Flotasjonsbasert T-celle isolering, aktivering og utvidelse fra humane perifere blod-mononukleære celleprøver ved bruk av mikrobobler

Summary

Målet med denne studien er å demonstrere muligheten for flotasjonsbasert separasjon for å isolere, aktivere og utvide primære humane T-celler.

Abstract

Prosessen med å isolere T-celler fra perifere mononukleære celler (PBMCs) for å etablere ex vivo-kulturer er avgjørende for forskning, klinisk testing og cellebaserte terapier. I denne studien presenteres en enkel, ny protokoll for å isolere, aktivere og utvide T-celler fra PBMCs ex vivo . Denne studien benytter funksjonalisert oppdriftsaktivert cellesortering (BACS) teknologi for å isolere og aktivere T-celler. Kort fortalt innebærer protokollen positiv seleksjon av CD3⁺ -celler fra leukopak-avledede PBMC-er, etterfulgt av en 48-timers kostimulering med forhåndskonjugerte anti-CD28-bundne streptavidinmikrobobler (SAMB) før transduksjon i 24-brønnsplater. Funksjonaliserte mikrobobler gir en unik mulighet til å aktivere celler flytende, noe som fører til proliferative fenotyper som muliggjør ekspansjon med minimal utmattelse. Denne teknikken gir redusert utmattelse fordi de kostimulerende mikroboblene forblir flytende og går tilbake til toppen av kulturmediet, og reduserer dermed tiden de ekspanderende cellene er i kontakt med de kostimulerende faktorene. Resultatene indikerer at de isolerte og kultiverte T-cellene får nok stimulering til å aktivere og proliferere, men ikke i en grad som fører til overaktivering, noe som deretter fører til utmattelse, som demonstrert ved tilstedeværelse av overdreven PD-1.

Introduction

Mer enn 500 chimere antigenreseptor (CAR) -T celleterapi kliniske studier utføres for tiden over hele verden, og fire CAR-T celleterapiprodukter er tilgjengelige på markedet¹. Imidlertid eksisterer det fortsatt mange CAR-T-celleforsknings- og produksjonsbehov som må tas opp for å forbedre effektiviteten, skalerbarheten og den langsiktige suksessen til disse potensielt kurative terapiene 2,3,4,5. Adoptiv CAR-T-celle klinisk forskning og produksjon begynner med T-celleisolasjon fra en perifer blodprøve og påfølgende stimulering, transduksjon og utvidelse av de isolerte cellene. Parametere som T-cellegjenoppretting, renhet og aktiverings- / utmattelsessignaler krever nøye vurdering når du velger celleisolasjons- og stimuleringsteknikker for CAR-T-celleforskning og produksjon ^3,4,6. Det er viktig at forbedring i terapeutisk utholdenhet av CAR-T-celleterapier ved å minimere de biologiske hindringene som følge av dagens produksjonsprosesser, for eksempel T-celleutmattelse, er nødvendig for å forbedre den terapeutiske effekten ^6,7.

Som et alternativ til tradisjonelle celleisolasjonsmetoder som fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og magnetisk aktivert cellesortering (MACS), her demonstreres oppdriftsaktivert cellesortering (BACS) med mikrobobler for T-celleisolasjon. Microbubble separasjon bruker flytende, hule mikrosfærer (mikrobobler) for å binde målene og flyte dem til overflaten av væskeprøver ^8,9. Ved å funksjonalisere mikrobobler med antistoffer (dvs. anti-CD3), kan de ønskede T-cellepopulasjonene velges positivt fra perifere blodprøver. Deretter demonstreres bruk av en annen populasjon av antistofffunksjonaliserte mikrobobler (dvs. anti-CD28) for å stimulere og aktivere positivt utvalgte T-celler i suspensjon i dette arbeidet. Microbubbles tilbyr en enkel og svært justerbar isolasjons- og aktiveringsarbeidsflyt som genererer T-celler klar for suspendert cellekultur og nedstrøms applikasjoner som genetisk modifisering og utvidelse. Kritisk fremmer flytende celleaktivering med mikrobobler behersket cellestimulering for å forhindre overdreven T-celleutmattelse⁷.

For denne studien var flowcytometri det primære verktøyet som ble brukt til å analysere isolasjons-, aktiverings- og transduksjonssuksessen til de funksjonaliserte mikroboblene, samt å gi detaljert informasjon om de spesifikke underpopulasjonene som er tilstede under vekst- og ekspansjonsfasene etter transduksjon. I tillegg til flowcytometri ble lysfelt- og fluorescensmikroskopi brukt for å bekrefte cellehelsen, morfologien og transduksjonssuksessen. Basert på disse resultatene gir mikrobobleteknologien og protokollen et mer justerbart og mildere alternativ til de tradisjonelle isolasjons- og aktiveringsmetodene som for tiden er i bruk i dag; Spesielt viser mikrobobleaktiverte celler betydelig lavere uttrykk for T-celleutmattelsesmarkører enn det som vanligvis observeres med industristandardverktøy og sett.

Protocol

1. Isolering av T-celler med mikrobobler ved bruk av positivt utvalg MERK: Denne protokollen beskriver en liten CD3+ positiv seleksjonsmetode ved bruk av SAMB-er. Inkuber 3 x 108 kommersielt oppnådde PBMC-er i 2,5 ml separasjonsbuffer med biotinylert anti-CD3 (OKT3) antistoff ved en konsentrasjon på 25 ng antistoff per 1 million celler (25 ng / M). Bland forsiktig ved pipettering opp og ned, og inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. <l…

Representative Results

T-celler ble isolert fra kjøpte PBMC-er og belagt for aktivering som beskrevet i protokollen. De negative kontrollprøvene (kjøpte PBMCer) ble ikke aktivert. Disse kontrollprøvene ble inkludert for å demonstrere effekten som mikrobobleaktiveringsprosessen hadde på de eksperimentelle prøvene sammenlignet med de uberørte og ustimulerte T-cellekontrollene, slik at aktiveringsmarkørene som ble observert var resultatet av de ekstra aktiveringsfaktorene og ikke var iboende for T-cellene selv. I henhold til eksperimente…

Discussion

Den beskrevne protokollen tillater isolering av T-celler fra PBMC-prøver og aktivering av suspenderte T-celler i dyrkningsmedier med mikrobobler. Denne metoden er avhengig av funksjonaliserte mikrobobler hvis iboende oppdrift gir en unik mulighet til å introdusere kostimulerende signaler til celler og aktivere dem mens de er suspendert i et kulturmedium, og dermed redusere eksponeringen av de ekspanderende cellene til langvarig stimulering; slik overstimulering kan resultere i økt ekspresjon av T-celleutmattelsesmark?…

Materials

2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates	VWR	76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody	Biolegend	302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody	Biolegend	317320
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061
Human Recombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated	Innovative Research	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES	Gibco	72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)	Akadeum	11110-000