Summary
Denne artikkelen beskriver murine medfødt hjertesykdom (CHD) diagnostiske metoder ved bruk av føtal ekkokardiografi, nekropsi og episkopisk fluorescens bildeopptak (EFIC) ved hjelp av episkopisk konfokalmikroskopi (ECM) etterfulgt av tredimensjonal (3D) rekonstruksjon.
Abstract
Medfødte hjertesykdommer (CHD) er viktige årsaker til spedbarnsdød i USA. På 1980-tallet og tidligere døde de fleste pasienter med moderat eller alvorlig CHD før voksen alder, med maksimal dødelighet i løpet av den første uken i livet. Bemerkelsesverdige fremskritt innen kirurgiske teknikker, diagnostiske tilnærminger og medisinsk behandling har ført til markante forbedringer i resultatene. For å møte de kritiske forskningsbehovene for å forstå medfødte hjertefeil, har murine modeller gitt en ideell forskningsplattform, da de har svært lik hjerteanatomi til mennesker og korte svangerskapsfrekvenser. Kombinasjonen av genteknologi med fenotypingsverktøy med høy gjennomstrømning har gjort det mulig for replikasjon og diagnostisering av strukturelle hjertefeil for ytterligere å belyse molekylære veier bak CHD. Bruken av ikke-invasiv føtal ekkokardiografi for å screene hjertefenotypene i musemodeller kombinert med den høye troskapen til episkopisk fluorescens bildeopptak (EFIC) ved bruk av episkopisk konfokalmikroskopi (ECM) histopatologi med tredimensjonale (3D) rekonstruksjoner muliggjør en detaljert oversikt over anatomien til ulike medfødte hjertefeil. Denne protokollen skisserer en komplett arbeidsflyt av disse metodene for å få en nøyaktig diagnose av murine medfødte hjertefeil. Bruk av denne fenotypingsprotokollen for å modellere organismer vil muliggjøre nøyaktig CHD-diagnose, noe som gir innsikt i mekanismene til CHD. Identifisering av de underliggende mekanismene for CHD gir muligheter for potensielle terapier og intervensjoner.
Introduction
Medfødte hjertesykdommer (CHD) er den vanligste neonatale fødselsdefekten 1,2, som påvirker omtrent 0,8% -1,7% av nyfødte og resulterer i betydelig neonatal dødelighet og sykelighet3. En genetisk etiologi er sterkt indikert med CHDs 4,5. Genmodifiserte musemodeller har blitt brukt mye for å forstå kompleksiteten til CHDs og mekanismene som forårsaker dem på grunn av at musene har firekammerhjerter og sammenlignbare hjerteutviklings-DNA-sekvenser hos mus og menneskefostre6. Identifisering av fenotypen til musemutantene er det grunnleggende første trinnet i å karakterisere funksjonen til det målrettede genet. Musemodeller som uttrykker gendoseringseffekter, der en enkelt genetisk mutasjon kan resultere i et spekter av hjertefeil som etterligner humane CHDs, er viktige for å forstå kompleksiteten til CHDs og mekanismene som forårsaker dem.
Denne artikkelen skisserer en rørledning for å karakterisere hjertefenotyper i musemodeller. De anvendte metodene benytter fosterets ekkokardiogram 7, etterfulgt av nekropsi og ECM-histopatologi 7,8, som kan vise den detaljerte anatomien for å utvikle murine hjertefenotyper. Et føtal ekkokardiogram er en ikke-invasiv modalitet som tillater direkte visualisering av flere embryoer med rimelig bildeoppløsning. I tillegg gir et føtal ekkokardiogram en rask bestemmelse av det totale antall embryoer i et søppel, deres utviklingsstadier og den relative orienteringen og plasseringen i livmorhornet. Ved hjelp av en spektral Doppler / fargestrøm kan unormale embryoer identifiseres basert på strukturen, den hemodynamiske forstyrrelsen, vekstbegrensningen eller utviklingen av hydrops. Siden en føtal ekkokardiogramstudie er en ikke-invasiv teknikk, kan den brukes til å skanne på flere dager og for å observere endringene i hemodynamikk eller hjertemorfologi. Innhenting av høy kvalitet avbildning av føtale ekkokardiogrammer krever praksis og dyktighet, som spesifikke hjertefeil kan bli savnet på grunn av mangel på erfaring og kunnskap. På grunn av dette kan en mer definitiv analyse av hjertemorfologi oppnås gjennom en kombinasjon av nekropsi og ECM-histopatologi. Nekropsi gir direkte visualisering av buestrukturen, de relative forholdene til aorta og lungearterien, størrelsen på ventriklene og atriene, hjertets stilling i forhold til brystet og bronkopulmonale strukturer. Imidlertid kan interiørfunksjoner som hjerteventiler og veggtykkelse være vanskelig å vurdere gjennom nekropsi alene. Dermed anbefales ECM-histopatologi for en avgjørende diagnose. ECM-histopatologi er en høyoppløselig visualiseringsteknikk som muliggjør både 2D- og 3D-rekonstruksjon av bildestakken9. Disse bildene er oppnådd gjennom seriell episkopisk fluorescerende avbildning av en parafininnebygd prøve da den er tynt seksjonert med et konsistent intervall av en automatisk mikrotom. I motsetning til klassisk histologi blir bilder tatt som en seksjon før den kuttes fra blokken slik at alle bilder blir tatt innenfor samme referanseramme. På grunn av dette kan 2D-bildestakken produsert av ECM-histopatologi enkelt og pålitelig rekonstrueres i tre dimensjoner. Dette gjøres ved hjelp av en DICOM-seer, som tillater 3D-visualisering av bildene i de tre anatomiske planene: koronal, sagittal og tverrgående. Fra disse høyoppløselige 3D-rekonstruksjonene kan en endelig hjertediagnose stilles. Anvendelsen av disse tre forskjellige visualiseringsmodalitetene, enten individuelt eller i kombinasjon, kan gi nøyaktige karakteriseringer av strukturelle hjertefeil i museembryoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av mus for disse studiene er nødvendig da mus har firekammerhjerter som kan etterligne menneskelige CHDs. Mus ble gitt veterinærpleie og plassert i institusjonens forening for vurdering og akkreditering av laboratoriedyrpleie (AAALAC) -akkreditert dyrepleieanlegg. Strenge protokoller ble fulgt for å minimere musens ubehag, stress, smerte og skade. Mus ble avlivet ved hjelp av CO2 -gass, som er akseptabelt for smågnagere i henhold til American Veterinary Medical Association Guidelines on Euthanasia. Studiene på mus i dette manuskriptet ble utført med en godkjent IACUC-protokoll ved University of Pittsburgh.
1. Foster ekkokardiogram
MERK: Et ekkokardiogram er et kraftig verktøy for å identifisere kardiovaskulær misdannelse og ekstrakardiale defekter hos mus. På grunn av den lille størrelsen på museembryoene (ca. 1-2 mm ved midgestation, 3,5 mm ved fødselen), er det nødvendig med ultrahøyfrekvent ekkokardiografisk utstyr med ultralydbiomikroskopi (UBM). UBM gir forskjellige høyfrekvente (30-50 MHz) sonder med et lite bildevindu (15 mm x 14 mm) som gir oppløsningen (30 μm aksial x 68 μm lateral) for å visualisere ett musefoster om gangen. En 40 MHz-svinger gir bilder med høy oppløsning for å identifisere kardiovaskulære fenotyper7.
- Slå på ekkokardiogrammaskinen og velg programmet Kardiologi.
MERK: Følgende protokoll kan brukes for hvilken som helst musebakgrunn fra embryonal dag (E) 14.5 til 19.5. - Bedøv ønsket mus i et bedøvelseskammer. Indusere anestesi med en konsentrasjon på 4 % isofluran og medisinsk oksygen med en strømningshastighet på 1 l/min og reduser den til 2 %-3 % for vedlikehold.
- Plasser musen raskt på bildeplattformen. Bildeplattformen har oppvarmet stål for å holde musen varm under prosedyren. Sett musens munn og nese inn i bedøvelsens nesekegle. Fest lemmer med tape for å unngå bevegelse. Overvåk hjertefrekvensen for å sikre at den holder seg mellom 400-450 bpm.
- Overvåk temperaturen med en rektal termometersonde og sørg for at den hviler ved 37 °C ± 0,5 °C. Overvåk pusten for å unngå hypoksi. Hold en mild kraft på sonden for å forhindre skade.
MERK: En varmelampe kan settes over musen for å forhindre hypotermi under og for å gjenopprette fra anestesi. Petrolatum oftalmisk salve kan brukes som smøremiddel for å unngå tørre øyne. - Fjern pelsen fra brystkassen og magen ved hjelp av hårfjerningskrem. Påfør kremen og vent 3 min før du tar den ut. Rengjør området med 70% etanol. Etanol fungerer bedre enn vann som barbersmøremiddel.
- Varm opp ultralydgel til normal kroppstemperatur. Påfør ultralydgelen sjenerøst og plasser transduseren på magen for å orientere den i et horisontalt plan og identifisere blæren på skjermen. Når blæren er identifisert, skanne kranialt fra blæren og se etter fosteret. Mål krone-til-rump-lengden for å bestemme svangerskapsalderen10 (figur 1 og tabell 1).
MERK: Endre svingerposisjoner for å visualisere forskjellige plan, inkludert de tverrgående firekammer-, sagittal- og frontal-/koronaavbildningsplanene7 (figur 1). - Bruk fargen Doppler til å analysere blodstrømmen fra hjertet.
- Sett musen tilbake i buret hvis embryoene ikke har nådd det tiltenkte stadiet. Ellers forbereder musen til høsting.
NOTAT: Sørg for at musen allerede er våken og gjenoppretter godt fra anestesi før du setter den tilbake i buret. - Slå av isofluran og oksygen, rengjør arbeidsområdet og slå av maskinen.
NOTAT: Det er viktig å fjerne gelen fra transduseren.
2. Nekropsi
MERK: Når unormale hjertefenotyper mistenkes ved bruk av føtal ekkokardiografi, samles fostre og fikseres via nedsenking i fikseringsløsningen: enten 10% bufret formalinfosfat eller 4% paraformaldehyd (PFA). Inspiser prøvens ytre og indre morfologi, på jakt etter makroskopiske anatomiske abnormiteter eller misdannelser.
- Forbered musen.
- Hvis musen er voksen, avlive musen ved hjelp av en standard CO2 -protokoll. Bruk tang eller dissekere saks for å lage snitt (ca. 3 cm) i lateral thorax og abdomen for å tillate penetrering av fiksativet i indre organer.
MERK: Prøven skal fikseres i minst 24 timer før nekropsi hvis embryoet er eldre enn E14.5.
- Hvis musen er voksen, avlive musen ved hjelp av en standard CO2 -protokoll. Bruk tang eller dissekere saks for å lage snitt (ca. 3 cm) i lateral thorax og abdomen for å tillate penetrering av fiksativet i indre organer.
- Analyser utsiden av kroppen.
- Sett opp programvaren for å lagre bildene med et navn, inkludert prøvens identifikasjon, mikroskopforstørrelsen og innholdet i bildet.
MERK: Forstørrelse på 1,0x til 3,2x bør være tilstrekkelig for avbildning av de fleste strukturer i E14,5 mus eller eldre. - Plasser musen på platen under stereomikroskoplinsen. Fyll platen med fosfatbufret saltvann (PBS) for å dekke prøven helt for å forhindre dehydrering og refleksjon i bildene. Juster forstørrelsen slik at skjermen inkluderer hele embryoet, og ta deretter et bilde av både venstre og høyre side av embryoet.
MERK: Bunnen av platen skal være belagt med parafin, silisium eller et annet slikt underlag for å lette festing. - Fest prøven gjennom halsen, vendt opp, og ta et nytt bilde.
MERK: Orienter tappen litt oppover for å sikre at ingen viktige strukturer i brysthulen blir gjennomboret.
- Sett opp programvaren for å lagre bildene med et navn, inkludert prøvens identifikasjon, mikroskopforstørrelsen og innholdet i bildet.
- Analyser brystet.
- Mens du løfter huden midt i nakken med tang, klipper du huden mot begge armhulene med saksen før du skjærer huden langs medianaksen mot halen. Deretter kutter du huden fra navlestrengen til bena. Fest prøven gjennom håndleddene og anklene.
MERK: Vær forsiktig med å kutte bare huden. Det anbefales å holde saksens blad horisontalt eller vinklet oppover. - For å bryte bort bindevevet, løft huden med ett par tang mens du holder det underliggende vevet på plass med det andre paret. Fest prøven gjennom huden for å eksponere brystet og magen (figur 2).
MERK: For mye strekking mens du fester, kutter eller skraper kan føre til vevskader. - Ta et bilde av de eksponerte musklene, og skrap forsiktig bort musklene for å avsløre ribbeina.
- Ta et bilde av de eksponerte ribbeina. Skill ribbeina fra mellomgulvet og klipp ribbeina på begge sider så langt som mulig på sideaksen mot nakken.
- Utsett hjertet ved å fjerne de kuttede ribbeina. Ta et bilde av hjertet.
- Fjern thymus ved å skrelle den opp med ett par tang. Bruk det andre tangparet til å stabilisere bunnen av thymus for å unngå å rive noen underliggende kar. Ta bilder av hjertet og de store karene.
MERK: Bruk av pinner for å strekke noen tilstøtende strukturer kan bidra til å få bedre bildevisninger. I tillegg kan du ta separate bilder med fokus på de store arteriene, hjertet og andre strukturer av interesse, da de kanskje ikke er i fokus sammen.
- Mens du løfter huden midt i nakken med tang, klipper du huden mot begge armhulene med saksen før du skjærer huden langs medianaksen mot halen. Deretter kutter du huden fra navlestrengen til bena. Fest prøven gjennom håndleddene og anklene.
- Analyser magen.
- Trekk membranen for å fjerne den og avsløre leveren. Ta et bilde.
- Pin tilbake leveren for å avsløre magen og bukspyttkjertelen. Ta et bilde.
- Klipp spiserøret. Fjern tykktarmen og tarmene ved å trekke dem ut med tang. Klipp like over leveren og fjern den for å avsløre nyrene og binyrene. Ta et bilde.
MERK: De fjernede organene skal oppbevares i fikseringsoppløsningen.
- Isoler thorax for ECM-analysen.
- Klipp den nedre brystkassen langs en rett linje mellom leveren og lungene. Klipp hodet av høyt nok til ikke å kutte grenene av karoten arterier.
- Fjern forsiktig de laterale ribbeina mens du opprettholder dorsale ribber og ryggraden. Skrell opp og skrap bort dorsalfettet.
- Løsne thorax fra resten av kroppen og legg den i en 10% bufret formalinfosfatløsning.
3. Innebygging
- Dekanter fikseringsmiddelet i en passende flaske for farlig avfall. Vask prøvene med 1x PBS i 15 min tre ganger.
- Bruk økende konsentrasjoner av etanol og xylen for å dehydrere prøvene. Varigheten av alle de følgende trinnene avhenger av embryostadiet. Se tabell 2 for detaljer.
MERK: Forsiktighet bør utvises ved bytte av oppløsning for å unngå å skade prøvene. De optimale parametrene for prøvebehandling kan justeres empirisk. Xylen vil oppløse visse plaststoffer; Glassinstrumenter og beholdere skal brukes. - Bytt ut xylen med paraffin for ønsket varighet. La flaskene stå i en 65 °C inkubator i passende varighet (tabell 2).
- Bruk fersk parafin til å legge prøvene i ønsket posisjon.
MERK: Det anbefales å orientere prøven i midten av parafinblokken, med dorsalsiden mot toppen og baksiden mot forsiden av blokken. Når du orienterer prøven, husk at prøven er innebygd med blokken vendt opp ned.
4. Biskopisk konfokalmikroskopi (ECM)
MERK: Etter passende innebygging gjennomgår embryoer bildeinnsamling serielt via ECM for histopatologianalyse. Individuelle lysbilder kan gjenopprettes fra mikrotomen for videre studier.
- Ta ut parafinblokken fra fryseren på -20 °C og fjern metallformene.
- Bruk et barberblad til å trimme voksen på kantene og baksiden av kassetten. Klipp voksen som omgir prøven til den er innkapslet i en liten firkant av voks festet til kassetten.
MERK: Vær ekstremt forsiktig når du håndterer kniver. - Bruk metallspaken til å klemme parafinblokken mot kuttetrinnet i mikrotomen. Velg MAN (manuell)-funksjonen i kjøremodus, løft overflaten på parafinen nær bladet, og kjør noen få lysbilder for å sikre at kappskiven kommer i kontakt med parafinblokken.
- Åpne LAS AF-programmet og velg MatrixScreener. Velg Single Regular Matrix og last inn riktig tidligere lagret mal. Klikk på Quick LUT-knappen for å bytte til hvit og oransje ombre.
- Velg Set Up Jobs og dra den 405 nm synlige laseren til maksimum. Match venstre kant av spektrumblokken til 405 nm-linjen og dra høyre kant til 800 nm-linjen. Merk Pinhole-alternativet og start Live view.
- Juster posisjonen til laserprojeksjonen for å sentrere prøven på skjermen og juster zoomknappen til ~20x. For å optimalisere oppløsningen, sett forsterkningen til 1,250 V og maksimer det blå området ved hjelp av fokusknappen; tilbakestill deretter forsterkningen til omtrent 750 V for avbildning.
MERK: Spesifikke verdier kan variere avhengig av embryoets tilstand. - Bytt skjæremetoden til Auto, sett tykkelsen til rundt 50 μm, og kjør lysbildene. Slutt å kutte når lungene og luftveiene er i sikte.
- Velg en skjæretykkelse mellom 8-10 μm og stopp Live view. Åpne Microtome Communicator for å starte avbildningen. Forsikre deg om at den midlertidige lagringsmappen er tom før du samler bilder.
- Stopp kutting når ingen ekstra hjertestruktur er visualisert. Lukk Microtome Communicator-programmet , og eksporter den midlertidige filen til en .tiff bildeserie via bildebehandlingsprogramvaren for 3D-rekonstruksjoner senere.
5. Tredimensjonal (3D) rekonstruksjon
MERK: Formålet med 3D-rekonstruksjon er å behandle en 2D-bildestakk fra ECM-avbildning til 3D-videoer i koronal, sagittal og tverrgående orientering og å bruke 3D-videoene til diagnostisering av strukturelle og anatomiske abnormiteter i prøvene.
- Åpne ECM-bildestakken i bildebehandlingsprogramvaren.
- Dra og slipp bildene filene inn i bildebehandlingsprogramvaren. Vend ECM-bildene horisontalt ved å velge Bilde > Transformer > Vend horisontalt i menylinjen.
- Lagre det vendte bildet og lukk bildebehandlingsprogramvaren.
- Importer ECM-bildestakken i DICOM-visningsprogramvaren.
- Dra og slipp de horisontalt vendte ECM-bildene til DICOM-visningsprogramvaren. Kontroller at det er en lyseblå kantlinje rundt eksempellisten, eller at bilder kan legges til i en eksisterende prøvemappe.
- Velg koblingene eller filene du vil kopiere til databasen når popup-vinduet vises. En ny prøve vises i prøvelisten med samme navn som filen kopiert til DICOM-visningsprogramvaren.
- Klikk på den nylig lagt til filen for å åpne den.
- Utfør 3D-rekonstruksjon.
- Når filen er åpnet, klikker du på menyen 2D/3D Reconstruction Tools fra verktøylinjen og velger 3D MPR.
- For Pixel X-oppløsning og Pixel Y-oppløsning skriver du inn bildeoppløsningen ved å angi zoomen som brukes under ECM-avbildning. For stykkeintervallet angir du stykketykkelsen som brukes til å skjære under ECM-avbildning.
MERK: Kameraoppløsningen endres avhengig av kameraets zoom og kan variere fra kamera til kamera.
- Bruk de forskjellige verktøyene fra Verktøy-fanen på venstre side for å justere bildestakker etter ønske.
- Bruk WW/WL-verktøyet til å justere vindusbredde og vindusnivå. Klikk og dra verktøyet på bildet oppover for å redusere bildelysstyrken og nedover for å øke det. Klikk og dra verktøyet på bildet til høyre for å redusere bildekontrasten og til venstre for å øke det.
MERK: De optimale WW / WL-innstillingene for en struktur kan være suboptimale for en annen. Av denne grunn anbefales det å lage separate videoer for å se forskjellige strukturer. - Bruk panoreringsverktøyet til å dra bildene til de ønskede posisjonene. Bruk zoomverktøyet til å forstørre eller forminske bildet etter behov, og roteringsverktøyet til å rotere bildet etter behov.
MERK: Forstørring av bilder kan føre til redusert bildekvalitet. Vær forsiktig når du roterer bilder, da dette kan føre til at aksene vender.
- Bruk WW/WL-verktøyet til å justere vindusbredde og vindusnivå. Klikk og dra verktøyet på bildet oppover for å redusere bildelysstyrken og nedover for å øke det. Klikk og dra verktøyet på bildet til høyre for å redusere bildekontrasten og til venstre for å øke det.
- Klikk og dra den fargede aksen i det første panelet. Legg merke til hvordan rotering av denne aksen endrer retningen til de to andre panelene. Roter aksene til de tre panelene til de tre panelene representerer koronal, sagittale og tverrgående visninger av prøven.
MERK: Mens du reorienterer prøvene, oppretthold riktig fremre / bakre orientering. - Generere videoer.
- Når alle tre panelene er riktig plassert, orientert og lysere, klikker du på panelet som representerer koronalvisningen.
- Klikk på Movie Export på høyre side av menylinjen. Klikk på Batch og dra glidebryterne Fra og Til for å omfatte hele interesseområdet. Under Intervall velger du alternativet Samme som tykkelse . Lagre videoen som angir visningens retning.
- Se gjennom videoen for å se om strukturene av interesse kan identifiseres tilstrekkelig. Hvis ikke, bruk verktøyene (trinn 5.4) for å justere videoene etter behov og lagre videoen på nytt.
- Gjenta trinn 5.6 for tverrgående og sagittale visninger. Diagnostiser prøvene ved hjelp av rekonstruerte videoer.
MERK: Se nøye på videoene i hver orientering for å gjøre en fullstendig vurdering av om prøven viser noen anatomiske abnormiteter eller sykdomsfenotyper (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Museembryoene med signifikante hemodynamiske defekter ble notert å være embryonale dødelige. Et bredt utvalg av CHDs kan identifiseres gjennom det høyutgåtte, ikke-invasive føtale ekkokardiogrammet ved hjelp av forskjellige visninger (figur 1).
Septumdefekter: De vanligste CHDene er septumdefekter som en ventrikkelseptumdefekt (VSD), en atrioventrikulær septumdefekt (AVSD) og en atrieseptumdefekt (ASD)1. VSD eller AVSD kan enkelt visualiseres ved hjelp av 2D-bilder og fargeflytbilder. Det er lett å identifisere blodstrømmen over ventriklene eller mellom atriene og ventriklene (figur 3). ASD er vanskelig å skille med åpent foramen ovale hos et foster.
Uregelmessigheter i utstrømningskanalen: Som vist i figur 3 er strømmen i hovedpulsåren over den stigende aortastrømmen i normale embryoer. I embryoer med dobbelt utløp av høyre ventrikkel (DORV), kan begge store arterier ses utgående fra høyre ventrikkel. DORV er også assosiert med VSD (figur 3D) og kan identifiseres ved hjelp av fargeflyt. Imidlertid, gitt den lille størrelsen på embryoene, kan DORV noen ganger ikke skilles pålitelig fra overstyring av aorta, pulmonal atresi eller vedvarende truncus arteriosus (PTA). Ved PTA ses kun én utløpsstrøm i fosterets ekkokardiogram (figur 3E). Den detaljerte buestrukturen og hovedpulsåren kan observeres ved hjelp av nekropsi (figur 2E,F).
Nekropsi kan raskt diagnostisere situsstatus i bryst og abdomen og hjertets posisjon i forhold til brystet (enten levokardi (figur 2C-E) eller dekstrokardi). Utstrømningskanalstrukturer og den relative størrelsen på både atriene og ventriklene kan enkelt visualiseres (figur 2E,F).
ECM-histopatologi er gullstandardteknikken for å vurdere enhver strukturell hjerteanomali 8,11,12. Det gir en enestående oppløsning og detalj til strukturer av embryoer. Tredimensjonal rekonstruksjon med ulike plan og syn kan enkelt identifisere sammenhengen mellom de store arteriene og ventriklene (figur 3) og defekten mellom ventriklene og atriene.
Figur 1: Stedene for måling av krone-rump-lengden i 2D ekkokardiogrambilder av embryoer for å bestemme svangerskapsalderen. 2D ekkokardiogrambilder av embryoer ved (A) E11.5, (B) E12.5, (C,D) E13.5-E14.5. (D) Det syke embryoet er mindre enn dets (C) søsken og er kjent for å ha et "grøtaktig" utseende med hydrops (pil). (AC) Levende embryoer viser forskjellige organer. Representativ VB-modus med fargebilder av E14.5 hjerte i en koronal 4-kammervisning vippet anteriort for å avbilde (E) utstrømningskanalene viser intakt ventrikkelseptum med det normale forholdet mellom store arterier, som bekreftes med ECM i (E') koronal visning. (F) Representativt sagittalt bilde av E14.5 hjerte demonstrerer venstre ventrikkel og høyre ventrikkels utstrømningskanaler med den stigende aorta (AO) spiss kranialt og lungearterien spiss bakover (mot ryggraden), som bekreftes med ECM i (F') sagittal visning. (G) Representativt tverrbilde av venstre ventrikkel (LV) og høyre ventrikkel (RV), som er bekreftet med ECM i (G') tverrgående visning. (H) Et tverrbilde ved hjertebunnen i ECM viser en distinkt og separert aortaklaffen (AV) og lungeklaffen (PV). PV er fremre for AV. (H') Representativt ECM tverrbilde av persisterende truncus arteriosus (PTA) viser venstre lungearterie og høyre lungearterie som oppstår posteriort fra den udelte persistente truncale arterien, med venstre halspulsåre som oppstår anteriort og kranialt fra persisterende arteria truncal. Forkortelser: A: anterior, AO: aorta, AV: aortaklaff, Cd: caudal, Cr: kranial, DAO: synkende aorta, L: venstre, LA: venstre atrium, LCA: venstre halspulsåre, LPA: venstre lungearterie, LV: venstre ventrikkel, P: posterior, PA: lungearterie, PTA: vedvarende truncus arteriosus, R: høyre, RA: høyre atrium, RPA: høyre lungearterie, RV: høyre ventrikkel. Skala bar: 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av en nekropsi for å observere kardiovaskulære abnormiteter . (A) Et embryo festet til en dissekeringsskål med svart bakgrunn uten åpenbare fenotyper. Bildet viser grov anatomi i hodet, brysthulen og magen. (B) Dermis fjernes fra valpen, og avslører submandibulære kjertler, brystkasse og mage. (C) Brystkassen løftes, og avslører den grove anatomien i brysthulen, inkludert thymus, hjerte, lunger og membran. (D) En zoomet visning av brystet med brystkassen fjernet. (E) Thymus er fjernet, og avslører store kar og luftrør. (F) En zoomet visning av store fartøy. Forkortelser: AAO: stigende aorta, D: diafragma, LA: venstre atrium, LCA: venstre halspulsåre, LSVC: venstre vena cava, LV: venstre ventrikkel, P: perikardium, RA: høyre atrium, Rb: ribber, RCA: høyre halspulsåre, RL: høyre lunge, RSVC: høyre vena cava, RV: høyre ventrikkel, S: sternum, SCA: høyre arteria subclavia, SMG: submandibulære kjertler, T: luftrør, Th: thymus. Skala bar: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Representativt føtalt ekkokardiogram (Ekko) og bilder fra biskopisk konfokalmikroskop (ECM). (A) Ekko viser en intakt ventrikkelseptum uten interventrikulær shunt og normalt relaterte store arterier i normal kontroll, bekreftet av (A') ECM ved E14.5-15.5 stadium. (B) Ultralyd påvisning av en atrioventrikulær septumdefekt (AVSD). Ekkobilder i 4-kammervisningen demonstrerer kommunikasjonen mellom LA, RA, LV og RV, bekreftet av (B') ECM på E14.5-trinnet. (C) Ultralyddiagnose av ventrikkelseptumdefekten (VSD) med fargeflyt demonstrerer strømningen over LV og RV, bekreftet av (C') ECM ved E16.5-trinnet. (D) Ekko og (D') ECM demonstrerer DORV med en VSD mellom LV og RV med side-ved-side store arterier (aorta er rett til lungearterien) på E14.5-stadiet. (E) Ultralyddiagnose av vedvarende truncus arteriosus (PTA) demonstrerer kommunikasjon mellom LV og RV med en enkelt utstrømningskanal som overstyrer begge ventriklene (PTA). (E') Denne patologien bekreftes av ECM på E14.5-trinnet. Skala bar: 0,5 mm. AO: aorta, AVSD: atrioventrikulær septumdefekt, Cd: caudal, Cr: kranial, L: venstre, LA: venstre atrium, LV: venstre ventrikkel, PA: lungearterie, PTA: vedvarende truncus arteriosus, R: høyre, RA: høyre atrium, RV: høyre ventrikkel, VSD: ventrikkelseptumdefekt. Skala bar: 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Stadium | Krone til rump lengde (mm) | Fosterets område (mm2) | Hjerteområde (mm2) | Hjerteområde/fosterområde |
| E12.5 | 7,9 ± 0,8 (n = 77) | 23,2 ± 5 (n = 77) | ||
| E13.5 | 10,5 ± 0,9 (n = 92) | 40,9 ± 7 (n = 92) | ||
| E14.5 | 12,5 ± 0,9 (n = 101) | 57,6 ± 8 (n = 101) | 2,9 ± 0,5 (n = 70) | 0,050 ± 0,004 (n = 70) |
| E15.5 | 14,1 ± 0,5 (n = 134) | 71,4 ± 6 (n = 134) | 3,8 ± 0,4 (n = 87) | 0,053 ± 0,004 (n = 87) |
| E16.5 | 15,4 ± 0,6 (n = 112) | 82,7 ± 6 (n = 112) | 4,9 ± 0,5 (n = 87) | 0,058 ± 0,007 (n = 87) |
| E17.5 | 16,6 ± 0,4 (n = 211) | 96,9 ± 7 (n = 211) | 6,1 ± 0,6 (n = 146) | 0,063 ± 0,004 (n = 146) |
| E18.5 | 17,7 ± 0,6 (n = 139) | 112,1 ± 8 (n = 139) | 7,1 ± 0,8 (n = 93) | 0,063 ± 0,005 (n = 93) |
| E19.5 | 18,7 ± 0,7 (n = 57) | 126,7 ± 8 (n = 57) | 7,7 ± 0,7 (n = 36) | 0,062 ± 0,005 (n = 36) |
Tabell 1: Utviklingsprofil for fostervekst.
| E14.5 | E16.5 | E18.5 | Nyfødt | |
| 70% etanol | 1 time | 1,5 t | 3 timer | 4 timer |
| 95% etanol | 35 min | 45 min | 1 time | 1 time |
| 95% etanol | 35 min | 45 min | 1 time | 1 time |
| 100% etanol | 15 min | 15 min | 30 min | 6 min |
| Xylen 1 | 20 min | 30 min | 40 min | 30 min |
| Xylen 2 | 20 min | 30 min | 40 min | 30 min |
| Voks 1 | 20 min | 20 min | 20 min | 30 min |
| Voks 2 | 20 min | 20 min | 20 min | 30 min |
| Voks 3 | Over natta | Over natta | Over natta | Over natta |
Tabell 2: Protokoll for embryoinnebygging basert på embryonale dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genmodifiserte mus har blitt brukt til å forstå patomekanismene til medfødte hjertefeil. Protokollene vi gir i denne studien forsøker å effektivisere og standardisere prosessen med å vurdere murine fosterets hjertefeil. Det er imidlertid kritiske trinn å merke seg under protokollen. Museembryoer vokser betydelig i løpet av hver dag i svangerskapet, og riktig tid for å høste en mus kan bestemmes ved å utføre et føtal ekkokardiogram nøyaktig. Fosterets ekkokardiogram kan brukes til å skjerme fosterets kardiovaskulære patologi. Et 2D-bilde gjør det mulig å identifisere unormal anatomi og hjertefunksjon, ved hjelp av fargedoppler for å undersøke blodstrømmen og oppdage kommunikasjon mellom hjertekamrene eller unormale utstrømnings- og innstrømningskanaler. For å bestemme CHD-diagnosen skannes fostre fra embryodag E14.5 når utstrømningskanalseptasjonen og hjertekammerdannelsen er fullført. Skanning på tidligere stadier kan gjenspeile utviklingsforsinkelsen.
Histopatologi er standarden for å karakterisere CHDs8 ved å bruke en mikrotome etterfulgt av optisk mikroskopvisualisering. Den største ulempen ved standardmetoden er mangelen på en intuitiv 3D-visning av kardiovaskulære strukturer for diagnose og begrensningen i mangelen på å gi forskjellige visninger av prøvene. En ECM-histologi er den mest tidseffektive metoden for å karakterisere hjertefeil. Hvis ECM ikke er tilgjengelig, kan en mikrotom brukes til å seksjonere embryoet og bestemme hjertefenotyper. Andre alternativer for å oppnå hjerteavbildning utfører høy gjennomstrømning, høyoppløselig magnetisk resonansavbildning (MRI) eller computertomografi (CT). Et viktig aspekt ved MR eller CT er at flere embryoer kan avbildes samtidig; Selv etter en ultralyd-, CT- eller MR-fenotyping er histopatologi imidlertid nødvendig for å bekrefte enhver CHD-diagnose.
Ved hjelp av ECM-avbildning for histopatologi blir embryoet serielt avbildet etter hvert kutt ved hjelp av et konfokalmikroskop med laserskanning montert over den automatiske glidemikrotomen. De individuelle bildene samlet inn fra ECM tillater påfølgende 3D-rekonstruksjoner og lar prøvene bli digitalt skåret i et hvilket som helst bildeplan uten å ta bildene 8,11 på nytt. En slik operasjon muliggjør en omfattende vurdering av hjerteanatomien, som kan brukes i ulike utviklingsstadier. Videre kan individuelle lysbilder gjenopprettes fra mikrotomen mens dataene samles fra ECM-utstyret. Selv om ECM-histopatologi er gullstandarden for å vurdere enhver strukturell hjerteanomali, er det begrensninger med tilgjengeligheten av utstyret, programvaren og kjøretiden per embryo. Kjøretiden til seksjon et embryonalt hjerte kan variere fra 1-3 timer per prøve, avhengig av størrelsen. På grunn av utstyrets kompleksitet må forskere regelmessig sjekke datamaskinen for å sikre at interesseområdet i feltet blir registrert. Forskere må også sjekke prøven for å sikre at ingen parafinvokspon hindrer prøven fra laserskanneren.
ECM og påfølgende 3D-rekonstruksjon gir en fullstendig høyoppløselig vurdering av enhver strukturell hjertefeil uavhengig av prøvens innebyggingsplan. Disse protokollene har bidratt til å diagnostisere en rekke CHDs og tillot oss å forstå hjerteembryogenesen i murinmodeller og patologier relatert til genetiske mutasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter i dette manuskriptet.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury,, Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
