Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एडेनोवायरस-मध्यस्थता पारगमन का उपयोग करके मूल मूत्राशय यूरोथेलियम में ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

पुनः संयोजक एडेनोवायरस की बड़ी मात्रा की पीढ़ी के लिए विधियों का वर्णन किया गया है, जिसका उपयोग तब देशी कृंतक यूरोथेलियम को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जा सकता है जो ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति या अंतर्जात जीन उत्पादों के डाउनरेग्यूलेशन की अनुमति देता है।

Abstract

एक उच्च प्रतिरोध बाधा बनाने के अलावा, गुर्दे की श्रोणि, मूत्रवाहिनी, मूत्राशय और समीपस्थ मूत्रमार्ग को अस्तर करने वाले यूरोथेलियम को अंतर्निहित ऊतकों को अपने पर्यावरण के बारे में जानकारी को समझने और प्रसारित करने के लिए परिकल्पित किया जाता है, जिससे शून्यता कार्य और व्यवहार को बढ़ावा मिलता है। यूरोथेलियल बाधा, या इसके संवेदी / ट्रांसड्यूसर फ़ंक्शन का विघटन, बीमारी का कारण बन सकता है। इन जटिल घटनाओं का अध्ययन यूरोथेलियम में जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति को बदलने के लिए सरल रणनीतियों की कमी से बाधित होता है। विधियों का वर्णन यहां किया गया है जो जांचकर्ताओं को बड़ी मात्रा में उच्च-टिटर एडेनोवायरस उत्पन्न करने की अनुमति देते हैं, जिसका उपयोग तब उच्च दक्षता के साथ कृंतक यूरोथेलियम को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जा सकता है, और अपेक्षाकृत सरल तरीके से। सीडीएनए और छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए दोनों को एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके व्यक्त किया जा सकता है, और यूरोथेलियल फ़ंक्शन पर ट्रांसजेन अभिव्यक्ति के प्रभाव का आकलन 12 घंटे से कई दिनों बाद किया जा सकता है। माउस या चूहे पशु मॉडल का उपयोग करके सामान्य और असामान्य यूरोथेलियल जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए इन विधियों की व्यापक प्रयोज्यता है।

Introduction

यूरोथेलियम विशेष उपकला है जो गुर्दे की श्रोणि, मूत्रवाहिनी, मूत्राशय और समीपस्थ मूत्रमार्ग1 को रेखाबद्ध करता है। इसमें तीन स्तर शामिल हैं: अत्यधिक विभेदित और ध्रुवीकृत अक्सर द्वि-न्यूक्लियेट छाता कोशिकाओं की एक परत, जिनकी एपिकल सतहों को मूत्र में स्नान किया जाता है; द्वि-न्यूक्लियेट पारगमन-प्रवर्धक कोशिकाओं की आबादी के साथ एक मध्यवर्ती कोशिका परत जो उनके तीव्र नुकसान के जवाब में सतही छाता कोशिकाओं को जन्म दे सकती है; और बेसल कोशिकाओं की एक एकल परत, जिनमें से एक उप-समूह स्टेम कोशिकाओं के रूप में कार्य करता है जो पुरानी चोट के जवाब में यूरोथेलियम की संपूर्णता को पुनर्जीवित कर सकता है। छाता कोशिकाएं मुख्य रूप से उच्च-प्रतिरोध यूरोथेलियल बाधा बनाने के लिए जिम्मेदार होती हैं, जिनमें से घटकों में पानी और विलेय के लिए कम पारगम्यता के साथ एक एपिकल झिल्ली (कोलेस्ट्रॉल और सेरेब्रोसाइड में समृद्ध) और एक उच्च प्रतिरोध एपिकल जंक्शनल कॉम्प्लेक्स (तंग जंक्शन, पालन जंक्शन, डेस्मोसोम और एक संबंधित एक्टोमायोसिन रिंग शामिल) शामिल हैं। . छाता कोशिका की एपिकल सतह और इसकी जंक्शन रिंग दोनों मूत्राशय भरने के दौरान फैलते हैं और 1,2,3,4,5 को शून्य करने के बाद तेजी से अपनी पूर्व-भरी स्थिति में लौट आते हैं। बैरियर फ़ंक्शन में इसकी भूमिका के अलावा, यूरोथेलियम को संवेदी और ट्रांसड्यूसर कार्यों के लिए भी परिकल्पित किया जाता है जो इसे बाह्य परिवेश (जैसे, खिंचाव) में परिवर्तन को समझने की अनुमति देता है और मध्यस्थों (एटीपी, एडेनोसिन और एसिटाइलकोलाइन सहित) की रिहाई के माध्यम से इस जानकारी को अंतर्निहित ऊतकों तक पहुंचाता है, जिसमें सबरोथेलियल अभिवाही तंत्रिका प्रक्रियाएं 6,7,8 शामिल हैं। . इस भूमिका के हालिया सबूत चूहों में पाए जाते हैं जिनमें पीज़ो 1 और पीज़ो 2 दोनों की यूरोथेलियल अभिव्यक्ति की कमी होती है, जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तित शून्यीकरण फ़ंक्शन9 होता है। इसके अतिरिक्त, छाता कोशिका परत में तंग-जंक्शन छिद्र बनाने वाले प्रोटीन सीएलडीएन 2 को अतिरंजित करने वाले चूहों में अंतरालीय सिस्टिटिस10 वाले रोगियों में देखी गई सूजन और दर्द विकसित होता है। ट्रांसड्यूसर या बैरियर फ़ंक्शन का विघटन कई मूत्राशयविकारों में योगदान कर सकता है 6,11.

सामान्य और रोग राज्यों में यूरोथेलियम के जीव विज्ञान की बेहतर समझ उपकरणों की उपलब्धता पर निर्भर करती है जो जांचकर्ताओं को आसानी से अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति को कम करने या देशी ऊतक में ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति की अनुमति देने की अनुमति देगी। जबकि जीन अभिव्यक्ति को डाउनरेगुलेट करने का एक दृष्टिकोण सशर्त यूरोथेलियल नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करना है, यह दृष्टिकोण फ्लोक्स्ड एलील्स वाले चूहों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, श्रम गहन है, और12 को पूरा करने में महीनों से लेकर वर्षों तक का समय लग सकता है। आश्चर्य की बात नहीं है, जांचकर्ताओं ने यूरोथेलियम को स्थानांतरित या ट्रांसड्यूस करने के लिए तकनीकें विकसित की हैं, जिससे कम समय के पैमाने पर परिणाम हो सकते हैं। अभिकर्मक के लिए प्रकाशित तरीकों में धनिक लिपिड13, एंटी-सेंस फॉस्फोरोथियोटेड ऑलिगोडीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स14, या एंटीसेंस न्यूक्लिक एसिड का उपयोग शामिल है जो एचआईवी टीएटी प्रोटीन पेनिट्रेटिंग 11-मेर पेप्टाइड15 से जुड़ा हुआ है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का फोकस एडेनोवायरल-मध्यस्थता पारगमन के उपयोग पर है, एक अच्छी तरह से अध्ययन की गई पद्धति जो कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में जीन वितरण में कुशल है, का कई नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया गया है, और हाल ही में इसका उपयोग कोविड-19 वैक्सीन16 के एक संस्करण के प्राप्तकर्ताओं को कोविड-19 कैप्सिड प्रोटीन एन्कोडिंग करने वाले सीडीएनए को वितरित करने के लिए किया गया था। 17. एडेनोवायरस जीवन चक्र, एडेनोवायरल वैक्टर और एडेनोवायरस के नैदानिक अनुप्रयोगों के अधिक गहन विवरण के लिए, पाठक कोसंदर्भ 17 के लिए निर्देशित किया जाता है।

यूरोथेलियम को ट्रांसड्यूस करने के लिए एडेनोवायरस के उपयोग में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर, रमेश एट अल की एक रिपोर्ट थी, जिसमें डिटर्जेंट के साथ छोटे पूर्वउपचार दिखाए गए थे, जिसमें एन-डोडेसिल-β-डी-माल्टोसाइड (डीडीएम) शामिल थे, जो एडेनोवायरस एन्कोडिंग β-गैलेक्टोसिडेज18 द्वारा यूरोथेलियम के पारगमन को नाटकीय रूप से बढ़ाते थे। एक गाइड के रूप में इस प्रमाण-सिद्धांत अध्ययन का उपयोग करते हुए, यूरोथेलियम के एडेनोवायरल-मध्यस्थता पारगमन का उपयोग अब विभिन्न प्रकार के प्रोटीनों को व्यक्त करने के लिए किया गया है, जिसमें आरएबी-परिवार जीटीपेस, गुआनिन-न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक, मायोसिन मोटर टुकड़े, छिद्र बनाने वाले तंग जंक्शन से जुड़े क्लॉडिन और एडीएएम 17 10,19,20,21,22 शामिल हैं। . उसी दृष्टिकोण को छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (सीआरएनए) को व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसके प्रभावों को ट्रांसजीन22 के सीआरएनए-प्रतिरोधी वेरिएंट को सह-व्यक्त करके बचाया गया था। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में बड़ी मात्रा में अत्यधिक केंद्रित एडेनोवायरस उत्पन्न करने के सामान्य तरीके शामिल हैं, जो इन तकनीकों के लिए एक आवश्यकता है, साथ ही उच्च दक्षता के साथ यूरोथेलियम में ट्रांसजेन व्यक्त करने के लिए रमेश एट अल .18 के तरीकों के अनुकूलन भी शामिल हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

एडेनोवायरस की पीढ़ी से जुड़े प्रयोग, जिसके लिए बीएसएल 2 प्रमाणन की आवश्यकता होती है, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा कार्यालयों और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति से अनुमोदन के तहत किए गए थे। एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन (जिसके लिए एबीएसएल 2 प्रमाणन की आवश्यकता होती है) सहित किए गए सभी पशु प्रयोगों को प्रयोगशाला जानवरों की मानवीय देखभाल और उपयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति और पशु कल्याण अधिनियम के प्रासंगिक दिशानिर्देशों / विनियमों के अनुसार और पिट्सबर्ग संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय के अनुमोदन के तहत किया गया था। पुनः संयोजक वायरस से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं के लिए दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और उचित पोशाक पहनी जाती है। किसी भी तरल या ठोस कचरे का निपटान नीचे वर्णित के रूप में किया जाना चाहिए। पारगमन के बाद जानवरों के बिस्तर, और किसी भी परिणामस्वरूप पशु शवों को जैव-खतरनाक सामग्री के रूप में माना जाना चाहिए और संस्थागत नीतियों के अनुसार निपटाया जाना चाहिए।

1. उच्च-टिटर एडेनोवायरस स्टॉक की तैयारी

नोट: कृंतक मूत्राशय का प्रभावी पारगमन शुद्ध और केंद्रित वायरल स्टॉक के उपयोग पर निर्भर करता है, आमतौर पर 1 x 107 से 1 x 108 संक्रामक वायरल कण (आईवीपी) प्रति μL। प्रोटोकॉल का यह हिस्सा मौजूदा वायरस तैयारियों से उच्च-टिटर एडेनोवायरस स्टॉक उत्पन्न करने पर केंद्रित है। बाँझ अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग करके सभी चरणों को सेल कल्चर हुड में किया जाना चाहिए। जबकि आज उपयोग किए जाने वाले एडेनोवायरस के उपलब्ध उपभेद प्रतिकृति दोषपूर्ण हैं, अधिकांश संस्थानों को एडेनोवायरस और पुनः संयोजक डीएनए का उपयोग करने के लिए अनुमोदन की आवश्यकता होती है। इसमें अक्सर एडेनोवायरस का उत्पादन और विस्तार करने के लिए बीएसएल 2 अनुमोदित सुविधा के रूप में सेल कल्चर रूम का पदनाम शामिल होता है। कुछ सामान्य विचारों में वायरस उत्पादन और शुद्धिकरण के सभी चरणों में मास्क, आंखों की सुरक्षा, दस्ताने और उचित पोशाक का उपयोग शामिल है। सेंट्रीफ्यूजेशन करते समय, सुरक्षा कैप की सिफारिश की जाती है यदि सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में तंग फिटिंग कैप की कमी होती है। संभावित रूप से दूषित सेंट्रीफ्यूज सुरक्षा कैप, बोतलों और रोटर सहित सभी गैर-डिस्पोजेबल सामग्रियों को एंटीवायरल समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इलाज किया जाता है, और फिर पानी या 70% इथेनॉल से धोया जाता है। तरल अपशिष्ट को 10% (v / v) की अंतिम सांद्रता में ब्लीच जोड़कर इलाज किया जाता है। इन तरल अपशिष्टों का निपटान संस्थागत नीतियों पर निर्भर करेगा। ठोस कचरे को आमतौर पर जैव-खतरनाक कचरे में निपटाया जाता है।

  1. संस्कृति HEK293T कोशिकाएँ
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में एचईके 293 टी कोशिकाओं की जमी हुई शीशी को पिघलाएं और कोशिकाओं को 15 सेमी व्यास सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करने के लिए 5 एमएल पिपेट का उपयोग करें। 25 एमएल पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे डिश में 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक (डीएमईएम-एफबीएस-पीएस) युक्त डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) के 20 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को 5% (v/v) CO2 के साथ गैसीकृत 37 डिग्री सेल्सियस सेल-कल्चर इनक्यूबेटर में तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि वे 80% -90% संगम (~ 2 x 10 7 कोशिकाओं) तक नहीं पहुंचजाते ।
    2. वैक्यूम स्रोत से जुड़े ग्लास पिपेट का उपयोग करके, माध्यम को एस्पिरेटेड करें, और फिर 25 एमएल पिपेट का उपयोग करके डिश में 20 एमएल बाँझ पीबीएस (2.7 एमएम केसीएल, 1.5 एमएम केएच2पीओ4, 136.9 एमएम एनएसीएल, और 8.9 एमएम एनए2एचपीओ4) को स्थानांतरित करके कोशिकाओं को कुल्ला करें। खर्च किए गए पीबीएस को एस्पिरेट करें, और फिर डिश में 3 एमएल गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) प्रोटीन समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) को स्थानांतरित करने के लिए 5 एमएल पिपेट का उपयोग करें, सेल-कल्चर इनक्यूबेटर में डिश को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं अलग न हो जाएं (~ 3-4 मिनट)।
      नोट: प्रभावी प्रोटियोलिसिस का सबसे अच्छा मूल्यांकन डिश के सभी हिस्सों से कोशिकाओं की रिहाई की तलाश में धीरे-धीरे आगे और पीछे झुकाकर किया जा सकता है। HEK293T कोशिकाएं विस्तारित प्रोटीन उपचार के प्रति संवेदनशील होती हैं और यदि प्रोटीन के घोल में कुछ मिनट से अधिक समय तक छोड़ दिया जाए तो वे मर जाएंगी।
    3. अलग कोशिकाओं के पकवान में 7 एमएल डीएमईएम-एफबीएस-पीएस स्थानांतरित करने के लिए 10 एमएल पिपेट का उपयोग करें, और फिर कोशिकाओं और माध्यम को एस्पिरेट करने के लिए उसी पिपेट का उपयोग करें। निलंबित कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और फिर 5 मिनट के लिए 200 x g पर कम गति वाले नैदानिक सेंट्रीफ्यूज में निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करके कोशिकाओं को पेलेट करें। वैक्यूम स्रोत से जुड़े ग्लास पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। डीएमईएम-एफबीएस-पीएस के 15 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करने के लिए 25 एमएल पिपेट का उपयोग करें।
    4. डीएमईएम-एफबीएस-पीएस के 19 एमएल वाले पंद्रह 15 सेमी व्यंजनों में से प्रत्येक में सेल निलंबन का 1 एमएल जोड़ें।
    5. कोशिकाओं को एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में तब तक बढ़ाएं जब तक कि वे 85% -90% संगम (~ 3-4 दिन) तक न पहुंच जाएं।
  2. एक पतला वायरस समाधान तैयार करें
    1. एफबीएस या एंटीबायोटिक दवाओं कीकमी वाले डीएमईएम के 45 एमएल से भरे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में मौजूदा वायरस स्टॉक (5-10 आईवीपी / सेल) के ~ 1.5 x 10 9 से 3 x 109 आईवीपी जोड़ें।
      नोट: वायरस की कम सांद्रता (1-5 आईवीपी / सेल) का उपयोग करना संभव है; हालांकि, वायरस के उत्पादन में अधिक समय लगेगा।
  3. वायरस के साथ सुसंस्कृत कोशिकाओं को संक्रमित करें।
    1. वैक्यूम स्रोत से जुड़े ग्लास पिपेट का उपयोग करके, चरण 1.1.5 में लगभग कंफ्लुएंट कोशिकाओं से माध्यम को एस्पिरेट करें।
    2. प्रत्येक सेल-कल्चर डिश में 3.0 एमएल पतला वायरस समाधान (चरण 1.2.1 में तैयार) स्थानांतरित करने के लिए 25 एमएल पिपेट का उपयोग करें। फिर, प्रत्येक डिश में 7.0 एमएल डीएमईएम माध्यम (एफबीएस या एंटीबायोटिक दवाओं की कमी) जोड़ने के लिए 10 एमएल पिपेट का उपयोग करें। सेल-कल्चर इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर प्रत्येक डिश में 20% (वी / वी) एफबीएस और 2 एक्स पीएस युक्त डीएमईएम के 10 एमएल जोड़ें।
      नोट: नियंत्रण प्लेट के रूप में 15 व्यंजनों में से एक का उपयोग करना (जिसमें वायरस नहीं जोड़ा जाता है) अगले चरण में संक्रमित कोशिकाओं में वायरस-प्रेरित सेल राउंडिंग और मृत्यु की पहचान करना आसान बनाता है।
    3. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 2-4 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि उनमें से अधिकांश गोल होना शुरू न हो जाएं और >60% कोशिकाएं अलग न हो जाएं।
      नोट: यदि वायरस के कम टिटर का उपयोग कर रहे हैं, तो कोशिका मृत्यु होने में एक सप्ताह तक का समय लग सकता है। यदि कोशिका मृत्यु एक सप्ताह के भीतर नहीं होती है, तो यह संभावना है कि वायरस के उच्च टिटर का उपयोग करके प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए।
  4. सेल लाइसेट से वायरस को ठीक करें
    1. प्रत्येक डिश के तल को स्क्रैप करने के लिए एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करें, माध्यम में संलग्न कोशिकाओं को जारी करें।
    2. 25 एमएल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक सेल कल्चर डिश से माध्यम, कोशिकाओं और सेल मलबे को 50 एमएल शंक्वाकार सेल कल्चर ट्यूब में इकट्ठा और पूल करें।
      नोट: संसाधनों को बचाने के लिए, दो व्यंजनों से माध्यम को एक 50 एमएल ट्यूब में जोड़ा जा सकता है।
    3. कम गति वाले टेबल-टॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेलुलर सामग्री को छर्रों: 3,000 x g पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट। सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करने के लिए वैक्यूम डिवाइस से जुड़े ग्लास पिपेट का उपयोग करें।
    4. 10 mM EDTA (Tris-EDTA समाधान) युक्त बाँझ-फ़िल्टर किए गए 100 mM Tris-HCl pH 7.4 के कुल 7 एमएल में सभी परिणामी छर्रित सामग्री को समेकित करने के लिए ट्राइट्यूरेशन के साथ संयुक्त 10 एमएल पिपेट का उपयोग करें। पूल की गई सामग्री को बाँझ 15 एमएल सेल कल्चर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें।
      नोट: इस बिंदु पर, वायरस की तैयारी अनिश्चित काल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमी हुई हो सकती है।
  5. सेल लाइसेट तैयार करें
    1. शेष कोशिकाओं को बाधित करने के लिए तीन फ्रीज-पिघलना चक्र करें, और इस प्रकार गठित वायरस कणों को और मुक्त करें। तरल नाइट्रोजन (~ 30-60 एस) में ट्यूब को डुबोकर चरण 1.4.4 में पूल की गई सामग्री को फ्रीज करें। ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखकर नमूने को तेजी से पिघलाएं। भंवर 15 सेकंड के लिए नमूना, और फिर तेजी से ठंड और पिघलने की प्रक्रिया को अतिरिक्त 2x दोहराएं।
      नोट: पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस में वायरस के समाधान को तेजी से पिघलाया जा सकता है, लेकिन सावधानी बरतने की आवश्यकता है क्योंकि तापमान स्विंग ट्यूब को क्रैक करने का कारण बन सकता है, जिससे पानी के स्नान में वायरस का समाधान निकल सकता है। ऐसा होने से रोकने के लिए, वायरल सुपरनैटेंट युक्त ट्यूब को एक बड़ी ट्यूब में रखें, जिसे बाद में पानी के स्नान में सेट किया जाता है।
    2. एक सुपरस्पीड सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तीन बार फ्रीज-पिघले हुए सेलुलर सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए 10 एमएल पिपेट का उपयोग करें। ट्यूब में सामग्री को ~ 18,500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस सुपर-स्पीड सेंट्रीफ्यूज पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. 10 एमएल पिपेट के साथ ~ 7 एमएल वायरस युक्त सुपरनैटेंट को पुनर्प्राप्त करें और इसे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। अगले चरण तक बर्फ पर नमूने को बनाए रखें।
      नोट: इस बिंदु पर, एक नए वायरस की तैयारी (या बैकअप के रूप में) शुरू करने के लिए एक प्रस्तावना के रूप में अशुद्ध वायरल सुपरनैटेंट का एक एलिकोट रखने पर विचार करें। इस एलिकोट को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके वायरस को अलग और शुद्ध करें।
    1. 12 एमएल पीईटी पतली दीवार, स्पष्ट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब ( सामग्री की तालिका देखें) या समकक्ष में सीएससीएल का एक असंतुलित ढाल तैयार करें। ट्यूब के तल में 1.4 ग्राम / एमएल सीएसएल समाधान के 2.5 एमएल को सावधानीपूर्वक पेश करने के लिए 18 जी सुई के साथ तैयार किए गए 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करें, और फिर इसे 1.25 ग्राम / एमएल सीएसएल समाधान के 2.5 एमएल के साथ परत करने के लिए एक नई सिरिंज / सुई का उपयोग करें।
      नोट: पहले से मौजूद परत के शीर्ष पर सीधे समाधान छोड़ने से महत्वपूर्ण और अवांछित मिश्रण होगा। इसके बजाय, सुई के घुमावदार हिस्से को ट्यूब के किनारे पर रखें, और फिर बहुत धीरे-धीरे सिरिंज प्लंजर दबाएं, सुई की स्थिति को ऊपर उठाएं क्योंकि घोल ट्यूब को भर देता है।
    2. 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके एक समान तरीके से ढाल के शीर्ष पर ~ 7 एमएल वायरल सुपरनैटेंट लोड करें। यदि वायरल सुपरनैटेंट और ट्यूब के शीर्ष के बीच 2-3 मिमी से अधिक जगह है, तो ट्यूब को भरने के लिए अतिरिक्त ट्रिस-ईडीटीए समाधान जोड़ें जब तक कि केवल 2-3 मिमी जगह न बचे।
    3. इसी तरह तैयार बैलेंस ट्यूब बनाएं, जिसमें सीएससीएल की परतें हों, लेकिन वायरल सुपरनैटेंट के लिए ट्रिस-ईडीटीए समाधान को प्रतिस्थापित करें।
      नोट: अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में संभावित खतरनाक असंतुलित लोड स्थिति को रोकने के लिए दो ट्यूबों में समान वजन (और समान घनत्व) होना चाहिए।
  7. दर-जोनल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके वायरस को अलग करें।
    1. चरण 1.6.2-1.6.3 में गठित ग्रेडिएंट को एसडब्ल्यू 41 रोटर या समकक्ष की बाल्टी में लोड करें। बकेट कैप्स में स्क्रू, रोटर को एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज (4 डिग्री सेल्सियस तक प्रीकूल्ड) में रखें, और ~ 150,000 x g पर 1 घंटे के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, नीचे दिए गए चरण 1.9.1 में वर्णित कॉलम को बराबर करें।
  8. पृथक वायरस कणों को पुनर्प्राप्त करें
    1. सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के अंत में, बाल्टी को रोटर से सावधानीपूर्वक अलग करें, और एक सेल-कल्चर हुड में, बाल्टी टोपी को हटा दें, और फिर ट्यूबों को हटा दें और उन्हें एक रैक में रखें।
    2. वायरस कणों से भरपूर बैंडेड सामग्री एकत्र करें, जो 1.25 ग्राम / एमएल और 1.4 ग्राम / एमएल सीएसएल समाधान के बीच इंटरफ़ेस पर तैरता है। सेल कल्चर डिश के निचले आधे हिस्से पर ढाल युक्त ट्यूब को पकड़ते हुए (जो किसी भी बिखरे हुए पदार्थ को पकड़ लेगा), बैंडेड वायरस के ठीक नीचे ट्यूब को सावधानीपूर्वक पंचर करने के लिए 3 एमएल सिरिंज से जुड़ी 1 इंच 18 ग्राम सुई का उपयोग करें। धीरे-धीरे वायरस को एस्पिरेट करें, जो आमतौर पर ~ 1 एमएल में पुनर्प्राप्त होता है।
    3. ट्यूब से सुई को हटा दें, जिसके परिणामस्वरूप ढाल में शेष सामग्री ट्यूब से सेल-कल्चर डिश के निचले आधे हिस्से में बह जाएगी (किसी भी तरल पदार्थ को खतरनाक अपशिष्ट के रूप में माना जाना चाहिए)।
    4. सिरिंज में वायरस के घोल को बर्फ पर एक बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: इस चरण में वायरस को ठीक करते समय, सुई को इस तरह रखें कि सुई का लुमेन वायरस युक्त बैंड से कुछ मिमी नीचे खुलने वाली सुई के साथ ऊपर की ओर हो। अनुचित रूप से इकट्ठे वायरस के पतले बैंड द्वारा संदूषण से बचें जो कभी-कभी बैंड किए गए वायरस से 2-3 मिमी ऊपर देखा जाता है ( चित्रा 1 ए में पतला काला तीर देखें)।
  9. जेल निस्पंदन द्वारा नमूने से सीएससीएल निकालें।
    1. पीडी -10 कॉलम (सेफाडेक्स जी -25 एम के साथ पूर्व-पैक) को एक समर्थन स्टैंड पर दबा दिया जाता है, जिसमें 50 एमएल 0.2 μm बाँझ-फ़िल्टर किए गए पीबीएस होते हैं जिसमें 10% (v / v) ग्लिसरॉल होता है।
      नोट: प्रारंभिक संतुलन चरण को पूरा करने में 2-3 घंटे लगते हैं और स्तंभ को स्थिर करने के लिए निर्माता द्वारा उपयोग किए जाने वाले परिरक्षकों के पूर्ण वॉशआउट को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।
    2. धोने के घोल को फ्रिट (कॉलम माध्यम के शीर्ष पर सफेद सामग्री की एक सुरक्षात्मक डिस्क) के नीचे उतरने दें, और फिर चरण 1.8 में एकत्र किए गए शुद्ध वायरस समाधान को कॉलम के शीर्ष पर सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। वायरस युक्त घोल को फ्रिट के नीचे उतरने दें, और फिर पीबीएस-ग्लिसरॉल के साथ कॉलम भरना शुरू करें।
      नोट: फ्रिट का एक कार्य कॉलम को सूखने से रोकना है। नतीजतन, कॉलम में अधिक एलुएंट जोड़ने से पहले छोटी देरी को सहन किया जाता है।
    3. 12 बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एलुएट एकत्र करें, 0.5 एमएल प्रति अंश।
  10. वायरल उपज निर्धारित करें।
    1. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करके पीक वायरस अंशों का निर्धारण करें। पीबीएस में प्रत्येक अंश का 1:100 कमजोर पड़ना तैयार करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में ओडी260 को मापें, अकेले बफर के 1:100 कमजोर पड़ने का उपयोग करके। वायरस के कणों को शून्य मात्रा में फैलना चाहिए, जो अंश 6 के आसपास शुरू होता है। उच्चतमOD 260 रीडिंग वाले अंशों को पूल करें।
    2. पूल किए गए वायरल अंशों का 1:100 कमजोर पड़ना बनाएं और ओडी260 को फिर से मापें। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके पूल किए गए अंशों में वायरस कणों की अंतिम एकाग्रता और आईवीपी की संख्या की गणना करें: वायरस कण प्रति एमएल = ओडी260 × 100 (यह कमजोर पड़ने वाले कारक के लिए सही है) × 1012। एक सामान्य अनुमान यह है कि वायरस के कणों का 1% आईवीपी है, जैसे: IVP / mL = OD260 × 100 ×10 10 या IVP / μL = OD260 × 100 × 107।
  11. एलिकोट वायरस अंशों (जिसमें 5 x 107 से 1 x 108 IVP होता है) को बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब या क्रायोवियल्स में विभाजित करें। नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. कृंतक मूत्राशय का पारगमन

नोट: यदि इस तकनीक के लिए नया है, तो यह अनुशंसा की जाती है कि एक समय में ट्रांसड्यूस किए गए जानवरों की संख्या 2-4 तक सीमित हो। यह प्रत्येक जानवर के लिए शुरुआती समय को चौंकाकर पूरा किया जा सकता है, विशेष रूप से चरण 2.2 में डिटर्जेंट उपचार के दौरान, और फिर चरण 2.3 में वायरस इनक्यूबेशन। अनुभवी जांचकर्ता एक समय में छह जानवरों तक पारगमन कर सकते हैं।

  1. मूत्राशय को कैथेटरीकृत करें
    1. 6 जे चूहों (आमतौर पर 8-10 सप्ताह, ~ 20-25 ग्राम) या मादा स्प्राग डॉवले चूहों (आमतौर पर 2-3 महीने, ~ 250 ग्राम) को संलग्न नाक शंकु के साथ वेपोराइज़र का उपयोग करके एनेस्थेटाइज करें। चूहों के लिए 3.0% (v/v) आइसोफ्लुरेन, 97% (v/v) O2 या चूहों के लिए 4.0% (v/v) आइसोफ्लुरेन, 96% (v/v) O2 का उत्पादन करने के लिए वेपोराइज़र को कैलिब्रेट करें। पुष्टि करें कि जानवरों को यह सुनिश्चित करके एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है कि वे पैर की अंगुली चुटकी (आमतौर पर 1-2 मिनट के बाद) के प्रति अनुत्तरदायी हैं।
    2. जानवरों को गर्म पैड पर रखकर जानवर के शरीर के तापमान को बनाए रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल के दौरान जानवर की निगरानी करें कि जानवरों को एनेस्थेटाइज्ड किया गया है और इस प्रक्रिया के दौरान किसी भी दर्द का अनुभव नहीं होता है।
    3. चूहों के लिए आइसोफ्लुरेन को 1.5% (v / v) या चूहों के लिए 2.0% (v / v) तक कम करें और प्रोटोकॉल की अवधि के लिए संज्ञाहरण के तहत जानवरों को बनाए रखें।
    4. मूत्राशय में हवा को पेश करने से रोकने के लिए, एक आईवी कैथेटर के प्लास्टिक कैथेटर भाग को भरें ( सामग्री की तालिका देखें) और एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके बाँझ पीबीएस के साथ संबद्ध हब।
    5. लापरवाह स्थिति में जानवर के साथ, बाहरी मीटस को 70% अल्कोहल के साथ स्वैब करें, और बाँझ कैथेटर को बाहरी मीटस, फिर मूत्रमार्ग और फिर मूत्राशय में डालें।
      1. इस कार्य को करने के लिए, बाहरी मांस बनाने वाले ऊतक को धीरे से पकड़ने के लिए बारीक बल का उपयोग करें और इसे जानवर से दूर लंबवत रूप से विस्तारित करें। दूसरी ओर, सावधानीपूर्वक कैथेटर को मूत्रमार्ग मीटस (योनि के उद्घाटन के ठीक ऊपर मांस का एक टीला) में लगभग 3-4 मिमी लंबवत रूप से डालें। फिर, मूत्रमार्ग में एक मोड़ के कारण, कैथेटर को नीचे करें, बाहरी मीटस में डाला गया, जानवर की पूंछ की ओर, जो मूत्रमार्ग के उस हिस्से में इसके प्रवेश को आसान बनाता है जो जघन हड्डी के नीचे से गुजरता है, और अंततः मूत्राशय में
        . नोट: विशेष रूप से माउस के मामले में, कैथेटर बहुत लंबा हो सकता है, और इससे अधिक 1.0-1.1 सेमी जानवर में नहीं डाला जाना चाहिए। अन्यथा, मूत्राशय के श्लेष्म को नुकसान होगा। इसे रोकने के लिए, कैथेटर ~ 1 सेमी को इसकी नोक से नीचे चिह्नित करें, और फिर इस अंकन से परे कैथेटर न डालें।
    6. मूत्राशय में मूत्र को बाहर निकलने दें। क्रेडे के पैंतरेबाज़ी करके किसी भी अवशिष्ट मूत्र को हटा दें: मालिश करें और निचले पेट क्षेत्र में मूत्राशय के बंप पर धीरे से दबाएं।
  2. यूरोथेलियम को डिटर्जेंट समाधान के साथ इलाज करके पारगमन के लिए ग्रहणशील बनाएं।
    1. कैथेटर हब में पीबीएस से भरे बाँझ 1 एमएल सिरिंज को संलग्न करके माउस या चूहे के मूत्राशय को धोएं। माउस मूत्राशय में बाँझ पीबीएस के 100 μL इंजेक्ट करें (या चूहे के मूत्राशय के मामले में 450 μL)। कैथेटर फिटिंग से सिरिंज को अलग करें और पीबीएस को नाली की अनुमति दें। यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त मूत्राशय के तरल पदार्थ को हटाने के लिए क्रेड का पैंतरेबाज़ी करें।
    2. एक बाँझ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके माउस मूत्राशय में 0.1% (डब्ल्यू / वी) एन-डोडेसिल-β-डी-माल्टोसाइड (डीडीएम) (पीबीएस में घुला हुआ और 0.2 एम फिल्टर-स्टरलाइज़्ड) का 100 μL डालें। सिरिंज को जगह पर छोड़कर 10 मिनट के लिए मूत्राशय में डीडीएम बनाए रखें। चूहों में, डीडीएम की मात्रा 450 μL तक बढ़ जाती है।
    3. सिरिंज को अलग करके और इसे बाहर निकालने की अनुमति देकर मूत्राशय से डीडीएम को हटा दें। यदि आवश्यक हो तो क्रेड का पैंतरेबाज़ी करें।
  3. मूत्राशय में वायरस का परिचय दें।
    1. कैथेटर हब में एक बाँझ 1 एमएल सिरिंज संलग्न करें और मूत्राशय में एडेनोवायरस के 0.5 x 107 से 1 x 108 आईवीपी (चरण 1 में तैयार), चूहों के लिए बाँझ पीबीएस के 100 μL में पतला या चूहों के लिए 450 μL डालें। वायरस के घोल को बाहर निकलने से रोकने के लिए कैथेटर से जुड़ी सिरिंज को छोड़ दें।
    2. 30 मिनट के बाद, सिरिंज को अलग करें और वायरस के घोल को डिस्पोजेबल पैड पर मूत्राशय को खाली करने की अनुमति दें। किसी भी अवशिष्ट वायरस के घोल को एक शोषक पोंछ के साथ ब्लोट करें, और पैड को छोड़ दें और बायोहाजर्दस कचरे में पोंछ दें।
      नोट: ग्लिसरॉल साइटोटोक्सिक है। जैसे, चूहों में डाले गए वायरस समाधान की अधिकतम मात्रा 5 μL तक सीमित है (जिसे जब पीबीएस के 100 μL में पतला किया जाता है तो इसके परिणामस्वरूप ~ 0.5% [v / v] की अंतिम ग्लिसरॉल एकाग्रता होती है)। इसके अतिरिक्त, संक्रमित आईवीपी की संख्या में वृद्धि करके और वायरस के इनक्यूबेशन को 45 मिनट तक बढ़ाकर पारगमन दक्षता को बढ़ाना संभव है।
    3. वैकल्पिक चरण: मूत्राशय को पीबीएस के साथ धोया जा सकता है जैसा कि ऊपर चरण 2.2.1 में वर्णित है; हालाँकि, यह आवश्यक नहीं है।
  4. जानवर को ठीक होने दें।
    1. आइसोफ्लुरेन के प्रवाह को रोकें और जानवर को अपने पिंजरे में वापस करने से पहले ठीक होने और पूरी तरह से गतिशील होने की अनुमति दें, खासकर अगर जानवरों को समूह में रखा गया है।
      नोट: चूंकि वायरस ट्रांसडक्शन प्रति से अवलोकन योग्य निचले मूत्र पथ के लक्षण या दर्द का कारण नहीं बनता है, आमतौर पर पोस्ट-सर्जिकल उपचार की कोई आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, यदि एन्कोडेड ट्रांसजीन विषाक्त है, तो पोस्ट-प्रक्रिया एनाल्जेसिया या एंटीबायोटिक्स संस्थान द्वारा आवश्यक रूप से आवश्यक हो सकते हैं।
  5. सीटू संकरण, पश्चिमी धब्बा, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस 9,10,23 में एमआरएनए जैसे तरीकों का उपयोग करके उपचार के बाद ट्रांसजीन अभिव्यक्ति 12-72 एच के प्रभावों का विश्लेषण करें (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

वायरस की तैयारी
घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा वायरस शुद्धिकरण का एक उदाहरण चित्र 1 ए में दिखाया गया है। लोडेड सेलुलर सामग्री और 1.25 ग्राम / एमएल सीएसएल परत के इंटरफ़ेस पर पाया जाने वाला हल्का गुलाबी बैंड, मुख्य रूप से बाधित कोशिकाओं और उनके मलबे से बना है ( चित्रा 1 ए में मैजेंटा तीर देखें)। यह प्रोटोकॉल में चरण 1.5 से ले जाए जाने वाले संस्कृति माध्यम की छोटी मात्रा से अपना गुलाबी रंग प्राप्त करता है। रुचि के वायरस कण, जो एक दूधिया सफेद बैंड के रूप में दिखाई देते हैं, 1.25 ग्राम / एमएल सीएससीएल और 1.40 ग्राम / एमएल सीएसएल समाधानों के इंटरफ़ेस पर पाए जाते हैं ( चित्रा 1 ए में पीला तीर देखें)। कोई सामग्री का एक बैंड भी देख सकता है जो समृद्ध वायरस कणों के ऊपर 2-3 मिमी तैरता है (चित्रा 1 ए में पतला काला तीर देखें)। इसमें बिना इकट्ठे हुए वायरस और मलबे शामिल हैं, इसमें कुछ आईवीपी होते हैं, और वायरस के नमूने एकत्र करते समय इससे बचा जाना चाहिए।

पीडी 10 कॉलम का उपयोग करके वायरस और बफर एक्सचेंज का आगे शुद्धिकरण चित्रा 1 बी में दर्शाया गया है, और क्षालन के बाद परिणामी अंशों के ओडी260 रीडिंग को चित्रा 1 सी में दिखाया गया है। इन स्तंभों का शून्य आयतन लगभग 3 एमएल है, और इस प्रकार वायरस अंश 6 में दिखाई देने लगता है और अंश 9 में चरम पर होता है। इस प्रयोग में, अंश 6-9 को पूल किया गया था। जबकि अंश 6 और 7 वायरस कणों में अपेक्षाकृत कम हैं, उनमें वसूली के लिए पर्याप्त वायरस होते हैं, और वे बहुत उच्च टिटर अंशों को अधिक उचित एकाग्रता में पतला करने का काम करते हैं। अंश 10-12 को शामिल नहीं किया गया था क्योंकि अंश 11 में ओडी260 में वृद्धि एक दूसरे दूषित शिखर की संभावित उपस्थिति को इंगित करती है, जो इन तैयारियों में अलग-अलग रूप से देखी जाती है। पूल किए गए अंश में आम तौर पर 1 x 107 से 1 x 108 IVP / μL होगा, और अपेक्षित उपज 1 x 10 10 से 2 x10 11 कुल IVP के क्रम में होगी। यह सैकड़ों पारगमन करने के लिए वायरस की पर्याप्त मात्रा है। जबकि प्लाक परख द्वारा या फ्लोरोसेंट प्रोटीन22 व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की कॉलोनियों की गिनती करके वायरस को टिटर करना संभव है, ज्यादातर मामलों में 1% नियम पर्याप्त है। इस नियम में कहा गया है कि नमूने के ओडी260 को मापकर अनुमानित शुद्ध वायरस कणों का 1% आईवीपी है। -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत वायरस के एलिकोट में 2-5 साल की शेल्फ-लाइफ होती है, हालांकि लंबे समय तक संक्रामकता कम हो जाती है। वायरस के पिघले हुए एलिकोट को संक्रामकता के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना एक बार -80 डिग्री सेल्सियस पर फिर से जमाया जा सकता है। हालांकि, बार-बार पिघलना और ठंड पड़ना वायरल संक्रामकता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है।

मूत्राशय पारगमन
पारगमन के प्रभाव का आकलन करते समय एक महत्वपूर्ण पहला कदम ट्रांसजेन अभिव्यक्ति की पुष्टि करना है। इसका मूल्यांकन कई तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसमें एमआरएनए (जैसे, आरएनएस्कोप), पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस 9,10,23 का उपयोग करने वाले उपकरण शामिल हैं। चित्रा 2 माउस यूरोथेलियम का एक उदाहरण है जिसे एक एडेनोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था जो वी 5-एपिटोप टैग किए गए मानव विकास हार्मोन (वी 5-एचजीएच) 23 को एन्कोड करता है। इस प्रोटीन को डिस्कोइडल / फ्यूसीफॉर्म पुटिकाओं में पैक किया जाता है और मूत्राशय भरने के दौरानएक्सोसाइटोसिस किया जा सकता है। यूरोथेलियल लाइसेट के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से ट्रांसड्यूस्ड मूत्राशय के यूरोथेलियम में वी 5-एचजीएच अभिव्यक्ति का पता चला, लेकिन अपरिवर्तित लोगों में नहीं (चित्रा 2 ए)। अभिव्यक्ति की पुष्टि इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा भी की गई थी, इस मामले में एंटीबॉडी का उपयोग करके जो एचजीएच या वी 5 एपिटोप टैग को पहचानते थे (अपरिवर्तित मूत्राशय में सिग्नल की कमी थी, नहीं दिखाया गया था) (चित्रा 2 बी)।

एक अतिरिक्त उदाहरण सीएलडीएन 2 को एन्कोडिंग करने वाले वायरस के साथ चूहे के मूत्राशय का पारगमन है, जो एक छिद्र बनाने वाला तंग जंक्शन-संबद्ध प्रोटीन24,25 है। सीएलडीएन 2 पिंजरों (के +सहित) के पैरासेल्युलर फ्लक्स को बढ़ाता है और इसके ओवरएक्प्रेशन के परिणामस्वरूप सूजन और आंत के दर्द का विकासहोता है। वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण ने एडेनोवायरस एन्कोडिंग Cldn2 के साथ ट्रांसड्यूस किए गए चूहे के मूत्राशय में CLND2 की अभिव्यक्ति की पुष्टि की, लेकिन नियंत्रण GFP-एन्कोडिंग वायरस (चित्रा 2C) के साथ ट्रांसड्यूस नहीं किया गया। सामान्य तौर पर, कोशिकाओं में व्यक्त होने पर जीएफपी को विषाक्त नहीं माना जाता है और इस प्रकार यह एक उपयोगी नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। जीएफपी का उपयोग अन्वेषक को यह पुष्टि करने की अनुमति देता है कि पारगमन काम कर रहा है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण ने आगे यूरोथेलियल छाता कोशिकाओं में बहिर्जात सीएलडीएन 2 अभिव्यक्ति की पुष्टि की, जो वायरस एन्कोडिंग Cldn2 cDNA (चित्रा 2 डी में लाल संकेत) के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। इसके अलावा, अंतर्जात सीएलडीएन 2 (नहीं दिखाया गया) के समान, व्यक्त सीएलडीएन 2 को टीजेपी 1-लेबल तंग जंक्शनों के साथ-साथ छाता कोशिकाओं की बेसोलेटरल सतहों के लिए स्थानीयकृत किया जाता है (सीएलडीएन 2 को चित्रा 2 ई में हरे रंग का लेबल दिया गया है)10। सीएलडीएन 2 अभिव्यक्ति के मामले में, यह पारगमन के एक दिन बाद उच्चतम था, लेकिन फिर पीछे हट गया, और 15 दिनों के बाद मुश्किल से पता लगाया जा सकता था।

एक दूसरा विचार यह है कि एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन द्वारा कौन से सेल प्रकारों को लक्षित किया जाएगा। जबकि चूहों में ज्यादातर छाता सेल परत19 को ट्रांसड्यूस करना संभव है, माउस में, यूरोथेलियम की सभी परतों को ट्रांसड्यूस किया जा सकता है, हालांकि मध्यवर्ती और बेसल सेल परतों का पारगमन परिवर्तनशील हो सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, मूत्राशय की दीवार की संपूर्णता में, केवल यूरोथेलियम को ट्रांसड्यूस किया जाता है और कोई अन्य ऊतक स्थापित एडेनोवायरस (चित्रा 3) द्वारा लक्षित नहीं होता है।

जबकि ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं का विश्लेषण एकल कोशिका स्तर पर किया जा सकता है, जब समग्र मूत्राशय फेनोटाइप की खोज की जाती है, तो किसी को यूरोथेलियल कोशिकाओं के बहुमत को ट्रांसड्यूस करना चाहिए। इस प्रकार, पारगमन की दक्षता को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है (यानी, यूरोथेलियल कोशिकाओं का कौन सा अंश ट्रांसड्यूस किया जाता है)। उदाहरण के लिए, Cldn2-व्यक्त एडेनोवायरस के मामले में, >95% छाता कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस किया गया था ( चित्रा 2 डी देखें)। एक अतिरिक्त उदाहरण चित्रा 3 में दिखाया गया छवि क्षेत्र है, जहां ट्रांसड्यूस्ड छाता कोशिकाओं की संख्या की गिनती (इस मामले में, सीए2 + सेंसर जीसीएएमपी 5 जी को व्यक्त करते हुए), एक दक्षता प्रकट करता है जो 95% तक पहुंचता है। हालांकि, ट्रांसडक्शन दक्षता का सटीक और निष्पक्ष अनुमान प्राप्त करने के लिए मूत्राशय की दीवार में यादृच्छिक क्षेत्रों में कोशिकाओं की जांच करनी चाहिए।

Figure 1
(ए) संक्रमित एचईके 293 टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित एडेनोवायरस कणों को 1.4 ग्राम / एमएल सीएसएल की एक परत, 1.25 ग्राम / एमएल सीएसएल की एक परत और ट्राइस-ईडीटीए समाधान में पतला नमूना (एस) की एक परत से बने असंतुलित सीएससीएल ढाल पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध किया गया था। सेलुलर सामग्री (गुलाबी तीर) एस / 1.25 इंटरफ़ेस पर जमा होती है, जबकि शुद्ध एडेनोवायरस 1.25/1.4 इंटरफ़ेस (पीला तीर) पर तैरता है। अनुचित रूप से इकट्ठे किए गए वायरस का एक छोटा बैंड उत्तरार्द्ध (पतला काला तीर) के ऊपर तैरता है। (बी) ढाल में एडेनोवायरस समृद्ध बैंड को सुई का उपयोग करके पुनर्प्राप्त किया जाता है, और सीएससीएल को जी 25 सेफाडेक्स से भरे पीडी 10 कॉलम का उपयोग करके जेल निस्पंदन द्वारा एडेनोवायरस से हटा दिया जाता है, जो 10.0% (वी / वी) ग्लिसरॉल युक्त पीबीएस के साथ समतुल्य होता है। सेफाडेक्स की सतह एक छिद्रपूर्ण, प्लास्टिक फ्रिट द्वारा संरक्षित है। (सी) अंश, 0.5 एमएल, पीडी 10 कॉलम से एकत्र किए गए थे। अंशों के ओडी260 को एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में मापा गया था और मूल्यों को प्लॉट किया गया था। वायरस से भरपूर अंश शून्य मात्रा में होते हैं, जो अंश 6 से शुरू होता है और अंश 9 तक फैला होता है। इस प्रतिनिधि प्रयोग के लिए पूल किए गए अंश नीले रंग में छायांकित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: V5-hGH या CLDN2 को एन्कोडिंग करने वाले एडेनोवायरस के साथ कृंतक मूत्राशय यूरोथेलियम का पारगमन। (A) माउस यूरोथेलियम को अपरिवर्तित (UT) छोड़ दिया गया था या V5 एपिटोप टैग किए गए मानव विकास हार्मोन (hGH) को एन्कोडिंग करने वाले एडेनोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। 24 घंटे के बाद, मूत्राशय को पुनर्प्राप्त किया गया, यूरोथेलियल लाइसेट तैयार किए गए और सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के अधीन किया गया, और वी 5-एचजीएच अभिव्यक्ति ने एचजीएच के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ जांच किए गए पश्चिमी धब्बों का उपयोग करके पुष्टि की। (बी) माउस यूरोथेलियम में वी 5-एचजीएच का पता लगाना एचजीएच (हरा) या वी 5 एपिटोप (लाल) और फ्लोरोफोरे-टैग किए गए द्वितीयक एंटीबॉडी के एंटीबॉडी का उपयोग करके वर्गीकृत और दाग दिया गया है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कैप्चर किया गया था। नाभिक को लेबल करने के लिए नमूने टीओ-प्रो 3 के साथ काउंटरस्टेन किए गए थे। (C-F) चूहे के यूरोथेलियम को एक नियंत्रण के रूप में चूहे सीएलडीएन 2 (सामान्य नाम क्लॉडिन -2) या जीएफपी (सामान्य नाम ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) को एन्कोडिंग करने वाले वायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। (ग) पश्चिमी सोख्ता द्वारा एक्सोजेनस सीएलडीएन2 का पता लगाना फिर से एक एंटीबॉडी का उपयोग करके। ध्यान दें कि अंतर्जात सीएलडीएन 2 निम्न स्तर पर व्यक्त किया जाता है और इस प्रयोग में इसका पता नहीं लगाया जाता है। (डी) छाता कोशिका परत का पारगमन इम्यूनोफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रकट होता है। कोशिका की सीमाओं को एफआईटीसी-फेलोइडिन के साथ ऊतक को सह-धुंधला करके प्रकट किया जाता है, जो कॉर्टिकल एक्टिन साइटोस्केलेटन को लेबल करता है। (ई) एक्सोजेनस सीएलडीएन 2 और टीजेपी 1 (सामान्य नाम जेडओ 1) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस और कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पूरे माउंटेड या क्रॉस-सेक्शनेड यूरोथेलियम का पता लगाना। छोटे सफेद तीर तंग जंक्शन के स्थान को इंगित करते हैं और छोटे मैजेंटा एरोहेड सेल साइटोप्लाज्म में सीएलडीएन 2 के इंट्रासेल्युलर संचय के स्थान को चिह्नित करते हैं। ये पहले गोल्गी से जुड़े सीएलडीएन 210 होने का खुलासा किया गया था। (च) पारगमन के बाद, जानवरों को संक्रमण के बाद संकेतित दिनों में इच्छामृत्यु दी गई थी। एक्सोजेनस सीएलडीएन 2 अभिव्यक्ति का पता पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके लगाया गया था। जीएफपी व्यक्त करने वाले जानवरों को पहले दिन के बाद इच्छामृत्यु दी गई थी। चित्रा 2 सी-ई में डेटा को मोंटलबेटी एट अल.10 से संशोधित किया गया है, और अमेरिकन फिजियोलॉजिकल सोसाइटी की अनुमति से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन की दक्षता। माउस मूत्राशय यूरोथेलियम को कैल्शियम सेंसर जीसीएएमपी 5 जी को एन्कोडिंग करने वाले एडेनोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। ऊपरी पैनल जीसीएएमपी 5 जी के लिए धुंधलापन दिखाते हैं (हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया गया; जीएफपी, हरा), मध्य पैनल डीएपीआई-दाग वाले नाभिक (नीले) और रोडामाइन-फेलोइडिन-लेबल एक्टिन (लाल) के वितरण को दिखाते हैं, और नीचे पैनल तीन संकेतों का विलय हैं। निचले पैनल में सफेद तीर के निशान दुर्लभ छाता कोशिकाएं हैं जो ट्रांसड्यूस नहीं होती हैं। इस छवि में छाता कोशिकाओं के पारगमन की समग्र दक्षता ~ 95% है। ध्यान दें कि केवल यूरोथेलियम ट्रांसड्यूस किया जाता है। बॉक्स किए गए क्षेत्रों को पैनलों में दाईं ओर बढ़ाया जाता है। बॉक्स 1 में क्षेत्र में मुख्य रूप से ट्रांसड्यूस्ड छाता कोशिकाएं शामिल हैं। बॉक्स 2 में क्षेत्र यूरोथेलियम है जो छाता कोशिकाओं के कुशल पारगमन को दर्शाता है, लेकिन अंतर्निहित सेल परतों का कम कुशल पारगमन करता है। एलपी = लैमिना प्रोप्रिया; एमई = मांसपेशियों का विस्तार; से = सेरोसा; यूटी = यूरोथेलियम। छवियों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

जबकि रमेश और अन्य मूत्राशय के कैंसर 18 के उपचार में एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करने के लिए रणनीतियों को विकसित करने पर केंद्रित थे, हाल की रिपोर्टों ने सामान्य यूरोथेलियल जीव विज्ञान / शरीर विज्ञान और पैथोफिज़ियोलॉजी 10,18,19,20,21 का अध्ययन करने में इन तकनीकों की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है। . इस दृष्टिकोण की महत्वपूर्ण विशेषताओं में निम्नलिखित शामिल हैं: (i) कृंतक मूत्राशय की दीवार की संपूर्णता में, केवल यूरोथेलियम को 10,19,20,21,22 ट्रांसड्यूस किया जाता है। चूहों के मामले में, पारगमन ज्यादातर छाता कोशिका परत तक सीमित होता है, जबकि चूहों में, यूरोथेलियम की संपूर्णता को लक्षित किया जा सकता है; (ii) इस दृष्टिकोण का उपयोग प्रोटीन या सिआरएनए10,19,20,21,22 को व्यक्त करने के लिए किया जा सकता है; (iii) पारगमन की दक्षता 70% -95% तक पहुंच सकती है (उदाहरण के लिए, चित्र 3)18,20 देखें; (iv) पारगमन के एक दिन बाद, यूरोथेलियम की अल्ट्रास्ट्रक्चर, ऊतक की अखंडता, एक उच्च प्रतिरोध बाधा की उपस्थिति (ट्रांस-एपिथेलियल प्रतिरोध को मापकर मूल्यांकन किया गया), और यूरोथेलियल भेदभाव मार्करों की अभिव्यक्ति "सामान्य" 10,19 है। अब तक नोट किया गया एकमात्र रूपात्मक प्रभाव छाता सेल व्यास में कमी है (जब ऊपर से देखा जाता है); हालांकि, वे 3-4 दिनों10,19 के बाद अपने सामान्य आकार में वापस आ जाते हैं; (v) यूरोथेलियम को एक साथ तीन अलग-अलग एडेनोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया जा सकताहै; (vi) ट्रांसजेन अभिव्यक्ति को आईवीपी की संख्या को कम करके बदला जा सकता है, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा को प्रभावित करता है, जानवर की बलि देने से पहले इनक्यूबेशन के समय को लंबा या छोटा करता है, या विभिन्न प्रमोटरों का उपयोग करता है जैसे टेट-विनियमित प्रणाली (टेट-ऑफ) 19। बाद के मामले में, कोई ट्रांसएक्टिवेटर / टेट-रिप्रेसर को एन्कोडिंग करने वाले वायरस को सह-व्यक्त कर सकता है, और फिर जानवर के आहार में डॉक्सीसाइक्लिन की एकाग्रता को बदलकर ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकता है।

जबकि समग्र प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें इन प्रयोगों को करते समय विचार किया जाना चाहिए। इनमें से एक उच्च-टिटर वायरस स्टॉक की उपलब्धता है जो उचित शुद्धता के हैं। एडेनोवायरस वाणिज्यिक विक्रेताओं से, संस्थागत वायरस उत्पादन कोर से, अन्य जांचकर्ताओं से प्राप्त किया जा सकता है, या उन्हें घर में उत्पादित किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध के मामले में, बर्ट वोगेलस्टीन प्रयोगशाला एडीईजी सिस्टम की सिफारिश की जाती है क्योंकि इसके घटकों को एडजीन से खरीदा जा सकता है, और इस दृष्टिकोण का उपयोग करके उत्पन्न एडेनोवायरस यूरोथेलियल ट्रांसडक्शन4 में अच्छी तरह से काम करते हैं। यह तकनीक किसी को पीएडीईजी -1 पैकेजिंग प्लास्मिड (इन्सर्ट वायरल जीन ई 1 और ई 3 को प्रतिस्थापित करता है), पीएडीईजीयर -1 बैक्टीरियल कोशिकाओं (जो वायरस का उत्पादन करने के लिए आवश्यक एडेनोवायरल जीन को एन्कोड करता है), और एचईके 293 टी कोशिकाओं में प्रतिकृति-दोषपूर्ण एडेनोवायरस का उत्पादन (जो आवश्यक वायरल ई 1 प्रोटीन को व्यक्त करता है) का उपयोग करके 8 केबी तक बड़े सीडीएनए को एन्कोडिंग करने वाले एडेनोवायरस उत्पन्न करने की अनुमति देता है। हालांकि, पीएडीईजी -2 पैकेजिंग प्लास्मिड के साथ पीएडीईजी -1 पैकेजिंग प्लास्मिड को प्रतिस्थापित करने से पैकेजिंग का आकार अतिरिक्त 2.7 केबी बढ़ जाता है, लेकिन एक अलग सेल लाइन (ई 1-रूपांतरित मानव भ्रूण रेटिना 911 कोशिकाओं) का उपयोग करने की आवश्यकता होती है क्योंकि वायरस में ई 1 और ई 3 4 के अलावा प्रारंभिक जीन ई4 की कमी होती है। एसआईआरएनए की अभिव्यक्ति को कई प्रणालियों का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है, जिसमें पीएडीलॉस भी शामिल है, जिसे कसाहारा एट अल.26 में विस्तार से वर्णित किया गया है। हालांकि यूरोथेलियम को ट्रांसड्यूस करने के लिए वायरस युक्त सेल कल्चर माध्यम का उपयोग करना संभव हो सकता है, यह विधि अविश्वसनीय हो सकती है। इसके बजाय, बड़े पैमाने पर वायरस प्रवर्धन, सीएससीएल ढाल शुद्धिकरण, इसके बाद जेल निस्पंदन बड़ी मात्रा में उच्च-टिटर वायरस उत्पन्न करने का सबसे विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। -80 डिग्री सेल्सियस पर वायरस की सापेक्ष स्थिरता, वायरस की अपेक्षाकृत बड़ी पैदावार के साथ मिलकर, इसे वायरस के लगातार स्टॉक के लिए एक आदर्श तरीका बनाती है जिसका उपयोग बड़ी संख्या में प्रयोगों में किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदमों में पारगमन प्रोटोकॉल से जुड़े लोग शामिल हैं। इनमें वाशिंग एजेंट और डिल्युएंट के रूप में पीबीएस (डिवेलेंट पिंजरों के बिना) का उपयोग और डीडीएम डिटर्जेंट का उपयोग शामिल है। चूंकि जंक्शनल कॉम्प्लेक्स उचित कार्य के लिए सीए2 + पर निर्भर है, पीबीएस संभवतः जंक्शन से जुड़े अवरोध को बाधित करके वायरल प्रविष्टि को बढ़ावा देता है। डीडीएम भी महत्वपूर्ण है; जैसा कि रमेश एट अल ने बताया, डिटर्जेंटउपचार की अनुपस्थिति में एडेनोवायरस पारगमन की दक्षता बहुत कम है। हालांकि, डिटर्जेंट की कार्रवाई का तरीका स्पष्ट नहीं है। डीडीएम के साथ 10 मिनट इनक्यूबेशन आदर्श है, लेकिन इसे 5 मिनट तक छोटा किया जा सकता है; हालांकि, यह अनुशंसा नहीं की जाती है कि इनक्यूबेशन 10 मिनट से आगे बढ़ें क्योंकि डिटर्जेंट अंतर्निहित ऊतकों को अप्रत्याशित नुकसान पहुंचा सकता है। उपयोग किए गए वायरस की मात्रा एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, जिसमें उच्च सांद्रता आम तौर पर ट्रांसजेन अभिव्यक्ति और उच्च पारगमन क्षमता की अधिक मात्रा की ओर ले जाती है। हालांकि, इष्टतम वायरस एकाग्रता जो अभिव्यक्ति, दक्षता और फेनोटाइप का सबसे अच्छा संयोजन देती है, को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। प्रारंभिक एकाग्रता के रूप में, प्रति पशु 5.0 x 106 से 2.0 x 107 IVP की सीमा की सिफारिश की जाती है। व्यक्त किए जा रहे प्रोटीन के आधार पर, इसके परिणामस्वरूप 70% -95% रेंज10,19,20,21,22 में क्षमता होती है; हालांकि, कुछ प्रमुख-नकारात्मक जीटीपेस निर्माण कम कुशल (30% -50%) हैं और एकल-सेल विश्लेषण दृष्टिकोण 4,20 की आवश्यकता होती है। दक्षता में ये अंतर ट्रांसजीन के कारोबार, इसकी विषाक्तता, या पारगमन के लिए उपयोग किए जाने वाले वायरस की शुद्धता और उपज को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। उत्तरार्द्ध को पट्टिका परख करके खारिज किया जा सकता है। यद्यपि हाइपर-क्रिटिकल नहीं है, लेकिन मूत्राशय में वायरस का समय वायरस को अपने सीएक्सएडीआर रिसेप्टर से जुड़ने के लिए पर्याप्त लंबा होना चाहिए। 30 मिनट से कम समय पारगमन की दक्षता को कम कर सकता है, जबकि इनक्यूबेशन अवधि को 45 मिनट तक बढ़ाने से दक्षता बढ़ सकती है; हालांकि, यह ट्रांसजीन-निर्भर हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में अंतिम महत्वपूर्ण कदम यह निर्धारित कर रहा है कि फेनोटाइप का आकलन करने से पहले जानवर को कितने समय तक रखा जाएगा। ट्रांसजेन 1-2 दिनों के बाद उच्चतम अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं, लेकिन उसके बाद अभिव्यक्ति कम हो सकती है। एसआईआरएनए के मामले में, यह प्रोटीन की टर्नओवर दर पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, आरएबी 11 ए, एक आरएबी-परिवार जीटीपेस की अभिव्यक्ति को लक्षित करने वाले एसआईआरएनए को व्यक्त करते समय, ट्रांसडक्शन23 के 72 घंटे बाद ही कुशल डाउनरेगुलेशन देखा जाता है। इस प्रकार, लंबे समय तक रहने वाले प्रोटीन (दिनों में मापा गया आधा जीवन) इस दृष्टिकोण का उपयोग करके उपयुक्त लक्ष्य नहीं हो सकते हैं।

अन्वेषक को इस दृष्टिकोण से जुड़ी चेतावनियों के बारे में भी पता होना चाहिए। सबसे पहले, इसकी उपयोगिता मादा कृन्तकों तक सीमित हो सकती है क्योंकि उनके लिंग के माध्यम से नर कृन्तकों को कैथेटर करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। हालांकि, मूत्राशय के गुंबद में कैथेटर पेश करके पुरुषों में इस प्रोटोकॉल को करना तकनीकी रूप से संभव हो सकता है, जैसा कि सिस्टोमेट्री9 करते समय नियोजित तैयारी के समान है। यह एक डिटर्जेंट या वायरस पेश करने और आवश्यकतानुसार धोने की अनुमति देगा। एक दूसरी चेतावनी यह है कि प्रोटीन के अतिवृद्धि सेल मार्गों और संसाधनों को समाप्त कर सकते हैं, जिससे प्रोटीन एकत्रीकरण, सेल तनाव मार्गों की सक्रियता और मृत्यु जैसी घटनाएं हो सकतीहैं। इस प्रकार, आम तौर पर ट्रांसजेन अभिव्यक्ति को गैर विषैले स्तरों तक सीमित करना बुद्धिमानी है (जब तक कि निश्चित रूप से ट्रांसजेन अभिव्यक्ति का इरादा न हो), जैसा कि सेल तनाव और कोशिका मृत्यु के मार्करों का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। एक तीसरी चेतावनी यह है कि कुछ सेटिंग्स में, दीर्घकालिक एडेनोवायरस अभिव्यक्ति प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकतीहै। हालांकि इस बात का कोई सबूत नहीं है कि यूरोथेलियम का एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित करता है10, यह ट्रांसजीन-निर्भर है और जैसा कि सीएलडीएन 2 ओवरएक्प्रेशन के ऊपर उल्लेख किया गया है, सिस्टिटिस की ओर जाता है।

वर्तमान में, जांचकर्ताओं के पास विभिन्न प्रकार के तरीके हैं जिनका उपयोग वे यूरोथेलियम में जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए कर सकते हैं, जिसमें ट्रांसजेनिक या सशर्त यूरोथेलियल नॉकआउट चूहों का उपयोग, अभिकर्मक अभिकर्मकों का उपयोग, या एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग शामिल है। बाद की विधि, इस प्रोटोकॉल का विषय, अपेक्षाकृत आसान, कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। वायरस स्टॉक उत्पन्न करने के लिए आवश्यक सेल कल्चर अभिकर्मकों के प्रारंभिक खर्च के अलावा, उत्पादित वायरस की बहुत बड़ी मात्रा (सैकड़ों पारगमन करने के लिए पर्याप्त), प्रति पशु आधार पर अपेक्षाकृत कम लागत का परिणाम है। यूरोथेलियल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का शोषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस 10,19,20,21,22 में रो-परिवार और रब-परिवार जीटीपेस, गुआनिन-न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक, मायोसिन मोटर टुकड़े और एडीएएम 17 के महत्व को परिभाषित करने के लिए किया गया था, और एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग हाल ही में यूरोथेलियल मेकैनोट्रांसडक्शन9 का अध्ययन करने के लिए किया गया था। . इसी तरह, मानव रोग की खोज और उपचार करते समय एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन प्रासंगिक हो सकता है। उदाहरण के लिए, रमेश एट अल ने शुरू में प्रस्तावित एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित करने का एक उपयोगी तरीका हो सकताहै। जबकि उनके अध्ययन एक प्रमाण-सिद्धांत दृष्टिकोण थे, कोई कल्पना कर सकता है कि कैंसर कोशिकाओं में विषाक्त पदार्थों की अभिव्यक्ति या एपिटोप्स की अभिव्यक्ति जिन्हें प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा पहचाना जा सकता है, उपयोगी रणनीतियां होंगी। एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन उन बीमारियों को समझने में भी उपयोगी हो सकता है जहां जीन उत्पादों की अतिवृद्धि या कम अभिव्यक्ति बीमारी की ओर ले जाती है। एक उदाहरण के रूप में, अंतरालीय सिस्टिटिस वाले रोगियों के मूत्राशय से बायोप्सी सीएलडीएन 2 अभिव्यक्ति 29 में90 गुना वृद्धि प्रदर्शित करती है। दिलचस्प बात यह है कि एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके सीएलडीएन 2 को अधिक व्यक्त करना चूहों में इस बीमारी के कई लक्षणों को दोहराताहै। इस प्रकार, सीएलडीएन 2 इस विकार वाले रोगियों के उपचार में एक लक्ष्य हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को P30DK079307 (M.G.D.D.), NIH अनुदान R01DK119183 (G.A. और M.D.C. को), NIH अनुदान R01DK129473 (G.A.), एक अमेरिकन यूरोलॉजी एसोसिएशन कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड और विंटर्स फाउंडेशन अनुदान (N.M.) के माध्यम से एक पायलट प्रोजेक्ट अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था। और S10OD028596 (G.A.) द्वारा, जिसने इस पांडुलिपि में प्रस्तुत कुछ छवियों को पकड़ने के लिए उपयोग की जाने वाली कॉन्फोकल प्रणाली की खरीद को वित्त पोषित किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Tags

जीव विज्ञान अंक 188
एडेनोवायरस-मध्यस्थता पारगमन का उपयोग करके मूल मूत्राशय यूरोथेलियम में ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter