (활성화)
- 원래 튜브에 남아 있는 버블 세포 층을 1mL의 완전한 T 세포 배지(또는 다른 원하는 배지)에 재현탁합니다.
- 자동 세포 카운터를 사용하여 명시야 현미경으로 하등액의 세포를 계수하고 시작 세포 수에서 이 값을 빼서 버블 세포 층에서 포획된 세포 수를 결정합니다.
- 이 단계 전에 비오티닐화된 항-CD28 항체를 최소 2시간 동안 상용 SAMB와 혼합하여 접합된 항-CD28 SAMB를 생성합니다. 접합에 필요한 항-CD28 항체의 양을 결정하려면 SAMB 제조업체에 문의하십시오. 항-CD28 접합 SAMB를 1.5(항-CD28 SAMB):1(세포)의 비율을 사용하여 단계 2.1로부터 생성된 버블-세포 현탁액에 첨가한다.
- EOE 회전을 사용하여 15분 동안 혼합한 다음, 단계 2.2에서 얻은 세포 수에 따라 완전한 T 세포 배지 또는 다른 원하는 배지와 mL당 총 부피를 200만 세포로 조정합니다.
3. 세포 배양 배지에서 공동자극된 세포의 확장
- 2.4단계에서 활성화된 세포 1mL를 웰당 2M/mL의 농도로 24웰 플레이트에 분배합니다. 37°C에서 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 배양한다.
- 24시간 후, 50 U/mL의 IL-2 및 25 ng/M의 가용성 항-CD3(OKT3)를 추가하여 0일째에 플레이팅된 초기 세포 수를 사용하여 계산된 바와 같이 확장을 더욱 장려합니다. 세포 플레이트를 가습된CO2 인큐베이터에 다시 넣고 37°C에서 밤새 배양하도록 합니다.
4. 선택 사항: 렌티바이러스로 활성화된 T 세포의 형질도입
참고 : 여기에 사용 된 접근법은 Prommersberger et al. 10.
- 렌티바이러스를 실온에서 해동하고 피펫팅으로 간단히 혼합합니다.
- 각 웰에서 중간 산액 600μL를 부드럽게 제거하고, 현재 웰 바닥에 있는 딸 세포나 용액 표면에 남아 있는 기포 층을 건드리지 않습니다.
- 웰당 5μg/mL 헥사디메트린 브로마이드를 추가하여 바이러스 형질도입을 향상시킵니다. 렌티바이러스 입자를 감염 다중성(MOI)이 3(세포당 렌티바이러스 입자)으로 추가합니다.
- 느린 가속과 감속을 위한 휴식 없이 플레이트를 800 x g 및 32°C에서 45분 동안 원심분리합니다. 세포를 37°C에서 가습된CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
- 4시간 후, 600μL의 시판되는 새로운 완전한 T 세포 배지와 50U/mL의 IL-2를 각 웰에 첨가하고, T 세포 확장을 위해 37°C에서 가습된CO2 인큐베이터에 세포 플레이트를 다시 놓습니다.
5. T 세포의 확장 (사전 형질 도입 유무에 관계없이)
- 2일마다 중간 산액에서 배지의 절반을 제거하고 새롭고 완전한 T 세포 배지로 교체하고 50U/mL 농도의 IL-2를 추가합니다.
- 세포 밀도를 평가하기 위해 일주일에 두 번 T 세포를 계수합니다. 세포 밀도가 2 x 10 6-2.5 x 106 cells/mL를 초과하면 세포를 더 큰 용기로 옮겨 5 x 105 cells/mL로 희석합니다.
6. T 세포 수확 및 유세포 분석
- 위아래로 피펫팅하여 각 웰의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 마이크로 버블을 포함하여 웰의 전체 내용물을 제거하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 400μL의 무칼슘 및 마그네슘 무마그네슘 DPBS(-/-)로 각 웰을 세척하고 용액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 실온에서 5분 동안 400 x g 로 원심분리합니다.
- 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 50 μL의 분리 완충액에 재현탁시킨다.
- 활성화 및 고갈 항체/염색 칵테일로 염색하고 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음과 같이 염색 칵테일을 준비하십시오 - 활성화 칵테일 : AF700-CD3, PE / 눈부심 -CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; 고갈 칵테일 : AF700-CD3, PE / 눈부심 -CD4, PE / Cy7-CD8, PE-PD-1.
- 분리 완충액 1mL를 넣고 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 400 x g로 원심분리하여 과도한 항체를 씻어냅니다. 상청액을 완전히 흡인하십시오.
- 세포 펠렛을 1mL의 분리 완충액에 재현탁시키고, 유세포분석 분석을 위해 적절한 용기 (예를 들어, FACS 튜브, 96-웰 플레이트 등)로 옮긴다. 권장되는 유세포분석 게이팅 체계는 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다.
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Representative Results
T 세포를 구입한 PBMC로부터 단리하고, 프로토콜에 기재된 바와 같이 활성화를 위해 도말하였다. 음성 대조군 샘플 (구입 한 PBMCs)은 활성화되지 않았습니다. 이들 대조군 샘플은 마이크로버블 활성화 과정이 비접촉 및 자극되지 않은 T 세포 대조군과 비교하여 실험 샘플에 미치는 영향을 입증하기 위해 포함되었으며, 관찰된 활성화 마커는 추가된 활성화 인자의 결과이며 T 세포 자체에 내재되지 않았음을 보장하였다. 그림 2의 실험 개요에 따라, 세포를 T 세포 배지에서 2 x 106 cells/mL로 시딩하고, 만지지 않은/무자극되거나 항-CD3 (클론 OKT3) 및 항-CD28 (클론 28.2) SAMB와 공동 자극되었다. 배양물에서 48 시간의 자극 후, 세포를 zsGreen을 암호화하는 렌티 바이러스 입자로 형질 도입 하였다. 형질도입 후 4일 및 6일째에, 세포를 AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (또는 고갈 또는 활성화 패널이 각각 사용되었는지에 따라 PE-CD69), 및 7-AAD를 사용하여 이미징하고, 수확하고, 표면 염색하였다. zsGreen 전이유전자는 FITC 채널에서 검출가능하였다. 유세포분석 게이팅 접근법은 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다. 생존 가능한 T 세포 수 및 전이-양성 T 세포의 증가가 대조군 샘플과 마이크로버블 공동 자극을 받은 세포 사이에서 관찰되었다(그림 3). 증가된 이펙터 세포 집단은 또한 마이크로버블 샘플에서 관찰되었다(도 4). 증가된 활성화 및 고갈 마커를 발현하는 T 세포는 마이크로버블 공동-자극을 받은 세포 샘플들 사이에서 관찰되었다(도 5 및 도 6). 공동자극된 샘플의 4일째와 6일째 시점 사이에 세포 확장이 관찰되었고, 이는 세포가 확장됨에 따라 활성이고, 증식하고, 전이유전자를 전달함을 나타낸다.
그림 1: 게이팅 체계의 예-손대지 않은/음성 대조군 샘플. 싱글릿에서 시작하여 집단 세포는 SSC-A/FSC-A를 사용하여 다음으로 게이트되었습니다. 총 CD3+ 세포를 게이팅한 다음, 7-AAD를 사용하여 생존 가능한 CD3+ 게이팅을 수행하여 집단의 생존 가능성을 결정했습니다. 모든 후속 모집단 및 계산은 하위 집단 게이트를 나타내는 화살표를 사용하여 표시된 대로 실행 가능한 7-AAD(-)/CD3+(+) 개체군에서 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실험적 타임라인 개요. 프로토콜의 날짜는 위에 명시되어 있으며 해당 형질 도입 후 일 (D0-D6)이 아래 그림에 사용됩니다. 세포를 선택 및 활성화 직후에 도말하였다. 대조군 웰은 마이크로버블 음성 선택 프로토콜을 사용하여 생성하였다. 대조군 T 세포는 공동 자극제를 투여받지 않았고 형질 도입을 거치지 않았지만, 세포가 실험 전반에 걸쳐 합리적인 생존력을 유지하기에 충분히 건강하게 유지되도록 IL-2를 투여 받았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 형질도입 후 생존 가능하고 성공적으로 형질도입된 세포의 평가. (A) 형질도입 후 4일 및 6일 후에 생존 가능한 CD3+ 세포. 생존력은 유세포 분석 분석을 통해 결정되었으며, 여기서 집단은 7-AAD (-) / CD3 + (+) 세포에 게이팅하여 정량화되었습니다. (B) rLV.EF1.zsGreen으로 성공적으로 형질도입된 세포의 수는 유세포분석을 통해 결정되었으며, 여기서 생존 가능한 7-AAD(-)/CD3+(+) 집단은 zsGreen(+) 세포로 추가로 게이트되었습니다. 모든 조건은 삼중(n=3)으로 수행하였다. 데이터는 SD± 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 생존 가능한 CD4+ 및 CD8+ T 세포. CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브집단은 생존 가능한 CD3+ 집단(CD3+ [+]/7-AAD[−])에 게이팅하고 (A) CD4+ 및 (B) CD8+의 발현을 측정함으로써 정량화하였다. 모든 조건은 삼중(n=3)으로 수행하였다. 데이터는 SD± 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 생존 가능한 활성화된 T 세포. 생존 가능한 CD3+ 집단은 또한 상기 그림에 표시된 바와 같이 특정 활성화 마커에 대해 분석되었다. (A) CD69는 활성화의 초기 마커이고; (b) CD25는 중기 내지 후기 활성화 마커이다. 오차 막대 위의 백분율은 각 마커를 발현하는 생존 가능한 CD3+ 세포의 백분율을 나타냅니다. 모든 조건은 삼중(n=3)으로 수행하였다. 데이터는 SD± 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 고갈된 T 세포. 생존 가능한 CD3+ 집단은 또한 고갈 (PD-1) 마커에 대해 분석되었다. (A) 형질도입 후 4일 및 6일째에 7-AAD(-)/CD3+(+)/PD-1+(+) 세포의 총 수. (b) PD-1+ 세포의 백분율. 4일 및 6일째에, 활성화/형질도입된 샘플 집단은 ~25% 생존 가능한 CD3+/PD-1+ 세포를 갖는 반면, 대조군 샘플 집단은 ~2% 생존 가능한 CD3+/PD-1+ 세포를 가졌다. 참고로, 시작/단리된 물질은 <~15%의 생존 가능한 CD3+/PD-1+ 세포를 가졌다(분리 후/사전 배양 데이터는 나타내지 않음). 모든 조건은 삼중(n=3)으로 수행하였다. 데이터는 SD± 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기술된 프로토콜은 PBMC 샘플로부터 T 세포의 단리 및 마이크로버블을 갖는 배양 배지 내의 부유 T 세포의 활성화를 허용한다. 이 방법은 고유 한 부력이 세포에 공동 자극 신호를 도입하고 배양 배지에 현탁되어있는 동안 활성화하여 확장 된 세포의 장기간 자극에 대한 노출을 줄이는 독특한 기회를 제공하는 기능화 된 마이크로 버블에 의존합니다. 이러한 과잉 자극은 T 세포 고갈 마커의 발현 증가 및 치료 효능 감소를 초래할 수 있다11. 기능화된 마이크로버블에 부력으로 부착된 자극된 T 세포는 확장을 위해 세포 배양 플레이트의 바닥으로 떨어지는 손대지 않은 딸 세포를 생성하여 부력 자극 인자로부터 멀리 떨어진 성장 기간을 허용합니다. 자극 인자 (예 : 자기 비드 기반 프로토콜 12)에 대한 분리 된 T 세포의 장기간 노출이 확장 및 치료 효능 6,7,11에 어떻게 악영향을 미칠 수 있는지에 대한 문헌에 자세히 설명되어 있습니다.
이 보고된 프로토콜은 CD3+ 세포의 양성 선택에 의존하기 때문에 이 프로토콜의 분리 단계에서 버블 세포 층 아래의 하위 산액을 신중하지만 철저하게 제거하는 것이 중요합니다. 이것은 양성으로 선택된 T 세포 집단만이 추가로 자극되고 도금되는 것을 보장합니다. 이것은 또한 정확한 공동자극 및 도금 계산에 필요한 출발 PBMC 샘플로부터 선택된 세포의 수를 결정하기 위한 중요한 단계이다.
T 세포 활성화 및 확장을 위한 이러한 마이크로버블 프로토콜 개발 활동은 유세포분석 중에 다양한 마커를 활용하여 분리되고 자극된 T 세포 집단의 철저한 특성 분석을 통해 활성화, 고갈 및 클론 확장을 포함한 중요한 T 세포 매개변수를 평가할 수 있습니다. 마그네틱 비드 기반 프로토콜과 같이 일반적으로 사용되는 T 세포 분리 및 자극 기술과 비교할 때, 이 마이크로버블 프로토콜은 분리된 T 세포의 확장 및 상응하는 이펙터 기능 능력을 희생하지 않으면서 세포의 과잉 자극을 최소화하는 것을 목표로 합니다. 이 마이크로버블 기술의 향후 응용 분야에는 세포 치료 연구 및 제조 커뮤니티에 대한 다양한 워크플로우 요구를 충족하기 위해 T 세포 양성 선택, 공동 자극 및 후속 마이크로버블 세포 배양을 위한 다양한 프로토콜이 포함될 것입니다.
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Disclosures
모든 저자는 제출 당시 마이크로 버블 분리 제품을 제조 및 판매하는 Akadeum Life Sciences의 직원입니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
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