Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ekspresjon av transgener i naturlig blære urotel ved bruk av adenovirusmediert transduksjon

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Metoder er beskrevet for generering av store mengder rekombinante adenovirus, som deretter kan brukes til å transducere det opprinnelige gnagerurotelet som muliggjør ekspresjon av transgener eller nedregulering av endogene genprodukter.

Abstract

I tillegg til å danne en høy motstandsbarriere, er urotelet som fôrer nyrebekkenet, urinlederne, blæren og proksimale urinrøret hypoteset for å fornemme og overføre informasjon om miljøet til det underliggende vevet, fremme tømmingsfunksjon og oppførsel. Forstyrrelse av urotelbarrieren, eller dens sensoriske / transduserfunksjon, kan føre til sykdom. Å studere disse komplekse hendelsene hindres av mangel på enkle strategier for å endre gen- og proteinuttrykk i urotelet. Metoder er beskrevet her som gjør det mulig for etterforskere å generere store mengder høytiter adenovirus, som deretter kan brukes til å transdusere gnagerurotel med høy effektivitet, og på en relativt enkel måte. Både cDNA og små forstyrrende RNA kan uttrykkes ved hjelp av adenoviral transduksjon, og virkningen av transgen ekspresjon på urotelfunksjonen kan vurderes 12 timer til flere dager senere. Disse metodene har bred anvendelighet for studier av normal og unormal urotelbiologi ved bruk av muse- eller rottedyrmodeller.

Introduction

Urotelet er det spesialiserte epitelet som strekker nyrebekkenet, urinlederne, blæren og det proksimale urinrøret1. Den består av tre lag: et lag av svært differensierte og polariserte ofte bi-nukleate paraplyceller, hvis apikale overflater er badet i urin; et mellomliggende cellelag med en populasjon av bi-nukleate transittforsterkende celler som kan gi opphav til overfladiske paraplyceller som svar på deres akutte tap; og et enkelt lag av basale celler, en delmengde som fungerer som stamceller som kan regenerere hele urotelet som respons på kronisk skade. Paraplyceller er hovedsakelig ansvarlige for å danne den høyresistente urotelbarrieren, hvorav komponenter inkluderer en apikal membran (rik på kolesterol og cerebrosider) med lav permeabilitet for vann og løsemidler, og et apikalt krysskompleks med høy motstand (bestående av tette kryss, adherenskryss, desmosomer og en tilhørende aktomyosinring)1 . Både den apikale overflaten av paraplycellen og dens kryssring utvides under blærefylling og går raskt tilbake til sin ferdigfylte tilstand etter tømming 1,2,3,4,5. I tillegg til sin rolle i barrierefunksjon, er urotelet også antatt å ha sensoriske og transduserfunksjoner som gjør det mulig å oppdage endringer i det ekstracellulære miljøet (f.eks. Stretch) og overføre denne informasjonen via frigjøring av mediatorer (inkludert ATP, adenosin og acetylkolin) til underliggende vev, inkludert suburoteliale afferente nerveprosesser 6,7,8 . Nyere bevis på denne rollen er funnet hos mus som mangler uroteluttrykk for både Piezo1 og Piezo2, noe som resulterer i endret vannlatingsfunksjon9. I tillegg utvikler rotter som overuttrykker det poredannende proteinet CLDN2 i paraplycellelaget betennelse og smerte som er analog med det som ses hos pasienter med interstitiell cystitt10. Det er en hypotese at forstyrrelse av urotelial sensorisk/transduser eller barrierefunksjon kan bidra til flere blærelidelser 6,11.

En bedre forståelse av urotelets biologi i normale og sykdomstilstander avhenger av tilgjengeligheten av verktøy som gjør det mulig for etterforskere å lett nedregulere endogent genuttrykk eller tillate ekspresjon av transgener i det opprinnelige vevet. Mens en tilnærming til å nedregulere genuttrykk er å generere betingede urotelial knockoutmus, avhenger denne tilnærmingen av tilgjengeligheten av mus med floxed alleler, er arbeidsintensiv og kan ta måneder til år å fullføre12. Ikke overraskende da har forskere utviklet teknikker for å transfektere eller transducere urotelet, noe som kan føre til resultater på kortere tidsskala. Publiserte metoder for transfeksjon inkluderer bruk av kationiske lipider13, anti-sense fosforothioated oligodeoxynucleotides 14, eller antisense nukleinsyrer bundet til HIV TAT protein penetrerende 11-mer peptid15. Imidlertid er fokuset i denne protokollen på bruk av adenoviral-mediert transduksjon, en godt studert metodikk som er effektiv ved genlevering til et bredt spekter av celler, har blitt testet i en rekke kliniske studier, og ble nylig brukt til å levere cDNA som koder for COVID-19-kapsidproteinet til mottakere av en variant av COVID-19-vaksinen16, 17. For en grundigere beskrivelse av adenovirusets livssyklus, adenovirale vektorer og kliniske anvendelser av adenovirus, henvises leseren til referanse17.

En viktig milepæl i bruken av adenovirus for å transducere urotelet, var en rapport fra Ramesh et al. som viste korte forbehandlinger med vaskemidler, inkludert N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dramatisk forbedret transduksjon av urotelet av et adenovirus som koder for β-galaktosidase18. Ved å bruke denne proof-of-principle-studien som en veiledning, har adenoviral-mediert transduksjon av urotelet nå blitt brukt til å uttrykke en rekke proteiner, inkludert Rab-familie GTPaser, guanin-nukleotidutvekslingsfaktorer, myosinmotoriske fragmenter, poredannende tette kryssassosierte klaudiner og ADAM17 10,19,20,21,22 . Den samme tilnærmingen ble tilpasset for å uttrykke små forstyrrende RNA (siRNA), hvis effekter ble reddet ved å uttrykke siRNA-resistente varianter av transgen22. Protokollen beskrevet her inkluderer generelle metoder for å generere store mengder høykonsentrert adenovirus, et krav til disse teknikkene, samt tilpasninger av metodene til Ramesh et al.18 for å uttrykke transgener i urotelet med høy effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter som involverer generering av adenovirus, som krever BSL2-sertifisering, ble utført under godkjenning fra University of Pittsburgh Environmental Health and Safety kontorer og Institutional Biosafety Committee. Alle dyreforsøk som ble utført, inkludert adenoviral transduksjon (som krever ABSL2-sertifisering), ble gjort i samsvar med relevante retningslinjer / forskrifter i Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og dyrevelferdsloven, og under godkjenning av University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Hansker, øyevern og passende klær brukes til alle prosedyrer som involverer rekombinante virus. Alt flytende eller fast avfall skal kastes som beskrevet nedenfor. Sengetøy av dyrene etter transduksjon, og eventuelle resulterende dyrekropper, skal behandles som biofarlige materialer og avhendes i henhold til institusjonelle retningslinjer.

1. Fremstilling av høy-titer adenovirus-aksjer

MERK: Effektiv transduksjon av gnagerblærer avhenger av bruk av rensede og konsentrerte virale bestander, typisk 1 x 107 til 1 x 108 infeksiøse viruspartikler (IVP) per μL. Denne delen av protokollen er fokusert på å generere høy-titer adenoviruslagre fra eksisterende viruspreparater. Alle trinn skal utføres i en cellekulturhette ved bruk av sterile reagenser og verktøy. Mens de tilgjengelige stammene av adenovirus som brukes i dag er replikasjonsdefekte, krever de fleste institusjoner godkjenning for å bruke adenovirus og rekombinant DNA. Dette inkluderer ofte betegnelse av et cellekulturrom som et BSL2-godkjent anlegg for å produsere og forsterke adenovirus. Noen generelle hensyn inkluderer bruk av masker, øyevern, hansker og passende klær i alle stadier av virusproduksjon og rensing. Ved sentrifugering anbefales sikkerhetshetter hvis sentrifugerørene mangler tettsittende hetter. Alle ikke-engangsmaterialer, inkludert potensielt forurensede sentrifugesikkerhetskapsler, flasker og rotorer, behandles med en antiviral løsning (se materialfortegnelse), og skylles deretter med vann eller 70% etanol. Flytende avfall behandles ved å tilsette blekemiddel til en endelig konsentrasjon på 10% (v / v). Avhending av dette flytende avfallet vil avhenge av institusjonell politikk. Fast avfall kastes vanligvis i biofarlig avfall.

  1. Kultur HEK293T-celler
    1. Tine et frossent hetteglass med HEK293T-celler i et vannbad ved 37 °C og bruk en 5 ml pipette til å overføre cellene til en cellekulturskål med en diameter på 15 cm. Bruk en 25 ml pipette, tilsett sakte 20 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) som inneholder 10% (v / v) føtal bovint serum og penicillin / streptomycin antibiotika (DMEM-FBS-PS) til parabolen. Inkuber cellene i en 37 °C cellekulturinkubator gasset med 5% (v / v) CO 2 til de når 80% -90% konfluens (~2 x 107 celler).
    2. Bruk en glasspipette festet til en vakuumkilde, aspirer mediet og skyll deretter cellene ved å overføre 20 ml steril PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mMNaCl og 8,9 mM Na2HPO4) til parabolen med en 25 ml pipette. Aspirer den brukte PBS, og bruk deretter en 5 ml pipette for å overføre 3 ml varm (37 ° C) proteinaseoppløsning (se materialfortegnelse) til parabolen, inkubere parabolen i cellekulturinkubatoren til cellene løsner (~ 3-4 min).
      MERK: Effektiv proteolyse kan best vurderes ved å sakte vippe parabolen frem og tilbake på jakt etter frigjøring av celler fra alle deler av parabolen i den bevegelige væsken. HEK293T-celler er følsomme for utvidet proteinasebehandling og vil dø hvis de blir liggende mer enn noen få minutter i proteinaseoppløsning.
    3. Bruk en 10 ml pipette til å overføre 7 ml DMEM-FBS-PS til parabolen i frittliggende celler, og bruk deretter den samme pipetten til å aspirere cellene og mediet. Overfør de suspenderte cellene til et 50 ml konisk rør, og pellet deretter cellene ved å sentrifugere suspensjonen i en klinisk sentrifuge med lav hastighet ved 200 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten ved hjelp av en glasspipette festet til en vakuumkilde. Bruk en 25 ml pipette til å resuspendere cellepelleten i 15 ml DMEM-FBS-PS.
    4. Tilsett 1 ml av cellesuspensjonen til hver av femten 15 cm fat som inneholder 19 ml DMEM-FBS-PS.
    5. Voks cellene i en vevskulturinkubator til de når 85% -90% sammenløp (~ 3-4 dager).
  2. Forbered en fortynnet virusoppløsning
    1. Legg til ~ 1,5 x 10 9 til 3 x 109 IVP av et eksisterende viruslager (5-10 IVP / celle) til et 50 ml konisk rør fylt med 45 ml DMEM som mangler FBS eller antibiotika.
      MERK: Det er mulig å bruke en lavere konsentrasjon av viruset (1-5 IVP / celle); Det vil imidlertid ta lengre tid før virusproduksjonen oppstår.
  3. Infiser de dyrkede cellene med viruset.
    1. Bruk en glasspipette festet til en vakuumkilde til å aspirere mediet fra de nesten sammenløpende cellene i trinn 1.1.5.
    2. Bruk en 25 ml pipette til å overføre 3,0 ml fortynnet virusoppløsning (tilberedt i trinn 1.2.1) til hver cellekulturskål. Bruk deretter en 10 ml pipette for å tilsette 7,0 ml DMEM medium (mangler FBS eller antibiotika) til hver tallerken. Inkuber i 60 minutter i en cellekulturinkubator, og tilsett deretter 10 ml DMEM inneholdende 20% (v / v) FBS og 2x PS til hver tallerken.
      MERK: Bruk av en av de 15 rettene som en kontrollplate (der virus ikke er tilsatt) gjør det lettere å identifisere virusindusert celleavrunding og død i infiserte celler i neste trinn.
    3. Inkuber cellene i cellekulturinkubatoren i 2-4 dager til flertallet av dem begynner å runde opp og >60% av cellene har løsnet.
      MERK: Hvis du bruker en lavere titer av viruset, kan det ta opptil en uke før celledød oppstår. Hvis celledød ikke forekommer innen en uke, er det sannsynlig at prosessen må gjentas ved hjelp av en høyere titer av viruset.
  4. Gjenopprett virus fra cellelysater
    1. Bruk en celleskraper til å skrape bunnen av hver tallerken, og slipp festede celler inn i mediet.
    2. Bruk en 25 ml pipette til å samle opp og samle medium, celler og cellerester fra hver cellekulturskål til et 50 ml konisk cellekulturrør.
      NOTAT: For å spare ressurser kan mediet fra to retter kombineres til ett 50 ml rør.
    3. Pellet cellematerialet ved sentrifugering ved hjelp av en lavhastighets bordplatesentrifuge: 5 min ved romtemperatur ved 3000 x g. Bruk en glasspipette festet til en vakuumanordning for å aspirere supernatanten.
    4. Bruk en 10 ml pipette, kombinert med triturering, for å konsolidere alt det resulterende pelleterte materialet i totalt 7 ml sterilfiltrert 100 mM Tris-HCl pH 7,4 inneholdende 10 mM EDTA (Tris-EDTA-løsning). Overfør det samlede materialet til et sterilt 15 ml cellekulturkonisk rør og legg det på is.
      MERK: På dette tidspunktet kan virusforberedelsen fryses ved -80 °C på ubestemt tid.
  5. Forbered cellelysater
    1. Utfør tre fryse-tine sykluser for å forstyrre de gjenværende cellene, og dermed frigjøre de dannede viruspartiklene ytterligere. Frys det samlede materialet i trinn 1.4.4 ved å senke røret i flytende nitrogen (~30-60 s). Tine prøven raskt ved å plassere tuben i en 37 °C inkubator. Vortex prøven i 15 s, og gjenta deretter den raske fryse- og tineprosedyren ytterligere 2x.
      MERK: Virusoppløsningen kan tines raskt i en 37 ° C i et vannbad, men forsiktighet er nødvendig da temperatursvingninger kan føre til at røret sprekker og frigjør virusoppløsning i vannbadet. For å forhindre at dette skjer, plasser røret som inneholder viral supernatant i et større rør, som deretter settes i vannbadet.
    2. Bruk en 10 ml pipette til å overføre det tre ganger frysetinte cellematerialet til et superspeed-sentrifugerør. Sentrifuger materialet i røret i 30 minutter ved 4 °C superhastighets sentrifuge ved ~18 500 x g.
    3. Gjenvinn ~7 ml virusrik supernatant med en 10 ml pipette og overfør den til et 15 ml konisk rør. Oppbevar prøven på is til neste trinn.
      MERK: På dette tidspunktet bør du vurdere å beholde en aliquot av den urensede virale supernatanten som en innledning for å starte et nytt viruspreparat (eller som en sikkerhetskopi). Oppbevar denne alikoten ved -80 °C.
  6. Isoler og rens viruset ved hjelp av sentrifugering av tetthetsgradient.
    1. Forbered en diskontinuerlig gradient av CsCl i et 12 ml PET tynnvegget, klart ultrasentrifugerør (se materialtabellen) eller tilsvarende. Bruk en 3 ml sprøyte utstyrt med en 18 G kanyle for forsiktig innføring av 2,5 ml 1,4 g/ml CsCl oppløsning i bunnen av slangen, og bruk deretter en ny sprøyte/kanyle til å legge den lagvis med 2,5 ml 1,25 g/ml CsCl oppløsning.
      MERK: Å slippe løsninger direkte på toppen av et allerede eksisterende lag vil forårsake betydelig og uønsket blanding. I stedet plasserer den skrå delen av nålen mot kanten av røret, og trykk deretter veldig sakte på sprøytestempelet, og hev nålens posisjon når løsningen fyller røret.
    2. Legg ~7 ml viral supernatant på toppen av gradienten på lignende måte ved hjelp av en 10 ml sprøyte. Hvis det er mer enn 2-3 mm mellomrom mellom den virale supernatanten og toppen av røret, tilsett ytterligere Tris-EDTA-løsning for å fylle røret til bare 2-3 mm plass gjenstår.
    3. Lag et lignende forberedt balanserør, som inneholder lag av CsCl, men erstatter Tris-EDTA-løsningen for den virale supernatanten.
      MERK: De to rørene må ha identiske vekter (og lignende tettheter) for å forhindre en potensielt farlig ubalansert belastningssituasjon i ultrasentrifugen.
  7. Isoler viruset ved hjelp av hastighetszonal ultrasentrifugering.
    1. Legg gradientene som er dannet i trinn 1.6.2-1.6.3 i bøttene til en SW41-rotor eller tilsvarende. Skru i bøttehetter, plasser rotoren i en ultrasentrifuge (forkjølt til 4 °C), og sentrifuge i 1 time ved ~150 000 x g.
    2. Under sentrifugering balanserer du kolonnen beskrevet i trinn 1.9.1 nedenfor.
  8. Gjenopprett isolerte viruspartikler
    1. På slutten av sentrifugeringstrinnet, løsne forsiktig bøttene fra rotoren, og fjern bøttehettene i en cellekulturhette, og fjern deretter rørene og legg dem i et stativ.
    2. Samle båndmaterialet, rikt på viruspartikler, som flyter ved grensesnittet mellom 1,25 g/ml og 1,4 g/ml CsCl-løsningen. Hold røret som inneholder gradienten over den nederste halvdelen av en cellekulturskål (som vil fange opp sølte materialer), bruk en 1 tomme 18 G nål festet til en 3 ml sprøyte for å forsiktig punktere røret, like under båndviruset. Sakte aspirere viruset, som vanligvis gjenvinnes i ~ 1 ml.
    3. Fjern nålen fra røret, noe som vil resultere i at det gjenværende materialet i gradienten strømmer ut av røret inn i den nederste halvdelen av cellekulturskålen (eventuelle væsker skal behandles som farlig avfall).
    4. Overfør virusoppløsningen i sprøyten til et sterilt mikrosentrifugerør på is.
      MERK: Når viruset er gjenopprettet i dette trinnet, plasser nålen slik at lumen på nålen vender oppover med nålens åpning noen få mm under det virusrike båndet. Unngå forurensning av det tynne båndet av feil montert virus som noen ganger observeres 2-3 mm over virusbåndet (se tynn svart pil i figur 1A).
  9. Fjern CsCl fra prøven ved hjelp av gelfiltrering.
    1. Likevekt en PD-10 kolonne (ferdigpakket med Sephadex G-25M), klemmet til et støttestativ, med 50 ml 0,2 μm sterilfiltrert PBS inneholdende 10% (v / v) glyserol.
      MERK: Det første likevektstrinnet tar 2-3 timer å fullføre og er nødvendig for å sikre fullstendig utvasking av konserveringsmidler som brukes av produsenten for å stabilisere kolonnen.
    2. La vaskeoppløsningen trekke seg under frit (en beskyttende plate av hvitt materiale på toppen av kolonnemediet), og overfør deretter forsiktig den rensede virusoppløsningen samlet i trinn 1.8 til toppen av kolonnen. La den virusrike løsningen trekke seg under frit, og begynn deretter å fylle kolonnen med PBS-glyserol.
      MERK: En funksjon av frit er å forhindre at kolonnen går tørr. Som et resultat av dette tolereres korte forsinkelser før mer eluant tilsettes kolonnen.
    3. Samle eluatet i 12 sterile mikrosentrifugerør, 0,5 ml per fraksjon.
  10. Bestem virusutbyttet.
    1. Bestem de maksimale virusfraksjonene ved hjelp av spektrofotometri. Forbered en 1:100 fortynning av hver fraksjon i PBS og mål OD260 i et spektrofotometer, ved å bruke en 1:100 fortynning av buffer alene som et tomt. Viruspartiklene skal eluere i tomromsvolumet, fra rundt fraksjon 6. Slå sammen brøkene som inneholder de høyeste OD260-avlesningene .
    2. Lag en 1:100 fortynning av de samlede virale fraksjonene og mål OD260 på nytt. Beregn den endelige konsentrasjonen av viruspartikler og antall IVP i de samlede fraksjonene ved å bruke følgende formel: Viruspartikler per ml = OD260 × 100 (dette korrigerer for fortynningsfaktoren) × 1012. Et generelt estimat er at 1% av viruspartiklene er IVP, som sådan: IVP / ml = OD 260 × 100 × 10 10 eller IVP / μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. Aliquot de samlede virusfraksjonene (inneholdende 5 x 107 til 1 x 108 IVP) i sterile mikrosentrifugerør eller kryovialer. Oppbevar prøvene ved -80 °C.

2. Transduksjon av gnagerblære

MERK: Hvis denne teknikken er ny, anbefales det at antall dyr som overføres på en gang, begrenses til 2-4. Dette kan oppnås ved å forskyve starttidene for hvert dyr, spesielt under vaskemiddelbehandlingen i trinn 2.2, og deretter virusinkubasjonen i trinn 2.3. Erfarne etterforskere kan transdusere opptil seks dyr om gangen.

  1. Kateteriser blæren
    1. Bedøv kvinnelige C57Bl / 6J-mus (vanligvis 8-10 uker gamle, ~ 20-25 g) eller kvinnelige Sprague Dawley-rotter (vanligvis 2-3 måneder gamle, ~ 250 g) ved hjelp av en fordamper med en festet nesekegle. Kalibrer fordamperen slik at den får 3,0 % (v/v) isofluran, 97 % (v/v) O2 for mus eller 4,0 % (v/v) isofluran, 96 % (v/v)O2 for rotter. Bekreft at dyrene er bedøvet ved å sørge for at de ikke reagerer på tåklemming (vanligvis etter 1-2 min).
    2. Opprettholde dyrets kroppstemperatur ved å plassere dyrene på en oppvarmet pute. Overvåk dyret gjennom hele transduksjonsprotokollen for å sikre at dyrene blir bedøvet og ikke opplever smerte under denne prosedyren.
    3. Reduser isofluran til 1,5 % (v/v) for mus eller 2,0 % (v/v) for rotter og hold dyrene under anestesi så lenge protokollen varer.
    4. For å unngå å innføre luft inn i blæren, fyll plastkateterdelen av et IV-kateter (se materialfortegnelse) og tilhørende nav med steril PBS ved hjelp av en overføringspipette.
    5. Med dyret i den bakre posisjonen, swab den eksterne meatus med 70% alkohol, og sett det sterile kateteret inn i den ytre meatusen, deretter urinrøret og deretter inn i blæren.
      1. For å utføre denne oppgaven, bruk fine tang for forsiktig å ta tak i vevet som danner den eksterne meatus og utvide den vertikalt, vekk fra dyret. Bruk den annen side, sett forsiktig kateteret vertikalt ca. 3-4 mm inn i urinrøret meatus (en kjøtthaug like over åpningen av skjeden). Deretter, på grunn av en bøyning i urinrøret, senk kateteret, satt inn i den ytre meatus, mot dyrets hale, noe som letter inngangen til den delen av urinrøret som passerer under skambenet, og til slutt inn i blæren
        . MERK: Spesielt når det gjelder musen, kan kateteret være for langt, og ikke mer enn 1,0-1,1 cm av det skal settes inn i dyret. Ellers vil skade på blæreslimhinnen oppstå. For å unngå dette, merk kateteret ~ 1 cm under spissen, og ikke sett inn kateteret utover denne merkingen.
    6. La urinen i blæren lekke ut. Fjern eventuell gjenværende urin ved å utføre Credés manøver: masser og trykk forsiktig ned på blærebumpen i det nedre bukområdet.
  2. Gjør urotelet mottakelig for transduksjon ved å behandle det med en vaskemiddelløsning.
    1. Vask musen eller rotteblæren ved å feste en steril 1 ml sprøyte fylt med PBS til kateternavet. Injiser 100 mikrol steril PBS i museblæren (eller 450 μL når det gjelder rotteblæren). Løsne sprøyten fra kateterbeslaget og la PBS renne. Utfør om nødvendig Credes manøver for å fjerne overflødig blærevæske.
    2. Drypp 100 mikrol 0,1 % (w/v) N-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) (oppløst i PBS og 0,2 μm filtersterilisert) inn i museblæren ved hjelp av en steril 1 ml sprøyte. Hold DDM i blæren i 10 minutter ved å la sprøyten være på plass. Hos rotter økes volumet av DDM til 450 μL.
    3. Fjern DDM fra blæren ved å løsne sprøyten og la den renne ut. Utfør Credes manøver om nødvendig.
  3. Introduser viruset i blæren.
    1. Fest en steril 1 ml sprøyte til kateternavet og injiser 0,5 x 107 til 1 x 108 IVP adenovirus (tilberedt i trinn 1), fortynnet i 100 mikrol steril PBS for mus eller 450 μL for rotter, inn i blæren. La sprøyten være festet til kateteret for å forhindre at virusoppløsningen slipper ut.
    2. Etter 30 minutter løsner du sprøyten og lar virusoppløsningen evakuere blæren over på en engangspute. Tørk eventuell gjenværende virusløsning med en absorberende våtserviett, og kast puten og tørk av biologisk farlig avfall.
      MERK: Glyserol er cytotoksisk. Som sådan er det maksimale volumet av virusoppløsning innpodet i mus begrenset til 5 μL (som når fortynnet i 100 μL PBS vil resultere i en endelig glyserolkonsentrasjon på ~ 0,5% [v / v]). I tillegg er det mulig å forbedre transduksjonseffektiviteten ved å øke antall instillert IVP og ved å utvide virusinkubasjonen til 45 minutter.
    3. Valgfritt trinn: Blæren kan skylles med PBS som beskrevet i trinn 2.2.1 ovenfor; Dette er imidlertid ikke nødvendig.
  4. La dyret komme seg.
    1. Stopp strømmen av isofluran og la dyret komme seg og være helt mobilt før det settes tilbake i buret, spesielt hvis dyrene har et gruppehus.
      MERK: Siden virustransduksjon i seg selv ikke forårsaker observerbare symptomer eller smerter i nedre urinveier, er det vanligvis ikke behov for postoperativ behandling. Imidlertid, hvis det kodede transgenet er giftig, kan analgesi eller antibiotika etter prosedyren være nødvendig som kreves av institusjonen.
  5. Analyser effekten av transgenuttrykk 12-72 timer etter behandling ved hjelp av metoder som mRNA in situ hybridisering, western blot eller immunfluorescens 9,10,23 (se representative resultater).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virus forberedelse
Et eksempel på virusrensing ved sentrifugering av tetthetsgradient er vist i figur 1A. Det lysrosa båndet, som finnes ved grensesnittet mellom det lastede cellematerialet og 1,25 g/ml CsCl-laget, består hovedsakelig av forstyrrede celler og deres rusk (se magenta pil i figur 1A). Den henter sin rosa farge fra den lille mengden kulturmedium som overføres fra trinn 1.5 i protokollen. Viruspartiklene av interesse, som vises som et melkehvitt bånd, finnes ved grensesnittet til 1,25 g / ml CsCl og 1,40 g / ml CsCl-oppløsningene (se gul pil i figur 1A). Man kan også observere et bånd av materiale som svever 2-3 mm over de berikede viruspartiklene (se tynn svart pil i figur 1A). Den består av umonterte virus og rusk, inneholder få IVP, og bør unngås ved innsamling av virusprøven.

Ytterligere rensing av viruset og bufferutveksling ved hjelp av en PD10-kolonne er vist i figur 1B, og OD260-avlesningene av de resulterende fraksjonene etter eluering er vist i figur 1C. Tomromsvolumet av disse kolonnene er ca. 3 ml, og dermed begynner viruset å vises i fraksjon 6 og topper i fraksjon 9. I dette forsøket ble fraksjonene 6-9 slått sammen. Mens fraksjon 6 og 7 er relativt lave i viruspartikler, inneholder de tilstrekkelig virus til å fortjene utvinning, og de tjener til å fortynne de svært høye titerfraksjonene til en mer fornuftig konsentrasjon. Fraksjonene 10-12 ble ikke inkludert, da økningen i OD260 i fraksjon 11 indikerer mulig tilstedeværelse av en andre forurensende topp, som er varierende observert i disse preparatene. Den samlede fraksjonen vil typisk ha 1 x 107 til 1 x 108 IVP / μL, og forventet utbytte vil være i størrelsesorden 1 x 10 10 til 2 x10 11 total IVP. Dette er tilstrekkelig mengde virus til å utføre hundrevis av transduksjoner. Selv om det er mulig å titre viruset ved plakkanalyser eller ved å telle kolonier av celler som uttrykker fluorescerende proteiner22, er 1%-regelen tilstrekkelig i de fleste tilfeller. Denne regelen sier at 1% av rensede viruspartikler, estimert ved å måle OD260 av prøven, er IVP. Alikoter av virus lagret ved -80 °C har en holdbarhet på 2-5 år, selv om smittsomheten avtar på lang sikt. Tinte alikoter av virus kan fryses på nytt ved -80 °C én gang uten nevneverdig tap av smittsomhet. Gjentatt tining og frysing påvirker imidlertid virusinfeksjonen negativt.

Blæretransduksjon
Et viktig første skritt når man vurderer virkningen av transduksjon er å bekrefte transgen ekspresjon. Dette kan vurderes ved hjelp av flere teknikker, inkludert verktøy som oppdager mRNA (f.eks. RNAScope), western blot-analyse eller bruk av immunfluorescens 9,10,23. Figur 2 er et eksempel på museurotel som ble transdusert med et adenovirus som koder for V5-epitopmerket humant veksthormon (V5-hGH)23. Dette proteinet er pakket inn i discoidale / fusiforme vesikler og kan eksocytoseres under blærefylling19,23. Western blot-analyse av urotellysater viste V5-hGH-uttrykk i urotelet i transducerte blærer, men ikke i utransduserte (figur 2A). Ekspresjon ble også bekreftet ved immunfluorescens, i dette tilfellet med antistoffer som gjenkjente hGH eller V5-epitopmerket (utransduserte blærer manglet signal, ikke vist) (figur 2B).

Et ytterligere eksempel er transduksjon av rotteblæren med et virus som koder for CLDN2, et poredannende tett kryssassosiert protein24,25. CLDN2 øker paracellulær fluks av kationer (inkludert K +) og dens overekspresjon resulterer i betennelse og utvikling av visceral smerte10. Western blot-analyse bekreftet ekspresjon av CLND2 i rotteblærer transdusert med adenovirus som koder for Cldn2, men ikke de som ble transdusert med et kontroll-GFP-kodende virus (figur 2C). Generelt anses GFP ikke å være giftig når det uttrykkes i celler, og det tjener dermed som en nyttig kontroll. Bruken av GFP gjør det også mulig for etterforskeren å bekrefte at transduksjon virker. Immunfluorescensanalyse bekreftet videre eksogent CLDN2-uttrykk i urotelparaplyceller transdusert med viruskodende Cldn2 cDNA (rødt signal i figur 2D). Videre, i likhet med endogen CLDN2 (ikke vist), er den uttrykte CLDN2 lokalisert til TJP1-merkede tette kryss, samt paraplycellens basolaterale overflater (CLDN2 er merket grønt i figur 2E)10. Når det gjelder CLDN2-uttrykk, var det høyest en dag etter transduksjon, men så sporet av, og var knapt påviselig etter 15 dager.

En annen vurdering er, hvilke celletyper vil bli målrettet ved adenoviral transduksjon. Mens det hos rotter er mulig å hovedsakelig transducere paraplycellelaget19, i mus, kan alle lagene i urotelet transduceres, selv om transduksjon av mellomliggende og basale cellelag kan variere. Det er viktig å merke seg at i hele blæreveggen er det bare urotelet som transduceres, og ingen andre vev er målrettet av det innpodede adenoviruset (figur 3).

Mens analyser av transducerte celler kan utføres på enkeltcellenivå, må man transdusere flertallet av urotelcellene når man utforsker en total blærefenotype. Det er derfor viktig å definere effektiviteten av transduksjon (dvs. hvilken brøkdel av urotelceller som transduceres). For eksempel, i tilfelle av Cldn2-uttrykkende adenovirus, ble >95% av paraplycellene transdusert (se figur 2D). Et annet eksempel er bildefeltet vist i figur 3, hvor telling av antall transduserte paraplyceller (i dette tilfellet uttrykk for Ca2+ -sensoren GCAMP5G), avslører en effektivitet som nærmer seg 95%. Imidlertid må man undersøke celler i tilfeldige felt tatt gjennom blæreveggen for å oppnå et nøyaktig og objektivt estimat av transduksjonseffektiviteten.

Figure 1
Figur 1: Rensing av adenovirus. (A) Adenoviruspartikler produsert av infiserte HEK293T-celler ble renset ved sentrifugering på en diskontinuerlig CsCl-gradient bestående av et lag på 1,4 g / ml CsCl, et lag på 1,25 g / ml CsCl og et lag av prøve (S) fortynnet i Tris-EDTA-oppløsning. Det cellulære materialet (rosa pil) akkumuleres ved S/1.25-grensesnittet, mens det rensede adenoviruset flyter ved 1.25/1.4-grensesnittet (gul pil). Et lite bånd av feil montert virus flyter over sistnevnte (tynn svart pil). (B) Det adenovirusrike båndet i gradienten gjenvinnes ved hjelp av en nål, og CsCl fjernes fra adenoviruset ved gelfiltrering ved hjelp av en G25 Sephadex-fylt PD10-kolonne likevektet med PBS inneholdende 10,0% (v / v) glyserol. Overflaten på Sephadex er beskyttet av en porøs, plastfrit. (C) Fraksjoner, 0,5 ml, ble samlet fra PD10-kolonnen. OD260 av fraksjonene ble målt i et spektrofotometer og verdiene plottet. Virusrike fraksjoner eluerer i tomromsvolumet, som begynner ved fraksjon 6 og strekker seg til fraksjon 9. Samlede brøker for dette representative eksperimentet er skyggelagt i blått. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Transduksjon av gnagerblæreurotel med adenovirus som koder for V5-hGH eller CLDN2. (A) Museurotel ble etterlatt utransducert (UT) eller transdusert med adenovirus som koder for V5-epitopmerket humant veksthormon (hGH). Etter 24 timer ble blærene gjenfunnet, urotellysater ble fremstilt og utsatt for natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese, og V5-hGH-ekspresjon bekreftet ved bruk av vestlige flekker undersøkt med antistoff mot hGH. (B) Påvisning av V5-hGH i mus urotel seksjonert og farget ved hjelp av antistoffer mot hGH (grønn) eller V5 epitop (rød) og fluorofor-merkede sekundære antistoffer. Immunfluorescens ble fanget opp ved konfokalmikroskopi. Prøvene ble motfarget med TO-PRO3 for å merke kjerner. (VG Nett) Rotte urotel ble transducert med et virus som koder rotte CLDN2 (vanlig navn claudin-2) eller GFP (fellesnavn grønt fluorescerende protein) som en kontroll. (C) Påvisning av eksogen CLDN2 ved vestlig blotting ved bruk av et antistoff igjen CLDN2. Merk at den endogene CLDN2 uttrykkes i lave nivåer og ikke oppdages i dette eksperimentet. (D) Transduksjon av paraplycellelaget avsløres ved immunfluorescens og konfokal mikroskopi. Grensene til cellen avsløres ved å fargelegge vevet sammen med FITC-phalloidin, som merker det kortikale aktincytoskelettet. (E) Påvisning av eksogent CLDN2 og TJP1 (fellesnavn ZO1) ved immunfluorescens og konfokal mikroskopi av helmontert eller tverrsnittet urotel. Små hvite piler indikerer plasseringen av det stramme krysset og små magenta pilspisser markerer plasseringen av intracellulære akkumuleringer av CLDN2 i cellecytoplasma. Disse ble tidligere avslørt å være Golgi-assosiert CLDN210. (F) Etter transduksjon ble dyrene avlivet på de angitte dagene etter infeksjon. Eksogent CLDN2-uttrykk ble påvist ved bruk av vestlig blotting. Dyr som uttrykte GFP ble avlivet etter dag 1. Dataene i figur 2C-E er modifisert fra Montalbetti et al.10, og er gjengitt med tillatelse fra American Physiological Society. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effektivitet av adenoviral transduksjon. Museblærens urotel ble transdusert med et adenovirus som koder for kalsiumsensoren GCaMP5G. De øvre panelene viser farging for GCaMP5G (oppdaget ved hjelp av et antistoff mot grønt fluorescerende protein; GFP, grønn), de midterste panelene viser fordelingen av DAPI-fargede kjerner (blå) og rhodamin-falloidin-merket aktin (rød), og bunnpanelene er en sammenslåing av de tre signalene. De hvite pilspissene i det nedre panelet er de sjeldne paraplycellene som ikke blir transducert. Den totale effektiviteten av transduksjon av paraplyceller i dette bildet er ~ 95%. Merk at bare urotelet blir transducert. De boksede områdene er forstørret i panelene til høyre. Regionen i ramme 1 består hovedsakelig av transduserte paraplyceller. Området i ramme 2 er urotel som viser effektiv transduksjon av paraplyceller, men mindre effektiv transduksjon av de underliggende cellelagene. LP = lamina propria; ME = muscularis externa; Se = serosa; Ut = urotel. Bildene ble tatt ved hjelp av et konfokalmikroskop (se materialfortegnelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens Ramesh et al. var fokusert på å utvikle strategier for å bruke adenoviral transduksjon i behandlingen av blærekreft 18, har nyere rapporter vist nytten av disse teknikkene i å studere normal urotelbiologi / fysiologi og patofysiologi 10,18,19,20,21 . De viktige funksjonene i denne tilnærmingen inkluderer følgende: (i) I hele gnagerblæreveggen blir bare urotelet transdusert 10,19,20,21,22. Når det gjelder rotter, er transduksjon for det meste begrenset til paraplycellelaget, mens hos mus kan hele urotelet målrettes; (ii) Denne tilnærmingen kan brukes til å uttrykke proteiner eller siRNA 10,19,20,21,22; (iii) Effektiviteten av transduksjon kan nærme seg 70% -95% (f.eks. se figur 3) 18,20; (iv) En dag etter transduksjon er ultrastrukturen til urotelet, vevets integritet, tilstedeværelsen av en høyresistensbarriere (vurdert ved å måle transepitelmotstand) og uttrykket av uroteliale differensieringsmarkører "normal"10,19. Den eneste morfologiske effekten som er notert så langt, er en reduksjon i paraplycellediameter (sett ovenfra); Imidlertid går de tilbake til sin normale størrelse etter 3-4 dager10,19; (v) Urotelet kan overføres med opptil tre forskjellige adenovirus samtidig18; (vi) Transgenuttrykk kan endres ved å titrere antall IVP, noe som påvirker mengden proteinuttrykk, forlenge eller forkorte inkubasjonstiden før dyret ofres, eller bruk av forskjellige promotorer som et tet-regulert system (tet-off)19. I sistnevnte tilfelle kan man co-uttrykke et virus som koder for transaktivatoren / tet-repressoren, og deretter modulere ekspresjonen av transgenet ved å endre konsentrasjonen av doxycyklin i dyrets diett.

Selv om den overordnede protokollen er relativt enkel, er det noen kritiske trinn som må vurderes når du utfører disse eksperimentene. En av disse er tilgjengeligheten av viruslagre med høy titer som er av rimelig renhet. Adenovirus kan fås fra kommersielle leverandører, fra institusjonelle virusproduksjonskjerner, fra andre etterforskere, eller de kan produseres internt. Når det gjelder sistnevnte, anbefales Bert Vogelstein-laboratoriet AdEasy-system fordi komponentene kan kjøpes fra Addgene, og adenovirus generert ved hjelp av denne tilnærmingen fungerer godt i urotelial transduksjon4. Denne teknikken gjør det mulig å generere adenovirus som koder for cDNA så store som 8 Kb ved hjelp av pAdEasy-1-emballasjeplasmidet (innsatsen erstatter virusgener E1 og E3), pAdEasier-1-bakterieceller (som koder for adenovirale gener som er nødvendige for å produsere virus) og produksjon av replikasjonsdefekte adenovirus i HEK293T-celler (som uttrykker det nødvendige virale E1-proteinet). Å erstatte pAdEasy-1-emballasjeplasmidet med pAdEasy-2-emballasjeplasmidet øker imidlertid emballasjestørrelsen med ytterligere 2,7 kB, men nødvendiggjør bruk av en annen cellelinje (E1-transformerte humane embryonale retinale 911-celler) da virusene mangler tidlig gen E4 i tillegg til E1 og E34. Ekspresjon av siRNA kan oppnås ved hjelp av flere systemer, inkludert pAdloss, som er beskrevet i detalj i Kasahara et al.26. Selv om det kan være mulig å bruke virusrikt cellekulturmedium for å transdusere urotelet, kan denne metoden være upålitelig. I stedet gir storskala virusforsterkning, CsCl gradientrensing, etterfulgt av gelfiltrering den mest pålitelige måten å generere store mengder høytitervirus på. Den relative stabiliteten av virus ved -80 ° C, kombinert med relativt store utbytter av virus, gjør dette til en ideell måte å ha en konsistent lager av virus som kan brukes over et stort antall eksperimenter.

Ytterligere kritiske trinn i denne protokollen inkluderer de som er knyttet til transduksjonsprotokollen. Disse inkluderer bruk av PBS (uten divalente kationer) som vaskemiddel og fortynningsmiddel, og bruk av DDM-vaskemiddel. Siden krysskomplekset er avhengig av Ca2+ for riktig funksjon, fremmer PBS sannsynligvis viral inngang ved å forstyrre den kryssassosierte barrieren. DDM er også kritisk; som Ramesh et al. rapporterte, er effektiviteten av adenovirustransduksjon svært lav i fravær av vaskemiddelbehandling18. Vaskemiddelets virkemåte er imidlertid ikke klart. En 10 min inkubasjon med DDM er ideell, men dette kan forkortes til 5 min; Det anbefales imidlertid ikke at inkubasjonen strekker seg utover 10 minutter, da vaskemiddelet kan forårsake uventet skade på underliggende vev. Mengden virus som brukes er en kritisk parameter, med høyere konsentrasjoner som generelt fører til større mengder transgenuttrykk og høyere transduksjonseffektivitet. Den optimale viruskonsentrasjonen som gir den beste kombinasjonen av uttrykk, effektivitet og fenotype må imidlertid bestemmes empirisk. Som startkonsentrasjon anbefales et område på 5,0 x 106 til 2,0 x 107 IVP per dyr. Avhengig av proteinet som uttrykkes, resulterer dette i effektivitet i området 70% -95% 10,19,20,21,22; Noen dominant-negative GTPase-konstruksjoner er imidlertid mindre effektive (30% -50%) og krever en enkeltcelleanalysetilnærming 4,20. Disse forskjellene i effektivitet kan gjenspeile omsetningen av transgenet, dets toksisitet eller renheten og utbyttet av virus som brukes til transduksjon. Sistnevnte kan utelukkes ved å utføre plakkanalyser. Selv om det ikke er hyperkritisk, må tiden viruset forblir i blæren være lang nok til at viruset fester seg til CXADR-reseptoren. Ganger mindre enn 30 minutter kan redusere effektiviteten av transduksjon, mens utvidelse av inkubasjonsperioden til 45 minutter kan øke effektiviteten; Dette kan imidlertid være transgenavhengig. Det siste kritiske trinnet i denne protokollen er å bestemme hvor lenge dyret vil bli holdt før en fenotype vurderes. Transgener viser det høyeste uttrykket etter 1-2 dager19, men uttrykket kan avta etter det. Når det gjelder siRNA, avhenger det av omsetningshastigheten til selve proteinet. For eksempel, når man uttrykker siRNA som retter seg mot uttrykk for Rab11a, en Rab-familie GTPase, observeres effektiv nedregulering først 72 timer etter transduksjon23. Dermed kan langlivede proteiner (med halveringstider målt i dager) ikke være egnede mål ved hjelp av denne tilnærmingen.

Utprøveren bør også være oppmerksom på forbeholdene knyttet til denne tilnærmingen. For det første kan dens nytte være begrenset til kvinnelige gnagere på grunn av vanskeligheter med å kateterisere mannlige gnagere gjennom penis. Imidlertid kan det være teknisk mulig å utføre denne protokollen hos menn ved å introdusere et kateter i blærekuppelen, lik preparatet som brukes ved utførelse av cystometri9. Dette vil tillate en å introdusere et vaskemiddel eller et virus, og utføre vasker etter behov. En annen advarsel er at overekspresjon av proteiner kan uttømme celleveier og ressurser, noe som kan føre til hendelser som proteinaggregering, aktivering av cellestressveier og død27. Dermed er det generelt lurt å begrense transgenuttrykk til ikke-toksiske nivåer (med mindre det selvfølgelig er intensjonen med transgenuttrykk), vurdert ved hjelp av markører for cellestress og celledød. En tredje advarsel er at i noen innstillinger kan langsiktig adenovirusuttrykk utløse immunresponser28. Selv om det ikke er holdepunkter for at adenoviral transduksjon av urotelet i seg selv stimulerer immunrespons10, er dette transgenavhengig og som nevnt ovenfor fører CLDN2-overekspresjon til blærekatarr.

For tiden har etterforskere en rekke metoder som de kan bruke til å modulere gen- og proteinuttrykk i urotelet, inkludert bruk av transgene eller betingede urotelial knockoutmus, bruk av transfeksjonsreagenser eller bruk av adenoviral transduksjon. Den sistnevnte metoden, emnet for denne protokollen, er relativt enkel, effektiv og reproduserbar. Annet enn den opprinnelige kostnaden av cellekulturreagenser som trengs for å generere virusbestandene, resulterer den svært store mengden virus som produseres (nok til å utføre hundrevis av transduksjoner), i en relativt lav kostnad per dyr. Adenoviral transduksjon kan utnyttes til å studere urotelbiologi. For eksempel ble adenoviral transduksjon brukt til å definere betydningen av Rho-familie og Rab-familie GTPaser, guanin-nukleotidutvekslingsfaktorer, myosinmotorfragmenter og ADAM17 i eksocytose og endocytose 10,19,20,21,22, og adenoviral transduksjon ble nylig brukt til å studere urotelial mekanotransduksjon9 . På samme måte kan adenoviral transduksjon være relevant ved utforskning og behandling av menneskelig sykdom. For eksempel kan Ramesh et al. opprinnelig foreslått adenoviral transduksjon være en nyttig måte å målrette tumorceller18. Mens deres studier var mer en proof-of-principle tilnærming, kan man forestille seg at uttrykk for toksiner i kreftceller eller uttrykk av epitoper som kan gjenkjennes av immunsystemet, ville være nyttige strategier. Adenoviral transduksjon kan også være nyttig for å forstå sykdommer der overekspresjon eller underekspresjon av genprodukter fører til sykdom. Som et eksempel viser biopsier fra blærene til pasienter med interstitiell cystitt en 90 ganger økning i CLDN2-uttrykk 29. Interessant, overuttrykkende CLDN2 ved hjelp av adenoviral transduksjon replikerer mange av symptomene på denne sykdommen hos rotter10. Dermed kan CLDN2 være et mål i behandlingen av pasienter med denne lidelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en pilotprosjektpris gjennom P30DK079307 (til M.G.D.), NIH grant R01DK119183 (til GA og MDC), NIH grant R01DK129473 (til GA), en American Urology Association Career Development award og et Winters Foundation-stipend (til NM), av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), og av S10OD028596 (til GA), som finansierte innkjøpet av konfokalsystemet som ble brukt til å fange noen av bildene som presenteres i dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Tags

Biologi utgave 188
Ekspresjon av transgener i naturlig blære urotel ved bruk av adenovirusmediert transduksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter