Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

שיטות מתוארות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוסים רקומביננטיים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי להתמיר את המכרסם המקומי urothelium המאפשר ביטוי של transgenes או downregulation של תוצרי גנים אנדוגניים.

Abstract

בנוסף ליצירת מחסום בעל התנגדות גבוהה, משערים כי השתן המצפה את אגן הכליה, השופכנים, שלפוחית השתן והשופכה הפרוקסימלית חש ומעביר מידע על סביבתו לרקמות שמתחתיו, ומקדם תפקוד והתנהגות של התרוקנות. הפרעה במחסום דרכי השתן, או בתפקוד החושי/מתמר שלו, עלולה להוביל למחלה. חקר האירועים המורכבים האלה נפגע בשל היעדר אסטרטגיות פשוטות לשינוי ביטוי גנים וחלבונים באורותל. מתוארות כאן שיטות המאפשרות לחוקרים לייצר כמויות גדולות של אדנו-וירוס בעל טיטר גבוה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי להפוך מכרסם אורותל ביעילות גבוהה, ובאופן פשוט יחסית. הן cDNA והן RNA מפריע קטן יכולים לבוא לידי ביטוי באמצעות התמרה אדנו-ויראלית, ואת ההשפעה של ביטוי טרנסגנים על תפקוד דרכי השתן ניתן להעריך 12 שעות עד כמה ימים מאוחר יותר. לשיטות אלה ישימות רחבה במחקרים של ביולוגיה נורמלית ולא תקינה של דרכי השתן באמצעות מודלים של חיות עכבר או חולדה.

Introduction

האורותל הוא אפיתל מיוחד המרפד את אגן הכליה, השופכנים, שלפוחית השתן והשופכה הפרוקסימלית1. הוא מורכב משלוש שכבות: שכבה של תאי מטריה ממוינים ומקוטבים מאוד, לעתים קרובות דו-גרעיניים, שפני השטח האפיקליים שלהם שטופים בשתן; שכבת תאי ביניים עם אוכלוסייה של תאים מגבירי מעבר דו-גרעיניים שיכולים ליצור תאי מטריה שטחיים בתגובה לאובדנם החריף; ושכבה אחת של תאי בסיס, תת-קבוצה שלהם מתפקדים כתאי גזע שיכולים לחדש את כל דרכי השתן בתגובה לפגיעה כרונית. תאי מטריה אחראים בעיקר ליצירת מחסום דרכי השתן בעל העמידות הגבוהה, שמרכיביו כוללים קרום אפיקלי (עשיר בכולסטרול וצרברוזידים) בעל חדירות נמוכה למים ולמומסים, וקומפלקס צמתים אפיקלי בעל עמידות גבוהה (המורכב מצמתים הדוקים, צמתים נצמדים, דסמוזומים וטבעת אקטומיוזין קשורה)1 . הן פני השטח האפיקליים של תא המטריה והן טבעת הצומת שלו מתרחבים במהלך מילוי שלפוחית השתן וחוזרים למצבם המלא מראש במהירות לאחר התרוקנות 1,2,3,4,5. בנוסף לתפקידו בתפקוד המחסום, משערים כי לאורותלים יש גם תפקודי חישה ומתמרים המאפשרים לו לחוש שינויים בסביבה החוץ-תאית (למשל, מתיחה) ולהעביר מידע זה באמצעות שחרור מתווכים (כולל ATP, אדנוזין ואצטילכולין) לרקמות הבסיסיות,כולל תהליכים עצביים תת-אורותליים 6,7,8 . עדויות עדכניות לתפקיד זה נמצאות בעכברים חסרי ביטוי דרכי השתן הן של Piezo1 והן של Piezo2, מה שגורם לשינוי בפונקציית ההתרוקנות9. בנוסף, חולדות המבטאות יתר על המידה את החלבון CLDN2 יוצר הנקבוביות בשכבת תאי המטריה מפתחות דלקת וכאב דומים לאלה שנצפו בחולים עם דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית10. משערים כי הפרעה בתפקוד החושי/מתמר או מחסום דרכי השתן עשויה לתרום למספר הפרעות בשלפוחית השתן 6,11.

הבנה טובה יותר של הביולוגיה של השתן במצבים נורמליים ובמצבי מחלה תלויה בזמינותם של כלים שיאפשרו לחוקרים להפחית בקלות את ביטוי הגנים האנדוגניים או לאפשר ביטוי של טרנסגנים ברקמה הטבעית. בעוד שגישה אחת להפחתת ויסות ביטוי גנים היא יצירת עכברי נוקאאוט מותנים של דרכי השתן, גישה זו תלויה בזמינות של עכברים עם אללים פלוקסדיים, היא אינטנסיבית ויכולה להימשך חודשים עד שנים כדי להשלים12. באופן לא מפתיע, אם כן, חוקרים פיתחו טכניקות להדביק או להתמיר את האורותל, מה שיכול להוביל לתוצאות בטווח זמן קצר יותר. שיטות שפורסמו לטרנספקציה כוללות שימוש בשומנים קטיוניים13, אוליגודאוקסינוקלאוטידים אנטי-סנס 14, או חומצות גרעין אנטיסנס הקשורות לחלבון HIV TAT החודר לפפטיד 11-mer15. עם זאת, המוקד של פרוטוקול זה הוא על השימוש בטרנסדוקציה בתיווך אדנובירל, מתודולוגיה נחקרת היטב היעילה בהעברת גנים למגוון רחב של תאים, נבדקה בניסויים קליניים רבים, ולאחרונה שימשה להעברת cDNA המקודד את חלבון הקפסיד COVID-19 למקבלי גרסה אחת של חיסון COVID-1916, 17. לתיאור מעמיק יותר של מחזור החיים של אדנווירוס, וקטורים אדנו-ויראליים ויישומים קליניים של אדנווירוסים, הקורא מופנה להפניה17.

אבן דרך חשובה בשימוש באדנו-וירוסים להעברת האורותל, הייתה דו"ח של Ramesh et al. שהראה טיפולים מקדימים קצרים עם דטרגנטים, כולל N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) שיפור דרמטי בהתמרה של האורותליום על ידי אדנווירוס המקודד β-גלקטוזידאז18. באמצעות מחקר הוכחת עיקרון זה כמדריך, התמרה בתיווך אדנובירל של האורותליום שימשה כעת לביטוי מגוון חלבונים, כולל GTPases ממשפחת ראב, גורמי חילוף גואנין-נוקלאוטידים, שברי מנוע מיוזין, קלאודינים הקשורים לצומת הדוק יוצרי נקבוביות, ו- ADAM17 10,19,20,21,22 . אותה גישה הותאמה לבטא רנ"א מפריע קטן (siRNA), שהשפעותיו ניצלו על ידי ביטוי משותף של גרסאות עמידות ל-siRNA של הטרנסגן22. הפרוטוקול המתואר כאן כולל שיטות כלליות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוס מרוכז מאוד, דרישה לטכניקות אלה, כמו גם התאמות של השיטות של Ramesh et al.18 כדי לבטא טרנסגנים באורותליום ביעילות גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים הכוללים ייצור של אדנווירוסים, הדורשים אישור BSL2, בוצעו תחת אישור של משרדי הבריאות והבטיחות הסביבתית באוניברסיטת פיטסבורג והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית. כל הניסויים בבעלי חיים שבוצעו, כולל התמרה אדנו-ויראלית (הדורשת אישור ABSL2), נעשו בהתאם להנחיות/תקנות הרלוונטיות של מדיניות שירותי בריאות הציבור בנושא טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה וחוק רווחת בעלי חיים, ובאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג. כפפות, הגנה על העיניים ולבוש מתאים נלבשים לכל ההליכים המערבים וירוסים רקומביננטיים. יש להשליך כל פסולת נוזלית או מוצקה כמתואר להלן. יש להתייחס למצע של בעלי החיים לאחר ההתמרה ולכל פגר של בעלי חיים כתוצאה מכך, כחומרים מסוכנים ביולוגית ולסלק אותם בהתאם למדיניות המוסדית.

1. הכנת מניות אדנווירוס טיטר גבוה

הערה: התמרה יעילה של שלפוחיות מכרסמים תלויה בשימוש במלאי נגיפיים מטוהרים ומרוכזים, בדרך כלל 1 x 107 עד 1 x 108 חלקיקים נגיפיים זיהומיים (IVP) לכל μL. חלק זה של הפרוטוקול מתמקד ביצירת מלאי אדנו-וירוס בעל טיטר גבוה מתכשירי וירוסים קיימים. כל השלבים צריכים להתבצע במכסה מנוע של תרבית תאים באמצעות ריאגנטים וכלים סטריליים. בעוד הזנים הזמינים של אדנו-וירוס המשמשים כיום פגומים בשכפול, רוב המוסדות דורשים אישור להשתמש באדנו-וירוסים ובדנ"א רקומביננטי. זה כולל לעתים קרובות ייעוד של חדר תרביות תאים כמתקן מאושר BSL2 לייצור והגברת אדנווירוסים. כמה שיקולים כלליים כוללים שימוש במסכות, הגנה על העיניים, כפפות ולבוש מתאים בכל שלבי הייצור והטיהור של הנגיף. בעת ביצוע צנטריפוגה, מומלץ להשתמש במכסי בטיחות אם צינורות הצנטריפוגות חסרים מכסים הדוקים. כל החומרים החד-פעמיים, כולל פקקי בטיחות, בקבוקים ורוטורים שעלולים להיות מזוהמים, מטופלים בתמיסה אנטי-ויראלית (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן נשטפים במים או באתנול 70%. פסולת נוזלית מטופלת על ידי הוספת אקונומיקה לריכוז סופי של 10% (v/v). סילוק פסולת נוזלית זו יהיה תלוי במדיניות מוסדית. פסולת מוצקה מושלכת בדרך כלל לפסולת מסוכנת ביולוגית.

  1. תאי HEK293T בתרבית
    1. הפשירו בקבוקון קפוא של תאי HEK293T באמבט מים בטמפרטורה של 37°C והשתמשו בפיפטה של 5 מ"ל כדי להעביר את התאים לצלחת תרבית תאים בקוטר 15 ס"מ. בעזרת פיפטה של 25 מ"ל, הוסיפו לצלחת באיטיות 20 מ"ל של מדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco המכיל 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי ואנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין (DMEM-FBS-PS). לדגור על התאים באינקובטור תרביות תאים של 37 מעלות צלזיוס המוגז עם 5% (v/v)CO2 עד שהם מגיעים למפגש של 80%-90% (~2 x 107 תאים).
    2. בעזרת פיפטת זכוכית המחוברת למקור ואקום, שואפים את התווך ולאחר מכן שוטפים את התאים על ידי העברת 20 מ"ל PBS סטרילי (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4, 136.9 mM NaCl ו- 8.9 mM Na2HPO4) לצלחת באמצעות פיפטה של 25 מ"ל. שאפו את ה-PBS המשומש, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה של 5 מ"ל כדי להעביר 3 מ"ל של תמיסת פרוטאינאז חמה (37 מעלות צלזיוס) לצלחת, תוך דגירה על המנה באינקובטור תרבית התאים עד שהתאים מתנתקים (~3-4 דקות).
      הערה: ניתן להעריך את יעילות הפרוטאוליזה בצורה הטובה ביותר על ידי הטייה איטית של הצלחת קדימה ואחורה בחיפוש אחר שחרור תאים מכל חלקי הצלחת לתוך הנוזל הנע. תאי HEK293T רגישים לטיפול ממושך בפרוטאינאז וימותו אם יישארו יותר מכמה דקות בתמיסת פרוטאינאז.
    3. השתמש פיפטה 10 מ"ל להעביר 7 מ"ל של DMEM-FBS-PS לצלחת של תאים מנותקים, ולאחר מכן להשתמש באותה פיפטה כדי לשאוף את התאים ואת המדיום. מעבירים את התאים המרחפים לצינור חרוטי של 50 מ"ל, ולאחר מכן מטילים את התאים על ידי צנטריפוגה של המתלה בצנטריפוגה קלינית במהירות נמוכה של 200 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטת זכוכית המחוברת למקור ואקום. השתמש פיפטה 25 מ"ל כדי להשעות מחדש את גלולת התא ב 15 מ"ל של DMEM-FBS-PS.
    4. הוסף 1 מ"ל של תרחיף התא לכל אחת מחמש עשרה צלחות 15 ס"מ המכילות 19 מ"ל של DMEM-FBS-PS.
    5. לגדל את התאים באינקובטור תרבית רקמה עד שהם מגיעים למפגש של 85%-90% (~3-4 ימים).
  2. הכן פתרון וירוס מדולל
    1. הוסף ~ 1.5 x 10 9 עד 3 x 109 IVP של מלאי וירוסים קיים (5-10 IVP / תא) לצינור חרוטי 50 מ"ל מלא 45 מ"ל DMEM חסר FBS או אנטיביוטיקה.
      הערה: ניתן להשתמש בריכוז נמוך יותר של הנגיף (1-5 IVP / תא); עם זאת, ייקח זמן רב יותר לייצור וירוסים.
  3. להדביק את התאים בתרבית עם הנגיף.
    1. בעזרת פיפטה מזכוכית המחוברת למקור ואקום, שואפים את התווך מהתאים הכמעט מתמזגים בשלב 1.1.5.
    2. השתמש פיפטה 25 מ"ל כדי להעביר 3.0 מ"ל של תמיסת וירוס מדולל (מוכן בשלב 1.2.1) לכל צלחת תרבית תאים. לאחר מכן, השתמש פיפטה 10 מ"ל כדי להוסיף 7.0 מ"ל של מדיום DMEM (חסר FBS או אנטיביוטיקה) לכל מנה. יש לדגור במשך 60 דקות באינקובטור של תרביות תאים, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל DMEM המכיל 20% (v/v) FBS ו-2x PS לכל מנה.
      הערה: שימוש באחת מ-15 הצלחות כצלחת בקרה (שבה לא מוסיפים וירוס) מקל על זיהוי עיגול תאים ומוות בתאים נגועים בשלב הבא.
    3. דוגרים על התאים באינקובטור תרביות התאים במשך 2-4 ימים עד שרובם מתחילים להתעגל למעלה ו->60% מהתאים התנתקו.
      הערה: אם משתמשים בטיטר תחתון של הנגיף, ייתכן שיחלוף עד שבוע עד שיתרחש מוות תאי. אם מוות תאי אינו מתרחש בתוך שבוע, סביר להניח שיהיה צורך לחזור על התהליך באמצעות טיטר גבוה יותר של הנגיף.
  4. לשחזר וירוס מ lysates התא
    1. השתמש במגרד תאים כדי לגרד את החלק התחתון של כל מנה, לשחרר תאים מחוברים לתוך המדיום.
    2. באמצעות פיפטה של 25 מ"ל, אספו ואגרו את המדיום, התאים ופסולת התאים מכל צלחת תרבית תאים לצינור תרבית תאים חרוטי של 50 מ"ל.
      הערה: כדי לחסוך במשאבים, ניתן לשלב את המדיום משתי מנות לצינור אחד של 50 מ"ל.
    3. משחררים את החומר התאי באמצעות צנטריפוגה באמצעות צנטריפוגה שולחנית במהירות נמוכה: 5 דקות בטמפרטורת החדר ב-3,000 x גרם. השתמשו בפיפטת זכוכית המחוברת למכשיר ואקום כדי לשאוף את הסופרנטנט.
    4. השתמש פיפטה 10 מ"ל, בשילוב עם טריטורציה, כדי לאחד את כל החומר הכדורי שנוצר בסך הכל 7 מ"ל של 100 mM מסונן סטרילי Tris-HCl pH 7.4 המכיל 10 mM EDTA (תמיסת Tris-EDTA). מעבירים את החומר המאוגד לצינור חרוטי סטרילי של תרבית תאים בנפח 15 מ"ל ומניחים על קרח.
      הערה: בשלב זה, ניתן להקפיא את הכנת הנגיף ב -80 °C ללא הגבלת זמן.
  5. הכנת ליזטים של תאים
    1. בצע שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה כדי לשבש את התאים הנותרים, ובכך לשחרר עוד יותר את חלקיקי הנגיף שנוצרו. הקפיאו את החומר המצטבר בשלב 1.4.4 על ידי טבילת הצינור בחנקן נוזלי (~30-60 שניות). הפשיר במהירות את הדגימה על ידי הצבת הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. מערבלים את הדגימה במשך 15 שניות, ולאחר מכן חוזרים על הליך ההקפאה וההפשרה המהיר פי 2 נוספים.
      הערה: ניתן להפשיר במהירות את תמיסת הנגיף בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, אך נדרשת זהירות מכיוון שתנודות הטמפרטורה עלולות לגרום לצינור להיסדק, ולשחרר תמיסת וירוס לאמבט המים. כדי למנוע זאת, הניחו את הצינור המכיל את הסופרנאטנט הנגיפי לתוך צינור גדול יותר, אשר לאחר מכן מוגדר באמבט המים.
    2. השתמש פיפטה 10 מ"ל כדי להעביר את החומר התאי מופשר שלוש פעמים בהקפאה לצינור צנטריפוגה במהירות סופר. צנטריפוגה את החומר בצינור במשך 30 דקות ב 4 ° C צנטריפוגה סופר מהירה ב ~ 18,500 x גרם.
    3. לשחזר את ~ 7 מ"ל של supernatant עשיר וירוס עם פיפטה 10 מ"ל ולהעביר אותו צינור חרוטי 15 מ"ל. שמרו את הדגימה על קרח עד לשלב הבא.
      הערה: בשלב זה, שקול לשמור aliquot של supernatant ויראלי לא מטוהר כמבוא להתחיל הכנה וירוס חדש (או כגיבוי). אחסן aliquot זה ב -80 °C.
  6. בודד וטיהר את הנגיף באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות.
    1. הכן שיפוע לא רציף של CsCl בצינור אולטרה-צנטריפוגה שקוף PET בעל דופן דקה של 12 מ"ל (ראה טבלת חומרים) או שווה ערך. השתמש מזרק 3 מ"ל מצויד מחט 18 G כדי להציג בזהירות 2.5 מ"ל של 1.4 גרם / מ"ל תמיסת CsCl לתוך החלק התחתון של הצינור, ולאחר מכן להשתמש מזרק חדש / מחט כדי שכבה עם 2.5 מ"ל של 1.25 גרם / מ"ל פתרון CsCl.
      הערה: הטלת תמיסות ישירות על גבי שכבה קיימת תגרום לערבוב משמעותי ולא רצוי. במקום זאת, הניחו את החלק המשופע של המחט כנגד קצה הצינור, ואז לחצו לאט מאוד על בוכנה המזרק, והעלו את מיקום המחט כאשר התמיסה ממלאת את הצינור.
    2. טען את ~ 7 מ"ל של supernatant נגיפי על גבי שיפוע באופן דומה באמצעות מזרק 10 מ"ל. אם יש יותר מ 2-3 מ"מ של רווח בין supernatant ויראלי לבין החלק העליון של הצינור, להוסיף פתרון Tris-EDTA נוסף כדי למלא את הצינור עד רק 2-3 מ"מ של מקום נשאר.
    3. הכינו צינור איזון שהוכן באופן דומה, המכיל שכבות של CsCl, אך מחליף את תמיסת Tris-EDTA בסופרנטנט הנגיפי.
      הערה: שני הצינורות חייבים להיות בעלי משקל זהה (וצפיפויות דומות) כדי למנוע מצב עומס לא מאוזן שעלול להיות מסוכן באולטרה-צנטריפוגה.
  7. בודדו את הנגיף באמצעות אולטרה-צנטריפוגה קצבית-אזורית.
    1. טען את שיפועי הצבע שנוצרו בשלבים 1.6.2-1.6.3 לתוך דליים של רוטור SW41 או שווה ערך. הברג במכסי דלי, הכנס את הרוטור לאולטרה-צנטריפוגה (מקוררת מראש ל -4 מעלות צלזיוס), וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב~ 150,000 x גרם.
    2. במהלך הצנטריפוגה, אזן את העמודה המתוארת בשלב 1.9.1 להלן.
  8. שחזור חלקיקי וירוס מבודדים
    1. בסוף שלב הצנטריפוגה, נתקו בזהירות את הדליים מהרוטור, ובמכסה מנוע של תרבית תאים, הסירו את מכסי הדלי, ואז הסירו את הצינורות והניחו אותם במתלה.
    2. אספו את החומר הפסים, העשיר בחלקיקי וירוסים, שצף בממשק שבין תמיסת CsCl של 1.25 גרם/מ"ל ו-1.4 גרם/מ"ל. מחזיקים את הצינור המכיל את השיפוע מעל החצי התחתון של צלחת תרבית תאים (אשר יתפוס את כל החומרים שנשפכו), להשתמש 1 אינץ '18 G מחט מחובר מזרק 3 מ"ל כדי לנקב בזהירות את הצינור, ממש מתחת וירוס פסים. לאט לשאוף את הנגיף, אשר בדרך כלל התאושש ~ 1 מ"ל.
    3. הסר את המחט מהצינור, מה שיגרום לחומר שנותר בשיפוע לזרום החוצה מהצינור לחצי התחתון של צלחת תרבית התאים (יש להתייחס לכל נוזל כפסולת מסוכנת).
    4. מעבירים את תמיסת הנגיף במזרק לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי על קרח.
      הערה: בעת שחזור הנגיף בשלב זה, מקם את המחט כך שלומן המחט פונה כלפי מעלה כאשר המחט נפתחת כמה מ"מ מתחת לרצועה העשירה בנגיף. הימנעו מזיהום על-ידי הרצועה הדקה של וירוס שהורכב בצורה לא נכונה, שלפעמים נצפית 2-3 מ"מ מעל הנגיף הפסים (ראו חץ שחור דק באיור 1A).
  9. הסר CsCl מהדגימה על ידי סינון ג'ל.
    1. יש לאזן עמוד PD-10 (ארוז מראש עם Sephadex G-25M), מהודק למעמד תמיכה, עם 50 מ"ל של PBS מסונן סטרילי 0.2 מיקרומטר המכיל 10% (v/v) גליצרול.
      הערה: שלב שיווי המשקל הראשוני אורך 2-3 שעות והוא הכרחי כדי להבטיח שטיפה מלאה של חומרים משמרים המשמשים את היצרן לייצוב העמודה.
    2. אפשר לתמיסת השטיפה לסגת מתחת לפריט (דיסק מגן של חומר לבן בחלק העליון של מדיום העמודה), ולאחר מכן העבר בזהירות את תמיסת הווירוסים המטוהרים שנאספה בשלב 1.8 לראש העמודה. אפשר לתמיסה העשירה בווירוסים לסגת מתחת לפריט, ולאחר מכן התחל למלא את העמודה עם PBS-גליצרול.
      הערה: פונקציה אחת של frit היא למנוע מהעמודה להתייבש. כתוצאה מכך, עיכובים קצרים נסבלים לפני הוספת יותר eluant לעמודה.
    3. לאסוף את eluate ב 12 צינורות microcentrifuge סטריליים, 0.5 מ"ל לכל שבר.
  10. לקבוע את התשואה הנגיפית.
    1. קבע את שיא שברי הווירוסים באמצעות ספקטרופוטומטריה. הכינו דילול של 1:100 מכל שבר ב-PBS ומדדו את OD260 בספקטרופוטומטר, תוך שימוש בדילול של 1:100 של חיץ בלבד כריק. חלקיקי הנגיף צריכים להיפלט בנפח הריק, החל מחלק 6 בערך. אחסן את השברים המכילים את קריאות OD260 הגבוהות ביותר.
    2. בצע דילול של 1:100 של השברים הנגיפיים המצטברים ומדוד מחדש את OD260. חשב את הריכוז הסופי של חלקיקי הנגיף ואת מספר ה- IVP בשברים המאוגמים באמצעות הנוסחה הבאה: חלקיקי וירוס לכל מ"ל = OD260 × 100 (זה מתקן עבור גורם דילול) × 1012. הערכה כללית היא כי 1% מחלקיקי הנגיף הם IVP, וכך: IVP/mL = OD 260 × 100 × 10 10 או IVP/μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. Aliquot את שברי הנגיף המאוחדים (המכילים 5 x 10,7 עד 1 x 10,8 IVP) לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליות או cryovials. אחסן את הדגימות ב -80 ° C.

2. התמרה של שלפוחית השתן מכרסם

הערה: אם טכניקה זו חדשה, מומלץ להגביל את מספר בעלי החיים המומרים בו זמנית ל 2-4. ניתן להשיג זאת על ידי קביעת זמני ההתחלה של כל בעל חיים, במיוחד במהלך הטיפול בחומרי ניקוי בשלב 2.2, ולאחר מכן דגירה של הנגיף בשלב 2.3. חוקרים מנוסים יכולים להמיר עד שישה בעלי חיים בכל פעם.

  1. צנתור שלפוחית השתן
    1. הרדימו נקבות עכברי C57Bl/6J (בדרך כלל בנות 8-10 שבועות, ~20-25 גרם) או נקבות חולדות Sprague Dawley (בדרך כלל בנות 2-3 חודשים, ~250 גרם) באמצעות וופורייזר עם חרוט אף מחובר. כיילו את הוופורייזר לייצור איזופלורן 3.0% (v/v), 97% (v/v) O 2 לעכברים או 4.0% (v/v) איזופלורן, 96% (v/v) O2 לחולדות. ודא כי בעלי החיים מורדמים על ידי וידוא שהם אינם מגיבים צביטת הבוהן (בדרך כלל לאחר 1-2 דקות).
    2. שמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים על ידי הנחת החיות על כרית מחוממת. עקוב אחר בעל החיים לאורך כל פרוטוקול ההעברה כדי לוודא שבעלי החיים מורדמים ואינם חווים כאב במהלך הליך זה.
    3. הפחיתו את האיזופלורן ל-1.5% (v/v) בעכברים או ל-2.0% (v/v) לחולדות והחזיקו את בעלי החיים תחת הרדמה למשך הפרוטוקול.
    4. כדי למנוע החדרת אוויר לשלפוחית השתן, מלא את חלק הצנתר הפלסטי של צנתר IV (ראה טבלת חומרים) ואת הרכזת המשויכת ל- PBS סטרילי באמצעות פיפטת העברה.
    5. כאשר בעל החיים במצב שכיבה, מקלונים את הבשר החיצוני עם 70% אלכוהול, ומכניסים את הצנתר הסטרילי לתוך הבשר החיצוני, ואז את השופכה, ולאחר מכן לתוך שלפוחית השתן.
      1. כדי לבצע משימה זו, השתמש במלקחיים עדינים כדי לתפוס בעדינות את הרקמה היוצרת את הבשר החיצוני ולהאריך אותו אנכית, הרחק מהחיה. בעזרת היד השנייה, מחדירים בזהירות את הצנתר אנכית כ-3-4 מ"מ לתוך השופכה (תלולית בשר ממש מעל פתח הנרתיק). לאחר מכן, בגלל כיפוף בשופכה, מורידים את הצנתר, המוחדר לבשר החיצוני, לכיוון זנב החיה, מה שמקל על כניסתו לחלק של השופכה שעובר מתחת לעצם הערווה, ובסופו של דבר לתוך שלפוחית השתן
        . הערה: במיוחד במקרה של העכבר, הצנתר עשוי להיות ארוך מדי, ולא יותר מ 1.0-1.1 ס"מ ממנו צריך להיות מוכנס לתוך החיה. אחרת, ייגרם נזק לרירית שלפוחית השתן. כדי למנוע זאת, סמן את הצנתר ~ 1 ס"מ מתחת לקצהו, ולאחר מכן אל תכניס את הצנתר מעבר לסימון זה.
    6. יש לאפשר לשתן בשלפוחית השתן לדלוף החוצה. הסירו שאריות שתן על ידי ביצוע התמרון של Credé: לעסות וללחוץ בעדינות על בליטת שלפוחית השתן באזור הבטן התחתונה.
  2. הפוך את האורותליום פתוח להתמרה על ידי טיפול בו עם תמיסת דטרגנט.
    1. שטפו את העכבר או שלפוחית השתן של החולדה על ידי חיבור מזרק סטרילי בנפח 1 מ"ל מלא PBS לרכזת הצנתר. הזריקו 100 מיקרוליטר PBS סטרילי לשלפוחית השתן של העכבר (או 450 מיקרוליטר במקרה של שלפוחית השתן של החולדה). יש לנתק את המזרק מהתאמת הצנתר ולאפשר ל-PBS להתנקז. במידת הצורך, בצעו תמרון Crede לסילוק עודפי נוזל שלפוחית השתן.
    2. להחדיר 100 μL של 0.1% (w/v) N-דודציל-β-D-מלטוזיד (DDM) (מומס ב-PBS ו-0.2 מיקרומטר מסונן-מעוקר) לשלפוחית העכבר באמצעות מזרק סטרילי של 1 מ"ל. שמור את ה- DDM בשלפוחית השתן למשך 10 דקות על ידי השארת המזרק במקומו. בחולדות, נפח DDM גדל ל 450 μL.
    3. הסר את ה- DDM משלפוחית השתן על ידי ניתוק המזרק ולאפשר לו להתנקז החוצה. בצע את התמרון של Crede במידת הצורך.
  3. הכניסו את הנגיף לשלפוחית השתן.
    1. חבר מזרק סטרילי 1 מ"ל לרכזת הצנתר והחדיר 0.5 x 107 עד 1 x 108 IVP של אדנווירוס (מוכן בשלב 1), מדולל ב 100 μL של PBS סטרילי עבור עכברים או 450 μL עבור חולדות, לתוך שלפוחית השתן. השאירו את המזרק מחובר לקטטר כדי למנוע מתמיסת הנגיף לברוח.
    2. לאחר 30 דקות, נתקו את המזרק ואפשרו לתמיסת הנגיף לפנות את שלפוחית השתן אל פד חד פעמי. יש להכתים כל תמיסת וירוס שארית עם מגבון סופג, ולהשליך את הפד ולנגב בפסולת מסוכנת ביולוגית.
      הערה: גליצרול הוא ציטוטוקסי. לפיכך, הנפח המרבי של תמיסת וירוס המוחדרת לעכברים מוגבל ל -5 μL (אשר כאשר מדולל ל -100 μL של PBS יגרום לריכוז גליצרול סופי של ~0.5% [v/v]). בנוסף, ניתן לשפר את יעילות ההולכה על ידי הגדלת מספר ההפריה החוץ גופית המוחדרת ועל ידי הארכת הדגירה של הנגיף ל -45 דקות.
    3. שלב אופציונלי: ניתן לשטוף את שלפוחית השתן עם PBS כמתואר בשלב 2.2.1 לעיל; עם זאת, זה לא נדרש.
  4. אפשרו לבעל החיים להתאושש.
    1. להפסיק את זרימת האיזופלורן ולאפשר לבעל החיים להתאושש ולהיות נייד לחלוטין לפני החזרתו לכלוב שלו, במיוחד אם החיות שוכנות בקבוצה.
      הערה: מכיוון שהתמרה של הנגיף כשלעצמה אינה גורמת לתסמינים או כאבים בדרכי השתן התחתונות הניתנים לצפייה, בדרך כלל אין צורך בטיפול לאחר הניתוח. עם זאת, אם הטרנסגן המקודד רעיל, ייתכן שיהיה צורך במשככי כאבים או אנטיביוטיקה לאחר ההליך כנדרש על ידי המוסד.
  5. לנתח את ההשפעות של ביטוי טרנסגנים 12-72 שעות לאחר הטיפול באמצעות שיטות כגון mRNA in situ hybridization, כתם מערבי, או immunofluorescence 9,10,23 (ראה את התוצאות המייצגות).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכנת וירוסים
דוגמה לטיהור וירוסים על-ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות מוצגת באיור 1A. הפס הוורוד בהיר, שנמצא בממשק של החומר התאי הטעון ושכבת CsCl של 1.25 גרם/מ"ל, מורכב בעיקר מתאים משובשים והפסולת שלהם (ראו חץ מגנטה באיור 1A). צבעו הוורדרד שואב מהכמות הקטנה של מדיום התרבות שמועבר משלב 1.5 בפרוטוקול. חלקיקי הנגיף המעניינים, שמופיעים כפס לבן חלבי, נמצאים בממשק של תמיסות CsCl במשקל 1.25 גרם/מ"ל ו-1.40 גרם/מ"ל CsCl (ראו חץ צהוב באיור 1A). אפשר גם לצפות ברצועת חומר שצפה 2-3 מ"מ מעל חלקיקי הנגיף המועשר (ראו חץ שחור דק באיור 1A). הוא כולל וירוסים ופסולת שלא הורכבו, מכיל מעט IVP, ויש להימנע ממנו בעת איסוף דגימת הנגיף.

טיהור נוסף של חילופי הווירוסים והמאגר באמצעות עמודת PD10 מתואר באיור 1B, וקריאות OD260 של השברים המתקבלים לאחר ה-elution מוצגות באיור 1C. נפח החלל של עמודות אלה הוא כ -3 מ"ל, ולכן הנגיף מתחיל להופיע בשבר 6 ומגיע לשיאו בשבר 9. בניסוי זה אוגמו שברים 6-9. בעוד ששברים 6 ו-7 נמוכים יחסית בחלקיקי הנגיף, הם מכילים מספיק וירוסים כדי להצדיק התאוששות, והם משמשים לדלל את שברי הטיטר הגבוהים מאוד לריכוז סביר יותר. שברים 10-12 לא נכללו מכיוון שהעלייה ב- OD260 בשבר 11 מצביעה על נוכחות אפשרית של שיא מזהם שני, אשר נצפה באופן משתנה בתכשירים אלה. החלק המאגר יהיה בדרך כלל 1 x 107 עד 1 x 108 IVP/μL, והתשואה הצפויה תהיה בסדר גודל של 1 x 10 10 עד 2 x10 11 סה"כ IVP. זוהי כמות מספקת של וירוס כדי לבצע מאות טרנסדוקציות. בעוד שניתן לקשור את הנגיף על ידי בדיקות פלאק או על ידי ספירת מושבות של תאים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים22, כלל 1% מספיק ברוב המקרים. כלל זה קובע כי 1% מחלקיקי הנגיף המטוהרים, המוערכים על ידי מדידת OD260 של הדגימה, הם IVP. Aliquots של וירוס מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס יש חיי מדף של 2-5 שנים, אם כי הדבקה פוחתת בטווח הארוך. ניתן להקפיא מחדש אליציטוטים מופשרים של הנגיף ב -80 מעלות צלזיוס פעם אחת ללא אובדן משמעותי של זיהום. עם זאת, הפשרה והקפאה חוזרות ונשנות משפיעות לרעה על הדבקה ויראלית.

התמרה של שלפוחית השתן
צעד ראשון חשוב בעת הערכת ההשפעה של טרנסדוקציה הוא לאשר ביטוי טרנסגן. ניתן להעריך זאת באמצעות מספר טכניקות, כולל כלים המזהים mRNA (למשל, RNAScope), ניתוח כתמים מערביים, או שימוש באימונופלואורסנציה 9,10,23. איור 2 הוא דוגמה של אורותל עכברי שהומר עם אדנו-וירוס שמקודד V5-epitope מתויג הורמון גדילה אנושי (V5-hGH)23. חלבון זה ארוז לתוך שלפוחיות דיסקואידליות / fusiform והוא יכול להיות exocytosed במהלך מילוי שלפוחית השתן 19,23. ניתוח כתמים מערביים של ליזטים של דרכי השתן גילה ביטוי V5-hGH באורותל של שלפוחית השתן, אך לא באלה שלא עברו טרנספורמציה (איור 2A). הביטוי אושר גם על-ידי אימונופלואורסנציה, במקרה זה באמצעות נוגדנים שזיהו hGH או תג אפיטופ V5 (שלפוחיות לא מותמרות חסרות קליטה, לא מוצגות) (איור 2B).

דוגמה נוספת היא התמרה של שלפוחית השתן של חולדה עם וירוס המקודד CLDN2, חלבון24,25 הקשור לצומת הדוק היוצר נקבוביות. CLDN2 מגביר שטף פרא-תאי של קטיונים (כולל K+) וביטוי היתר שלו גורם לדלקת ולהתפתחות כאב ויסצרלי10. ניתוח כתמים מערביים אישר ביטוי של CLND2 בשלפוחיות חולדות שהותמרו עם אדנו-וירוס המקודד Cldn2, אך לא באלה שהותמרו עם וירוס מקודד GFP (איור 2C). באופן כללי, GFP אינו נחשב רעיל כאשר הוא מתבטא בתאים ולכן הוא משמש כבקרה שימושית. השימוש ב- GFP גם מאפשר לחוקר לאשר כי התמרה עובדת. ניתוח אימונופלואורסנציה אישר עוד יותר ביטוי אקסוגני של CLDN2 בתאי מטריה של דרכי השתן שהותמרו עם וירוס המקודד Cldn2 cDNA (אות אדום באיור 2D). יתר על כן, בדומה ל-CLDN2 אנדוגני (לא מוצג), CLDN2 המבוטאת ממוקמת בצמתים הדוקים המסומנים ב-TJP1, כמו גם במשטחים הבזולטרליים של תאי המטריה (CLDN2 מסומן בירוק באיור 2E)10. במקרה של ביטוי CLDN2, הוא היה הגבוה ביותר יום אחד לאחר הטרנסדוקציה, אך לאחר מכן נגרר, ובקושי ניתן היה להבחין בו לאחר 15 יום.

שיקול שני הוא, אילו סוגי תאים יהיו ממוקדים על ידי התמרה אדנו-ויראלית. בעוד שבחולדות ניתן להתמיר בעיקר את שכבת תא המטריה19, בעכבר ניתן להתמיר את כל שכבות השתן, אם כי התמרה של שכבות תאי הביניים והבסיס יכולה להיות משתנה. חשוב לציין שבשלמות דופן שלפוחית השתן, רק האורותל עובר טרנספורמציה, ואף רקמה אחרת אינה ממוקדת על-ידי אדנו-וירוס המוחדר (איור 3).

בעוד שניתן לבצע אנליזות של תאים מותמרים ברמת התא הבודד, כאשר בוחנים פנוטיפ כולל של שלפוחית השתן, יש להתמיר את רוב תאי השתן. לכן, חשוב להגדיר את יעילות הטרנסדוקציה (כלומר, איזה חלק של תאי השתן מתומרים). לדוגמה, במקרה של אדנו-וירוס המבטא Cldn2, >95% מתאי המטריה עברו טרנספורמציה (ראו איור 2D). דוגמה נוספת היא שדה התמונה המוצג באיור 3, שבו ספירת מספר תאי המטריה המומרים (במקרה זה, המבטא את חיישן Ca2+ GCAMP5G), מגלה יעילות המתקרבת ל-95%. עם זאת, יש לבחון תאים בשדות אקראיים שצולמו לאורך דופן שלפוחית השתן כדי להשיג הערכה מדויקת ובלתי משוחדת של יעילות הטרנסדוקציה.

Figure 1
איור 1: טיהור אדנו-וירוס. (A) חלקיקי אדנו-וירוס המיוצרים על-ידי תאי HEK293T נגועים טוהרו על-ידי צנטריפוגה על שיפוע CsCl לא רציף המורכב משכבה של 1.4 גרם/מ"ל CsCl, שכבה של 1.25 גרם/מ"ל CsCl, ושכבה של דגימה (S) מדוללת בתמיסת Tris-EDTA. החומר התאי (חץ ורוד) מצטבר בממשק S/1.25, בעוד שהאדנו-וירוס המטוהר צף בממשק 1.25/1.4 (חץ צהוב). רצועה קטנה של וירוס שהורכב בצורה לא נכונה צפה מעל האחרון (חץ שחור דק). (B) הרצועה העשירה באדנו-וירוס בשיפוע משוחזרת באמצעות מחט, וה-CsCl מוסר מהאדנו-וירוס על-ידי סינון ג'ל באמצעות עמודת PD10 מלאה ב-G25 Sephadex המקבילה ל-PBS המכילה 10.0% (v/v) גליצרול. פני השטח של הספדקס מוגנים על ידי פריטה נקבובית מפלסטיק. (C) שברים, 0.5 מ"ל, נאספו מעמודת PD10. OD260 של השברים נמדדו בספקטרופוטומטר והערכים שורטטו. שברים עשירים בווירוסים מתפוגגים בנפח הריק, שמתחיל בשבר 6 ונמשך עד לשבר 9. שברים מאוגמים לניסוי מייצג זה מוצללים בכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התמרה של אורותל שלפוחית השתן של מכרסם עם אדנו-וירוסים המקודדים V5-hGH או CLDN2. (A) אורותל עכבר נותר ללא המרה (UT) או הומר עם אדנו-וירוסים המקודדים אפיטופ V5 המתויג הורמון גדילה אנושי (hGH). לאחר 24 שעות, שלפוחיות השתן התאוששו, lysates השתן הוכנו ונתונים נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה, ביטוי V5-hGH אושר באמצעות כתמים מערביים נבדק עם נוגדן נגד hGH. (B) זיהוי V5-hGH באורותל עכבר חתך ומוכתם באמצעות נוגדנים ל-hGH (ירוק) או לאפיטופ V5 (אדום) ולנוגדנים משניים עם תיוג פלואורופור. Immunofluorescence נלכד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. הדגימות הוכתמו ב-TO-PRO3 כדי לסמן גרעינים. (ג-ו) אורותליום של חולדה הומר עם וירוס המקודד לחולדה CLDN2 (שם נפוץ claudin-2) או GFP (שם נפוץ חלבון פלואורסצנטי ירוק) כביקורת. (C) זיהוי CLDN2 אקסוגני על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדן שוב CLDN2. שימו לב שה-CLDN2 האנדוגני מבוטא ברמות נמוכות ואינו מזוהה בניסוי זה. (D) התמרה של שכבת תא המטריה מתגלה על ידי אימונופלואורסנציה ומיקרוסקופ קונפוקלי. גבולות התא נחשפים על ידי צביעה משותפת של הרקמה עם FITC-phalloidin, אשר מסמן את שלד האקטין קליפת המוח. (E) זיהוי של CLDN2 ו-TJP1 אקסוגניים (שם נפוץ ZO1) על ידי אימונופלואורסצנטיות ומיקרוסקופ קונפוקלי של אורותל שלם או חתך. חצים לבנים קטנים מציינים את מיקום הצומת ההדוק וראשי חץ מגנטה קטנים מסמנים את מיקום ההצטברות התוך-תאית של CLDN2 בציטופלסמה של התא. אלה התגלו בעבר כקשורים לגולג'י CLDN210. (F) לאחר ההדבקה, בעלי החיים הומתו בימים שצוינו לאחר ההדבקה. ביטוי CLDN2 אקסוגני זוהה באמצעות כתם מערבי. בעלי חיים המבטאים GFP הומתו לאחר היום הראשון. הנתונים באיור 2C-E שונו מ-Montalbetti et al.10, והם משוכפלים באישור האגודה הפיזיולוגית האמריקאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יעילות של התמרה אדנו-ויראלית. אורותל שלפוחית השתן של העכבר הומר באדנווירוס המקודד את חיישן הסידן GCaMP5G. הפאנלים העליונים מראים צביעה עבור GCaMP5G (זוהה באמצעות נוגדן לחלבון פלואורסצנטי ירוק; GFP, ירוק), הלוחות האמצעיים מראים את התפלגות הגרעינים המוכתמים ב-DAPI (כחול) ואקטין המסומן ברודמין-פלואידין (אדום), והלוחות התחתונים הם מיזוג של שלושת האותות. ראשי החץ הלבנים בלוח התחתון הם תאי מטריה נדירים שאינם מותמרים. היעילות הכוללת של התמרה של תאי מטריה בתמונה זו היא ~ 95%. שים לב שרק האורוטליום מותמר. האזורים הארוזים מוגדלים בחלוניות מימין. האזור בתיבה 1 מורכב בעיקר מתאי מטריה מותמרים. האזור בתיבה 2 הוא אורותל המראה התמרה יעילה של תאי מטרייה, אך התמרה פחות יעילה של שכבות התא שמתחתיה. LP = lamina propria; ME = שרירים חיצוניים; סה = סרוסה; Ut = אורותל. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (ראו טבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעוד ראמש ועמיתיו התמקדו בפיתוח אסטרטגיות לשימוש בהתמרה אדנו-ויראלית בטיפול בסרטן שלפוחית השתן 18, דיווחים עדכניים יותר הדגימו את התועלת של טכניקות אלה בחקר ביולוגיה / פיזיולוגיה של דרכי השתן ופתופיזיולוגיה תקינה 10,18,19,20,21 . המאפיינים החשובים של גישה זו כוללים: (i) בשלמות דופן שלפוחית השתן של המכרסם, רק האורטליום מומר 10,19,20,21,22. במקרה של חולדות, ההתמרה מוגבלת בעיקר לשכבת תאי המטריה, בעוד שבעכברים, ניתן לכוון את כל השתן; (ii) ניתן להשתמש בגישה זו כדי לבטא חלבונים או siRNAs 10,19,20,21,22; (iii) יעילות הטרנסדוקציה יכולה להתקרב ל-70%-95% (למשל, ראה איור 3)18,20; (iv) יום לאחר הטרנסדוקציה, מבנה העל של האורוטל, שלמות הרקמה, נוכחות מחסום התנגדות גבוהה (מוערך על ידי מדידת עמידות טרנס-אפיתל), והביטוי של סמני התמיינות השתן הוא "נורמלי"10,19. ההשפעה המורפולוגית היחידה שנצפתה עד כה היא ירידה בקוטר תאי המטריה (במבט מלמעלה); עם זאת, הם חוזרים לגודלם הרגיל לאחר 3-4 ימים10,19; (v) ניתן להמיר את האורותליום עם עד שלושה אדנו-וירוסים שונים בו זמנית18; (vi) ביטוי טרנסגנים ניתן לשינוי על ידי טיטרציה של מספר IVP, המשפיע על כמות ביטוי החלבון, הארכה או קיצור של זמן הדגירה לפני הקרבת החיה, או שימוש במקדמים שונים כגון מערכת מווסתת טט (tet-off)19. במקרה האחרון, ניתן לבטא במשותף וירוס המקודד את transactivator/tet-repressor, ולאחר מכן לווסת את ביטוי הטרנסגן על ידי שינוי ריכוז דוקסיציקלין בתזונה של החיה.

בעוד הפרוטוקול הכולל הוא פשוט יחסית, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע ניסויים אלה. אחד מהם הוא הזמינות של מלאי וירוסים בעלי טיטר גבוה שהם בעלי טוהר סביר. Adenoviruses ניתן להשיג מספקים מסחריים, מליבות ייצור וירוסים מוסדיים, מחוקרים אחרים, או שהם יכולים להיות מיוצרים בבית. במקרה של האחרון, מערכת AdEasy של מעבדת ברט ווגלשטיין מומלצת מכיוון שניתן לרכוש את מרכיביה מ- Addgene, ואדנווירוסים שנוצרו באמצעות גישה זו פועלים היטב בהתמרה של דרכי השתן4. טכניקה זו מאפשרת לייצר אדנו-וירוסים המקודדים cDNA בגודל של עד 8Kb באמצעות פלסמיד אריזת pAdEasy-1 (העלון מחליף את הגנים הנגיפיים E1 ו-E3), תאי החיידק pAdEasier-1 (המקודדים את הגנים האדנו-ויראליים הדרושים לייצור וירוס), וייצור אדנו-וירוסים פגומים בשכפול בתאי HEK293T (המבטאים את חלבון E1 הנגיפי הנדרש). עם זאת, החלפת פלסמיד האריזה pAdEasy-1 בפלסמיד האריזה pAdEasy-2 מגדילה את גודל האריזה ב-2.7 kB נוספים, אך מחייבת שימוש בקו תאים שונה (תאי רשתית עובריים אנושיים מותמרים E1 911) מכיוון שלנגיפים חסר גן E4 מוקדם בנוסף ל-E1 ו-E34. ביטוי של siRNA יכול להתבצע באמצעות מספר מערכות, כולל pAdloss, אשר מתואר בפירוט Kasahara et al.26. אמנם ייתכן שניתן להשתמש במדיום תרבית תאים עשיר בווירוסים כדי להתמיר את האורותל, אך שיטה זו עלולה להיות לא אמינה. במקום זאת, הגברת וירוסים בקנה מידה גדול, טיהור הדרגתי CsCl, ואחריו סינון ג'ל מספק את הדרך האמינה ביותר לייצר כמויות גדולות של וירוס טיטר גבוה. היציבות היחסית של הנגיף ב -80 מעלות צלזיוס, יחד עם יבולים גדולים יחסית של וירוס, עושה את זה דרך אידיאלית יש מלאי עקבי של וירוס שניתן להשתמש בו על פני מספר רב של ניסויים.

שלבים קריטיים נוספים בפרוטוקול זה כוללים את אלה המשויכים לפרוטוקול הטרנסדוקציה. אלה כוללים שימוש ב- PBS (ללא קטיונים דו-ערכיים) כחומר כביסה ודילול, ושימוש בחומר ניקוי DDM. מכיוון שמתחם הצומת תלוי ב- Ca2+ לתפקוד תקין, PBS ככל הנראה מקדם כניסה נגיפית על ידי שיבוש המחסום הקשור לצומת. DDM הוא גם קריטי; כפי שדיווחו Ramesh et al., היעילות של התמרה אדנווירוס נמוכה ביותר בהיעדר טיפול בחומרי ניקוי18. עם זאת, אופן הפעולה של חומר הניקוי אינו ברור. דגירה של 10 דקות עם DDM היא אידיאלית, אך ניתן לקצר אותה ל -5 דקות; עם זאת, לא מומלץ שהדגירה תימשך מעבר ל-10 דקות מכיוון שחומר הניקוי עלול לגרום נזק בלתי צפוי לרקמות הבסיסיות. כמות הנגיף המשמשת היא פרמטר קריטי, כאשר ריכוזים גבוהים יותר מובילים בדרך כלל לכמויות גדולות יותר של ביטוי טרנסגנים ויעילות התמרה גבוהה יותר. עם זאת, ריכוז הנגיף האופטימלי שנותן את השילוב הטוב ביותר של ביטוי, יעילות ופנוטיפ חייב להיקבע אמפירית. כריכוז התחלתי, מומלץ טווח של 5.0 x 106 עד 2.0 x 107 IVP לכל בעל חיים. בהתאם לחלבון המתבטא, התוצאה היא יעילות בטווח של 70%-95% 10,19,20,21,22; עם זאת, חלק ממבני GTPase הדומיננטיים-שליליים פחות יעילים (30%-50%) ודורשים גישת אנליזה של תא יחיד 4,20. הבדלים אלה ביעילות עשויים לשקף את תחלופת הטרנסגן, רעילותו, או טוהר ותפוקת הנגיף המשמש להתמרה. האחרון ניתן לשלול על ידי ביצוע בדיקות פלאק. למרות שזה לא קריטי במיוחד, הזמן שהנגיף נשאר בשלפוחית השתן חייב להיות מספיק זמן כדי שהנגיף יתחבר לקולטן CXADR שלו. פעמים פחות מ -30 דקות יכול להוריד את יעילות הטרנסדוקציה, בעוד הארכת תקופת הדגירה ל -45 דקות יכולה להגביר את היעילות; עם זאת, זה יכול להיות תלוי טרנסגן. השלב הקריטי האחרון בפרוטוקול זה הוא לקבוע כמה זמן יוחזק בעל החיים לפני הערכת פנוטיפ. טרנסגנים מציגים את הביטוי הגבוה ביותר לאחר 1-2 ימים19, אך הביטוי יכול לרדת לאחר מכן. במקרה של siRNAs, זה תלוי בקצב התחלופה של החלבון עצמו. לדוגמה, כאשר מבטאים siRNAs המכוונים לביטוי של Rab11a, GTPase ממשפחת ראב, נצפתה ירידה יעילה רק 72 שעות לאחר התמרה23. לכן, חלבונים מאריכי חיים (עם זמן מחצית חיים שנמדד בימים) עשויים שלא להיות מטרות מתאימות בגישה זו.

החוקר צריך להיות מודע גם לסייגים הקשורים לגישה זו. ראשית, התועלת שלה עשויה להיות מוגבלת למכרסמים נקבות בגלל קשיים בצנתור מכרסמים זכרים דרך איבר המין שלהם. עם זאת, ייתכן שניתן יהיה לבצע פרוטוקול זה בגברים על ידי החדרת קטטר לכיפת שלפוחית השתן, בדומה לתכשיר המשמש בעת ביצוע ציסטומטריה9. זה יאפשר להכניס חומר ניקוי או וירוס, ולבצע שטיפות לפי הצורך. אזהרה שנייה היא שביטוי יתר של חלבונים יכול למצות מסלולים ומשאבים של תאים, מה שעלול להוביל לאירועים כגון צבירת חלבונים, הפעלת מסלולי עקה תאית ומוות27. לכן, בדרך כלל חכם להגביל את ביטוי הטרנסגנים לרמות לא רעילות (אלא אם כן זו כמובן הכוונה של ביטוי טרנסגנים), כפי שהוערך באמצעות סמנים של לחץ תאי ומוות תאי. אזהרה שלישית היא כי במסגרות מסוימות, ביטוי אדנווירוס לטווח ארוך יכול לעורר תגובות חיסוניות28. אמנם אין ראיות לכך שהתמרה אדנו-ויראלית של השתן כשלעצמה מעוררת תגובות חיסוניות10, אך הדבר תלוי טרנסגן וכפי שצוין לעיל ביטוי יתר CLDN2 מוביל לדלקת שלפוחית השתן.

כיום, לחוקרים יש מגוון שיטות שבהן הם יכולים להשתמש כדי לווסת ביטוי גנים וחלבונים באורותל, כולל שימוש בעכברי נוקאאוט מהונדס או מותנה של השתן, שימוש בריאגנטים טרנספקציוניים, או שימוש בהתמרה אדנו-ויראלית. השיטה השנייה, נשוא פרוטוקול זה, קלה יחסית, יעילה וניתנת לשחזור. מלבד ההוצאה הראשונית של ריאגנטים של תרביות תאים הדרושים ליצירת מלאי הנגיף, הכמות הגדולה מאוד של הנגיף המיוצרת (מספיק כדי לבצע מאות טרנסדוקציות), גורמת לעלות נמוכה יחסית על בסיס לכל בעל חיים. ניתן לנצל התמרה אדנו-ויראלית לחקר ביולוגיה של דרכי השתן. לדוגמה, התמרה אדנו-ויראלית שימשה להגדרת החשיבות של GTPases ממשפחת Rho ומשפחת ראב, גורמי חילוף גואנין-נוקלאוטידים, שברי מנוע מיוזין ו-ADAM17 באקסוציטוזה ואנדוציטוזה 10,19,20,21,22, ולאחרונה נעשה שימוש בהתמרה אדנו-ויראלית כדי לחקור מכנוטרנסדוקציה של דרכי השתן9 . כמו כן, התמרה אדנו-ויראלית עשויה להיות רלוונטית בעת חקר וטיפול במחלות אנושיות. לדוגמה, Ramesh et al. הציעו בתחילה התמרה אדנו-ויראלית עשויה להיות דרך שימושית להתמקד בתאי גידול18. בעוד שהמחקרים שלהם היו יותר גישה של הוכחת עקרונות, אפשר לדמיין שביטוי של רעלים בתאים סרטניים או ביטוי של אפיטופים שיכולים להיות מזוהים על ידי מערכת החיסון יהיו אסטרטגיות שימושיות. התמרה אדנו-ויראלית עשויה להיות שימושית גם בהבנת מחלות שבהן ביטוי יתר או תת-ביטוי של תוצרי גנים מוביל למחלה. לדוגמה, ביופסיות משלפוחית השתן של חולים עם דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית מציגות עלייה של פי 90 בביטוי CLDN2 29. באופן מעניין, ביטוי יתר של CLDN2 באמצעות התמרה אדנו-ויראלית משכפל רבים מהתסמינים של מחלה זו בחולדות10. לפיכך, CLDN2 יכול להיות מטרה אחת בטיפול בחולים עם הפרעה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי פרס פרויקט פיילוט באמצעות P30DK079307 (ל- M.G.D.), מענק NIH R01DK119183 (ל- G.A. ו- M.D.C.), מענק NIH R01DK129473 (ל- G.A.), פרס פיתוח קריירה של האגודה האמריקאית לאורולוגיה ומענק קרן וינטרס (ל- N.M.), על ידי פיזיולוגיה של התא וליבות הדמיית כליות של אורגניזמים מודל של מרכז פיטסבורג לחקר הכליות (P30DK079307), ועל ידי S10OD028596 (ל-G.A.), שמימנה את רכישת המערכת הקונפוקלית ששימשה ללכידת חלק מהתמונות המוצגות בכתב יד זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 188
ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter