Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Büyük miktarlarda rekombinant adenovirüslerin üretimi için yöntemler tanımlanmıştır, bu daha sonra transgenlerin ekspresyonuna veya endojen gen ürünlerinin aşağı regülasyonuna izin veren doğal kemirgen ürotelyumunu dönüştürmek için kullanılabilir.

Abstract

Yüksek dirençli bir bariyer oluşturmanın yanı sıra, renal pelvis, üreterler, mesane ve proksimal üretrayı kaplayan ürotelyumun, çevresi hakkındaki bilgileri altta yatan dokulara algılamak ve iletmek, işeme fonksiyonunu ve davranışını teşvik etmek için varsayılmıştır. Ürotelyal bariyerin veya duyusal / dönüştürücü fonksiyonunun bozulması hastalığa yol açabilir. Bu karmaşık olayları incelemek, ürotelyumdaki gen ve protein ekspresyonunu değiştirmek için basit stratejilerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, araştırmacıların kemirgen ürotelyumunu yüksek verimlilikle ve nispeten basit bir şekilde dönüştürmek için kullanılabilecek büyük miktarlarda yüksek titreli adenovirüs üretmelerine izin veren yöntemler açıklanmaktadır. Hem cDNA'lar hem de küçük müdahale eden RNA'lar adenoviral transdüksiyon kullanılarak eksprese edilebilir ve transgen ekspresyonunun ürotelyal fonksiyon üzerindeki etkisi 12 saat ila birkaç gün sonra değerlendirilebilir. Bu yöntemler, fare veya sıçan hayvan modellerini kullanan normal ve anormal ürotelyal biyoloji çalışmalarına geniş uygulanabilirliğe sahiptir.

Introduction

Ürotelyum, renal pelvis, üreterler, mesane ve proksimal üretra1'i kaplayan özel bir epiteldir. Üç tabakadan oluşur: apikal yüzeyleri idrarla yıkanan, oldukça farklılaşmış ve polarize olmuş, genellikle iki çekirdekli şemsiye hücrelerden oluşan bir tabaka; akut kayıplarına yanıt olarak yüzeysel şemsiye hücrelerine yol açabilen bi-nükleat geçiş-yükseltici hücre popülasyonuna sahip bir ara hücre tabakası; ve bir alt kümesi, kronik hasara yanıt olarak ürotelyumun tamamını yenileyebilen kök hücreler olarak işlev gören tek bir bazal hücre tabakası. Şemsiye hücreleri, bileşenleri suya ve çözünürlere karşı düşük geçirgenliğe sahip bir apikal membran (kolesterol ve serebrosidler bakımından zengin) ve yüksek dirençli apikal bileşke kompleksi (sıkı bağlantılar, aderens kavşakları, dezmozomlar ve ilişkili bir aktomiyosin halkasından oluşan) içeren yüksek dirençli ürotelyal bariyerin oluşturulmasından başlıca sorumludur.1 . Hem şemsiye hücresinin apikal yüzeyi hem de bileşke halkası mesane dolgusu sırasında genişler ve 1,2,3,4,5 işedikten sonra hızla önceden doldurulmuş hallerine geri döner. Bariyer fonksiyonundaki rolüne ek olarak, ürotelyumun ayrıca hücre dışı ortamdaki değişiklikleri (örneğin, gerilme) algılamasına ve bu bilgiyi subürotelyal afferent sinir süreçleri de dahil olmak üzere altta yatan dokulara (ATP, adenosin ve asetilkolin dahil) salınımı yoluyla iletmesine izin veren duyusal ve dönüştürücü fonksiyonlara sahip olduğu varsayılmıştır 6,7,8 . Bu rolün son kanıtları, hem Piezo1 hem de Piezo2'nin ürotelyal ekspresyonundan yoksun farelerde bulunur ve bu da işeme fonksiyonunun değişmesine neden olur9. Ek olarak, şemsiye hücre tabakasında sıkı bağlantı gözenek oluşturan protein CLDN2'yi aşırı eksprese eden sıçanlar, interstisyel sistit10 hastalarında görülene benzer inflamasyon ve ağrı geliştirir. Ürotelyal duyusal/transdüser veya bariyer fonksiyonunun bozulmasının birçok mesane bozukluğuna katkıda bulunabileceği varsayılmıştır 6,11.

Normal ve hastalık durumlarında ürotelyumun biyolojisinin daha iyi anlaşılması, araştırmacıların endojen gen ekspresyonunu kolayca aşağı regüle etmelerine veya doğal dokudaki transgenlerin ekspresyonuna izin vermelerine izin verecek araçların mevcudiyetine bağlıdır. Gen ekspresyonunu aşağı regüle etmeye yönelik bir yaklaşım, koşullu ürotelyal nakavt fareleri üretmek olsa da, bu yaklaşım flokslu alelleri olan farelerin mevcudiyetine bağlıdır, emek yoğundur ve12'nin tamamlanması aylar ila yıllar sürebilir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırmacılar ürotelyumu transfekte etmek veya transdübe etmek için teknikler geliştirdiler ve bu da daha kısa bir zaman ölçeğinde sonuçlara yol açabilir. Transfeksiyon için yayınlanmış yöntemler arasında katyonik lipitler 13, anti-sens fosforothioated oligodeoksinükleotidler14 veya HIV TAT proteinine nüfuz eden 11-mer peptid15'e bağlı antisens nükleik asitlerin kullanımı bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu protokolün odak noktası, geniş bir hücre yelpazesine gen iletiminde etkili olan, çok sayıda klinik çalışmada test edilmiş ve en son COVID-19 kapsid proteinini kodlayan cDNA'yı COVID-19 aşısının bir varyantının alıcılarına iletmek için kullanılan iyi çalışılmış bir metodoloji olan adenoviral aracılı transdüksiyonun kullanılmasıdır16, 17. Adenovirüs yaşam döngüsünün, adenoviral vektörlerin ve adenovirüslerin klinik uygulamalarının daha kapsamlı bir açıklaması için, okuyucu referans17'ye yönlendirilir.

Ürotelyumu dönüştürmek için adenovirüslerin kullanımında önemli bir kilometre taşı, Ramesh ve ark. tarafından hazırlanan ve N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dahil olmak üzere deterjanlarla yapılan kısa ön işlemlerin, β-galaktosidaz18'i kodlayan bir adenovirüs tarafından ürotelyumun transdüksiyonunu önemli ölçüde artırdığını gösteren bir rapordu. Bu prensip kanıtı çalışmasını bir rehber olarak kullanarak, ürotelyumun adenoviral aracılı transdüksiyonu, Rab ailesi GTPazları, guanin-nükleotid değişim faktörleri, miyozin motor fragmanları, gözenek oluşturan sıkı bağlantı ile ilişkili klodinler ve ADAM17 10,19,20,21,22 dahil olmak üzere çeşitli proteinleri ifade etmek için kullanılmıştır . Aynı yaklaşım, etkileri transgen22'nin siRNA'ya dirençli varyantlarının birlikte eksprese edilmesiyle kurtarılan küçük müdahale eden RNA'ları (siRNA) ifade etmek için uyarlandı. Burada açıklanan protokol, bu teknikler için bir gereklilik olan büyük miktarlarda yüksek konsantrasyonlu adenovirüs üretmek için genel yöntemlerin yanı sıra, ürotelyumdaki transgenleri yüksek verimlilikle ifade etmek için Ramesh ve ark.18 yöntemlerinin uyarlanmasını içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BSL2 sertifikası gerektiren adenovirüslerin üretimini içeren deneyler, Pittsburgh Üniversitesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği ofisleri ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin onayı altında gerçekleştirildi. Adenoviral transdüksiyon (ABSL2 sertifikası gerektiren) dahil olmak üzere gerçekleştirilen tüm hayvan deneyleri, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikası ve Hayvan Refahı Yasası'nın ilgili yönergelerine / düzenlemelerine uygun olarak ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı altında yapılmıştır. Rekombinant virüsleri içeren tüm prosedürler için eldiven, göz koruması ve uygun giysi giyilir. Herhangi bir sıvı veya katı atık aşağıda açıklandığı gibi bertaraf edilmelidir. Transdüksiyon sonrası hayvanların yatakları ve ortaya çıkan hayvan karkasları, biyolojik tehlikeli maddeler olarak ele alınmalı ve kurumsal politikalara göre bertaraf edilmelidir.

1. Yüksek titreli adenovirüs stoklarının hazırlanması

NOT: Kemirgen mesanelerinin etkili transdüksiyonu, saflaştırılmış ve konsantre viral stokların, tipik olarak μL başına 1 x 107 ila 1 x 108 enfeksiyöz viral partiküllerin (IVP) kullanımına bağlıdır. Protokolün bu kısmı, mevcut virüs preparatlarından yüksek titreli adenovirüs stokları üretmeye odaklanmıştır. Tüm adımlar, steril reaktifler ve aletler kullanılarak bir hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirilmelidir. Günümüzde kullanılan mevcut adenovirüs suşları replikasyon kusurlu olsa da, çoğu kurum adenovirüsleri ve rekombinant DNA'yı kullanmak için onay gerektirir. Bu genellikle adenovirüsleri üretmek ve büyütmek için BSL2 onaylı bir tesis olarak bir hücre kültürü odasının belirlenmesini içerir. Bazı genel hususlar, virüs üretimi ve saflaştırmasının her aşamasında maske, göz koruması, eldiven ve uygun giysi kullanımını içerir. Santrifüjleme yaparken, santrifüj tüplerinde sıkı oturan kapaklar yoksa güvenlik kapakları önerilir. Potansiyel olarak kontamine olmuş santrifüj güvenlik kapakları, şişeler ve rotorlar dahil olmak üzere tek kullanımlık olmayan tüm malzemeler antiviral bir çözelti ile muamele edilir ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve daha sonra su veya% 70 etanol ile durulanır. Sıvı atıklar, %10'luk (v/v) nihai konsantrasyona çamaşır suyu ilave edilerek arıtılır. Bu sıvı atıkların bertarafı kurumsal politikalara bağlı olacaktır. Katı atıklar tipik olarak biyolojik tehlikeli atıklarda bertaraf edilir.

  1. Kültür HEK293T hücreleri
    1. Dondurulmuş bir HEK293T hücresi şişesini 37 °C'de bir su banyosunda çözün ve hücreleri 15 cm çapında bir hücre kültürü kabına aktarmak için 5 mL'lik bir pipet kullanın. 25 mL'lik bir pipet kullanarak, yemeğe yavaşça %10 (v/v) fetal sığır serumu ve penisilin/streptomisin antibiyotik (DMEM-FBS-PS) içeren 20 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) ekleyin. Hücreleri, %80-%90 birleşim oranına (~2 x 107 hücre) ulaşana kadar %5 (v/v) CO2 ile gazlanmış 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
    2. Bir vakum kaynağına bağlı bir cam pipet kullanarak, ortamı aspire edin ve ardından 25 mL'lik bir pipet kullanarak kaba 20 mL steril PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mM NaCl ve 8,9 mM Na2HPO4) aktararak hücreleri durulayın. Harcanan PBS'yi aspire edin ve daha sonra 3 mL ılık (37 ° C) proteinaz çözeltisini (Malzeme Tablosuna bakınız) tabağa aktarmak için 5 mL'lik bir pipet kullanın, çanak hücreler ayrılana kadar (~ 3-4 dakika) hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
      NOT: Etkili proteoliz, çanağın tüm kısımlarından hücrelerin hareketli sıvıya salınmasını aramak için çanağı yavaşça ileri geri eğerek en iyi şekilde değerlendirilebilir. HEK293T hücreleri genişletilmiş proteinaz tedavisine duyarlıdır ve proteinaz çözeltisinde birkaç dakikadan fazla bırakılırsa ölürler.
    3. 7 mL DMEM-FBS-PS'yi ayrılmış hücrelerin kabına aktarmak için 10 mL'lik bir pipet kullanın ve ardından hücreleri ve ortamı aspire etmek için aynı pipeti kullanın. Asılı hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve daha sonra süspansiyonu 5 dakika boyunca 200 x g'de düşük hızlı bir klinik santrifüjde santrifüj ederek hücreleri pelet haline getirin. Bir vakum kaynağına bağlı bir cam pipet kullanarak süpernatantı aspire edin. Hücre peletini 15 mL DMEM-FBS-PS cinsinden yeniden askıya almak için 25 mL'lik bir pipet kullanın.
    4. 19 mL DMEM-FBS-PS içeren on beş adet 15 cm'lik kabın her birine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
    5. Hücreleri bir doku kültürü inkübatöründe% 85-90 birleşmeye (~ 3-4 gün) ulaşana kadar büyütün.
  2. Seyreltilmiş bir virüs çözeltisi hazırlayın
    1. FBS veya antibiyotik içermeyen 45 mL DMEM ile doldurulmuş 50 mL'lik bir konik tüpe mevcut bir virüs stoğunun (5-10 IVP / hücre) ~ 1.5 x 109 ila 3 x 109 IVP'sini ekleyin.
      NOT: Virüsün daha düşük bir konsantrasyonunu (1-5 IVP / hücre) kullanmak mümkündür; ancak, virüs üretiminin ortaya çıkması daha uzun sürecektir.
  3. Kültürlenmiş hücreleri virüsle enfekte edin.
    1. Bir vakum kaynağına bağlı bir cam pipet kullanarak, adım 1.1.5'te ortamı neredeyse birleşen hücrelerden aspire edin.
    2. Her bir hücre kültürü kabına 3,0 mL seyreltilmiş virüs çözeltisini (adım 1.2.1'de hazırlanan) aktarmak için 25 mL'lik bir pipet kullanın. Ardından, her bir yemeğe 7,0 mL DMEM ortamı (FBS veya antibiyotik içermeyen) eklemek için 10 mL'lik bir pipet kullanın. Bir hücre kültürü inkübatöründe 60 dakika boyunca inkübe edin ve ardından her bir yemeğe %20 (v / v) FBS ve 2x PS içeren 10 mL DMEM ekleyin.
      NOT: 15 çanaktan birini kontrol plakası olarak kullanmak (virüsün eklenmediği), bir sonraki adımda enfekte hücrelerde virüs kaynaklı hücre yuvarlamasını ve ölümünü tanımlamayı kolaylaştırır.
    3. Hücre kültürü inkübatöründeki hücreleri, çoğunluğu yuvarlanmaya başlayana ve hücrelerin% >60'ı ayrılana kadar 2-4 gün boyunca inkübe edin.
      NOT: Virüsün daha düşük bir titresi kullanılıyorsa, hücre ölümünün gerçekleşmesi bir hafta kadar sürebilir. Hücre ölümü bir hafta içinde gerçekleşmezse, işlemin virüsün daha yüksek bir titresi kullanılarak tekrarlanması gerekecektir.
  4. Hücre lizatlarından virüsü kurtarın
    1. Her çanağın tabanını kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bağlı hücreleri ortama bırakın.
    2. 25 mL'lik bir pipet kullanarak, her hücre kültürü kabındaki ortamı, hücreleri ve hücre kalıntılarını toplayın ve 50 mL'lik bir konik hücre kültürü tüpünde toplayın.
      NOT: Kaynaklardan tasarruf etmek için, iki çanaktan gelen ortam bir 50 mL tüpte birleştirilebilir.
    3. Düşük hızlı bir masa üstü santrifüj kullanarak santrifüjleme yoluyla hücresel malzemeyi peletleyin: 3.000 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika. Süpernatanı aspire etmek için vakum cihazına bağlı bir cam pipet kullanın.
    4. Elde edilen tüm peletlenmiş malzemeyi, 10 mM EDTA (Tris-EDTA çözeltisi) içeren toplam 7 mL steril filtrelenmiş 100 mM Tris-HCl pH 7,4 içinde birleştirmek için tritürasyonla birlikte 10 mL'lik bir pipet kullanın. Toplanan malzemeyi steril bir 15 mL hücre kültürü konik tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: Bu noktada, virüs hazırlığı -80 °C'de süresiz olarak dondurulabilir.
  5. Hücre lizatlarını hazırlayın
    1. Kalan hücreleri bozmak için üç donma-çözülme döngüsü gerçekleştirin ve böylece oluşan virüs parçacıklarını daha da serbest bırakın. Havuzlanmış malzemeyi adım 1.4.4'te, tüpü sıvı azota (~ 30-60 s) batırarak dondurun. Tüpü 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirerek numuneyi hızla çözün. Numuneyi 15 saniye boyunca vorteks edin ve ardından hızlı dondurma ve çözme prosedürünü 2 kat daha tekrarlayın.
      NOT: Virüs çözeltisi bir su banyosunda 37 ° C'de hızla çözülebilir, ancak sıcaklık dalgalanmaları tüpün çatlamasına ve virüs çözeltisinin su banyosuna salınmasına neden olabileceğinden dikkatli olunması gerekir. Bunun oluşmasını önlemek için, viral süpernatant içeren tüpü, daha sonra su banyosuna yerleştirilen daha büyük bir tüpe yerleştirin.
    2. Üç kez dondurularak çözülmüş hücresel malzemeyi süper hızlı bir santrifüj tüpüne aktarmak için 10 mL'lik bir pipet kullanın. Tüpteki malzemeyi ~ 18.500 x g'de 4 ° C süper hızlı santrifüjde 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
    3. ~7 mL virüs bakımından zengin süpernatantı 10 mL'lik bir pipetle kurtarın ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Numuneyi bir sonraki adıma kadar buz üzerinde tutun.
      NOT: Bu noktada, saflaştırılmamış viral süpernatantın bir alikotunu yeni bir virüs preparatı başlatmak için bir giriş olarak (veya yedek olarak) tutmayı düşünün. Bu aliquot -80 °C'de saklayın.
  6. Yoğunluk gradyanı santrifüjleme kullanarak virüsü izole edin ve saflaştırın.
    1. 12 mL PET ince duvarlı, şeffaf ultra santrifüj tüpünde ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya eşdeğerinde süreksiz bir CsCl gradyanı hazırlayın. Tüpün dibine 2,5 mL 1,4 g/mL CsCl çözeltisini dikkatlice sokmak için 18 G iğne ile donatılmış 3 mL'lik bir şırınga kullanın ve ardından 2,5 mL 1,25 g / mL CsCl çözeltisi ile katmanlamak için yeni bir şırınga / iğne kullanın.
      NOT: Çözeltileri doğrudan önceden var olan bir katmanın üzerine bırakmak, önemli ve istenmeyen karıştırmalara neden olur. Bunun yerine, iğnenin eğimli kısmını tüpün kenarına yerleştirin ve ardından şırınga pistonuna çok yavaşça bastırın, çözelti tüpü doldururken iğnenin konumunu yükseltin.
    2. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak ~ 7 mL viral süpernatantı gradyanın üzerine benzer şekilde yükleyin. Viral süpernatant ile tüpün üst kısmı arasında 2-3 mm'den fazla boşluk varsa, tüpü sadece 2-3 mm boşluk kalana kadar doldurmak için ek Tris-EDTA çözeltisi ekleyin.
    3. CsCl katmanları içeren, ancak viral süpernatan için Tris-EDTA çözeltisinin yerini alan benzer şekilde hazırlanmış bir denge tüpü yapın.
      NOT: İki tüp, ultra santrifüjde potansiyel olarak tehlikeli bir dengesiz yük durumunu önlemek için aynı ağırlıklara (ve benzer yoğunluklara) sahip olmalıdır.
  7. Hızı zonal ultrasantrifüjleme kullanarak virüsü izole edin.
    1. 1.6.2-1.6.3 adımlarında oluşturulan gradyanları SW41 rotorunun veya eşdeğerinin kovalarına yükleyin. Kova kapaklarına vidalayın, rotoru bir ultra santrifüje yerleştirin (4 ° C'ye kadar önceden soğutulmuş) ve ~ 150.000 x g'de 1 saat boyunca santrifüj.
    2. Santrifüjleme sırasında, aşağıdaki adım 1.9.1'de açıklanan sütunu dengeleyin.
  8. İzole virüs parçacıklarını kurtarın
    1. Santrifüjleme adımının sonunda, kovaları rotordan dikkatlice ayırın ve bir hücre kültürü başlığında, kova kapaklarını çıkarın ve ardından tüpleri çıkarın ve bir rafa yerleştirin.
    2. 1,25 g/mL ile 1,4 g/mL CsCl çözeltisi arasındaki arayüzde yüzen virüs parçacıkları bakımından zengin bantlı malzemeyi toplayın. Degradeyi içeren tüpü bir hücre kültürü kabının alt yarısı üzerinde tutarak (dökülen herhangi bir malzemeyi yakalayacak), tüpü bantlı virüsün hemen altında dikkatlice delmek için 3 mL'lik bir şırıngaya bağlı 1 inç 18 G iğne kullanın. Tipik olarak ~ 1 mL'de iyileşen virüsü yavaşça aspire edin.
    3. İğneyi tüpten çıkarın, bu da gradyanda kalan malzemenin tüpten hücre kültürü kabının alt yarısına akmasına neden olur (herhangi bir sıvı tehlikeli atık olarak muamele edilmelidir).
    4. Şırıngadaki virüs çözeltisini buz üzerindeki steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Bu adımda virüsü kurtarırken, iğneyi, iğnenin lümeni yukarı bakacak ve iğne virüs bakımından zengin bandın birkaç mm altında açılacak şekilde konumlandırın. Bazen bantlı virüsün 2-3 mm yukarısında gözlenen, yanlış monte edilmiş virüsün ince bandı tarafından kontaminasyondan kaçının ( bkz. Şekil 1A'daki ince siyah ok).
  9. CsCl'yi jel filtrasyonu ile numuneden çıkarın.
    1. Bir destek standına tutturulmuş bir PD-10 sütununu (Sephadex G-25M ile önceden paketlenmiş), %10 (v/v) gliserol içeren 50 mL'lik 0,2 μm steril filtreli PBS ile dengeleyin.
      NOT: İlk dengeleme adımının tamamlanması 2-3 saat sürer ve üretici tarafından kolonu stabilize etmek için kullanılan koruyucuların tamamen yıkanmasını sağlamak için gereklidir.
    2. Yıkama çözeltisinin fritin altına çekilmesine izin verin (sütun ortamının üstündeki koruyucu bir beyaz malzeme diski) ve ardından adım 1.8'de toplanan saflaştırılmış virüs çözeltisini sütunun üstüne dikkatlice aktarın. Virüs bakımından zengin çözeltinin fritin altına çekilmesine izin verin ve ardından sütunu PBS-gliserol ile doldurmaya başlayın.
      NOT: Fritin bir işlevi, kolonun kurumasını önlemektir. Sonuç olarak, sütuna daha fazla elüant eklenmeden önce kısa gecikmeler tolere edilir.
    3. Elüatı 12 steril mikrosantrifüj tüpünde, fraksiyon başına 0,5 mL'de toplayın.
  10. Viral verimi belirleyin.
    1. Spektrofotometri kullanarak tepe virüs fraksiyonlarını belirleyin. PBS'de her fraksiyonun 1:100 seyreltmesini hazırlayın ve OD260'ı bir spektrofotometrede tek başına 1:100 tampon seyreltme kullanarak boş olarak ölçün. Virüs parçacıkları, fraksiyon 6 civarında başlayarak boşluk hacminde serbest bırakılmalıdır. En yüksek OD260 okumalarını içeren kesirleri bir araya getirin.
    2. Havuzlanmış viral fraksiyonların 1:100 seyreltilmesini yapın ve OD260'ı yeniden ölçün. Aşağıdaki formülü kullanarak virüs parçacıklarının nihai konsantrasyonunu ve havuzlanmış fraksiyonlardaki IVP sayısını hesaplayın: mL başına virüs parçacıkları = OD260 × 100 (bu, seyreltme faktörü için düzeltir) × 1012. Genel bir tahmin, virüs parçacıklarının% 1'inin IVP olduğudur, şu şekilde: IVP / mL = OD 260 × 100 × 10 10 veya IVP / μL = OD260 × 100 × 10 7.
  11. Havuzlanmış virüs fraksiyonlarını (5 x 107 ila 1 x 108 IVP içeren) steril mikrosantrifüj tüplerine veya kriyovyal maddelere ayırın. Numuneleri -80 °C'de saklayın.

2. Kemirgen mesanesinin iletimi

NOT: Bu teknikte yeniyseniz, bir seferde transdübe edilen hayvan sayısının 2-4 ile sınırlandırılması önerilir. Bu, özellikle adım 2.2'deki deterjan tedavisi sırasında ve daha sonra adım 2.3'te virüs inkübasyonu sırasında her hayvan için başlangıç zamanlarını şaşırtarak gerçekleştirilebilir. Deneyimli araştırmacılar bir seferde altı hayvana kadar transdübe yapabilirler.

  1. Mesaneyi kateterize edin
    1. Dişi C57Bl / 6J fareleri (tipik olarak 8-10 haftalık, ~ 20-25 g) veya dişi Sprague Dawley sıçanlarını (tipik olarak 2-3 aylık, ~ 250 g) ekli bir burun konisi ile bir buharlaştırıcı kullanarak anestezi yapın. Buharlaştırıcıyı, fareler için %3,0 (v/v) izofluran, %97 (v/v) O2 veya sıçanlar için %4,0 (v/v) izofluran, %96 (v/v)O2 üretecek şekilde kalibre edin. Ayak parmaklarının sıkışmasına tepki vermediklerinden emin olarak hayvanların uyuşturulduğunu doğrulayın (tipik olarak 1-2 dakika sonra).
    2. Hayvanları ısıtılmış bir ped üzerine yerleştirerek hayvanın vücut ısısını koruyun. Hayvanların anestezi altına alındığından ve bu işlem sırasında herhangi bir acı yaşamadığından emin olmak için transdüksiyon protokolü boyunca hayvanı izleyin.
    3. İzofluran'ı fareler için% 1.5'e (v / v) veya sıçanlar için% 2.0'a (v / v) düşürün ve hayvanları protokol süresince anestezi altında tutun.
    4. Mesaneye hava girmesini önlemek için, bir IV kateterinin plastik kateter kısmını ( bakınız Malzeme Tablosu) ve ilişkili göbeği bir transfer pipeti kullanarak steril PBS ile doldurun.
    5. Hayvan sırtüstü pozisyondayken, dış meatusu% 70 alkolle sürün ve steril kateteri dış meatusa, sonra üretraya ve daha sonra mesaneye yerleştirin.
      1. Bu görevi yerine getirmek için, dış meatusu oluşturan dokuyu nazikçe tutmak ve hayvandan uzağa dikey olarak uzatmak için ince forseps kullanın. Diğer elinizi kullanarak, kateteri üretral meatusa (vajinanın açıklığının hemen üstünde bir et höyüğü) dikey olarak yaklaşık 3-4 mm dikey olarak dikkatlice yerleştirin. Daha sonra, üretradaki bir bükülme nedeniyle, dış meatusa yerleştirilen kateteri, hayvanın kuyruğuna doğru indirin, bu da üretranın kasık kemiğinin altından geçen kısmına ve nihayetinde mesaneye girişini kolaylaştırır
        . NOT: Özellikle fare söz konusu olduğunda, kateter çok uzun olabilir ve hayvanın içine 1.0-1.1 cm'den fazla yerleştirilmemelidir. Aksi takdirde, mesane mukozasında hasar meydana gelecektir. Bunu önlemek için, kateteri ucunun ~ 1 cm altında işaretleyin ve ardından kateteri bu işaretin ötesine yerleştirmeyin.
    6. Mesanedeki idrarın dışarı sızmasına izin verin. Credé'nin manevrasını yaparak kalan idrarı çıkarın: masaj yapın ve alt karın bölgesindeki mesane yumruğuna hafifçe bastırın.
  2. Ürotelyumu bir deterjan çözeltisi ile muamele ederek transdüksiyona açık hale getirin.
    1. Kateter göbeğine PBS ile doldurulmuş steril bir 1 mL şırınga takarak fare veya sıçan mesanesini yıkayın. Fare kesesine 100 μL steril PBS enjekte edin (veya sıçan mesanesi durumunda 450 μL). Şırıngayı kateter bağlantısından ayırın ve PBS'nin boşalmasına izin verin. Gerekirse, fazla mesane sıvısını çıkarmak için Crede'nin manevrasını yapın.
    2. Steril 1 mL şırınga kullanarak fare kesesine 100 μL %0,1 (w/v) N-dodesyl-β-D-maltoside (DDM) (PBS'de çözünmüş ve 0,2 μm filtreyle sterilize edilmiş) damlatın. Şırıngayı yerinde bırakarak DDM'yi mesanede 10 dakika tutun. Sıçanlarda, DDM hacmi 450 μL'ye yükseltilir.
    3. Şırıngayı ayırarak ve boşalmasına izin vererek DDM'yi mesaneden çıkarın. Gerekirse Crede'nin manevrasını yapın.
  3. Virüsü mesaneye sokun.
    1. Kateter göbeğine steril bir 1 mL şırınga takın ve 0.5 x 107 ila 1 x 108 IVP adenovirüs (1. adımda hazırlanan), fareler için 100 μL steril PBS veya sıçanlar için 450 μL ile seyreltilmiş mesaneye aşılayın. Virüs çözeltisinin kaçmasını önlemek için şırıngayı kateterin üzerine bağlı bırakın.
    2. 30 dakika sonra, şırıngayı ayırın ve virüs çözeltisinin mesaneyi tek kullanımlık bir ped üzerine boşaltmasına izin verin. Herhangi bir artık virüs çözeltisini emici bir mendille lekeleyin ve pedi atın ve biyolojik olarak tehlikeli atıkları silin.
      NOT: Gliserol sitotoksiktir. Bu nedenle, farelere aşılanan maksimum virüs çözeltisi hacmi 5 μL ile sınırlıdır (100 μL PBS'ye seyreltildiğinde, ~% 0.5'lik bir nihai gliserol konsantrasyonuna neden olur [v / v]). Ek olarak, aşılanan IVP sayısını artırarak ve virüs inkübasyonunu 45 dakikaya uzatarak iletim verimliliğini artırmak mümkündür.
    3. İsteğe bağlı adım: Mesane, yukarıdaki adım 2.2.1'de açıklandığı gibi PBS ile durulanabilir; ancak, bu gerekli değildir.
  4. Hayvanın iyileşmesine izin verin.
    1. İzofluran akışını durdurun ve özellikle hayvanlar grup halinde barındırılıyorsa, hayvanın kafesine geri döndürmeden önce iyileşmesine ve tamamen hareketli olmasına izin verin.
      NOT: Virüs iletimi kendi başına gözlenebilir alt üriner sistem semptomlarına veya ağrıya neden olmadığından, genellikle cerrahi sonrası tedaviye gerek yoktur. Bununla birlikte, kodlanmış transgen toksik ise, kurumun gerektirdiği şekilde işlem sonrası analjezi veya antibiyotikler gerekli olabilir.
  5. Transgen ekspresyonunun etkilerini tedavi sonrası 12-72 saat sonra mRNA in situ hibridizasyon, batı lekesi veya immünofloresan 9,10,23 gibi yöntemleri kullanarak analiz edin (temsili sonuçlara bakınız).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virüs hazırlığı
Yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile virüs saflaştırmanın bir örneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Yüklenen hücresel malzemenin ve 1.25 g / mL CsCl tabakasının arayüzünde bulunan açık pembe bant, esas olarak bozulmuş hücrelerden ve kalıntılarından oluşur ( Şekil 1A'daki macenta okuna bakınız). Pembemsi rengini, protokoldeki adım 1.5'ten taşınan az miktarda kültür ortamından alır. Süt beyazı bir bant olarak görünen ilgili virüs parçacıkları, 1.25 g / mL CsCl ve 1.40 g / mL CsCl çözeltilerinin arayüzünde bulunur ( Şekil 1A'daki sarı oka bakınız). Ayrıca, zenginleştirilmiş virüs parçacıklarının 2-3 mm üzerinde yüzen bir malzeme bandı da gözlemlenebilir ( Şekil 1A'daki ince siyah oka bakınız). Birleştirilmemiş virüsler ve döküntüler içerir, az sayıda IVP içerir ve virüs örneğini toplarken kaçınılmalıdır.

PD10 sütunu kullanılarak virüsün daha fazla saflaştırılması ve tampon değişimi Şekil 1B'de gösterilmiştir ve elüsyondan sonra elde edilen fraksiyonların OD260 okumaları Şekil 1C'de gösterilmiştir. Bu sütunların boşluk hacmi yaklaşık 3 mL'dir ve bu nedenle virüs fraksiyon 6'da görünmeye başlar ve fraksiyon 9'da zirveye ulaşır. Bu deneyde, 6-9 kesirleri bir araya getirildi. Fraksiyon 6 ve 7 virüs parçacıklarında nispeten düşük olsa da, iyileşmeyi hak etmek için yeterli virüs içerirler ve çok yüksek titreli fraksiyonları daha makul bir konsantrasyona seyreltmeye hizmet ederler. Fraksiyon 11'deki OD 260'taki artış, bu preparatlarda değişken olarak gözlenen ikinci bir kirletici pikin olası varlığını gösterdiğinden, fraksiyonlar10-12 dahil edilmemiştir. Havuzlanmış fraksiyon tipik olarak 1 x 107 ila 1 x 108 IVP / μL'ye sahip olacak ve beklenen verim 1 x 10 10 ila 2 x10 11 toplam IVP arasında olacaktır. Bu, yüzlerce transdüksiyon gerçekleştirmek için yeterli miktarda virüstür. Virüsü plak tahlilleriyle veya floresan proteinleri22 eksprese eden hücrelerin kolonilerini sayarak titre etmek mümkün olsa da, çoğu durumda% 1 kuralı yeterlidir. Bu kural, numunenin OD260'ının ölçülmesiyle tahmin edilen saflaştırılmış virüs parçacıklarının% 1'inin IVP olduğunu belirtir. -80 ° C'de depolanan virüsün alikotları 2-5 yıllık bir raf ömrüne sahiptir, ancak bulaşıcılık uzun vadede azalır. Çözülmüş virüs alikotları, önemli bir enfeksiyon kaybı olmadan bir kez -80 ° C'de yeniden dondurulabilir. Bununla birlikte, tekrarlanan çözülme ve donma, viral enfeksiyonu olumsuz yönde etkiler.

Mesane iletimi
Transdüksiyonun etkisini değerlendirirken önemli bir ilk adım, transgen ekspresyonunu doğrulamaktır. Bu, mRNA'yı (örneğin, RNAScope) tespit eden araçlar, batı leke analizi veya immünofloresan 9,10,23 kullanımı dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak değerlendirilebilir. Şekil 2, V5-epitop etiketli insan büyüme hormonu (V5-hGH)23'ü kodlayan bir adenovirüs ile dönüştürülen fare ürotelyumuna bir örnektir. Bu protein diskoidal / fusiform veziküller halinde paketlenir ve mesane dolgusu19,23 sırasında ekzositozlanabilir. Ürotelyal lizatların Western blot analizi, transdüe edilmiş mesanelerin ürotelyumunda V5-hGH ekspresyonunu ortaya koydu, ancak transdüne edilmemiş olanlarda yoktu (Şekil 2A). İfade ayrıca immünofloresan ile doğrulandı, bu durumda hGH veya V5 epitop etiketini tanıyan antikorlar kullanılarak (transdüne edilmemiş mesanelerde sinyal yoktu, gösterilmedi) (Şekil 2B).

Ek bir örnek, sıçan mesanesinin CLDN2'yi kodlayan bir virüsle, gözenek oluşturan sıkı bağlantı ile ilişkili bir protein24,25 ile transdüksiyonudur. CLDN2, katyonların parasellüler akısını arttırır (K + dahil) ve aşırı ekspresyonu, iltihaplanma ve viseral ağrı gelişimine neden olur10. Western blot analizi, Cldn2 kodlayan adenovirüs ile transdüe edilen sıçan mesanelerinde CLND2 ekspresyonunu doğruladı, ancak kontrol GFP kodlayan bir virüs ile transdüe edilenleri doğrulamadı (Şekil 2C). Genel olarak, GFP'nin hücrelerde eksprese edildiğinde toksik olduğu düşünülmez ve bu nedenle yararlı bir kontrol görevi görür. GFP'nin kullanımı ayrıca araştırmacının transdüksiyonun çalıştığını doğrulamasına izin verir. İmmünofloresan analizi, Cldn2 cDNA'yı kodlayan virüs ile transdüe edilen ürotelyal şemsiye hücrelerinde eksojen CLDN2 ekspresyonunu daha da doğruladı (Şekil 2D'deki kırmızı sinyal). Ayrıca, endojen CLDN2'ye benzer şekilde (gösterilmemiştir), ifade edilen CLDN2, TJP1 etiketli sıkı bağlantılara ve ayrıca şemsiye hücrelerinin bazolateral yüzeylerine lokalize edilir (CLDN2, Şekil 2E'de yeşil olarak etiketlenmiştir)10. CLDN2 ekspresyonu durumunda, transdüksiyondan bir gün sonra en yüksekti, ancak daha sonra takip edildi ve 15 gün sonra zar zor tespit edilebildi.

İkinci bir husus, adenoviral transdüksiyon ile hangi hücre tiplerinin hedefleneceğidir. Sıçanlarda çoğunlukla şemsiye hücre tabakası19'u dönüştürmek mümkün olsa da, farede, ara ve bazal hücre katmanlarının transdüksiyonu değişken olabilse de, ürotelyumun tüm katmanları dönüştürülebilir. Önemli olarak, mesane duvarının tamamında, sadece ürotelyum dönüştürülür ve aşılanmış adenovirüs tarafından başka hiçbir doku hedeflenmez (Şekil 3).

Transdüe hücrelerin analizleri tek hücre seviyesinde yapılabilirken, genel bir mesane fenotipini araştırırken, ürotelyal hücrelerin çoğunluğunu transdübe etmek gerekir. Bu nedenle, transdüksiyonun etkinliğini tanımlamak önemlidir (yani, ürotelyal hücrelerin hangi fraksiyonunun dönüştürüldüğü). Örneğin, Cldn2 eksprese eden adenovirüs durumunda, şemsiye hücrelerinin% >95'i dönüştürülmüştür (bkz. Şekil 2D). Ek bir örnek, Şekil 3'te gösterilen görüntü alanıdır; burada dönüştürülmüş şemsiye hücrelerinin sayısını saymak (bu durumda, Ca2+ sensörü GCAMP5G'yi ifade eder)% 95'e yaklaşan bir verimlilik ortaya çıkarır. Bununla birlikte, transdüksiyon verimliliğinin doğru ve tarafsız bir tahminini elde etmek için mesane duvarı boyunca alınan rastgele alanlardaki hücreleri incelemek gerekir.

Figure 1
Şekil 1: Adenovirüsün saflaştırılması. (A) Enfekte HEK293T hücreleri tarafından üretilen adenovirüs parçacıkları, 1.4 g / mL CsCl'lik bir tabaka, 1.25 g / mL CsCl'lik bir tabaka ve Tris-EDTA çözeltisi içinde seyreltilmiş bir numune (S) tabakasından oluşan süreksiz bir CsCl gradyanı üzerinde santrifüjleme ile saflaştırılmıştır. Hücresel materyal (pembe ok) S / 1.25 arayüzünde birikirken, saflaştırılmış adenovirüs 1.25 / 1.4 arayüzünde (sarı ok) yüzer. Yanlış monte edilmiş küçük bir virüs bandı, ikincisinin üzerinde yüzer (ince siyah ok). (B) Gradyandaki adenovirüs bakımından zengin bant bir iğne kullanılarak geri kazanılır ve CsCl, %10.0 (v/v) gliserol içeren PBS ile dengelenmiş G25 Sephadex dolgulu PD10 sütunu kullanılarak jel filtrasyonu ile adenovirüsten uzaklaştırılır. Sephadex'in yüzeyi gözenekli, plastik bir frit ile korunmaktadır. (C) PD10 kolonundan 0,5 mL fraksiyonlar toplanmıştır. Fraksiyonların OD260'ı bir spektrofotometrede ölçüldü ve değerler çizildi. Virüs bakımından zengin fraksiyonlar, fraksiyon 6'dan başlayan ve fraksiyon 9'a kadar uzanan boşluk hacminde boşalır. Bu temsili deney için havuzlanmış kesirler mavi renkle gölgelendirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kemirgen mesane ürotelyumunun V5-hGH veya CLDN2 kodlayan adenovirüslerle transdüksiyonu. (A) Fare ürotelyumu dönüştürülmeden bırakıldı (UT) veya V5 epitop etiketli insan büyüme hormonunu (hGH) kodlayan adenovirüslerle dönüştürüldü. 24 saat sonra, mesaneler geri kazanıldı, ürotelyal lizatlar hazırlandı ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezine tabi tutuldu ve hGH'ye karşı bir antikor ile araştırılan batı lekeleri kullanılarak V5-hGH ekspresyonu doğrulandı. (B) hGH (yeşil) veya V5 epitop (kırmızı) ve florofor etiketli ikincil antikorlara karşı antikorlar kullanılarak kesitlenmiş ve boyanmış fare ürotelyumunda V5-hGH'nin saptanması. İmmünofloresan konfokal mikroskopi kullanılarak yakalandı. Numuneler, çekirdekleri etiketlemek için TO-PRO3 ile boyandı. (C-F) Sıçan urothelium, kontrol olarak sıçan CLDN2 (ortak adı claudin-2) veya GFP (ortak adı yeşil floresan proteini) kodlayan bir virüs ile dönüştürüldü. (C) Eksojen CLDN2'nin yine bir antikor kullanılarak batı lekelenmesi ile saptanması. Endojen CLDN2'nin düşük seviyelerde eksprese edildiğini ve bu deneyde tespit edilmediğini unutmayın. (D) Şemsiye hücre tabakasının transdüksiyonu, immünofloresan ve konfokal mikroskopi ile ortaya çıkar. Hücrenin sınırları, dokunun, kortikal aktin sitoiskeletini etiketleyen FITC-faloidin ile birlikte boyanmasıyla ortaya çıkar. (E) Ekzojen CLDN2 ve TJP1'in (ortak adı ZO1) immünofloresan ve bütün monte edilmiş veya kesitli ürotelyumun konfokal mikroskopisi ile saptanması. Küçük beyaz oklar sıkı bağlantının yerini gösterir ve küçük macenta ok uçları hücre sitoplazmasında hücre içi CLDN2 birikimlerinin yerini gösterir. Bunların daha önce Golgi ile ilişkili CLDN210 olduğu ortaya çıkmıştı. (F) Transdüksiyonu takiben, hayvanlar enfeksiyondan sonraki belirtilen günlerde ötenazi yapıldı. Eksojen CLDN2 ekspresyonu western blotlama kullanılarak tespit edildi. GFP ifade eden hayvanlar 1. günden sonra ötenazi yapıldı. Şekil 2C-E'deki veriler Montalbetti ve ark.10'dan değiştirilmiştir ve Amerikan Fizyoloji Derneği'nin izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Adenoviral transdüksiyonun etkinliği. Fare mesane ürotelyumu, kalsiyum sensörü GCaMP5G'yi kodlayan bir adenovirüs ile dönüştürüldü. Üst paneller GCaMP5G için boyama gösterir (yeşil floresan proteinine karşı bir antikor kullanılarak tespit edilir; GFP, yeşil), orta paneller DAPI boyalı çekirdeklerin (mavi) ve rodamin-faloidin etiketli aktinin (kırmızı) dağılımını gösterir ve alt paneller üç sinyalin birleşimidir. Alt paneldeki beyaz ok uçları, dönüştürülmeyen nadir şemsiye hücreleridir. Bu görüntüdeki şemsiye hücrelerinin transdüksiyonunun genel verimliliği ~% 95'tir. Sadece ürotelyumun dönüştürüldüğünü unutmayın. Kutulu bölgeler sağdaki panellerde büyütülür. Kutu 1'deki bölge öncelikle dönüştürülmüş şemsiye hücrelerinden oluşur. Kutu 2'deki bölge, şemsiye hücrelerinin etkili transdüksiyonunu gösteren ürotelyumdur, ancak altta yatan hücre katmanlarının daha az verimli transdüksiyonunu gösterir. LP = lamina propria; ME = muscularis externa; Se = serosa; Ut = ürotelyum. Görüntüler konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi (bakınız Malzeme Tablosu). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ramesh ve ark. mesane kanseri tedavisinde adenoviral transdüksiyonu kullanmak için stratejiler geliştirmeye odaklanmış olsalar da 18, daha yeni raporlar bu tekniklerin normal ürotelyal biyoloji / fizyoloji ve patofizyoloji 10,18,19,20,21 çalışmalarında yararlılığını göstermiştir . Bu yaklaşımın önemli özellikleri şunlardır: (i) Kemirgen mesane duvarının tamamında, sadece ürotelyum 10,19,20,21,22 dönüştürülür. Sıçanlarda, transdüksiyon çoğunlukla şemsiye hücre tabakası ile sınırlıdır, farelerde ise ürotelyumun tamamı hedeflenebilir; (ii) Bu yaklaşım, proteinleri veya siRNA'ları ifade etmek için kullanılabilir 10,19,20,21,22; (iii) Transdüksiyonun verimliliği %70-%95'e yaklaşabilir (örneğin, bkz. Şekil 3)18,20; (iv) Transdüksiyondan bir gün sonra, ürotelyumun ultrayapısı, dokunun bütünlüğü, yüksek dirençli bir bariyerin varlığı (trans-epitel direncinin ölçülmesiyle değerlendirilir) ve ürotelyal farklılaşma belirteçlerinin ekspresyonu "normal"dir10,19. Şimdiye kadar belirtilen tek morfolojik etki, şemsiye hücre çapındaki bir azalmadır (yukarıdan bakıldığında); ancak 3-4 gün sonra normal boyutlarına dönerler10,19; (v) Ürotelyum aynı anda üç farklı adenovirüs ile dönüştürülebilir18; (vi) Transgen ekspresyonu, protein ekspresyonu miktarını etkileyen IVP sayısını titre ederek, hayvan kurban edilmeden önce kuluçka süresini uzatarak veya kısaltarak veya tet tarafından düzenlenmiş bir sistem (tet-off) gibi farklı promotörlerin kullanılmasıyla değiştirilebilir19. İkinci durumda, transaktivatör / tet-repressor'ı kodlayan bir virüsü birlikte eksprese edebilir ve daha sonra hayvanın diyetindeki doksisiklin konsantrasyonunu değiştirerek transgenin ekspresyonunu modüle edebilir.

Genel protokol nispeten basit olsa da, bu deneyleri gerçekleştirirken göz önünde bulundurulması gereken bazı kritik adımlar vardır. Bunlardan biri, makul saflıkta yüksek titreli virüs stoklarının mevcudiyetidir. Adenovirüsler ticari satıcılardan, kurumsal virüs üretim çekirdeklerinden, diğer araştırmacılardan elde edilebilir veya şirket içinde üretilebilir. İkincisi durumunda, Bert Vogelstein laboratuvarı AdEasy sistemi önerilir, çünkü bileşenleri Addgene'den satın alınabilir ve bu yaklaşım kullanılarak üretilen adenovirüsler ürotelyal transdüksiyon4'te iyi çalışır. Bu teknik, pAdEasy-1 ambalaj plazmidini (ek, viral genler E1 ve E3'ün yerini alır), pAdEasy-1 bakteri hücrelerini (virüs üretmek için gerekli adenoviral genleri kodlayan) ve HEK293T hücrelerinde (gerekli viral E1 proteinini ifade eden) replikasyon kusurlu adenovirüslerin üretimini kullanarak 8 Kb'ye kadar cDNA'ları kodlayan adenovirüslerin üretilmesini sağlar. Bununla birlikte, pAdEasy-1 ambalaj plazmidinin pAdEasy-2 ambalaj plazmidi ile değiştirilmesi, ambalaj boyutunu 2,7 kB daha arttırır, ancak virüsler E1 ve E34'e ek olarak erken gen E4'ten yoksun olduğu için farklı bir hücre hattının (E1-transforme insan embriyonik retinal 911 hücreleri) kullanılmasını gerektirir. SiRNA'ların ekspresyonu, Kasahara ve ark.26'da ayrıntılı olarak açıklanan pAdloss da dahil olmak üzere çeşitli sistemler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ürotelyumu dönüştürmek için virüs açısından zengin hücre kültürü ortamını kullanmak mümkün olsa da, bu yöntem güvenilmez olabilir. Bunun yerine, büyük ölçekli virüs amplifikasyonu, CsCl gradyan saflaştırması, ardından jel filtrasyonu, büyük miktarlarda yüksek titreli virüs üretmenin en güvenilir yolunu sağlar. Virüsün -80 ° C'deki göreceli stabilitesi, nispeten büyük virüs verimleri ile birleştiğinde, bunu çok sayıda deneyde kullanılabilecek tutarlı bir virüs stoğuna sahip olmak için ideal bir yol haline getirir.

Bu protokoldeki ek kritik adımlar, iletim protokolüyle ilişkili olanları içerir. Bunlar, PBS'nin (iki değerli katyonlar olmadan) bir yıkama maddesi ve seyreltici olarak kullanılmasını ve DDM deterjanının kullanımını içerir. Kavşak kompleksi düzgün çalışması için Ca2 + 'ya bağımlı olduğundan, PBS muhtemelen kavşakla ilişkili bariyeri bozarak viral girişi teşvik eder. DDM de kritiktir; Ramesh ve ark.'nın bildirdiği gibi, deterjan tedavisinin yokluğunda adenovirüs iletiminin etkinliği son derece düşüktür18. Bununla birlikte, deterjanın etki şekli açık değildir. DDM ile 10 dakikalık bir inkübasyon idealdir, ancak bu 5 dakikaya kısaltılabilir; Bununla birlikte, deterjan altta yatan dokularda beklenmedik hasara neden olabileceğinden, inkübasyonun 10 dakikadan fazla sürmesi önerilmez. Kullanılan virüs miktarı kritik bir parametredir, daha yüksek konsantrasyonlar genellikle daha fazla miktarda transgen ekspresyonuna ve daha yüksek transdüksiyon verimliliğine yol açar. Bununla birlikte, ekspresyon, verimlilik ve fenotipin en iyi kombinasyonunu veren optimal virüs konsantrasyonu ampirik olarak belirlenmelidir. Başlangıç konsantrasyonu olarak, hayvan başına 5.0 x 106 ila 2.0 x 107 IVP aralığı önerilir. İfade edilen proteine bağlı olarak, bu% 70 -% 95 aralığında verimlilikle sonuçlanır 10,19,20,21,22; Bununla birlikte, bazı baskın-negatif GTPaz yapıları daha az verimlidir (% 30 -% 50) ve tek hücreli bir analiz yaklaşımı gerektirir 4,20. Verimlilikteki bu farklılıklar, transgenin cirosunu, toksisitesini veya transdüksiyon için kullanılan virüsün saflığını ve verimini yansıtabilir. İkincisi, plak tahlilleri yapılarak ekarte edilebilir. Hiper-kritik olmasa da, virüsün mesanede kaldığı süre, virüsün CXADR reseptörüne bağlanması için yeterince uzun olmalıdır. 30 dakikadan daha kısa süreler transdüksiyon verimliliğini düşürebilirken, inkübasyon süresini 45 dakikaya uzatmak verimliliği artırabilir; Bununla birlikte, bu transgene bağımlı olabilir. Bu protokoldeki son kritik adım, bir fenotip değerlendirilmeden önce hayvanın ne kadar süre tutulacağını belirlemektir. Transgenler 1-2 gün sonra en yüksek ifadeyi sergiler19, ancak ekspresyon bundan sonra azalabilir. SiRNA'lar söz konusu olduğunda, proteinin kendisinin devir hızına bağlıdır. Örneğin, Rab ailesi GTPaz olan Rab11a'nın ekspresyonunu hedef alan siRNA'ları ifade ederken, etkili downregülasyon sadece transdüksiyon23'ten 72 saat sonra gözlenir. Bu nedenle, uzun ömürlü proteinler (yarı ömürleri gün cinsinden ölçülür) bu yaklaşımı kullanarak uygun hedefler olmayabilir.

Araştırmacı ayrıca bu yaklaşımla ilişkili uyarıların farkında olmalıdır. İlk olarak, erkek kemirgenleri penislerinden kateterize etmedeki zorluklar nedeniyle faydası dişi kemirgenlerle sınırlı olabilir. Bununla birlikte, bu protokolü erkeklerde, sistometri9 yapılırken kullanılan preparasyona benzer şekilde, mesanenin kubbesine bir kateter sokarak gerçekleştirmek teknik olarak mümkün olabilir. Bu, birinin bir deterjan veya virüs sokmasına ve gerektiğinde yıkama yapmasına izin verecektir. İkinci bir uyarı, proteinlerin aşırı ekspresyonunun hücre yollarını ve kaynaklarını tüketebileceğidir, bu da protein agregasyonu, hücre stres yollarının aktivasyonu ve ölüm gibi olaylara yol açabilir27. Bu nedenle, transgen ekspresyonunu, hücre stresi ve hücre ölümü belirteçleri kullanılarak değerlendirildiği gibi, toksik olmayan seviyelerle (tabii ki transgen ekspresyonunun amacı bu değilse) sınırlamak genellikle akıllıcadır. Üçüncü bir uyarı, bazı ortamlarda, uzun süreli adenovirüs ekspresyonunun bağışıklık tepkilerini tetikleyebileceğidir28. Ürotelyumun adenoviral transdüksiyonunun kendi başına immün yanıtları uyardığına dair bir kanıt bulunmamakla birlikte,10, bu transgene bağımlıdır ve yukarıda belirtildiği gibi CLDN2 aşırı ekspresyonu sistite yol açar.

Şu anda, araştırmacılar, transgenik veya koşullu ürotelyal nakavt farelerinin kullanımı, transfeksiyon reaktiflerinin kullanımı veya adenoviral transdüksiyonun kullanımı da dahil olmak üzere, ürotelyumdaki gen ve protein ekspresyonunu modüle etmek için kullanabilecekleri çeşitli yöntemlere sahiptir. Bu protokolün konusu olan ikinci yöntem nispeten kolay, verimli ve tekrarlanabilir. Virüs stoklarını üretmek için gereken hücre kültürü reaktiflerinin ilk masrafı dışında, üretilen çok büyük miktarda virüs (yüzlerce transdüksiyon gerçekleştirmek için yeterli), hayvan başına nispeten düşük bir maliyetle sonuçlanır. Adenoviral transdüksiyon, ürotelyal biyolojiyi incelemek için kullanılabilir. Örneğin, ekzositoz ve endositoz 10,19,20,21,22'de Rho-ailesi ve Rab-ailesi GTPazların, guanin-nükleotid değişim faktörlerinin, miyozin motor fragmanlarının ve ADAM17'nin önemini tanımlamak için adenoviral transdüksiyon kullanıldı ve adenoviral transdüksiyon yakın zamanda ürotelyal mekanotransdüksiyonuincelemek için kullanıldı 9 . Benzer şekilde, adenoviral transdüksiyon, insan hastalığını araştırırken ve tedavi ederken alakalı olabilir. Örneğin, Ramesh ve ark. başlangıçta adenoviral transdüksiyonun tümör hücrelerini hedeflemek için yararlı bir yol olabileceğini önesürdüler 18. Çalışmaları daha çok bir ilke kanıtı yaklaşımı olsa da, kanser hücrelerinde toksinlerin ekspresyonunun veya bağışıklık sistemi tarafından tanınabilecek epitopların ekspresyonunun yararlı stratejiler olacağı düşünülebilir. Adenoviral transdüksiyon, gen ürünlerinin aşırı ekspresyonunun veya az ekspresyonunun hastalığa yol açtığı hastalıkları anlamada da yararlı olabilir. Bir örnek olarak, interstisyel sistitli hastaların mesanelerinden yapılan biyopsiler, CLDN2 ekspresyonunda 90 kat artış gösterir29. İlginç bir şekilde, adenoviral transdüksiyon kullanarak CLDN2'yi aşırı eksprese etmek, sıçanlarda bu hastalığın semptomlarının çoğunu çoğaltır10. Bu nedenle, CLDN2 bu bozukluğu olan hastaların tedavisinde bir hedef olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, P30DK079307 (M.G.D.'ye), NIH hibesi R01DK119183 (G.A. ve MDC'ye), NIH hibesi R01DK129473 (G.A.'ya), Amerikan Üroloji Derneği Kariyer Geliştirme ödülü ve Winters Vakfı hibesi (N.M.'ye), Pittsburgh Böbrek Araştırmaları Merkezi'nin Hücre Fizyolojisi ve Model Organizmalar Böbrek Görüntüleme Çekirdekleri (P30DK079307) tarafından bir pilot proje ödülü ile desteklenmiştir. ve bu el yazmasında sunulan görüntülerin bazılarını yakalamak için kullanılan konfokal sistemin satın alınmasını finanse eden S10OD028596 (G.A.'ya) tarafından.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Tags

Biyoloji Sayı 188
Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter