Summary
Целью данного исследования является демонстрация возможности разделения на основе флотации для выделения, активации и расширения первичных Т-клеток человека.
Abstract
Процесс выделения Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) для создания культур ex vivo имеет решающее значение для исследований, клинических испытаний и клеточной терапии. В этом исследовании представлен простой, новый протокол для изоляции, активации и расширения Т-клеток из PBMCs ex vivo . В этом исследовании используется функционализированная технология сортировки клеток с активацией плавучести (BACS) для выделения и активации Т-клеток. Вкратце, протокол включает в себя положительный отбор клеток CD3+ из ПБМК, полученных из лейкопака, с последующей 48-часовой стимуляцией с предварительно конъюгированными анти-CD28-связанными микропузырьками стрептавидина (SAMB) до трансдукции в 24-луночных пластинах. Функционализированные микропузырьки предлагают уникальную возможность плавучей активации клеток, что приводит к пролиферативным фенотипам, которые позволяют расширяться с минимальным истощением. Этот метод обеспечивает снижение истощения, поскольку костимулирующие микропузырьки остаются плавучими и возвращаются в верхнюю часть питательной среды, тем самым уменьшая количество времени, в течение которого расширяющиеся клетки находятся в контакте с костимулирующими факторами. Результаты показывают, что изолированные и культивируемые Т-клетки получают достаточную стимуляцию для активации и пролиферации, но не до такой степени, которая приводит к гиперактивации, что затем приводит к истощению, о чем свидетельствует наличие избыточного PD-1.
Introduction
В настоящее время во всем мире проводится более 500 клинических испытаний терапии рецепторами химерного антигена (CAR)-Т-клетками, и четыре продукта car-T-клеточной терапии доступны на рынке1. Тем не менее, многочисленные потребности в исследованиях и производстве CAR-T-клеток все еще существуют, которые необходимо решить для повышения эффективности, масштабируемости и долгосрочного успеха этих потенциально лечебных методовлечения 2,3,4,5. Прикладные клинические исследования и производство CAR-T-клеток начинаются с выделения Т-клеток из образца периферической крови и последующей стимуляции, трансдукции и расширения изолированных клеток. Такие параметры, как восстановление Т-клеток, чистота и сигналы активации/истощения, требуют тщательного рассмотрения при выборе методов изоляции и стимуляции клеток для исследования и производства CAR-T-клеток 3,4,6. Важно отметить, что улучшение терапевтической стойкости CAR-T-клеточной терапии путем минимизации биологических препятствий, возникающих в результате текущих производственных процессов, таких как истощение Т-клеток, необходимо для повышения терапевтической эффективности 6,7.
В качестве альтернативы традиционным методам изоляции клеток, таким как флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) и магнитно-активированная сортировка клеток (MACS), здесь демонстрируется сортировка клеток с активацией плавучести (BACS) с микропузырьками для изоляции Т-клеток. Разделение микропузырьков использует плавучие, полые микросферы (микропузырьки) для связывания мишеней и вывоза их на поверхность образцов жидкости 8,9. Функционализируя микропузырьки антителами (т.е. анти-CD3), желаемые популяции Т-клеток могут быть положительно отобраны из образцов периферической крови. Впоследствии в данной работе продемонстрировано использование другой популяции микропузырьков, функционализированных антителами (т.е. анти-CD28) для совместной стимуляции и активации положительно отобранных Т-клеток в суспензии. Микропузырьки предлагают простой и настраиваемый рабочий процесс изоляции и активации, который генерирует Т-клетки, готовые к взвешенной клеточной культуре и последующим приложениям, таким как генетическая модификация и расширение. Критически важно, что активация плавучих клеток микропузырьками способствует сдержанной стимуляции клеток для предотвращения чрезмерного истощения Т-клеток7.
Для этого исследования проточная цитометрия была основным инструментом, используемым для анализа успеха выделения, активации и трансдукции функционализированных микропузырьков, а также для предоставления подробной информации о конкретных субпопуляциях, присутствующих во время фаз роста и расширения после трансдукции. В дополнение к проточной цитометрии, для подтверждения здоровья клеток, морфологии и успеха трансдукции использовалась ярко-полевая и флуоресцентная микроскопия. Основываясь на этих результатах, технология и протокол microbubble обеспечивают более настраиваемую и более мягкую альтернативу традиционным методам изоляции и активации, используемым в настоящее время; в частности, клетки, активированные микропузырем, демонстрируют заметно более низкую экспрессию маркеров истощения Т-клеток, чем та, которая обычно наблюдается с помощью стандартных инструментов и наборов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение Т-клеток с микропузырьками с помощью положительного отбора
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол детализирует мелкомасштабный подход к положительному выбору CD3+ с использованием SAMB.
- Инкубировать 3 х 108 коммерчески полученных ПБМК в 2,5 мл разделительного буфера с биотинилированным анти-CD3 (OKT3) антителом в концентрации 25 нг антитела на 1 млн клеток (25 нг/М). Аккуратно перемешать, пипеткой вверх и вниз, и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Добавьте микропузырьки стрептавидина (SAMB) в соотношении 0,5 (количество SAMB):1 (количество ячейки) в соответствии с заявленной производителем концентрацией SAMB.
- Смешайте с помощью коммерческого торцевого ротатора (EOE) при 20 об/мин в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре.
- После центрифугирования положительно выбранные ячейки будут находиться в верхней части суспензии с SAMB. Остальные невыбранные ячейки будут находиться в ячейке гранулы в нижней части трубки. Используя стеклянную пипетку 9 дюймов, вставьте наконечник под слой пузырьковой ячейки на дно трубки, аспирируйте гранулу ячейки и субнатант электронной пипеткой и перенесите их в новую трубку.
2. Стимуляция (активация) положительно выбранных Т-клеток
- Повторно суспендировать слой пузырьковых клеток, оставшийся в исходной трубке, в 1 мл полной Т-клеточной среды (или другой желаемой среды).
- Подсчитайте ячейки в субнатанте с помощью микроскопии яркого поля с помощью автоматизированного счетчика клеток и вычтите это значение из начального номера ячейки, чтобы определить количество клеток, захваченных в слое пузырьковых клеток.
- До этого этапа смешайте биотинилированное антитело против CD28 с коммерческими SAMB в течение как минимум 2 ч для создания конъюгированных анти-CD28 SAMB. Свяжитесь с производителем SAMBs для определения количества антител против CD28, необходимых для конъюгации. Добавьте конъюгированные SAMB против CD28 в суспензию пузырьковых клеток, полученную в результате шага 2.1, используя соотношение 1,5 (анти-CD28 SAMBs):1 (клетки).
- Смешайте с использованием вращения EOE в течение 15 мин, а затем отрегулируйте общий объем до 2 миллионов клеток на мл с полной Т-клеточной средой или другой желаемой средой в соответствии с номером ячейки, полученным на стадии 2.2.
3. Расширение костимулированных клеток в клеточной культуральной среде
- Распределите 1 мл активированных клеток со стадии 2,4 в концентрации 2 М/мл на скважину в 24-луночной пластине. Инкубировать в увлажненном 5% CO2 инкубаторе при 37 °C.
- Через 24 ч добавляют 50 ЕД/мл IL-2 и 25 нг/М растворимого анти-CD3 (OKT3) для дальнейшего стимулирования расширения, рассчитанного с использованием начального числа клеток, покрытых на 0-й день. Поместите клеточную пластину обратно в увлажненный инкубатор CO2 и дайте ей инкубироваться в течение ночи при 37 °C.
4. Необязательно: Трансдукция активированных Т-клеток лентивирусом
ПРИМЕЧАНИЕ: Подход, используемый здесь, адаптирован из Prommersberger et al. 10 см.
- Оттаивают лентивирус при комнатной температуре и кратковременно перемешивают путем пипетки.
- Осторожно извлеките средний натант, по 600 мкл из каждой лунки, не касаясь дочерних клеток, которые сейчас находятся на дне лунки, или пузырькового слоя, который остался на поверхности раствора.
- Добавьте 5 мкг/мл гексадиметрина бромида на лунку для усиления вирусной трансдукции. Добавьте лентивирусные частицы при множественности инфекции (MOI) 3 (лентивирусные частицы на клетку).
- Центрифугируйте пластину в течение 45 мин при 800 x g и 32 °C, используя медленное ускорение и без перерыва для замедления. Инкубируют клетки в течение 4 ч в увлажненном инкубатореCO2 при 37 °C.
- Через 4 ч добавляют 600 мкл коммерчески доступной, свежей полной Т-клеточной среды и 50 ЕД/мл IL-2 в каждую лунку и помещают клеточную пластину обратно в увлажненный инкубаторCO2 при 37 °C для расширения Т-клеток.
5. Расширение Т-клеток (с предварительной трансдукцией или без нее)
- Каждые 2 дня удаляют половину среды из среднего натана, заменяют ее свежей, полной Т-клеточной средой и добавляют IL-2 в концентрации 50 Ед/мл.
- Подсчитывайте Т-клетки два раза в неделю, чтобы оценить плотность клеток. Когда плотность клеток превысит 2 х 10 6-2,5 х 106 клеток/мл, переместите клетки в более крупный сосуд, разбавив их до 5 х 105 клеток/мл.
6. Сбор Т-клеток и проточная цитометрия
- Аккуратно перемешайте содержимое каждой лунки, пипетируя вверх и вниз. Удалите все содержимое лунки, включая микропузырьки, и переложите их в пробирку объемом 1,5 мл.
- Промыть каждую лунку 400 мкл DPBS без кальция и магния (−/−) и переложить раствор в пробирку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу в 50 мкл разделительного буфера.
- Окрашивание с активацией и истощением антителом/окрашивающим коктейлем и инкубация в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте. Приготовьте окрашивающие коктейли следующим образом: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; коктейль истощения: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
- Добавьте 1 мл разделительного буфера и аккуратно перемешайте. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре для вымывания избытка антител. Аспирировать супернатанта полностью.
- Повторно суспендировать ячейку гранулы в 1 мл разделительного буфера и перенести в соответствующий сосуд (например, трубку FACS, пластину с 96 лунками и т.д.) для анализа проточной цитометрии. Рекомендуемая схема анализа проточной цитометрии приведена на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Т-клетки были выделены из купленных NBMC и покрыты для активации, как описано в протоколе. Отрицательные контрольные образцы (приобретенные МПК) не активировались. Эти контрольные образцы были включены, чтобы продемонстрировать эффект, который процесс активации микропузырька оказал на экспериментальные образцы по сравнению с нетронутыми и нестимулированными контрольными Т-клетками, гарантируя, что наблюдаемые маркеры активации были результатом добавленных факторов активации и не были присущи самим Т-клеткам. Согласно экспериментальному плану на рисунке 2, клетки были посеяны в 2 x 106 клеток / мл в Т-клеточной среде и были либо нетронутыми / нестимулированными, либо совместно стимулированными с анти-CD3 (клон OKT3) и анти-CD28 (клон 28.2) SAMB. После 48 ч стимуляции в культуре клетки трансдуцировали лентивирусной частицей, кодирующей zsGreen. Через 4 дня и 6 дней после трансдукции клетки были визуализированы, собраны и окрашены поверхностью с использованием AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (или PE-CD69 в зависимости от того, использовались ли панели истощения или активации, соответственно) и 7-AAD. Трансген zsGreen был обнаружен в канале FITC. Подход к проточной цитометрии подробно описан на рисунке 1. Увеличение числа жизнеспособных Т-клеток и трансген-положительных Т-клеток наблюдалось между контрольным образцом и клетками, которые получали костимуляцию микропузырьков (рисунок 3). Увеличение популяций эффекторных клеток также наблюдалось в микропузырьковых образцах (рисунок 4). Т-клетки, экспрессирующие повышенные маркеры активации и истощения, наблюдались среди образцов клеток, получавших костимуляцию микропузырьков (Рисунок 5 и Рисунок 6). Клеточное расширение наблюдалось между временными точками 4-го и 6-го дней совместно стимулируемых образцов, что указывает на то, что клетки были активными, пролиферативными и передавали трансген по мере их расширения.
Рисунок 1: Пример схемы гаширования - нетронутый/отрицательный контрольный образец. Начиная с синглетов, популяционные ячейки были закрыты с использованием SSC-A / FSC-A. Общее количество клеток CD3+ было закрыто, за которым последовал жизнеспособный CD3+ gating с использованием 7-AAD для определения жизнеспособности популяции. Все последующие популяции и расчеты были определены из жизнеспособной популяции 7-AAD(−)/CD3+(+), как показано с помощью стрелок, указывающих на ворота субпопуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обзор экспериментальной временной шкалы. Дни протокола указаны выше, а соответствующие дни после трансдукции (D0-D6) используются на рисунках ниже. Клетки были покрыты сразу после отбора и активации. Контрольные скважины были сформированы с использованием протокола отрицательного отбора микропузырьков. Контрольные Т-клетки не получали агентов костимуляции и не подвергались трансдукции, хотя они получали IL-2, чтобы гарантировать, что клетки были достаточно здоровыми для поддержания разумной жизнеспособности на протяжении всего эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка жизнеспособных и успешно трансдуцированных клеток после трансдукции. (A) Жизнеспособные cd3+ клетки через 4 дня и 6 дней после трансдукции. Жизнеспособность определяли с помощью анализа проточной цитометрии, в котором популяция количественно оценивалась путем наведения 7-AAD(−)/CD3+(+) клеток. (B) Количество клеток, успешно трансдуцированных с помощью rLV.EF1.zsGreen, определяли с помощью проточной цитометрии, в которой жизнеспособная популяция 7-AAD(−)/CD3+(+) была дополнительно ограничена клетками zsGreen(+). Все условия выполнялись в трех экземплярах (n = 3). Данные представляют собой среднюю ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Жизнеспособные CD4+ и CD8+ Т-клетки. Субпопуляции CD4+ и CD8+ Т-клеток были количественно определены путем определения жизнеспособной популяции CD3+ (CD3+ [+]/7-AAD[−]) и измерения экспрессии (A) CD4+ и (B) CD8+. Все условия выполнялись в трех экземплярах (n = 3). Данные представляют собой среднюю ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Жизнеспособные активированные Т-клетки. Жизнеспособная популяция CD3+ также была проанализирована на предмет специфических маркеров активации, как указано на рисунках выше. (A) CD69 является ранним маркером активации; (B) CD25 является маркером активации от среднего до позднего. Проценты над полосами ошибок представляют собой процент жизнеспособных клеток CD3+ , экспрессирующих соответствующий маркер. Все условия выполнялись в трех экземплярах (n = 3). Данные представляют собой среднюю ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Истощенные Т-клетки. Жизнеспособная популяция CD3+ также была проанализирована на наличие маркеров истощения (PD-1). (A) Общее количество 7-AAD(−)/CD3+(+)/PD-1+(+) клеток на 4-й день и 6-й день после трансдукции. (B) Процентное содержание ячеек PD-1+ . На 4-й и 6-й день активированная/трансдуцированная выборочная популяция имела ~ 25% жизнеспособных клеток CD3 + / PD-1 + , тогда как контрольная выборочная популяция имела ~ 2% жизнеспособных CD3 + / PD-1 + клеток. Следует отметить, что исходный / изолированный материал имел < ~ 15% жизнеспособных клеток CD3 + / PD-1 + (данные после изоляции / до культивирования не показаны). Все условия выполнялись в трех экземплярах (n = 3). Данные представляют собой среднее значение ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный протокол позволяет выделять Т-клетки из образцов PBMC и активировать взвешенные Т-клетки в культуральных средах с микропузырьками. Этот метод опирается на функционализированные микропузырьки, присущая им плавучесть, дает уникальную возможность вводить в клетки костимулирующие сигналы и активировать их, пока они подвешены в культуральной среде, тем самым уменьшая воздействие расширяющихся клеток на длительную стимуляцию; такая чрезмерная стимуляция может привести к увеличению экспрессии маркеров истощения Т-клеток и снижению терапевтической эффективности11. Стимулированные Т-клетки, которые плавуче прикреплены к функционализированным микропузырькам, производят нетронутые дочерние клетки, которые опускаются на дно пластины клеточной культуры для расширения, обеспечивая период роста вдали от плавучих факторов стимуляции. В литературе подробно описано, как длительное воздействие изолированных Т-клеток на стимулирующие факторы, такие как протоколы12 на основе магнитной бусины, может отрицательно повлиять на расширение и терапевтическую эффективность 6,7,11.
Поскольку этот протокол основан на положительном отборе клеток CD3 + , крайне важно удалить субнатант под слой пузырьковых клеток осторожно, но тщательно во время фазы изоляции этого протокола. Это гарантирует, что только положительно выбранная популяция Т-клеток дополнительно стимулируется и покрывается. Это также важный шаг для определения количества клеток, отобранных из исходного образца PBMC, что необходимо для точных расчетов совместной стимуляции и покрытия.
Эти мероприятия по разработке микропузырьков для активации и расширения Т-клеток использовали широкий спектр маркеров во время анализа проточной цитометрии, что позволило тщательно охарактеризовать изолированную и стимулированную популяцию Т-клеток для оценки критических параметров Т-клеток, включая активацию, истощение и клональное расширение. По сравнению с широко используемыми технологиями изоляции и стимуляции Т-клеток, такими как протоколы на основе магнитных шариков, этот протокол микропузырьков направлен на минимизацию чрезмерной стимуляции клеток без ущерба для расширения и соответствующих функциональных способностей изолированных Т-клеток. Будущие применения этого метода микропузырьков будут включать в себя различные протоколы для положительного отбора Т-клеток, костимуляции и последующих культур микропузырьковых клеток для удовлетворения различных потребностей рабочего процесса для исследований и производственных сообществ клеточной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы, на момент подачи заявки, являются сотрудниками Akadeum Life Sciences, которая производит и продает продукты для разделения микропузырьков.
Acknowledgments
Никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).
