Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Expressie van transgenen in native blaasurotheel met behulp van adenovirus-gemedieerde transductie

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Er worden methoden beschreven voor het genereren van grote hoeveelheden recombinante adenovirussen, die vervolgens kunnen worden gebruikt om het inheemse knaagdier urotheel te transduceren, waardoor expressie van transgenen of downregulatie van endogene genproducten mogelijk is.

Abstract

Naast het vormen van een barrière met hoge weerstand, wordt verondersteld dat het urotheel dat het nierbekken, urineleiders, blaas en proximale urethra bekleedt, informatie over zijn omgeving waarneemt en doorgeeft aan de onderliggende weefsels, waardoor de ledigingsfunctie en het gedrag worden bevorderd. Verstoring van de urotheliale barrière, of de sensorische / transducerfunctie, kan leiden tot ziekte. Het bestuderen van deze complexe gebeurtenissen wordt belemmerd door een gebrek aan eenvoudige strategieën om de gen- en eiwitexpressie in het urotheel te veranderen. Hier worden methoden beschreven waarmee onderzoekers grote hoeveelheden adenovirus met een hoge titer kunnen genereren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om knaagdier urotheel met hoge efficiëntie en op een relatief eenvoudige manier te transduceren. Zowel cDNA's als kleine storende RNA's kunnen worden uitgedrukt met behulp van adenovirale transductie, en de impact van transgenexpressie op de urotheliale functie kan 12 uur tot enkele dagen later worden beoordeeld. Deze methoden zijn breed toepasbaar op studies van normale en abnormale urotheliale biologie met behulp van muis- of rattendiermodellen.

Introduction

Het urotheel is het gespecialiseerde epitheel dat het nierbekken, de urineleiders, de blaas en de proximale urethra1 bekleedt. Het bestaat uit drie lagen: een laag van sterk gedifferentieerde en gepolariseerde vaak bi-nucleate paraplucellen, waarvan de apicale oppervlakken baden in urine; een tussenliggende cellaag met een populatie van bi-nucleaat transit-versterkende cellen die aanleiding kunnen geven tot oppervlakkige paraplucellen als reactie op hun acute verlies; en een enkele laag basale cellen, waarvan een subset functioneert als stamcellen die het geheel van het urotheel kunnen regenereren als reactie op chronische schade. Paraplucellen zijn voornamelijk verantwoordelijk voor het vormen van de urotheliale barrière met hoge weerstand, waarvan componenten een apicale membraan (rijk aan cholesterol en cerebrosiden) met een lage permeabiliteit voor water en opgeloste stoffen omvatten, en een apicale junctionele complex met hoge weerstand (bestaande uit tight junctions, adherens junctions, desmosomen en een bijbehorende actomyosinering)1 . Zowel het apicale oppervlak van de paraplucel als de junctionele ring zetten uit tijdens het vullen van de blaas en keren snel terug naar hun voorgevulde toestand na het legen van 1,2,3,4,5. Naast zijn rol in de barrièrefunctie, wordt ook verondersteld dat het urotheel sensorische en transducerfuncties heeft die het mogelijk maken om veranderingen in het extracellulaire milieu (bijv. Stretch) te detecteren en deze informatie via afgifte van mediatoren (waaronder ATP, adenosine en acetylcholine) door te geven aan onderliggende weefsels, waaronder suburotheliale afferente zenuwprocessen 6,7,8 . Recent bewijs van deze rol wordt gevonden bij muizen zonder urotheliale expressie van zowel Piezo1 als Piezo2, wat resulteert in een veranderde ledigingsfunctie9. Bovendien ontwikkelen ratten die het tight-junction porievormende eiwit CLDN2 in de paraplucellaag overexpressie overexpressie, ontsteking en pijn analoog aan die bij patiënten met interstitiële cystitis10. Er wordt verondersteld dat verstoring van de urotheliale sensorische / transducer- of barrièrefunctie kan bijdragen aan verschillende blaasaandoeningen 6,11.

Een beter begrip van de biologie van het urotheel in normale en ziektetoestanden hangt af van de beschikbaarheid van hulpmiddelen waarmee onderzoekers gemakkelijk endogene genexpressie kunnen downreguleren of de expressie van transgenen in het inheemse weefsel mogelijk maken. Hoewel een benadering om genexpressie te downreguleren is om voorwaardelijke urotheliale knock-out muizen te genereren, hangt deze aanpak af van de beschikbaarheid van muizen met floxed allelen, is arbeidsintensief en kan maanden tot jaren duren om12 te voltooien. Het is dan ook niet verrassend dat onderzoekers technieken hebben ontwikkeld om het urotheel te transfecteren of te transduceren, wat kan leiden tot resultaten op een kortere tijdschaal. Gepubliceerde methoden voor transfectie omvatten het gebruik van kationische lipiden13, anti-sense fosforothioated oligodeoxynucleotiden 14, of antisense nucleïnezuren gebonden aan het HIV TAT-eiwit dat 11-mer peptide15 penetreert. De focus van dit protocol ligt echter op het gebruik van adenovirale gemedieerde transductie, een goed bestudeerde methodologie die efficiënt is in genafgifte aan een breed scala aan cellen, is getest in tal van klinische onderzoeken en werd onlangs gebruikt om het cDNA dat codeert voor het COVID-19 capsid-eiwit te leveren aan ontvangers van één variant van het COVID-19-vaccin16, 17. Voor een meer grondige beschrijving van de levenscyclus van het adenovirus, adenovirale vectoren en klinische toepassingen van adenovirussen, wordt de lezer verwezen naar referentie17.

Een belangrijke mijlpaal in het gebruik van adenovirussen om het urotheel te transduceren, was een rapport van Ramesh et al. dat korte voorbehandelingen met detergentia, waaronder N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) dramatisch verbeterde transductie van het urotheel door een adenovirus dat codeert voor β-galactosidase18. Met behulp van deze proof-of-principle studie als leidraad, is adenovirale transductie van het urotheel nu gebruikt om een verscheidenheid aan eiwitten tot expressie te brengen, waaronder Rab-familie GTPases, guanine-nucleotide uitwisselingsfactoren, myosine motorfragmenten, porievormende tight junction-geassocieerde claudinen en ADAM17 10,19,20,21,22 . Dezelfde aanpak werd aangepast om kleine interfererende RNA's (siRNA) tot expressie te brengen, waarvan de effecten werden gered door co-expressie van siRNA-resistente varianten van het transgen22. Het hier beschreven protocol omvat algemene methoden om grote hoeveelheden sterk geconcentreerd adenovirus te genereren, een vereiste voor deze technieken, evenals aanpassingen van de methoden van Ramesh et al.18 om transgenen in het urotheel met hoge efficiëntie tot expressie te brengen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimenten met het genereren van adenovirussen, waarvoor BSL2-certificering vereist is, werden uitgevoerd onder goedkeuring van de milieugezondheids- en veiligheidskantoren van de Universiteit van Pittsburgh en het Institutional Biosafety Committee. Alle uitgevoerde dierproeven, inclusief adenovirale transductie (waarvoor ABSL2-certificering vereist is), werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen / voorschriften van het beleid van de volksgezondheidsdienst inzake humane zorg en gebruik van proefdieren en de dierenwelzijnswet, en onder de goedkeuring van de University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Handschoenen, oogbescherming en geschikte kleding worden gedragen voor alle procedures waarbij recombinante virussen betrokken zijn. Alle vloeibare of vaste afvalstoffen moeten worden verwijderd zoals hieronder beschreven. Het strooisel van de dieren na transductie en eventuele resulterende kadavers van dieren moeten worden behandeld als biologisch gevaarlijk materiaal en worden verwijderd volgens het institutionele beleid.

1. Bereiding van adenovirusvoorraden met een hoge titer

OPMERKING: Effectieve transductie van knaagdierblazen hangt af van het gebruik van gezuiverde en geconcentreerde virale voorraden, meestal 1 x 107 tot 1 x 108 infectieuze virale deeltjes (IVP) per μL. Dit deel van het protocol is gericht op het genereren van adenovirusvoorraden met een hoge titer uit bestaande viruspreparaten. Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een celkweekkap met behulp van steriele reagentia en hulpmiddelen. Hoewel de beschikbare stammen van adenovirus die tegenwoordig worden gebruikt, replicatiedefect zijn, hebben de meeste instellingen goedkeuring nodig om adenovirussen en recombinant DNA te gebruiken. Dit omvat vaak de aanwijzing van een celkweekruimte als een BSL2-goedgekeurde faciliteit om adenovirussen te produceren en te versterken. Enkele algemene overwegingen omvatten het gebruik van maskers, oogbescherming, handschoenen en passende kleding in alle stadia van virusproductie en -zuivering. Bij het uitvoeren van centrifugeren worden veiligheidsdoppen aanbevolen als de centrifugebuizen geen nauwsluitende doppen hebben. Alle niet-wegwerpmaterialen, inclusief mogelijk verontreinigde veiligheidsdoppen, flessen en rotoren van centrifuge, worden behandeld met een antivirale oplossing (zie materiaaltabel) en vervolgens gespoeld met water of 70% ethanol. Vloeibaar afval wordt behandeld door bleekmiddel toe te voegen tot een eindconcentratie van 10% (v/v). De verwijdering van deze vloeibare afvalstoffen zal afhangen van het institutionele beleid. Vast afval wordt doorgaans verwijderd in biologisch gevaarlijk afval.

  1. Kweek HEK293T cellen
    1. Ontdooi een bevroren injectieflacon met HEK293T-cellen in een waterbad bij 37 °C en gebruik een pipet van 5 ml om de cellen over te brengen naar een celkweekschaal met een diameter van 15 cm. Voeg met behulp van een pipet van 25 ml langzaam 20 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% (v / v) foetaal runderserum en penicilline / streptomycine-antibioticum (DMEM-FBS-PS) toe aan het gerecht. Incubeer de cellen in een 37 °C celkweekincubator vergast met 5% (v/v) CO2 totdat ze 80%-90% samenvloeiing bereiken (~2 x 107 cellen).
    2. Gebruik een glazen pipet die aan een vacuümbron is bevestigd, zuig het medium op en spoel de cellen vervolgens af door 20 ml steriele PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 136,9 mM NaCl en 8,9 mM Na2HPO4) met een pipet van 25 ml over te brengen naar de schaal. Zuig de gebruikte PBS aan en gebruik vervolgens een pipet van 5 ml om 3 ml warme (37 °C) proteïnase-oplossing (zie materiaaltabel) over te brengen naar de schaal, waarbij de schaal in de celkweekincubator wordt geïncubeerd totdat de cellen loskomen (~ 3-4 min).
      OPMERKING: Effectieve proteolyse kan het beste worden beoordeeld door de schaal langzaam heen en weer te kantelen op zoek naar afgifte van cellen uit alle delen van de schaal in de bewegende vloeistof. HEK293T-cellen zijn gevoelig voor uitgebreide proteïnasebehandeling en zullen sterven als ze langer dan een paar minuten in proteïnase-oplossing worden achtergelaten.
    3. Gebruik een pipet van 10 ml om 7 ml DMEM-FBS-PS over te brengen naar de schaal van losgemaakte cellen en gebruik vervolgens dezelfde pipet om de cellen en het medium op te zuigen. Breng de gesuspendeerde cellen over in een conische buis van 50 ml en pelleteer de cellen vervolgens door de suspensie gedurende 5 minuten in een klinische centrifuge met lage snelheid bij 200 x g te centrifugeren. Zuig het supernatant op met behulp van een glazen pipet die aan een vacuümbron is bevestigd. Gebruik een pipet van 25 ml om de celpellet te resuspenderen in 15 ml DMEM-FBS-PS.
    4. Voeg 1 ml van de celsuspensie toe aan elk van de vijftien schalen van 15 cm met 19 ml DMEM-FBS-PS.
    5. Laat de cellen groeien in een weefselkweekincubator totdat ze 85% -90% samenvloeiing bereiken (~ 3-4 dagen).
  2. Bereid een verdunde virusoplossing
    1. Voeg ~1,5 x 10 9 tot 3 x 109 IVP van een bestaande virusvoorraad (5-10 IVP/cel) toe aan een 50 ml conische buis gevuld met 45 ml DMEM zonder FBS of antibiotica.
      OPMERKING: Het is mogelijk om een lagere concentratie van het virus te gebruiken (1-5 IVP / cel); Het zal echter langer duren voordat de virusproductie volgt.
  3. Infecteer de gekweekte cellen met het virus.
    1. Gebruik een glazen pipet die aan een vacuümbron is bevestigd en zuig het medium uit de bijna samenvloeiende cellen in stap 1.1.5.
    2. Gebruik een pipet van 25 ml om 3,0 ml verdunde virusoplossing (bereid in stap 1.2.1) over te brengen naar elke celkweekschaal. Gebruik vervolgens een pipet van 10 ml om 7,0 ml DMEM-medium (zonder FBS of antibiotica) aan elk gerecht toe te voegen. Incubeer gedurende 60 minuten in een celkweekincubator en voeg vervolgens 10 ml DMEM met 20% (v / v) FBS en 2x PS toe aan elk gerecht.
      OPMERKING: Het gebruik van een van de 15 schotels als controleplaat (waarin geen virus is toegevoegd) maakt het gemakkelijker om virus-geïnduceerde celafronding en dood in geïnfecteerde cellen in de volgende stap te identificeren.
    3. Incubeer de cellen in de celkweekincubator gedurende 2-4 dagen totdat de meerderheid van hen begint af te ronden en >60% van de cellen is losgekomen.
      OPMERKING: Als u een lagere titer van het virus gebruikt, kan het tot een week duren voordat celdood optreedt. Als celdood niet binnen een week optreedt, is het waarschijnlijk dat het proces moet worden herhaald met een hogere titer van het virus.
  4. Herstel virus van cellysaten
    1. Gebruik een celschraper om de bodem van elke schaal te schrapen en gehechte cellen in het medium vrij te geven.
    2. Gebruik een pipet van 25 ml om het medium, de cellen en het celafval van elke celkweekschaal te verzamelen en samen te voegen tot een conische celkweekbuis van 50 ml.
      OPMERKING: Om middelen te besparen, kan het medium van twee gerechten worden gecombineerd tot één buis van 50 ml.
    3. Pellet het celmateriaal door centrifugeren met behulp van een tafelcentrifuge met lage snelheid: 5 min bij kamertemperatuur bij 3.000 x g. Gebruik een glazen pipet die aan een vacuümapparaat is bevestigd om het supernatant op te zuigen.
    4. Gebruik een pipet van 10 ml, gecombineerd met trituratie, om al het resulterende gepelletiseerde materiaal te consolideren in een totaal van 7 ml steriel gefilterde 100 mM Tris-HCl pH 7,4 met 10 mM EDTA (Tris-EDTA-oplossing). Breng het samengevoegde materiaal over in een steriele conische buis van 15 ml celkweek en plaats het op ijs.
      OPMERKING: Op dit punt kan de virusvoorbereiding voor onbepaalde tijd worden ingevroren bij -80 °C.
  5. Cellysaten bereiden
    1. Voer drie vries-dooicycli uit om de resterende cellen te verstoren en zo de gevormde virusdeeltjes verder vrij te maken. Bevries het samengevoegde materiaal in stap 1.4.4 door de buis onder te dompelen in vloeibare stikstof (~ 30-60 s). Ontdooi het monster snel door de buis in een incubator van 37 °C te plaatsen. Draai het monster gedurende 15 s en herhaal vervolgens de snelle vries- en ontdooiprocedure nog eens 2x.
      OPMERKING: De virusoplossing kan snel worden ontdooid in een 37 ° C in een waterbad, maar voorzichtigheid is geboden omdat de temperatuurschommelingen ervoor kunnen zorgen dat de buis barst, waardoor virusoplossing in het waterbad vrijkomt. Om dit te voorkomen, plaatst u de buis met het virale supernatant in een grotere buis, die vervolgens in het waterbad wordt geplaatst.
    2. Gebruik een pipet van 10 ml om het driemaal bevroren ontdooide celmateriaal over te brengen naar een centrifugebuis met supersnelheid. Centrifugeer het materiaal in de buis gedurende 30 minuten bij 4 °C supersnelle centrifuge bij ~ 18.500 x g.
    3. Herstel de ~ 7 ml virusrijk supernatant met een pipet van 10 ml en breng deze over in een conische buis van 15 ml. Bewaar het monster op ijs tot de volgende stap.
      OPMERKING: Overweeg op dit punt een aliquot van het ongezuiverde virale supernatant te bewaren als een preambule om een nieuw viruspreparaat te starten (of als back-up). Bewaar dit aliquot bij -80 °C.
  6. Isoleer en zuiver het virus met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie.
    1. Bereid een discontinue gradiënt van CsCl in een 12 ml PET dunwandige, heldere ultracentrifugebuis (zie materiaaltabel) of gelijkwaardig. Gebruik een spuit van 3 ml uitgerust met een naald van 18 G om voorzichtig 2,5 ml 1,4 g/ml CsCl-oplossing in de bodem van de buis te brengen en gebruik vervolgens een nieuwe spuit/naald om deze te bedekken met 2,5 ml 1,25 g/ml CsCl-oplossing.
      OPMERKING: Het direct op een reeds bestaande laag laten vallen van oplossingen zal aanzienlijke en ongewenste vermenging veroorzaken. Plaats in plaats daarvan het afgeschuinde deel van de naald tegen de rand van de buis en druk vervolgens heel langzaam op de zuiger van de spuit, waarbij u de positie van de naald verhoogt terwijl de oplossing de buis vult.
    2. Laad de ~ 7 ml viraal supernatant op de top van de gradiënt op een vergelijkbare manier met behulp van een spuit van 10 ml. Als er meer dan 2-3 mm ruimte is tussen het virale supernatant en de bovenkant van de buis, voeg dan extra Tris-EDTA-oplossing toe om de buis te vullen totdat er slechts 2-3 mm ruimte overblijft.
    3. Maak een op dezelfde manier geprepareerde balansbuis, die lagen CsCl bevat, maar Tris-EDTA-oplossing vervangt voor het virale supernatant.
      OPMERKING: De twee buizen moeten identieke gewichten (en vergelijkbare dichtheden) hebben om een potentieel gevaarlijke onevenwichtige belastingssituatie in de ultracentrifuge te voorkomen.
  7. Isoleer het virus met behulp van rate-zonale ultracentrifugatie.
    1. Laad de hellingen gevormd in stappen 1.6.2-1.6.3 in de bakken van een SW41-rotor of gelijkwaardig. Schroef de emmerdoppen in, plaats de rotor in een ultracentrifuge (voorgekoeld tot 4 °C) en centrifugeer gedurende 1 uur bij ~ 150.000 x g.
    2. Breng tijdens het centrifugeren de in stap 1.9.1 beschreven kolom in evenwicht.
  8. Geïsoleerde virusdeeltjes terugwinnen
    1. Maak aan het einde van de centrifugatiestap de emmers voorzichtig los van de rotor en verwijder in een celkweekkap de emmerdoppen en verwijder vervolgens de buizen en plaats ze in een rek.
    2. Verzamel het gestreepte materiaal, rijk aan virusdeeltjes, dat drijft op het grensvlak tussen de 1,25 g/ml en 1,4 g/ml CsCl-oplossing. Houd de buis met de gradiënt over de onderste helft van een celkweekschaal (die gemorst materiaal zal vangen), gebruik een naald van 1 inch 18 G die is bevestigd aan een spuit van 3 ml om de buis voorzichtig door te prikken, net onder het gestreepte virus. Zuig het virus langzaam op, dat meestal wordt hersteld in ~ 1 ml.
    3. Verwijder de naald uit de buis, waardoor het resterende materiaal in de gradiënt uit de buis in de onderste helft van de celkweekschaal stroomt (eventuele vloeistoffen moeten als gevaarlijk afval worden behandeld).
    4. Breng de virusoplossing in de spuit over in een steriele microcentrifugebuis op ijs.
      OPMERKING: Wanneer u het virus in deze stap herstelt, plaatst u de naald zo dat het lumen van de naald naar boven is gericht met de naaldopening een paar mm onder de virusrijke band. Vermijd besmetting door de dunne band van onjuist geassembleerd virus die soms 2-3 mm boven het gestreepte virus wordt waargenomen (zie dunne zwarte pijl in figuur 1A).
  9. Verwijder CsCl uit het monster door gelfiltratie.
    1. Balanceer een PD-10-kolom (voorverpakt met Sephadex G-25M), vastgeklemd aan een steunstandaard, met 50 ml steriel gefilterd PBS van 0,2 μm met 10% (v / v) glycerol.
      OPMERKING: De eerste evenwichtsstap duurt 2-3 uur om te voltooien en is noodzakelijk om te zorgen voor volledige uitspoeling van conserveermiddelen die door de fabrikant worden gebruikt om de kolom te stabiliseren.
    2. Laat de wasoplossing zich terugtrekken onder de fries (een beschermende schijf van wit materiaal aan de bovenkant van het kolommedium) en breng vervolgens voorzichtig de gezuiverde virusoplossing die in stap 1.8 is verzameld over naar de bovenkant van de kolom. Laat de virusrijke oplossing zich terugtrekken onder de frit en begin dan met het vullen van de kolom met PBS-glycerol.
      OPMERKING: Een functie van de frit is om te voorkomen dat de kolom droogloopt. Als gevolg hiervan worden korte vertragingen getolereerd voordat er meer eluant aan de kolom wordt toegevoegd.
    3. Verzamel het eluaat in 12 steriele microcentrifugebuizen, 0,5 ml per fractie.
  10. Bepaal de virale opbrengst.
    1. Bepaal de piekvirusfracties met behulp van spectrofotometrie. Bereid een verdunning van 1:100 van elke fractie in PBS en meet de OD260 in een spectrofotometer, met behulp van een 1:100 verdunning van alleen buffer als blanco. De virusdeeltjes moeten in het leegtevolume elueren, te beginnen rond fractie 6. Bundel de fracties met de hoogste OD260-waarden .
    2. Maak een verdunning van 1:100 van de gepoolde virale fracties en meet de OD260 opnieuw. Bereken de uiteindelijke concentratie van virusdeeltjes en het aantal IVP in de gepoolde fracties met behulp van de volgende formule: Virusdeeltjes per ml = OD260 × 100 (dit corrigeert voor de verdunningsfactor) × 1012. Een algemene schatting is dat 1% van de virusdeeltjes IVP is, als zodanig: IVP/ml = OD 260 × 100 × 10 10 of IVP/μL = OD260 ×100 × 10 7.
  11. Aliquot de gepoolde virusfracties (met 5 x 107 tot 1 x 108 IVP) in steriele microcentrifugebuizen of cryovialen. Bewaar de monsters bij -80 °C.

2. Transductie van knaagdierblaas

OPMERKING: Als deze techniek nieuw is, wordt aanbevolen het aantal dieren dat in één keer wordt getransduceerd te beperken tot 2-4. Dit kan worden bereikt door de starttijden voor elk dier te spreiden, met name tijdens de wasmiddelbehandeling in stap 2.2 en vervolgens de virusincubatie in stap 2.3. Ervaren onderzoekers kunnen maximaal zes dieren tegelijk transduceren.

  1. Catheteriseer de blaas
    1. Verdoof vrouwelijke C57Bl/6J muizen (meestal 8-10 weken oud, ~20-25 g) of vrouwelijke Sprague Dawley ratten (meestal 2-3 maanden oud, ~250 g) met behulp van een vaporizer met een aangehechte neuskegel. Kalibreer de vaporizer om 3,0% (v/v) isofluraan, 97% (v/v) O 2 voor muizen of 4,0% (v/v) isofluraan, 96% (v/v) O2 voor ratten te produceren. Bevestig dat de dieren verdoofd zijn door ervoor te zorgen dat ze niet reageren op teenknijpen (meestal na 1-2 minuten).
    2. Handhaaf de lichaamstemperatuur van het dier door de dieren op een verwarmd pad te plaatsen. Controleer het dier gedurende het transductieprotocol om ervoor te zorgen dat de dieren worden verdoofd en geen pijn ervaren tijdens deze procedure.
    3. Verlaag isofluraan tot 1,5% (v/v) voor muizen of 2,0% (v/v) voor ratten en houd de dieren onder narcose voor de duur van het protocol.
    4. Om te voorkomen dat er lucht in de blaas wordt gebracht, vult u het plastic kathetergedeelte van een infuuskatheter (zie materiaaltabel) en de bijbehorende naaf met steriele PBS met behulp van een transferpipet.
    5. Met het dier in rugligging, veeg de externe meatus met 70% alcohol en breng de steriele katheter in de externe meatus, vervolgens de urethra en vervolgens in de blaas.
      1. Om deze taak uit te voeren, gebruikt u een fijne tang om het weefsel dat de externe meatus vormt voorzichtig vast te pakken en verticaal uit te breiden, weg van het dier. Breng met de andere hand de katheter voorzichtig verticaal ongeveer 3-4 mm in de urethrale meatus (een hoop vlees net boven de opening van de vagina). Laat vervolgens, vanwege een bocht in de urethra, de katheter zakken, ingebracht in de externe meatus, in de richting van de staart van het dier, wat de toegang tot het deel van de urethra dat onder het schaambeen passeert, en uiteindelijk in de blaas vergemakkelijkt
        . OPMERKING: Vooral in het geval van de muis kan de katheter te lang zijn en mag niet meer dan 1,0-1,1 cm ervan in het dier worden ingebracht. Anders zal schade aan het blaasslijmvlies ontstaan. Om dit te voorkomen, markeert u de katheter ~ 1 cm onder de punt en plaatst u de katheter vervolgens niet verder dan deze markering.
    6. Laat de urine in de blaas uitlekken. Verwijder eventuele resterende urine door de manoeuvre van Credé uit te voeren: masseer en druk zachtjes op de blaasbult in de onderbuik.
  2. Maak het urotheel ontvankelijk voor transductie door het te behandelen met een reinigingsmiddeloplossing.
    1. Was de muis- of rattenblaas door een steriele spuit van 1 ml gevuld met PBS aan de katheterhub te bevestigen. Injecteer 100 μL steriele PBS in de muizenblaas (of 450 μL in het geval van de rattenblaas). Maak de spuit los van de katheterfitting en laat de PBS leeglopen. Voer indien nodig Crede's manoeuvre uit om overtollig blaasvocht te verwijderen.
    2. Inbreng 100 μL van 0,1% (m/v) N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) (opgelost in PBS en 0,2 μm filter-gesteriliseerd) in de muizenblaas met behulp van een steriele spuit van 1 ml. Houd de DDM gedurende 10 minuten in de blaas door de spuit op zijn plaats te laten. Bij ratten wordt het volume DDM verhoogd tot 450 μL.
    3. Verwijder de DDM uit de blaas door de spuit los te maken en uit te laten lopen. Voer Crede's manoeuvre uit indien nodig.
  3. Introduceer het virus in de blaas.
    1. Bevestig een steriele spuit van 1 ml aan de katheterhub en breng 0,5 x 107 tot 1 x 108 IVP adenovirus (bereid in stap 1), verdund in 100 μL steriele PBS voor muizen of 450 μL voor ratten, in de blaas. Laat de spuit op de katheter zitten om te voorkomen dat de virusoplossing ontsnapt.
    2. Maak na 30 minuten de spuit los en laat de virusoplossing de blaas evacueren op een wegwerppad. Dep eventuele resterende virusoplossing met een absorberend doekje en gooi het maandverband en doekje weg in biologisch gevaarlijk afval.
      OPMERKING: Glycerol is cytotoxisch. Als zodanig is het maximale volume virusoplossing dat in muizen wordt ingebracht beperkt tot 5 μL (wat bij verdunding in 100 μL PBS zou resulteren in een uiteindelijke glycerolconcentratie van ~ 0,5% [v / v]). Bovendien is het mogelijk om de transductie-efficiëntie te verbeteren door het aantal geïnstilleerde IVP te verhogen en door de virusincubatie uit te breiden tot 45 minuten.
    3. Optionele stap: De blaas kan worden gespoeld met PBS zoals beschreven in stap 2.2.1 hierboven; dit is echter niet verplicht.
  4. Laat het dier herstellen.
    1. Stop de stroom van isofluraan en laat het dier herstellen en volledig mobiel zijn voordat het terugkeert naar zijn kooi, vooral als de dieren in groep zijn gehuisvest.
      OPMERKING: Aangezien virustransductie op zich geen waarneembare symptomen of pijn van de lagere urinewegen veroorzaakt, is er meestal geen behoefte aan postoperatieve behandeling. Als het gecodeerde transgen echter toxisch is, kan analgesie of antibiotica na de procedure nodig zijn, zoals vereist door de instelling.
  5. Analyseer de effecten van transgenexpressie 12-72 h na de behandeling met behulp van methoden zoals mRNA in situ hybridisatie, western blot of immunofluorescentie 9,10,23 (zie de representatieve resultaten).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virusvoorbereiding
Een voorbeeld van viruszuivering door dichtheidsgradiëntcentrifugatie is weergegeven in figuur 1A. De lichtroze band, te vinden op het grensvlak van het geladen celmateriaal en de 1,25 g/ml CsCl-laag, bestaat voornamelijk uit verstoorde cellen en hun puin (zie magentapijl in figuur 1A). Het ontleent zijn roze kleur aan de kleine hoeveelheid cultuurmedium die wordt overgenomen van stap 1.5 in het protocol. De relevante virusdeeltjes, die verschijnen als een melkwitte band, worden aangetroffen op het grensvlak van de 1,25 g/ml CsCl- en 1,40 g/ml CsCl-oplossingen (zie gele pijl in figuur 1A). Men kan ook een band van materiaal waarnemen die 2-3 mm boven de verrijkte virusdeeltjes zweeft (zie dunne zwarte pijl in figuur 1A). Het bestaat uit niet-geassembleerde virussen en puin, bevat weinig IVP en moet worden vermeden bij het verzamelen van het virusmonster.

Verdere zuivering van het virus en de bufferuitwisseling met behulp van een PD10-kolom is weergegeven in figuur 1B en de OD260-waarden van de resulterende fracties na elutie zijn weergegeven in figuur 1C. Het lege volume van deze kolommen is ongeveer 3 ml, en dus begint het virus te verschijnen in fractie 6 en piekt het in fractie 9. In dit experiment werden fracties 6-9 gepoold. Hoewel fractie 6 en 7 relatief weinig virusdeeltjes bevatten, bevatten ze voldoende virus om herstel te verdienen en dienen ze om de zeer hoge titerfracties te verdunnen tot een redelijkere concentratie. Fracties 10-12 werden niet opgenomen omdat de toename van OD260 in fractie 11 wijst op de mogelijke aanwezigheid van een tweede verontreinigende piek, die variabel wordt waargenomen in deze preparaten. De gepoolde fractie heeft meestal 1 x 107 tot 1 x 108 IVP / μL en de verwachte opbrengst zou in de orde van grootte van 1 x 10 10 tot 2 x10 11 totale IVP liggen. Dit is voldoende hoeveelheid virus om honderden transducties uit te voeren. Hoewel het mogelijk is om het virus te titeren door plaquetests of door kolonies cellen te tellen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen22, is de 1%-regel in de meeste gevallen voldoende. Deze regel stelt dat 1% van de gezuiverde virusdeeltjes, geschat door het meten van de OD260 van het monster, IVP zijn. Aliquots van virus opgeslagen bij -80 °C hebben een houdbaarheid van 2-5 jaar, hoewel de infectiviteit op lange termijn afneemt. Ontdooide aliquots van het virus kunnen eenmalig opnieuw worden ingevroren bij -80 °C zonder significant verlies van infectiviteit. Herhaaldelijk ontdooien en bevriezen heeft echter een negatieve invloed op de virale infectiviteit.

Blaastransductie
Een belangrijke eerste stap bij het beoordelen van de impact van transductie is het bevestigen van transgenexpressie. Dit kan worden beoordeeld met behulp van verschillende technieken, waaronder hulpmiddelen die mRNA detecteren (bijv. RNAScope), western blot-analyse of het gebruik van immunofluorescentie 9,10,23. Figuur 2 is een voorbeeld van muis urotheel dat werd getransduceerd met een adenovirus dat codeert voor V5-epitoop gelabeld menselijk groeihormoon (V5-hGH)23. Dit eiwit is verpakt in discoïdale/fusiforme blaasjes en kan worden geëxexoteerd tijdens blaasvulling19,23. Western blot-analyse van urotheliale lysaten onthulde V5-hGH-expressie in het urotheel van getransduceerde blazen, maar niet in niet-getransduceerde blazen (figuur 2A). Expressie werd ook bevestigd door immunofluorescentie, in dit geval met behulp van antilichamen die hGH of de V5-epitooptag herkenden (niet-getransduceerde blazen misten signaal, niet getoond) (figuur 2B).

Een ander voorbeeld is transductie van de rattenblaas met een virus dat codeert voor CLDN2, een porievormend tight junction-geassocieerd eiwit24,25. CLDN2 verhoogt de paracellulaire flux van kationen (inclusief K +) en de overexpressie ervan resulteert in ontsteking en ontwikkeling van viscerale pijn10. Western blot-analyse bevestigde de expressie van CLND2 in rattenblazen getransduceerd met adenovirus dat codeert voor Cldn2, maar niet in die getransduceerd met een controle GFP-coderend virus (figuur 2C). Over het algemeen wordt GFP niet als toxisch beschouwd wanneer het in cellen wordt uitgedrukt en dient het dus als een nuttige controle. Het gebruik van GFP stelt de onderzoeker ook in staat om te bevestigen dat transductie werkt. Immunofluorescentieanalyse bevestigde verder exogene CLDN2-expressie in urotheliale paraplucellen getransduceerd met virus dat codeert voor Cldn2 cDNA (rood signaal in figuur 2D). Bovendien, vergelijkbaar met endogene CLDN2 (niet weergegeven), is de tot expressie gebrachte CLDN2 gelokaliseerd in TJP1-gelabelde tight junctions, evenals de basolaterale oppervlakken van de paraplucellen (CLDN2 is groen gelabeld in figuur 2E)10. In het geval van CLDN2-expressie was het het hoogst een dag na transductie, maar daarna weggelopen en was het na 15 dagen nauwelijks detecteerbaar.

Een tweede overweging is, welke celtypen het doelwit zullen zijn van adenovirale transductie. Terwijl het bij ratten mogelijk is om meestal de paraplucellaag19 te transduceren, kunnen bij muizen alle lagen van het urotheel worden getransduceerd, hoewel transductie van de tussenliggende en basale cellagen variabel kan zijn. Belangrijk is dat in het geheel van de blaaswand alleen het urotheel wordt getransduceerd en geen ander weefsel wordt aangevallen door het ingebrachte adenovirus (figuur 3).

Hoewel analyses van getransduceerde cellen op het niveau van één cel kunnen worden uitgevoerd, moet men bij het onderzoeken van een algemeen blaasfenotype de meerderheid van de urotheliale cellen transduceren. Het is dus belangrijk om de efficiëntie van transductie te definiëren (d.w.z. welke fractie van urotheliale cellen wordt getransduceerd). In het geval van het Cldn2-tot expressie brengende adenovirus werd bijvoorbeeld >95% van de paraplucellen getransduceerd (zie figuur 2D). Een ander voorbeeld is het beeldveld in figuur 3, waar het tellen van het aantal getransduceerde paraplucellen (in dit geval het uitdrukken van de Ca2+ sensor GCAMP5G), een efficiëntie laat zien die 95% benadert. Men moet echter cellen onderzoeken in willekeurige velden die door de blaaswand zijn genomen om een nauwkeurige en onbevooroordeelde schatting van de transductie-efficiëntie te verkrijgen.

Figure 1
Figuur 1: Zuivering van adenovirus. (A) Adenovirusdeeltjes geproduceerd door geïnfecteerde HEK293T-cellen werden gezuiverd door centrifugatie op een discontinue CsCl-gradiënt bestaande uit een laag van 1,4 g/ml CsCl, een laag van 1,25 g/ml CsCl en een laag monster (S) verdund in Tris-EDTA-oplossing. Het celmateriaal (roze pijl) hoopt zich op bij de S/1.25-interface, terwijl het gezuiverde adenovirus zweeft op de 1.25/1.4-interface (gele pijl). Een klein bandje van verkeerd geassembleerd virus zweeft boven de laatste (dunne zwarte pijl). (B) De adenovirusrijke band in de gradiënt wordt teruggewonnen met behulp van een naald en de CsCl wordt uit het adenovirus verwijderd door gelfiltratie met behulp van een met G25 Sephadex gevulde PD10-kolom in evenwicht met PBS die 10,0% (v / v) glycerol bevat. Het oppervlak van de Sephadex wordt beschermd door een poreuze, plastic friet. (C) Fracties, 0,5 ml, werden verzameld uit de PD10-kolom. De OD260 van de fracties werden gemeten in een spectrofotometer en de waarden werden uitgezet. Virusrijke fracties elueren in het leegtevolume, dat begint bij fractie 6 en zich uitstrekt tot fractie 9. Gepoolde fracties voor dit representatieve experiment zijn blauw gearceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Transductie van knaagdierblaas urotheel met adenovirussen die coderen voor V5-hGH of CLDN2. (A) Muis urotheel werd ongetransduceerd gelaten (UT) of getransduceerd met adenovirussen die coderen voor V5 epitoop gelabeld menselijk groeihormoon (hGH). Na 24 uur werden de blazen teruggevonden, urotheliale lysaten werden bereid en onderworpen aan natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel-elektroforese, en V5-hGH-expressie bevestigd met behulp van western blots onderzocht met een antilichaam tegen hGH. (B) Detectie van V5-hGH in muis urotheel doorsneden en gekleurd met behulp van antilichamen tegen hGH (groen) of het V5-epitoop (rood) en fluorofoor-gelabelde secundaire antilichamen. Immunofluorescentie werd opgevangen met behulp van confocale microscopie. Monsters werden gecounterd met TO-PRO3 om kernen te labelen. (C-F) Rat urotheel werd getransduceerd met een virus dat codeert voor rat CLDN2 (algemene naam claudin-2) of GFP (algemene naam groen fluorescerend eiwit) als controle. (C) Detectie van exogene CLDN2 door western blotting met behulp van een antilichaam opnieuw CLDN2. Merk op dat het endogene CLDN2 tot expressie komt bij lage niveaus en niet wordt gedetecteerd in dit experiment. (D) Transductie van de paraplucellaag wordt onthuld door immunofluorescentie en confocale microscopie. De grenzen van de cel worden onthuld door het weefsel samen te kleuren met FITC-falloidine, dat het corticale actinecytoskelet labelt. (E) Detectie van exogene CLDN2 en TJP1 (algemene naam ZO1) door immunofluorescentie en confocale microscopie van geheel gemonteerd of dwarsdoorsneden urotheheel. Kleine witte pijlen geven de locatie van de tight junction aan en kleine magenta pijlpunten markeren de locatie van intracellulaire accumulaties van CLDN2 in het celcytoplasma. Eerder bleek het te gaan om Golgi-geassocieerde CLDN210. (F) Na transductie werden de dieren geëuthanaseerd op de aangegeven dagen na infectie. Exogene CLDN2-expressie werd gedetecteerd met behulp van western blotting. Dieren die GFP tot expressie brachten, werden na dag 1 geëuthanaseerd. De gegevens in figuur 2C-E zijn gewijzigd van Montalbetti et al.10 en zijn gereproduceerd met toestemming van de American Physiological Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Efficiëntie van adenovirale transductie. Muisblaas urotheel werd getransduceerd met een adenovirus dat codeert voor de calciumsensor GCaMP5G. De bovenste panelen tonen kleuring voor GCaMP5G (gedetecteerd met behulp van een antilichaam tegen groen fluorescerend eiwit; GFP, groen), tonen de middelste panelen de verdeling van DAPI-gekleurde kernen (blauw) en rhodamine-falloidine-gelabelde actine (rood), en de onderste panelen zijn een samensmelting van de drie signalen. De witte pijlpunten in het onderste paneel zijn de zeldzame paraplucellen die niet worden getransduceerd. De totale efficiëntie van transductie van paraplucellen in deze afbeelding is ~ 95%. Merk op dat alleen het urotheel wordt getransduceerd. De kadergebieden worden vergroot in de panelen aan de rechterkant. Het gebied in box 1 bestaat voornamelijk uit getransduceerde paraplucellen. Het gebied in box 2 is urotheel met efficiënte transductie van paraplucellen, maar minder efficiënte transductie van de onderliggende cellagen. LP = lamina propria; ME = muscularis externa; Se = serosa; Ut = urothelium. De beelden werden verkregen met behulp van een confocale microscoop (zie Materiaaltabel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Terwijl Ramesh et al. zich richtten op het ontwikkelen van strategieën om adenovirale transductie te gebruiken bij de behandeling van blaaskanker 18, hebben recentere rapporten het nut van deze technieken aangetoond bij het bestuderen van normale urotheliale biologie / fysiologie en pathofysiologie 10,18,19,20,21 . De belangrijkste kenmerken van deze aanpak zijn onder meer: (i) In het geheel van de blaaswand van knaagdieren wordt alleen het urotheel getransduceerd 10,19,20,21,22. In het geval van ratten is transductie meestal beperkt tot de paraplucellaag, terwijl bij muizen het geheel van het urotheel kan worden gericht; (ii) Deze benadering kan worden gebruikt om eiwitten of siRNA's tot expressie te brengen 10,19,20,21,22; (iii) De efficiëntie van transductie kan 70%-95% benaderen (zie bijvoorbeeld figuur 3)18,20; iv) Een dag na transductie is de ultrastructuur van het urotheel, de integriteit van het weefsel, de aanwezigheid van een barrière met hoge resistentie (beoordeeld door trans-epitheelresistentie te meten) en de expressie van urotheliale differentiatiemarkers "normaal"10,19. Het enige morfologische effect dat tot nu toe is waargenomen, is een afname van de diameter van de paraplucel (van bovenaf bekeken); ze keren echter terug naar hun normale grootte na 3-4 dagen10,19; v) het urotheel kan worden getransduceerd met maximaal drie verschillende adenovirussen tegelijk18; vi) Transgenexpressie kan worden gewijzigd door titratie van het aantal IVP, dat van invloed is op de hoeveelheid eiwitexpressie, het verlengen of verkorten van de incubatietijd voordat het dier wordt geofferd, of het gebruik van verschillende promotors zoals een tet-gereguleerd systeem (tet-off)19. In het laatste geval kan men een virus dat codeert voor de transactivator / tet-repressor co-expressie en vervolgens de expressie van het transgen moduleren door de concentratie van doxycycline in het dieet van het dier te veranderen.

Hoewel het algemene protocol relatief eenvoudig is, zijn er enkele kritieke stappen waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van deze experimenten. Een daarvan is de beschikbaarheid van virusvoorraden met een hoge titer die van redelijke zuiverheid zijn. Adenovirussen kunnen worden verkregen van commerciële leveranciers, van institutionele virusproductiekernen, van andere onderzoekers, of ze kunnen in eigen huis worden geproduceerd. In het laatste geval wordt het AdEasy-laboratoriumsysteem van Bert Vogelstein aanbevolen omdat de componenten ervan kunnen worden gekocht bij Addgene en adenovirussen die met deze aanpak worden gegenereerd, goed werken bij urotheliale transductie4. Met deze techniek kan men adenovirussen genereren die coderen voor cDNA's zo groot als 8 Kb met behulp van het pAdEasy-1-verpakkingsplasmide (de insert vervangt virale genen E1 en E3), de pAdEasier-1 bacteriële cellen (die coderen voor de adenovirale genen die nodig zijn om virus te produceren) en de productie van replicatie-defecte adenovirussen in HEK293T-cellen (die het vereiste virale E1-eiwit tot expressie brengen). Het vervangen van het pAdEasy-1-verpakkingsplasmide door het pAdEasy-2-verpakkingsplasmide verhoogt echter de verpakkingsgrootte met nog eens 2,7 kB, maar vereist het gebruik van een andere cellijn (E1-getransformeerde menselijke embryonale retinale 911-cellen) omdat de virussen naast E1 en E3 4 geen vroeg gen E4hebben. Expressie van siRNA's kan worden bereikt met behulp van verschillende systemen, waaronder pAdloss, dat in detail wordt beschreven in Kasahara et al.26. Hoewel het mogelijk is om virusrijk celkweekmedium te gebruiken om het urotheel te transduceren, kan deze methode onbetrouwbaar zijn. In plaats daarvan biedt grootschalige virusversterking, CsCl-gradiëntzuivering, gevolgd door gelfiltratie de meest betrouwbare manier om grote hoeveelheden high-titervirus te genereren. De relatieve stabiliteit van het virus bij -80 °C, in combinatie met relatief grote hoeveelheden virus, maakt dit een ideale manier om een consistente voorraad virus te hebben die over een groot aantal experimenten kan worden gebruikt.

Aanvullende kritieke stappen in dit protocol zijn die welke zijn gekoppeld aan het transductieprotocol. Deze omvatten het gebruik van PBS (zonder tweewaardige kationen) als wasmiddel en verdunningsmiddel, en het gebruik van DDM-wasmiddel. Omdat het junctionele complex afhankelijk is van Ca2+ voor een goede werking, bevordert PBS waarschijnlijk virale toegang door de junction-geassocieerde barrière te verstoren. DDM is ook van cruciaal belang; zoals Ramesh et al. meldden, is de efficiëntie van adenovirustransductie buitengewoon laag bij afwezigheid van behandeling met detergentia18. Het werkingsmechanisme van het wasmiddel is echter niet duidelijk. Een incubatie van 10 minuten met DDM is ideaal, maar dit kan worden ingekort tot 5 minuten; Het wordt echter niet aanbevolen dat de incubatie langer duurt dan 10 minuten, omdat het reinigingsmiddel onverwachte schade aan onderliggende weefsels kan veroorzaken. De hoeveelheid gebruikt virus is een kritische parameter, waarbij hogere concentraties over het algemeen leiden tot grotere hoeveelheden transgenexpressie en hogere transductie-efficiënties. De optimale virusconcentratie die de beste combinatie van expressie, efficiëntie en fenotype geeft, moet echter empirisch worden bepaald. Als startconcentratie wordt een bereik van 5,0 x 106 tot 2,0 x 107 IVP per dier aanbevolen. Afhankelijk van het eiwit dat wordt uitgedrukt, resulteert dit in efficiënties in het bereik van 70% -95% 10,19,20,21,22; sommige dominant-negatieve GTPase-constructies zijn echter minder efficiënt (30%-50%) en vereisen een eencellige analysebenadering 4,20. Deze verschillen in efficiëntie kunnen de omzet van het transgen, de toxiciteit ervan of de zuiverheid en opbrengst van het voor transductie gebruikte virus weerspiegelen. Dit laatste kan worden uitgesloten door het uitvoeren van plaque-assays. Hoewel niet hyperkritisch, moet de tijd dat het virus in de blaas blijft lang genoeg zijn om het virus aan zijn CXADR-receptor te laten hechten. Keer minder dan 30 minuten kan de efficiëntie van transductie verlagen, terwijl het verlengen van de incubatietijd tot 45 minuten de efficiëntie kan verhogen; Dit kan echter transgen-afhankelijk zijn. De laatste cruciale stap in dit protocol is bepalen hoe lang het dier zal worden vastgehouden voordat een fenotype wordt beoordeeld. Transgenen vertonen de hoogste expressie na1-2 dagen 19, maar de expressie kan daarna afnemen. In het geval van siRNA's hangt het af van de omloopsnelheid van het eiwit zelf. Bijvoorbeeld, bij het tot expressie brengen van siRNA's die gericht zijn op expressie van Rab11a, een Rab-familie GTPase, wordt efficiënte downregulatie pas 72 uur na transductie23 waargenomen. Langlevende eiwitten (met halfwaardetijden gemeten in dagen) zijn dus mogelijk geen geschikte doelwitten met deze aanpak.

De onderzoeker moet zich ook bewust zijn van de kanttekeningen die aan deze aanpak zijn verbonden. Ten eerste kan het nut ervan beperkt zijn tot vrouwelijke knaagdieren vanwege problemen bij het katheteriseren van mannelijke knaagdieren via hun penis. Het kan echter technisch mogelijk zijn om dit protocol bij mannen uit te voeren door een katheter in de koepel van de blaas in te brengen, vergelijkbaar met het preparaat dat wordt gebruikt bij het uitvoeren van cystometrie9. Dit zou iemand in staat stellen om een wasmiddel of een virus te introduceren en wasbeurten uit te voeren als dat nodig is. Een tweede voorbehoud is dat overexpressie van eiwitten celpaden en -bronnen kan uitputten, wat kan leiden tot gebeurtenissen zoals eiwitaggregatie, activering van celstressroutes en de dood27. Het is dus over het algemeen verstandig om transgenexpressie te beperken tot niet-toxische niveaus (tenzij dat natuurlijk de bedoeling is van transgenexpressie), zoals beoordeeld met behulp van markers van celstress en celdood. Een derde voorbehoud is dat in sommige omgevingen langdurige adenovirusexpressie immuunresponsen kan veroorzaken28. Hoewel er geen bewijs is dat adenovirale transductie van het urotheel op zich immuunresponsen stimuleert10, is dit transgen-afhankelijk en zoals hierboven opgemerkt leidt CLDN2-overexpressie tot cystitis.

Momenteel hebben onderzoekers een verscheidenheid aan methoden die ze kunnen gebruiken om gen- en eiwitexpressie in het urotheel te moduleren, waaronder het gebruik van transgene of voorwaardelijke urotheliale knock-outmuizen, het gebruik van transfectiereagentia of het gebruik van adenovirale transductie. De laatste methode, het onderwerp van dit protocol, is relatief eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar. Afgezien van de initiële kosten van celkweekreagentia die nodig zijn om de virusvoorraden te genereren, resulteert de zeer grote hoeveelheid geproduceerd virus (genoeg om honderden transducties uit te voeren) in relatief lage kosten per dier. Adenovirale transductie kan worden gebruikt om urotheliale biologie te bestuderen. Adenovirale transductie werd bijvoorbeeld gebruikt om het belang van Rho-familie en Rab-familie GTPases, guanine-nucleotide-uitwisselingsfactoren, myosinemotorfragmenten en ADAM17 in exocytose en endocytose 10,19,20,21,22 te definiëren, en adenovirale transductie werd onlangs gebruikt om urotheliale mechanotransductie9 te bestuderen . Evenzo kan adenovirale transductie relevant zijn bij het onderzoeken en behandelen van menselijke ziekten. Ramesh et al. stelden bijvoorbeeld aanvankelijk voor dat adenovirale transductie een nuttige manier kan zijn om tumorcellen tetargeten 18. Hoewel hun studies meer een proof-of-principle-benadering waren, kan men zich voorstellen dat expressie van toxines in kankercellen of expressie van epitopen die door het immuunsysteem kunnen worden herkend, nuttige strategieën zouden zijn. Adenovirale transductie kan ook nuttig zijn bij het begrijpen van ziekten waarbij overexpressie of onderexpressie van genproducten tot ziekte leidt. Als een voorbeeld, biopsieën van de blazen van patiënten met interstitiële cystitis vertonen een 90-voudige toename van CLDN2-expressie 29. Interessant is dat overexpressie van CLDN2 met behulp van adenovirale transductie veel van de symptomen van deze ziekte repliceert bij ratten10. CLDN2 zou dus een doelwit kunnen zijn bij de behandeling van patiënten met deze aandoening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een proefprojectprijs via P30DK079307 (aan M.G.D.), NIH-subsidie R01DK119183 (aan G.A. en M.D.C.), NIH-subsidie R01DK129473 (aan G.A.), een American Urology Association Career Development award en een Winters Foundation-beurs (aan N.M.), door de Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores van het Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), en door S10OD028596 (aan G.A.), die de aankoop financierde van het confocale systeem dat werd gebruikt om enkele van de afbeeldingen in dit manuscript vast te leggen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Tags

Biologie Nummer 188
Expressie van transgenen in native blaasurotheel met behulp van adenovirus-gemedieerde transductie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter