Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ekspression af transgener i naturligt blæreurothelium ved hjælp af adenovirusmedieret transduktion

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Metoder er beskrevet til generering af store mængder rekombinante adenovirus, som derefter kan bruges til at transducere det indfødte gnaverurothelium, hvilket muliggør ekspression af transgener eller nedregulering af endogene genprodukter.

Abstract

Ud over at danne en højmodstandsbarriere antages urothelium, der forer nyrebækkenet, urinlederne, blæren og proksimal urinrøret at mærke og transmittere information om dets miljø til de underliggende væv, hvilket fremmer ugyldiggørelsesfunktion og adfærd. Forstyrrelse af urothelialbarrieren eller dens sensoriske / transducerfunktion kan føre til sygdom. At studere disse komplekse begivenheder hæmmes af manglen på enkle strategier til at ændre gen- og proteinekspression i urothelium. Metoder er beskrevet her, der gør det muligt for efterforskere at generere store mængder high-titer adenovirus, som derefter kan bruges til at transducere gnaverurothelium med høj effektivitet og på en relativt ligetil måde. Både cDNA'er og små interfererende RNA'er kan udtrykkes ved hjælp af adenoviral transduktion, og virkningen af transgenekspression på urothelial funktion kan vurderes 12 timer til flere dage senere. Disse metoder har bred anvendelighed til studier af normal og abnorm urothelial biologi ved hjælp af muse- eller rottedyremodeller.

Introduction

Urothelium er det specialiserede epitel, der linjer nyrebækkenet, urinlederne, blæren og proksimal urinrør1. Det består af tre lag: et lag af stærkt differentierede og polariserede ofte bi-nucleate paraplyceller, hvis apikale overflader er badet i urin; et mellemliggende cellelag med en population af bi-nukleattransitforstærkende celler, der kan give anledning til overfladiske paraplyceller som reaktion på deres akutte tab og et enkelt lag af basalceller, hvoraf en delmængde fungerer som stamceller, der kan regenerere hele urothelium som reaktion på kronisk skade. Paraplyceller er hovedsageligt ansvarlige for dannelsen af urothelialbarrieren med høj modstand, hvis komponenter inkluderer en apikal membran (rig på kolesterol og cerebrosider) med lav permeabilitet for vand og opløste stoffer og et apikalt forbindelseskompleks med høj modstand (bestående af tætte kryds, klæbende kryds, desmosomer og en tilhørende actomyosinring)1 . Både paraplycellens apikale overflade og dens forbindelsesring udvider sig under blærefyldning og vender hurtigt tilbage til deres fyldte tilstand efter tømning af 1,2,3,4,5. Ud over sin rolle i barrierefunktionen antages urothelium også at have sensoriske og transducerfunktioner, der gør det muligt at mærke ændringer i det ekstracellulære miljø (fx stretch) og overføre denne information via frigivelse af mediatorer (herunder ATP, adenosin og acetylcholin) til underliggende væv, herunder suburothelial afferente nerveprocesser 6,7,8 . Nylige beviser for denne rolle findes hos mus, der mangler urothelial ekspression af både Piezo1 og Piezo2, hvilket resulterer i ændret ugyldiggørelsesfunktion9. Derudover udvikler rotter, der overudtrykker det poredannende protein CLDN2 i paraplycellelaget, betændelse og smerte svarende til det, der ses hos patienter med interstitiel blærebetændelse10. Det antages, at forstyrrelse af urothelial sensorisk / transducer eller barrierefunktion kan bidrage til flere blæreforstyrrelser 6,11.

En bedre forståelse af urotheliums biologi i normale og sygdomstilstande afhænger af tilgængeligheden af værktøjer, der gør det muligt for efterforskere let at nedregulere endogen genekspression eller muliggøre ekspression af transgener i det indfødte væv. Mens en tilgang til nedregulering af genekspression er at generere betingede urotheliale knockout-mus, afhænger denne tilgang af tilgængeligheden af mus med floxede alleler, er arbejdskrævende og kan tage måneder til år at gennemføre12. Ikke overraskende har forskere udviklet teknikker til at transfektere eller transducere urothelium, hvilket kan føre til resultater på en kortere tidsskala. Offentliggjorte metoder til transfektion inkluderer anvendelse af kationiske lipider13, anti-sense phosphorothioated oligodeoxynucleotider 14 eller antisensenukleinsyrer bundet til HIV TAT-proteinet, der trænger ind i 11-mer peptid15. Denne protokols fokus er imidlertid på brugen af adenoviralmedieret transduktion, en velundersøgt metode, der er effektiv til genlevering til en bred vifte af celler, er blevet testet i adskillige kliniske forsøg og blev senest brugt til at levere cDNA'et, der koder for COVID-19-kapsidproteinet, til modtagere af en variant af COVID-19-vaccinen16, 17. For en mere grundig beskrivelse af adenoviruslivscyklussen, adenovirale vektorer og kliniske anvendelser af adenovirus henvises læseren til reference17.

En vigtig milepæl i brugen af adenovirus til transducere urothelium var en rapport fra Ramesh et al., der viste korte forbehandlinger med vaskemidler, herunder N-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) dramatisk forbedret transduktion af urothelium af en adenovirus, der koder for β-galactosidase18. Ved hjælp af denne proof-of-principle-undersøgelse som vejledning er adenoviral-medieret transduktion af urothelium nu blevet brugt til at udtrykke en række proteiner, herunder Rab-familie GTPaser, guanin-nukleotidudvekslingsfaktorer, myosinmotoriske fragmenter, poredannende tætte forbindelsesassocierede claudiner og ADAM17 10,19,20,21,22 . Den samme tilgang blev tilpasset til at udtrykke små interfererende RNA'er (siRNA), hvis virkninger blev reddet af co-ekspressive siRNA-resistente varianter af transgenet22. Protokollen beskrevet her indeholder generelle metoder til at generere store mængder stærkt koncentreret adenovirus, et krav til disse teknikker, samt tilpasninger af metoderne fra Ramesh et al.18 til at udtrykke transgener i urothelium med høj effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter, der involverer generering af adenovirus, som kræver BSL2-certificering, blev udført under godkendelse fra University of Pittsburgh Environmental Health and Safety kontorer og Institutional Biosafety Committee. Alle udførte dyreforsøg, herunder adenoviral transduktion (som kræver ABSL2-certificering), blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer/bestemmelser i Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og Animal Welfare Act og under godkendelse af University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Handsker, øjenbeskyttelse og passende tøj bæres til alle procedurer, der involverer rekombinante vira. Flydende eller fast affald skal bortskaffes som beskrevet nedenfor. Strøelse af dyrene efter transduktion og eventuelle resulterende dyrekroppe bør behandles som biofarlige materialer og bortskaffes i overensstemmelse med institutionelle politikker.

1. Fremstilling af adenoviruslagre med høj titer

BEMÆRK: Effektiv transduktion af gnaverblærer afhænger af brugen af oprensede og koncentrerede virale stammer, typisk 1 x 107 til 1 x 108 infektiøse virale partikler (IVP) pr. μL. Denne del af protokollen er fokuseret på at generere adenoviruslagre med høj titer fra eksisterende viruspræparater. Alle trin skal udføres i en cellekulturhætte ved hjælp af sterile reagenser og værktøjer. Mens de tilgængelige stammer af adenovirus, der anvendes i dag, er replikationsdefekte, kræver de fleste institutioner godkendelse til at bruge adenovirus og rekombinant DNA. Dette omfatter ofte udpegning af et cellekulturrum som et BSL2-godkendt anlæg til fremstilling og forstærkning af adenovirus. Nogle generelle overvejelser omfatter brug af masker, øjenbeskyttelse, handsker og passende beklædning på alle stadier af virusproduktion og oprensning. Ved centrifugering anbefales sikkerhedshætter, hvis centrifugerørene mangler tætsluttende hætter. Alle ikke-engangsmaterialer, herunder potentielt forurenede centrifugesikkerhedshætter, flasker og rotorer, behandles med en antiviral opløsning (se materialetabellen) og skylles derefter med vand eller 70% ethanol. Flydende affald behandles ved tilsætning af blegemiddel til en slutkoncentration på 10% (v/v). Bortskaffelsen af dette flydende affald vil afhænge af institutionelle politikker. Fast affald bortskaffes typisk i biofarligt affald.

  1. Kultur HEK293T-celler
    1. Optø et frossent hætteglas med HEK293T-celler i et vandbad ved 37 °C, og brug en 5 ml pipette til at overføre cellerne til en cellekulturskål med en diameter på 15 cm. Brug en 25 ml pipette til langsomt at tilsætte 20 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) indeholdende 10% (v/v) føtalt bovint serum og penicillin/streptomycin antibiotikum (DMEM-FBS-PS) til skålen. Inkuber cellerne i en 37 °C cellekulturinkubator gasset med 5% (v / v) CO 2, indtil de når 80% -90% sammenløb (~2 x 107 celler).
    2. Brug en glaspipette fastgjort til en vakuumkilde til at aspirere mediet og skyl derefter cellerne ved at overføre 20 ml steril PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mM NaCl og 8,9 mM Na2HPO4) til skålen ved hjælp af en 25 ml pipette. Den brugte PBS suges op, og brug derefter en 5 ml pipette til at overføre 3 ml varm (37 °C) proteinaseopløsning (se materialetabel) til skålen, og inkuber skålen i cellekulturinkubatoren, indtil cellerne løsner sig (~3-4 min).
      BEMÆRK: Effektiv proteolyse kan bedst vurderes ved langsomt at vippe skålen frem og tilbage på udkig efter frigivelse af celler fra alle dele af skålen ind i den bevægelige væske. HEK293T-celler er følsomme over for udvidet proteinasebehandling og vil dø, hvis de efterlades mere end et par minutter i proteinaseopløsning.
    3. Brug en 10 ml pipette til at overføre 7 ml DMEM-FBS-PS til skålen med løsrevne celler, og brug derefter den samme pipette til at aspirere cellerne og mediet. Overfør de suspenderede celler til et 50 ml konisk rør, og pellet derefter cellerne ved at centrifugere suspensionen i en klinisk centrifuge med lav hastighed ved 200 x g i 5 minutter. Supernatanten suges til ved hjælp af en glaspipette fastgjort til en vakuumkilde. Brug en 25 ml pipette til at resuspendere cellepelleten i 15 ml DMEM-FBS-PS.
    4. Tilsæt 1 ml cellesuspension til hver af femten 15 cm skåle indeholdende 19 ml DMEM-FBS-PS.
    5. Dyrk cellerne i en vævskulturinkubator, indtil de når 85% -90% sammenløb (~ 3-4 dage).
  2. Forbered en fortyndet virusopløsning
    1. Tilføj ~ 1.5 x 10 9 til 3 x 109 IVP af en eksisterende virusbestand (5-10 IVP / celle) til et 50 ml konisk rør fyldt med 45 ml DMEM, der mangler FBS eller antibiotika.
      BEMÆRK: Det er muligt at bruge en lavere koncentration af virussen (1-5 IVP / celle); Det vil dog tage længere tid for virusproduktion at følge.
  3. Inficere de dyrkede celler med virussen.
    1. Ved hjælp af en glaspipette fastgjort til en vakuumkilde suges mediet fra de næsten sammenflydende celler i trin 1.1.5.
    2. Der anvendes en 25 ml pipette til overførsel af 3,0 ml fortyndet virusopløsning (fremstillet i trin 1.2.1) til hver cellekulturskål. Brug derefter en 10 ml pipette til at tilføje 7,0 ml DMEM-medium (mangler FBS eller antibiotika) til hver skål. Inkuber i 60 minutter i en cellekulturinkubator, og tilsæt derefter 10 ml DMEM indeholdende 20% (v/v) FBS og 2x PS til hver skål.
      BEMÆRK: Brug af en af de 15 skåle som kontrolplade (hvor virus ikke tilsættes) gør det lettere at identificere virusinduceret celleafrunding og død i inficerede celler i næste trin.
    3. Inkuber cellerne i cellekulturinkubatoren i 2-4 dage, indtil størstedelen af dem begynder at runde op, og >60% af cellerne har løsnet sig.
      BEMÆRK: Hvis du bruger en lavere titer af virussen, kan det tage op til en uge, før celledød forekommer. Hvis celledød ikke forekommer inden for en uge, er det sandsynligt, at processen skal gentages ved hjælp af en højere titer af virussen.
  4. Gendan virus fra cellelysater
    1. Brug en celleskraber til at skrabe bunden af hver skål og frigive vedhæftede celler i mediet.
    2. Brug en 25 ml pipette til at samle og samle mediet, cellerne og celleaffaldet fra hver cellekulturskål i et 50 ml konisk cellekulturrør.
      BEMÆRK: For at spare ressourcer kan mediet fra to skåle kombineres til et 50 ml rør.
    3. Pilleindustrien pelleteres ved centrifugering ved hjælp af en lavhastighedscentrifuge til bordplade: 5 min ved stuetemperatur ved 3.000 x g. Der anvendes en glaspipette fastgjort til en vakuumanordning til at aspirere supernatanten.
    4. Brug en 10 ml pipette kombineret med trituration til at konsolidere alt det resulterende pelleterede materiale i i alt 7 ml sterilfiltreret 100 mM Tris-HCl pH 7,4 indeholdende 10 mM EDTA (Tris-EDTA-opløsning). Overfør det samlede materiale til et sterilt konisk rør med 15 ml cellekultur og læg det på is.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan viruspræparatet fryses ved -80 °C på ubestemt tid.
  5. Forbered cellelysater
    1. Udfør tre fryse-optøningscyklusser for at forstyrre de resterende celler og dermed yderligere frigøre de dannede viruspartikler. Det samlede materiale fryses i trin 1.4.4 ved at nedsænke røret i flydende nitrogen (~30-60 s). Prøven tøs hurtigt op ved at anbringe røret i en inkubator på 37 °C. Vortex prøven i 15 s, og gentag derefter hurtigfrysnings- og optøningsproceduren yderligere 2x.
      BEMÆRK: Virusopløsningen kan hurtigt optøs i 37 °C i et vandbad, men forsigtighed er berettiget, da temperatursvingningerne kan få røret til at revne og frigive virusopløsning i vandbadet. For at undgå dette anbringes tuben med virussupernatanten i et større glas, som derefter anbringes i vandbadet.
    2. Brug en 10 ml pipette til at overføre det tre gange fryseoptøede cellemateriale til et superspeed centrifugerør. Centrifuger materialet i røret i 30 minutter ved 4 °C superhastighedscentrifuge ved ~18.500 x g.
    3. Den ~7 ml virusrige supernatant genvindes med en 10 ml pipette og overføres til et konisk rør på 15 ml. Opbevar prøven på is indtil næste trin.
      BEMÆRK: Overvej på dette tidspunkt at beholde en prøve af den urensede virale supernatant som indledning til at starte et nyt viruspræparat (eller som backup). Denne prøve opbevares ved -80 °C.
  6. Isoler og rens virussen ved hjælp af densitetsgradientcentrifugering.
    1. Der fremstilles en diskontinuerlig gradient af CsCl i et 12 ml tyndvægget PET-tyndvægget, klart ultracentrifugerør (se materialetabellen) eller tilsvarende. Brug en 3 ml sprøjte udstyret med en 18 G kanyle til forsigtigt at indføre 2,5 ml 1,4 g/ml CsCl-opløsning i bunden af tuben, og brug derefter en ny sprøjte/kanyle til at lægge den i lag med 2,5 ml 1,25 g/ml CsCl-opløsning.
      BEMÆRK: Hvis opløsninger tabes direkte oven på et allerede eksisterende lag, vil det medføre betydelig og uønsket blanding. Placer i stedet den skrå del af kanylen mod kanten af slangen, og tryk derefter meget langsomt på sprøjtestemplet, og hæv kanylens position, når opløsningen fylder røret.
    2. Læg ~7 ml viral supernatant oven på gradienten på lignende måde ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Hvis der er mere end 2-3 mm mellemrum mellem den virale supernatant og toppen af glasset, tilsættes yderligere Tris-EDTA-opløsning for at fylde glasset, indtil der kun er 2-3 mm plads tilbage.
    3. Der fremstilles et tilsvarende forberedt balancerør, der indeholder lag af CsCl, men erstatter den virale supernatant med Tris-EDTA-opløsning.
      BEMÆRK: De to rør skal have identiske vægte (og lignende tætheder) for at forhindre en potentielt farlig ubalanceret belastningssituation i ultracentrifugen.
  7. Isoler virussen ved hjælp af ultracentrifugering med hastighedszonal hastighed.
    1. Gradienterne dannet i trin 1.6.2-1.6.3 lægges i skovlene på en SW41-rotor eller tilsvarende. Skru skovlhætterne i, anbring rotoren i en ultracentrifuge (forkølet til 4 °C), og centrifuger i 1 time ved ~150.000 x g.
    2. Under centrifugeringen ligevægtes kolonnen beskrevet i trin 1.9.1 nedenfor.
  8. Gendan isolerede viruspartikler
    1. Ved afslutningen af centrifugeringstrinnet skal du forsigtigt løsne spandene fra rotoren, og i en cellekulturhætte skal du fjerne skovlhætterne og derefter fjerne rørene og placere dem i et stativ.
    2. Opsaml det båndede materiale, der er rigt på viruspartikler, og som flyder ved grænsefladen mellem 1,25 g/ml og 1,4 g/ml CsCl-opløsningen. Hold røret, der indeholder gradienten over den nederste halvdel af en cellekulturskål (som vil fange spildte materialer), brug en 1 tommer 18 G nål fastgjort til en 3 ml sprøjte til forsigtigt at punktere røret lige under den båndede virus. Aspirer langsomt virussen, som typisk genvindes i ~ 1 ml.
    3. Fjern nålen fra røret, hvilket vil resultere i, at det resterende materiale i gradienten strømmer ud af røret ind i den nederste halvdel af cellekulturskålen (eventuelle væsker skal behandles som farligt affald).
    4. Virusopløsningen i sprøjten overføres til et sterilt mikrocentrifugerør på is.
      BEMÆRK: Når du gendanner virussen i dette trin, skal nålen placeres, så nålens lumen vender opad med nålens åbning et par mm under det virusrige bånd. Undgå kontaminering med det tynde bånd af forkert samlet virus, der undertiden observeres 2-3 mm over den stribede virus (se tynd sort pil i figur 1A).
  9. CsCl fjernes fra prøven ved gelfiltrering.
    1. Ligevægt mellem en PD-10-søjle (færdigpakket med Sephadex G-25M), fastspændt til et støttestativ, med 50 ml 0,2 μm sterilfiltreret PBS indeholdende 10% (v / v) glycerol.
      BEMÆRK: Det indledende ligevægtstrin tager 2-3 timer at fuldføre og er nødvendigt for at sikre fuldstændig udvaskning af konserveringsmidler, der bruges af producenten til at stabilisere søjlen.
    2. Lad vaskeopløsningen trække sig tilbage under frittet (en beskyttende skive af hvidt materiale øverst i kolonnemediet), og overfør derefter forsigtigt den rensede virusopløsning, der er opsamlet i trin 1.8, til toppen af kolonnen. Lad den virusrige opløsning trække sig tilbage under fritten, og begynd derefter at fylde kolonnen med PBS-glycerol.
      BEMÆRK: En funktion af fritten er at forhindre, at søjlen løber tør. Som følge heraf tolereres korte forsinkelser, før der tilføjes mere elueringsmiddel til kolonnen.
    3. Eluatet opsamles i 12 sterile mikrocentrifugeglas, 0,5 ml pr. fraktion.
  10. Bestem det virale udbytte.
    1. Bestem de maksimale virusfraktioner ved hjælp af spektrofotometri. Der fremstilles en 1:100 fortynding af hver fraktion i PBS, og OD260 måles i et spektrofotometer ved hjælp af en 1:100 fortynding af bufferen alene som blindprøve. Viruspartiklerne skal eluere i hulrumsvolumenet, begyndende omkring fraktion 6. Saml de fraktioner, der indeholder de højeste OD260-aflæsninger .
    2. Lav en 1:100 fortynding af de poolede virale fraktioner og mål OD260 igen. Den endelige koncentration af viruspartikler og antallet af IVP i de poolede fraktioner beregnes ved hjælp af følgende formel: Viruspartikler pr. ml = OD260 × 100 (dette korrigerer for fortyndingsfaktoren) × 1012. Et generelt skøn er, at 1% af viruspartiklerne er IVP som sådan: IVP / ml = OD 260 × 100 × 10 10 eller IVP / μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. De samlede virusfraktioner (indeholdende 5 x 107 til 1 x 108 IVP) alikvote i sterile mikrocentrifugeglas eller kryoialer. Prøverne opbevares ved -80 °C.

2. Transduktion af gnaverblære

BEMÆRK: Hvis denne teknik er ny, anbefales det, at antallet af dyr, der transduceres ad gangen, begrænses til 2-4. Dette kan opnås ved at forskyde starttiderne for hvert dyr, især under behandlingen af vaskemiddel i trin 2.2 og derefter virusinkubationen i trin 2.3. Erfarne efterforskere kan transdukere op til seks dyr ad gangen.

  1. Kateterisere blæren
    1. Bedøv kvindelige C57Bl / 6J-mus (typisk 8-10 uger gamle, ~ 20-25 g) eller kvindelige Sprague Dawley-rotter (typisk 2-3 måneder gamle, ~ 250 g) ved hjælp af en fordamper med en fastgjort næsekegle. Fordamperen kalibreres til fremstilling af 3,0 % (v/v) isofluran, 97 % (v/v) O2 for mus eller 4,0 % (v/v) isofluran, 96 % (v/v)O2 for rotter. Bekræft, at dyrene bedøves ved at sikre, at de ikke reagerer på tåklemme (typisk efter 1-2 min).
    2. Oprethold dyrets kropstemperatur ved at placere dyrene på en opvarmet pude. Overvåg dyret gennem hele transduktionsprotokollen for at sikre, at dyrene bedøves og ikke oplever smerter under denne procedure.
    3. Isofluran reduceres til 1,5 % (v/v) for mus eller 2,0 % (v/v) for rotter, og dyrene holdes under bedøvelse i protokollens gyldighedsperiode.
    4. For at forhindre, at der føres luft ind i blæren, fyldes plastkateterdelen af et IV-kateter (se materialetabellen) og den tilhørende hub med sterilt PBS ved hjælp af en overførselspipette.
    5. Med dyret i liggende stilling, swab den ydre meatus med 70% alkohol, og indsæt det sterile kateter i den ydre meatus, derefter urinrøret og derefter ind i blæren.
      1. For at udføre denne opgave skal du bruge fine tang til forsigtigt at gribe vævet, der danner den ydre meatus og udvide det lodret væk fra dyret. Brug den anden hånd til forsigtigt at indsætte kateteret lodret ca. 3-4 mm i urinrøret meatus (en bunke kød lige over åbningen af vagina). På grund af en bøjning i urinrøret sænkes kateteret, indsættes i det ydre meatus, mod dyrets hale, hvilket letter dets indtræden i den del af urinrøret, der passerer under skambenet og i sidste ende ind i blæren
        . BEMÆRK: Især i tilfælde af musen kan kateteret være for langt, og ikke mere end 1,0-1,1 cm af det skal indsættes i dyret. Ellers vil der opstå skader på blæreslimhinden. For at forhindre dette skal du markere kateteret ~ 1 cm under spidsen og derefter ikke indsætte kateteret ud over denne markering.
    6. Lad urinen i blæren lække ud. Fjern eventuel resterende urin ved at udføre Credés manøvre: massage og tryk forsigtigt ned på blærebumpen i det nedre abdominalområde.
  2. Gør urothelet modtageligt for transduktion ved at behandle det med en vaskemiddelopløsning.
    1. Vask musen eller rotteblæren ved at sætte en steril 1 ml sprøjte fyldt med PBS på kateternavet. Injicer 100 μL steril PBS i museblæren (eller 450 μL for rotteblæren). Fjern sprøjten fra kateterbeslaget, og lad PBS løbe ud. Udfør om nødvendigt Credes manøvre for at fjerne overskydende blærevæske.
    2. Indsæt 100 μL 0,1% (w/v) N-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) (opløst i PBS og 0,2 μm filtersteriliseret) i museblæren ved hjælp af en steril 1 ml sprøjte. Opbevar DDM i blæren i 10 minutter ved at lade sprøjten blive siddende. Hos rotter øges volumenet af DDM til 450 μL.
    3. Fjern DDM fra blæren ved at løsne sprøjten og lade den løbe ud. Udfør Credes manøvre, hvis det er nødvendigt.
  3. Indfør virussen i blæren.
    1. Sæt en steril 1 ml sprøjte på kateternavet og indsæt 0,5 x 107 til 1 x 108 IVP adenovirus (fremstillet i trin 1), fortyndet i 100 μL steril PBS til mus eller 450 μL til rotter, i blæren. Lad sprøjten sidde fast på kateteret for at forhindre, at virusopløsningen slipper ud.
    2. Efter 30 minutter tages sprøjten af, og virusopløsningen evakueres fra blæren til en engangspude. Blott enhver resterende virusopløsning med en absorberende serviet, kassér puden og tør i biofarligt affald.
      BEMÆRK: Glycerol er cytotoksisk. Som sådan er det maksimale volumen af virusopløsning indlagt i mus begrænset til 5 μL (hvilket, når det fortyndes til 100 μL PBS, ville resultere i en endelig glycerolkoncentration på ~ 0,5% [v / v]). Derudover er det muligt at forbedre transduktionseffektiviteten ved at øge antallet af indpodet IVP og ved at udvide virusinkubationen til 45 min.
    3. Valgfrit trin: Blæren kan skylles med PBS som beskrevet i trin 2.2.1 ovenfor; Dette er dog ikke påkrævet.
  4. Lad dyret komme sig.
    1. Isofluranstrømmen skal ophøre, og dyret skal have mulighed for at komme sig og være helt mobilt, inden det sættes tilbage i buret, navnlig hvis dyrene er opstaldet flok.
      BEMÆRK: Da virustransduktion i sig selv ikke forårsager observerbare nedre urinvejssymptomer eller smerter, er der normalt ikke behov for postkirurgisk behandling. Men hvis det kodede transgen er toksisk, kan analgesi eller antibiotika efter proceduren være nødvendig som krævet af institutionen.
  5. Analyser virkningerne af transgenekspression 12-72 timer efter behandling ved hjælp af metoder som mRNA in situ hybridisering, western blot eller immunofluorescens 9,10,23 (se de repræsentative resultater).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virus forberedelse
Et eksempel på virusrensning ved densitetsgradientcentrifugering er vist i figur 1A. Det lyserøde bånd, der findes ved grænsefladen mellem det indlæste cellulære materiale og 1,25 g / ml CsCl-laget, består primært af forstyrrede celler og deres affald (se magenta pil i figur 1A). Det stammer sin lyserøde farve fra den lille mængde kulturmedium, der overføres fra trin 1.5 i protokollen. De pågældende viruspartikler, der fremstår som et mælkehvidt bånd, findes ved grænsefladen mellem 1,25 g/ml CsCl- og 1,40 g/ml CsCl-opløsningerne (se gul pil i figur 1A). Man kan også observere et bånd af materiale, der svæver 2-3 mm over de berigede viruspartikler (se tynd sort pil i figur 1A). Det består af usamlede vira og snavs, indeholder få IVP og bør undgås ved indsamling af virusprøven.

Yderligere rensning af virus og bufferbytning ved hjælp af en PD10-kolonne er afbildet i figur 1B, og OD260-aflæsningerne af de resulterende fraktioner efter eluering er vist i figur 1C. Hulrumsvolumenet af disse kolonner er ca. 3 ml, og dermed begynder virussen at forekomme i fraktion 6 og toppe i fraktion 9. I dette eksperiment blev fraktionerne 6-9 samlet. Mens fraktion 6 og 7 er relativt lave i viruspartikler, indeholder de tilstrækkelig virus til at fortjene genopretning, og de tjener til at fortynde de meget høje titerfraktioner til en mere rimelig koncentration. Fraktionerne 10-12 blev ikke inkluderet, da stigningen i OD260 i fraktion 11 indikerer den mulige tilstedeværelse af en anden kontaminerende top, som observeres variabelt i disse præparater. Den samlede fraktion vil typisk have 1 x 107 til 1 x 108 IVP / μL, og det forventede udbytte vil være i størrelsesordenen 1 x 10 10 til 2 x10 11 total IVP. Dette er tilstrækkelig mængde virus til at udføre hundredvis af transduktioner. Mens det er muligt at titere virussen ved plaque-assays eller ved at tælle kolonier af celler, der udtrykker fluorescerende proteiner22, er 1%-reglen tilstrækkelig i de fleste tilfælde. Denne regel siger, at 1% af de oprensede viruspartikler, estimeret ved måling af OD260 af prøven, er IVP. Alikvoter af virus opbevaret ved -80 °C har en holdbarhed på 2-5 år, selv om smitsomheden falder på lang sigt. Optøede delprøver af virus kan genfryses ved -80 °C én gang uden signifikant tab af smitsomhed. Imidlertid påvirker gentagen optøning og frysning virusinfektiviteten negativt.

Blæretransduktion
Et vigtigt første skridt, når man vurderer virkningen af transduktion, er at bekræfte transgenekspression. Dette kan vurderes ved hjælp af flere teknikker, herunder værktøjer, der detekterer mRNA (f.eks. RNAScope), western blot-analyse eller anvendelse af immunofluorescens 9,10,23. Figur 2 er et eksempel på museurothelium, der blev transduceret med et adenovirus, der koder for V5-epitopmærket humant væksthormon (V5-hGH)23. Dette protein pakkes i discoide/fusiforme vesikler og kan eksocytoseres under blærefyldning19,23. Western blot-analyse af urotheliale lysater afslørede V5-hGH-ekspression i urothelium af transducerede blærer, men ikke i utransducerede (figur 2A). Ekspression blev også bekræftet ved immunofluorescens, i dette tilfælde ved hjælp af antistoffer, der genkendte hGH eller V5-epitopmærket (utransducerede blærer manglede signal, ikke vist) (figur 2B).

Et yderligere eksempel er transduktion af rotteblæren med en virus, der koder for CLDN2, et poredannende tæt forbindelsesassocieret protein24,25. CLDN2 øger paracellulær flux af kationer (herunder K +), og dets overekspression resulterer i betændelse og udvikling af visceral smerte10. Western blot-analyse bekræftede ekspression af CLND2 i rotteblærer transduceret med adenoviruskodende Cldn2, men ikke dem, der blev transduceret med et GFP-kodende kontrolvirus (figur 2C). Generelt anses GFP ikke for at være toksisk, når den udtrykkes i celler, og den tjener således som en nyttig kontrol. Brugen af GFP giver også efterforskeren mulighed for at bekræfte, at transduktion virker. Immunofluorescensanalyse bekræftede yderligere eksogen CLDN2-ekspression i urotheliale paraplyceller transduceret med viruskodende Cldn2 cDNA (rødt signal i figur 2D). I lighed med endogen CLDN2 (ikke vist) er den udtrykte CLDN2 desuden lokaliseret til TJP1-mærkede tætte kryds såvel som paraplycellernes basolaterale overflader (CLDN2 er mærket grønt i figur 2E)10. I tilfælde af CLDN2-ekspression var det højest en dag efter transduktion, men derefter bagud og kunne næppe påvises efter 15 dage.

En anden overvejelse er, hvilke celletyper der vil blive målrettet mod adenoviral transduktion. Mens det hos rotter er muligt for det meste at transducere paraplycellelaget19, kan alle lag af urothelium i mus transduceres, selvom transduktion af mellem- og basalcellelagene kan variere. Det er vigtigt, at kun urothelium transduceres i hele blærevæggen, og intet andet væv er målrettet mod det indpodede adenovirus (figur 3).

Mens analyser af transducerede celler kan udføres på enkeltcelleniveau, skal man, når man udforsker en samlet blærefænotype, transducere størstedelen af urothelccellerne. Det er således vigtigt at definere effektiviteten af transduktion (dvs. hvilken fraktion af urothelceller transduceres). For eksempel i tilfælde af Cldn2-ekspresserende adenovirus blev >95% af paraplycellerne transduceret (se figur 2D). Et yderligere eksempel er billedfeltet vist i figur 3, hvor optælling af antallet af transducerede paraplyceller (i dette tilfælde udtrykker Ca2+ sensoren GCAMP5G) afslører en effektivitet, der nærmer sig 95%. Man skal dog undersøge celler i tilfældige felter taget gennem blærevæggen for at opnå et nøjagtigt og upartisk skøn over transduktionseffektiviteten.

Figure 1
Figur 1: Oprensning af adenovirus. (A) Adenoviruspartikler produceret af inficerede HEK293T-celler blev renset ved centrifugering på en diskontinuerlig CsCl-gradient bestående af et lag på 1,4 g / ml CsCl, et lag på 1,25 g / ml CsCl og et lag af prøve (S) fortyndet i Tris-EDTA-opløsning. Det cellulære materiale (lyserød pil) akkumuleres ved S / 1.25-grænsefladen, mens det rensede adenovirus flyder ved 1.25/1.4-grænsefladen (gul pil). Et lille bånd af forkert monteret virus flyder over sidstnævnte (tynd sort pil). (B) Det adenovirusrige bånd i gradienten genvindes ved hjælp af en nål, og CsCl fjernes fra adenoviruset ved gelfiltrering under anvendelse af en G25 Sephadex-fyldt PD10-kolonne, der er ekvilibreret med PBS indeholdende 10,0% (v/v) glycerol. Overfladen af Sephadex er beskyttet af en porøs plastfritte. (C) Brøker, 0,5 ml, blev indsamlet fra PD10-kolonnen. OD260 af fraktionerne blev målt i et spektrofotometer, og værdierne blev plottet. Virusrige fraktioner elueres i tomrumsvolumenet, som begynder ved fraktion 6 og strækker sig til fraktion 9. Samlede fraktioner for dette repræsentative eksperiment er skraveret med blåt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Transduktion af gnaverblæreurotelium med adenovirus, der koder for V5-hGH eller CLDN2. (A) Musens urotel blev efterladt utransduceret (UT) eller transduceret med adenovirus, der koder for V5-epitopmærket humant væksthormon (hGH). Efter 24 timer blev blærerne genvundet, urotheliale lysater blev fremstillet og udsat for natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese og V5-hGH-ekspression bekræftet ved hjælp af vestlige blots undersøgt med et antistof mod hGH. (B) Påvisning af V5-hGH i museurothelium snittet og farvet ved hjælp af antistoffer mod hGH (grøn) eller V5-epitopen (rød) og fluoroformærkede sekundære antistoffer. Immunofluorescens blev fanget ved hjælp af konfokal mikroskopi. Prøver blev modfarvet med TO-PRO3 for at mærke kerner. (C-F) Rotteurothelium blev transduceret med en viruskodende rotte CLDN2 (almindeligt navn claudin-2) eller GFP (almindeligt navn grønt fluorescerende protein) som kontrol. (C) Påvisning af eksogen CLDN2 ved western blotting ved anvendelse af et antistof igen CLDN2. Bemærk, at den endogene CLDN2 udtrykkes ved lave niveauer og ikke påvises i dette eksperiment. (D) Transduktion af paraplycellelaget afsløres ved immunofluorescens og konfokal mikroskopi. Cellens grænser afsløres ved at co-farvning af vævet med FITC-phalloidin, som mærker det kortikale actincytoskelet. E) Påvisning af eksogent CLDN2 og TJP1 (fællesnavn ZO1) ved immunofluorescens og konfokalmikroskopi af helmonteret eller tværsnitsurothelium. Små hvide pile angiver placeringen af det tætte kryds, og små magenta pilespidser markerer placeringen af intracellulære akkumuleringer af CLDN2 i cellecytoplasmaet. Disse blev tidligere afsløret at være Golgi-associerede CLDN210. (F) Efter transduktion blev dyrene aflivet på de angivne dage efter infektion. Eksogen CLDN2-ekspression blev påvist ved western blotting. Dyr, der udtrykte GFP, blev aflivet efter dag 1. Dataene i figur 2C-E er blevet modificeret fra Montalbetti et al.10 og er gengivet med tilladelse fra American Physiological Society. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Effektiviteten af adenoviral transduktion. Musens blære urothelium blev transduceret med et adenovirus, der koder for calciumsensoren GCaMP5G. De øverste paneler viser farvning for GCaMP5G (detekteret ved hjælp af et antistof mod grønt fluorescerende protein; GFP, grøn), viser de midterste paneler fordelingen af DAPI-farvede kerner (blå) og rhodamin-phalloidin-mærket actin (rød), og bundpanelerne er en fusion af de tre signaler. De hvide pilespidser i det nederste panel er de sjældne paraplyceller, der ikke transduceres. Den samlede effektivitet af transduktion af paraplyceller i dette billede er ~ 95%. Bemærk, at kun urothelium transduceres. De indrammede områder forstørres i panelerne til højre. Området i rubrik 1 består primært af transducerede paraplyceller. Området i boks 2 er urothelium, der viser effektiv transduktion af paraplyceller, men mindre effektiv transduktion af de underliggende cellelag. LP = lamina propria; ME = muskularis externa; Se = serosa; Ut = urothelium. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et konfokalmikroskop (se materialetabel). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens Ramesh et al. var fokuseret på at udvikle strategier til at anvende adenoviral transduktion til behandling af blærekræft 18, har nyere rapporter vist nytten af disse teknikker til at studere normal urothelial biologi / fysiologi og patofysiologi 10,18,19,20,21 . De vigtigste træk ved denne fremgangsmåde omfatter følgende: (i) I hele gnaverblærevæggen transduceres kun urothelium 10,19,20,21,22. I tilfælde af rotter er transduktion for det meste begrænset til paraplycellelaget, mens hos mus kan hele urothelium målrettes; (ii) Denne fremgangsmåde kan anvendes til at udtrykke proteiner eller siRNA'er 10,19,20,21,22; iii) Transduktionens effektivitet kan nærme sig 70-95 % (se f.eks. figur 3)18,20; iv) En dag efter transduktion er urotheliums ultrastruktur, vævets integritet, tilstedeværelsen af en højmodstandsbarriere (vurderet ved måling af transepitelresistens) og ekspressionen af urotheliale differentieringsmarkører "normal"10,19. Den eneste morfologiske effekt, der hidtil er bemærket, er et fald i paraplycellediameteren (set ovenfra); de vender dog tilbage til deres normale størrelse efter 3-4 dage10,19; v) Urothelium kan transduceres med op til tre forskellige adenovirus samtidigt18; vi) Transgenekspression kan ændres ved at titrere antallet af IVP, hvilket påvirker mængden af proteinekspression, forlænge eller forkorte inkubationstiden, før dyret aflives, eller anvende forskellige promotorer, f.eks. et tetreguleret system (tet-off)19. I sidstnævnte tilfælde kan man co-udtrykke en virus, der koder for transaktivatoren/tet-repressoren, og derefter modulere ekspressionen af transgenet ved at ændre koncentrationen af doxycyclin i dyrets kost.

Mens den overordnede protokol er relativt enkel, er der nogle kritiske trin, der skal overvejes, når du udfører disse eksperimenter. En af disse er tilgængeligheden af viruslagre med høj titer, der er af rimelig renhed. Adenovirus kan fås fra kommercielle leverandører, fra institutionelle virusproduktionskerner, fra andre efterforskere, eller de kan produceres internt. I tilfælde af sidstnævnte anbefales Bert Vogelstein-laboratoriet AdEasy-systemet, fordi dets komponenter kan købes fra Addgene, og adenovirus, der genereres ved hjælp af denne tilgang, fungerer godt i urothelial transduktion4. Denne teknik gør det muligt at generere adenovirus, der koder for cDNA'er så store som 8 Kb ved hjælp af pAdEasy-1-emballageplasmidet (indsatsen erstatter virale gener E1 og E3), pAdEasier-1-bakteriecellerne (som koder for de adenovirale gener, der er nødvendige for at producere virus) og produktion af replikationsdefekte adenovirus i HEK293T-celler (som udtrykker det krævede virale E1-protein). Erstatning af pAdEasy-1-emballageplasmidet med pAdEasy-2-emballageplasmidet øger imidlertid emballagestørrelsen med yderligere 2,7 kB, men kræver brug af en anden cellelinje (E1-transformerede humane embryonale retinale 911-celler), da viraerne mangler tidligt gen E4 ud over E1 og E34. Ekspression af siRNA'er kan opnås ved hjælp af flere systemer, herunder pAdloss, som er beskrevet detaljeret i Kasahara et al.26. Selvom det kan være muligt at bruge virusrigt cellekulturmedium til at transducere urothelium, kan denne metode være upålidelig. I stedet giver storskala virusforstærkning, CsCl-gradientrensning efterfulgt af gelfiltrering den mest pålidelige måde at generere store mængder højtitervirus på. Den relative stabilitet af virus ved -80 °C kombineret med relativt store udbytter af virus gør dette til en ideel måde at have et konsistent lager af virus, der kan bruges over et stort antal forsøg.

Yderligere kritiske trin i denne protokol omfatter dem, der er forbundet med transduktionsprotokollen. Disse omfatter brug af PBS (uden divalente kationer) som vaskemiddel og fortyndingsmiddel og brug af DDM-vaskemiddel. Da forbindelseskomplekset er afhængigt af Ca2+ for korrekt funktion, fremmer PBS sandsynligvis viral indgang ved at forstyrre den krydsassocierede barriere. DDM er også kritisk; som Ramesh et al. rapporterede, er effektiviteten af adenovirustransduktion overordentlig lav i fravær af vaskemiddelbehandling18. Vaskemidlets virkningsmekanisme er imidlertid ikke klar. En 10 minutters inkubation med DDM er ideel, men dette kan forkortes til 5 min; Det anbefales dog ikke, at inkubationen strækker sig ud over 10 minutter, da vaskemidlet kan forårsage uventet skade på underliggende væv. Den anvendte mængde virus er en kritisk parameter, hvor højere koncentrationer generelt fører til større mængder transgenekspression og højere transduktionseffektivitet. Den optimale viruskoncentration, der giver den bedste kombination af ekspression, effektivitet og fænotype, skal dog bestemmes empirisk. Som startkoncentration anbefales et interval på 5,0 x 106 til 2,0 x 107 IVP pr. dyr. Afhængigt af proteinet, der udtrykkes, resulterer dette i effektivitetsgevinster i intervallet 70%-95% 10,19,20,21,22; nogle dominerende negative GTPase-konstruktioner er dog mindre effektive (30% -50%) og kræver en enkeltcelleanalysemetode 4,20. Disse forskelle i effektivitet kan afspejle transgenets omsætning, dets toksicitet eller renheden og udbyttet af virus, der anvendes til transduktion. Sidstnævnte kan udelukkes ved at udføre plakanalyser. Selvom det ikke er hyperkritisk, skal den tid, virussen forbliver i blæren, være lang nok til, at virussen kan binde sig til sin CXADR-receptor. Gange mindre end 30 min kan sænke effektiviteten af transduktion, mens forlængelse af inkubationsperioden til 45 min kan øge effektiviteten; Dette kan dog være transgenafhængigt. Det sidste kritiske trin i denne protokol er at bestemme, hvor længe dyret vil blive holdt, før en fænotype vurderes. Transgener udviser det højeste udtryk efter 1-2 dage19, men udtrykket kan falde efter det. I tilfælde af siRNA'er afhænger det af selve proteinets omsætningshastighed. For eksempel, når man udtrykker siRNA'er, der målretter ekspression af Rab11a, en Rab-familie GTPase, observeres effektiv nedregulering kun 72 timer efter transduktion23. Således er langlivede proteiner (med halveringstider målt i dage) muligvis ikke egnede mål ved hjælp af denne tilgang.

Investigator bør også være opmærksom på de forbehold, der er forbundet med denne tilgang. For det første kan dets anvendelighed være begrænset til kvindelige gnavere på grund af vanskeligheder med kateterisering af mandlige gnavere gennem deres penis. Det kan dog være teknisk muligt at udføre denne protokol hos mænd ved at indføre et kateter i blærekuplen, svarende til det præparat, der anvendes ved udførelse af cystometri9. Dette ville gøre det muligt for en at indføre et vaskemiddel eller en virus og udføre vask efter behov. En anden advarsel er, at overekspression af proteiner kan udtømme celleveje og ressourcer, hvilket kan føre til begivenheder som proteinaggregering, aktivering af cellestressveje og død27. Det er således generelt klogt at begrænse transgenekspression til ikke-toksiske niveauer (medmindre det selvfølgelig er hensigten med transgenekspression), som vurderet ved hjælp af markører for cellestress og celledød. En tredje advarsel er, at i nogle indstillinger kan langsigtet adenovirusekspression udløse immunresponser28. Selvom der ikke er tegn på, at adenoviral transduktion af urothelium i sig selv stimulerer immunresponser10, er dette transgenafhængigt, og som nævnt ovenfor fører CLDN2-overekspression til blærebetændelse.

I øjeblikket har efterforskere en række forskellige metoder, som de kan bruge til at modulere gen- og proteinekspression i urothelium, herunder brug af transgene eller betingede urotheliale knockout-mus, brug af transfektionsreagenser eller anvendelse af adenoviral transduktion. Sidstnævnte metode, emnet for denne protokol, er relativt let, effektiv og reproducerbar. Bortset fra den oprindelige udgift til cellekulturreagenser, der er nødvendige for at generere viruslagrene, resulterer den meget store mængde virus, der produceres (nok til at udføre hundredvis af transduktioner), i en relativt lav pris pr. Dyr. Adenoviral transduktion kan udnyttes til at studere urothelial biologi. For eksempel blev adenoviral transduktion brugt til at definere betydningen af Rho-familie og Rab-familie GTPaser, guanin-nukleotidudvekslingsfaktorer, myosinmotoriske fragmenter og ADAM17 i exocytose og endocytose 10,19,20,21,22, og adenoviral transduktion blev for nylig brugt til at studere urothelial mekanotransduktion9 . Ligeledes kan adenoviral transduktion være relevant ved udforskning og behandling af menneskelig sygdom. For eksempel kan Ramesh et al. oprindeligt foreslået adenoviral transduktion være en nyttig måde at målrette tumorceller18. Mens deres undersøgelser mere var en proof-of-principle tilgang, kan man forestille sig, at ekspression af toksiner i kræftceller eller ekspression af epitoper, der kunne genkendes af immunsystemet, ville være nyttige strategier. Adenoviral transduktion kan også være nyttig til forståelse af sygdomme, hvor overekspression eller underekspression af genprodukter fører til sygdom. Som et eksempel udviser biopsier fra blæren hos patienter med interstitiel blærebetændelse en 90 gange stigning i CLDN2-ekspression 29. Interessant nok replikerer overekspression af CLDN2 ved hjælp af adenoviral transduktion mange af symptomerne på denne sygdom hos rotter10. CLDN2 kan således være et mål i behandlingen af patienter med denne lidelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en pilotprojektpris gennem P30DK079307 (til M.G.D.), NIH-bevilling R01DK119183 (til G.A. og MDC), NIH-tilskud R01DK129473 (til G.A.), en American Urology Association Career Development-pris og et Winters Foundation-tilskud (til N.M.) af Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), og af S10OD028596 (til G.A.), som finansierede købet af det konfokale system, der blev brugt til at fange nogle af de billeder, der præsenteres i dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Tags

Biologi nr. 188
Ekspression af transgener i naturligt blæreurothelium ved hjælp af adenovirusmedieret transduktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter