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Biology

Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Vengono descritti metodi per la generazione di grandi quantità di adenovirus ricombinanti, che possono quindi essere utilizzati per trasdurre l'urotelio nativo dei roditori consentendo l'espressione di transgeni o la downregulation di prodotti genici endogeni.

Abstract

Oltre a formare una barriera ad alta resistenza, si ipotizza che l'urotelio che riveste la pelvi renale, gli ureteri, la vescica e l'uretra prossimale percepisca e trasmetta informazioni sul suo ambiente ai tessuti sottostanti, promuovendo la funzione e il comportamento minzionale. La rottura della barriera uroteliale, o della sua funzione sensoriale / trasduttore, può portare a malattie. Lo studio di questi eventi complessi è ostacolato dalla mancanza di strategie semplici per alterare l'espressione genica e proteica nell'urotelio. Qui sono descritti metodi che consentono ai ricercatori di generare grandi quantità di adenovirus ad alto titolo, che può quindi essere utilizzato per trasdurre l'urotelio dei roditori con alta efficienza e in modo relativamente semplice. Sia i cDNA che i piccoli RNA interferenti possono essere espressi utilizzando la trasduzione adenovirale e l'impatto dell'espressione del transgene sulla funzione uroteliale può essere valutato da 12 ore a diversi giorni dopo. Questi metodi hanno un'ampia applicabilità agli studi di biologia uroteliale normale e anormale utilizzando modelli animali murini o ratti.

Introduction

L'urotelio è l'epitelio specializzato che riveste la pelvi renale, gli ureteri, la vescica e l'uretra prossimale1. Comprende tre strati: uno strato di cellule ombrello altamente differenziate e polarizzate spesso bi-nucleate, le cui superfici apicali sono immerse nelle urine; uno strato cellulare intermedio con una popolazione di cellule binucleate che amplificano il transito che possono dare origine a cellule ombrello superficiali in risposta alla loro perdita acuta; e un singolo strato di cellule basali, un sottoinsieme delle quali funziona come cellule staminali in grado di rigenerare l'intero urotelio in risposta a lesioni croniche. Le cellule ombrello sono principalmente responsabili della formazione della barriera uroteliale ad alta resistenza, i cui componenti includono una membrana apicale (ricca di colesterolo e cerebrosidi) con bassa permeabilità all'acqua e ai soluti e un complesso giunzionale apicale ad alta resistenza (composto da giunzioni strette, giunzioni aderenti, desmosomi e un anello di actomiosina associato)1 . Sia la superficie apicale della cellula ombrello che il suo anello giunzionale si espandono durante il riempimento della vescica e ritornano rapidamente al loro stato pre-riempito dopo aver annullato 1,2,3,4,5. Oltre al suo ruolo nella funzione di barriera, si ipotizza che l'urotelio abbia anche funzioni sensoriali e trasduttrici che gli consentono di percepire i cambiamenti nell'ambiente extracellulare (ad esempio, allungare) e trasmettere queste informazioni attraverso il rilascio di mediatori (tra cui ATP, adenosina e acetilcolina) ai tessuti sottostanti, compresi i processi nervosi afferenti suburoteliali 6,7,8 . Recenti prove di questo ruolo si trovano in topi privi di espressione uroteliale sia di Piezo1 che di Piezo2, che si traduce in un'alterata funzione minzionale9. Inoltre, i ratti che sovraesprimono la proteina CLDN2 che forma i pori stretti nello strato cellulare dell'ombrello sviluppano infiammazione e dolore analoghi a quelli osservati nei pazienti con cistite interstiziale10. Si ipotizza che l'interruzione della funzione sensoriale/trasduttore uroteliale o della barriera possa contribuire a diversi disturbi della vescica 6,11.

Una migliore comprensione della biologia dell'urotelio negli stati normali e patologici dipende dalla disponibilità di strumenti che consentiranno ai ricercatori di sottoregolare prontamente l'espressione genica endogena o consentire l'espressione di transgeni nel tessuto nativo. Mentre un approccio per sottoregolare l'espressione genica è quello di generare topi knockout uroteliali condizionali, questo approccio dipende dalla disponibilità di topi con alleli floxati, è laborioso e può richiedere mesi o anni per completarne12. Non sorprende quindi che i ricercatori abbiano sviluppato tecniche per trasfettare o trasdurre l'urotelio, che possono portare a risultati su una scala temporale più breve. I metodi pubblicati per la trasfezione includono l'uso di lipidi cationici13, oligodeossinucleotidi fosforotioati antisenso14 o acidi nucleici antisenso legati alla proteina TAT dell'HIV che penetra il peptide 11-mer15. Tuttavia, il focus di questo protocollo è sull'uso della trasduzione adenovirale-mediata, una metodologia ben studiata che è efficiente nella consegna genica a una vasta gamma di cellule, è stata testata in numerosi studi clinici e più recentemente è stata utilizzata per fornire il cDNA che codifica la proteina del capside COVID-19 ai destinatari di una variante del vaccino COVID-1916, 17. Per una descrizione più approfondita del ciclo di vita dell'adenovirus, dei vettori adenovirali e delle applicazioni cliniche degli adenovirus, il lettore è indirizzato al riferimento17.

Un'importante pietra miliare nell'uso di adenovirus per trasdurre l'urotelio, è stato un rapporto di Ramesh et al. che ha mostrato brevi pretrattamenti con detergenti, tra cui N-dodecil-β-D-maltoside (DDM) drammaticamente aumentato la trasduzione dell'urotelio da parte di un adenovirus che codifica β-galattosidasi18. Utilizzando questo studio proof-of-principle come guida, la trasduzione adenovirale-mediata dell'urotelio è stata ora utilizzata per esprimere una varietà di proteine, tra cui GTPasi della famiglia Rab, fattori di scambio guanina-nucleotide, frammenti motori di miosina, claudine associate alla giunzione stretta che formano pori e ADAM17 10,19,20,21,22 . Lo stesso approccio è stato adattato per esprimere piccoli RNA interferenti (siRNA), i cui effetti sono stati salvati da varianti co-esprimenti resistenti ai siRNA del transgene22. Il protocollo qui descritto include metodi generali per generare grandi quantità di adenovirus altamente concentrato, un requisito per queste tecniche, nonché adattamenti dei metodi di Ramesh et al.18 per esprimere transgeni nell'urotelio con alta efficienza.

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Protocol

Gli esperimenti che coinvolgono la generazione di adenovirus, che richiede la certificazione BSL2, sono stati eseguiti sotto l'approvazione degli uffici di salute e sicurezza ambientale dell'Università di Pittsburgh e del Comitato istituzionale per la biosicurezza. Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti, compresa la trasduzione adenovirale (che richiede la certificazione ABSL2), sono stati condotti in conformità con le linee guida / regolamenti pertinenti della politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio e della legge sul benessere degli animali e sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh. Guanti, protezione per gli occhi e abbigliamento appropriato sono indossati per tutte le procedure che coinvolgono virus ricombinanti. Tutti i rifiuti liquidi o solidi devono essere smaltiti come descritto di seguito. La lettiera degli animali dopo la trasduzione e le carcasse di animali risultanti devono essere trattate come materiali biopericolosi e smaltite secondo le politiche istituzionali.

1. Preparazione di stock di adenovirus ad alto titolo

NOTA: L'efficace trasduzione delle vesciche dei roditori dipende dall'uso di scorte virali purificate e concentrate, tipicamente da 1 x 107 a 1 x 108 particelle virali infettive (IVP) per μL. Questa parte del protocollo è focalizzata sulla generazione di stock di adenovirus ad alto titolo da preparazioni di virus esistenti. Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare utilizzando reagenti e strumenti sterili. Mentre i ceppi disponibili di adenovirus utilizzati oggi sono difettosi di replicazione, la maggior parte delle istituzioni richiede l'approvazione per utilizzare adenovirus e DNA ricombinante. Ciò include spesso la designazione di una sala di coltura cellulare come struttura approvata BSL2 per produrre e amplificare adenovirus. Alcune considerazioni generali includono l'uso di maschere, protezione per gli occhi, guanti e abbigliamento appropriato in tutte le fasi della produzione e della purificazione del virus. Quando si esegue la centrifugazione, si raccomandano tappi di sicurezza se i tubi della centrifuga non hanno tappi aderenti. Tutti i materiali non usa e getta, compresi i tappi di sicurezza delle centrifughe potenzialmente contaminati, le bottiglie e i rotori vengono trattati con una soluzione antivirale (vedere la tabella dei materiali) e quindi risciacquati con acqua o etanolo al 70%. I rifiuti liquidi vengono trattati aggiungendo candeggina ad una concentrazione finale del 10% (v/v). Lo smaltimento di questi rifiuti liquidi dipenderà dalle politiche istituzionali. I rifiuti solidi vengono generalmente smaltiti in rifiuti biopericolosi.

  1. Coltura cellule HEK293T
    1. Scongelare un flaconcino congelato di cellule HEK293T a bagnomaria a 37 °C e utilizzare una pipetta da 5 ml per trasferire le cellule in un piatto di coltura cellulare di 15 cm di diametro. Utilizzando una pipetta da 25 ml, aggiungere lentamente 20 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% (v/v) di siero fetale bovino e l'antibiotico penicillina/streptomicina (DMEM-FBS-PS) al piatto. Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare a 37 °C gassato con 5% (v/v) di CO2 fino a raggiungere l'80%-90% di confluenza (~2 x 107 cellule).
    2. Utilizzando una pipetta di vetro collegata a una sorgente di vuoto, aspirare il fluido, quindi risciacquare le celle trasferendo 20 mL di PBS sterile (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO4, 136,9 mM NaCl e 8,9 mM Na2HPO4) al piatto utilizzando una pipetta da 25 ml. Aspirare il PBS esaurito, quindi utilizzare una pipetta da 5 mL per trasferire 3 mL di soluzione calda (37 °C) di proteinasi (vedere Tabella dei materiali) al piatto, incubando il piatto nell'incubatore di coltura cellulare fino a quando le cellule non si staccano (~3-4 min).
      NOTA: La proteolisi efficace può essere valutata al meglio inclinando lentamente il piatto avanti e indietro cercando il rilascio di cellule da tutte le parti del piatto nel fluido in movimento. Le cellule HEK293T sono sensibili al trattamento prolungato con proteinasi e moriranno se lasciate più di pochi minuti in soluzione di proteinasi.
    3. Utilizzare una pipetta da 10 mL per trasferire 7 mL di DMEM-FBS-PS al piatto delle celle staccate, quindi utilizzare la stessa pipetta per aspirare le cellule e il mezzo. Trasferire le cellule sospese in un tubo conico da 50 ml, quindi pellettare le cellule centrifugando la sospensione in una centrifuga clinica a bassa velocità a 200 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante usando una pipetta di vetro collegata a una sorgente di vuoto. Utilizzare una pipetta da 25 mL per risospendere il pellet cellulare in 15 mL di DMEM-FBS-PS.
    4. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a ciascuno dei quindici piatti da 15 cm contenenti 19 mL di DMEM-FBS-PS.
    5. Far crescere le cellule in un incubatore di coltura tissutale fino a raggiungere l'85% -90% di confluenza (~ 3-4 giorni).
  2. Preparare una soluzione virale diluita
    1. Aggiungere ~ 1,5 x 10 9 a 3 x 109 IVP di uno stock virale esistente (5-10 IVP / cellula) a un tubo conico da 50 ml riempito con 45 ml di DMEM privo di FBS o antibiotici.
      NOTA: È possibile utilizzare una concentrazione inferiore del virus (1-5 IVP/cellula); Tuttavia, ci vorrà più tempo per la produzione di virus.
  3. Infettare le cellule coltivate con il virus.
    1. Utilizzando una pipetta di vetro collegata ad una sorgente di vuoto, aspirare il mezzo dalle celle quasi confluenti al punto 1.1.5.
    2. Utilizzare una pipetta da 25 mL per trasferire 3,0 mL di soluzione virale diluita (preparata al punto 1.2.1) in ciascuna capsula di coltura cellulare. Quindi, utilizzare una pipetta da 10 ml per aggiungere 7,0 ml di terreno DMEM (privo di FBS o antibiotici) a ciascun piatto. Incubare per 60 minuti in un incubatore di colture cellulari, quindi aggiungere 10 ml di DMEM contenente il 20% (v/v) di FBS e 2x PS a ciascun piatto.
      NOTA: L'utilizzo di uno dei 15 piatti come piastra di controllo (in cui il virus non viene aggiunto) rende più facile identificare l'arrotondamento delle cellule indotto dal virus e la morte nelle cellule infette nella fase successiva.
    3. Incubare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 2-4 giorni fino a quando la maggior parte di esse inizia ad arrotondare e >60% delle cellule si è staccato.
      NOTA: se si utilizza un titolo inferiore del virus, potrebbe essere necessaria fino a una settimana prima che si verifichi la morte cellulare. Se la morte cellulare non si verifica entro una settimana, è probabile che il processo debba essere ripetuto utilizzando un titolo più alto del virus.
  4. Recuperare il virus dai lisati cellulari
    1. Utilizzare un raschietto per raschiare il fondo di ogni piatto, rilasciando le cellule attaccate nel mezzo.
    2. Utilizzando una pipetta da 25 ml, raccogliere e raggruppare il terreno, le cellule e i detriti cellulari da ciascun piatto di coltura cellulare in una provetta conica di coltura cellulare da 50 ml.
      NOTA: Per risparmiare risorse, il mezzo di due piatti può essere combinato in un tubo da 50 ml.
    3. Pellet il materiale cellulare mediante centrifugazione utilizzando una centrifuga da tavolo a bassa velocità: 5 minuti a temperatura ambiente a 3.000 x g. Utilizzare una pipetta di vetro collegata a un dispositivo a vuoto per aspirare il surnatante.
    4. Utilizzare una pipetta da 10 ml, combinata con la triturazione, per consolidare tutto il materiale pellettato risultante in un totale di 7 ml di Tris-HCl 100 mM filtrato sterile pH 7,4 contenente 10 mM EDTA (soluzione Tris-EDTA). Trasferire il materiale aggregato in un tubo conico di coltura cellulare sterile da 15 mL e metterlo su ghiaccio.
      NOTA: A questo punto, la preparazione del virus può essere congelata a -80 °C a tempo indeterminato.
  5. Preparare lisati cellulari
    1. Eseguire tre cicli di congelamento-disgelo per interrompere le cellule rimanenti e quindi liberare ulteriormente le particelle virali formate. Congelare il materiale raggruppato nella fase 1.4.4 immergendo il tubo in azoto liquido (~30-60 s). Scongelare rapidamente il campione collocando il tubo in un incubatore a 37 °C. Vortice il campione per 15 s, quindi ripetere la procedura di congelamento e scongelamento rapido di altre 2 volte.
      NOTA: La soluzione virale può essere rapidamente scongelata a 37 °C a bagnomaria, ma è necessaria cautela poiché le oscillazioni di temperatura possono causare la rottura del tubo, rilasciando la soluzione virale nel bagno d'acqua. Per evitare che ciò accada, posizionare il tubo contenente il surnatante virale in un tubo più grande, che viene quindi impostato nel bagno d'acqua.
    2. Utilizzare una pipetta da 10 ml per trasferire il materiale cellulare congelato tre volte in una provetta da centrifuga superspeed. Centrifugare il materiale nel tubo per 30 minuti a 4 °C di centrifuga super-velocità a ~18.500 x g.
    3. Recuperare ~7 mL di surnatante ricco di virus con una pipetta da 10 mL e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL. Conservare il campione su ghiaccio fino alla fase successiva.
      NOTA: A questo punto, considerare di mantenere un'aliquota del surnatante virale non purificato come preambolo per iniziare una nuova preparazione del virus (o come backup). Conservare questa aliquota a -80 °C.
  6. Isolare e purificare il virus utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità.
    1. Preparare un gradiente discontinuo di CsCl in un tubo di ultracentrifuga trasparente a parete sottile da 12 mL di PET (vedere la tabella dei materiali) o equivalente. Utilizzare una siringa da 3 mL dotata di un ago da 18 G per introdurre con cautela 2,5 mL di soluzione di CsCl da 1,4 g/mL sul fondo del tubo, quindi utilizzare una nuova siringa/ago per sovrapporlo con 2,5 mL di soluzione di CsCl da 1,25 g/mL.
      NOTA: la caduta di soluzioni direttamente sopra uno strato preesistente causerà una miscelazione significativa e indesiderata. Posizionare invece la parte smussata dell'ago contro il bordo del tubo, quindi premere molto lentamente lo stantuffo della siringa, sollevando la posizione dell'ago mentre la soluzione riempie il tubo.
    2. Caricare ~ 7 ml di surnatante virale sopra il gradiente in modo simile usando una siringa da 10 ml. Se c'è più di 2-3 mm di spazio tra il surnatante virale e la parte superiore del tubo, aggiungere ulteriore soluzione Tris-EDTA per riempire il tubo fino a quando rimangono solo 2-3 mm di spazio.
    3. Crea un tubo di equilibrio preparato in modo simile, contenente strati di CsCl, ma sostituendo la soluzione Tris-EDTA per il surnatante virale.
      NOTA: I due tubi devono avere pesi identici (e densità simili) per evitare una situazione di carico sbilanciato potenzialmente pericolosa nell'ultracentrifuga.
  7. Isolare il virus usando l'ultracentrifugazione zonale.
    1. Caricare le pendenze formate nei passi 1.6.2-1.6.3 nelle benne di un rotore SW41 o equivalente. Avvitare i tappi a secchio, inserire il rotore in un'ultracentrifuga (preraffreddata a 4 °C) e centrifugare per 1 ora a ~150.000 x g.
    2. Durante la centrifugazione, equilibrare la colonna descritta al punto 1.9.1 di seguito.
  8. Recupera particelle virali isolate
    1. Alla fine della fase di centrifugazione, staccare con cura i secchi dal rotore e, in una cappa di coltura cellulare, rimuovere i tappi del secchio, quindi rimuovere i tubi e posizionarli in un rack.
    2. Raccogliere il materiale fasciato, ricco di particelle virali, che galleggia all'interfaccia tra la soluzione CsCl da 1,25 g/mL e 1,4 g/mL. Tenendo il tubo contenente il gradiente sopra la metà inferiore di un piatto di coltura cellulare (che catturerà eventuali materiali versati), utilizzare un ago da 1 pollice da 18 G collegato a una siringa da 3 ml per perforare accuratamente il tubo, appena sotto il virus a bande. Aspirare lentamente il virus, che viene tipicamente recuperato in ~ 1 ml.
    3. Rimuovere l'ago dal tubo, in modo che il materiale rimanente nel gradiente fuoriesca dal tubo nella metà inferiore del piatto di coltura cellulare (qualsiasi liquido deve essere trattato come rifiuto pericoloso).
    4. Trasferire la soluzione virale nella siringa in una provetta sterile per microcentrifuga su ghiaccio.
      NOTA: quando si recupera il virus in questo passaggio, posizionare l'ago in modo che il lume dell'ago sia rivolto verso l'alto con l'ago che si apre alcuni mm sotto la banda ricca di virus. Evitare la contaminazione da parte della banda sottile del virus assemblato in modo improprio che a volte si osserva 2-3 mm sopra il virus a bande (vedere la sottile freccia nera nella figura 1A).
  9. Rimuovere CsCl dal campione mediante filtrazione su gel.
    1. Equilibrare una colonna PD-10 (preconfezionata con Sephadex G-25M), bloccata a un supporto di supporto, con 50 ml di PBS filtrato sterile da 0,2 μm contenente glicerolo al 10% (v/v).
      NOTA: La fase iniziale di equilibrio richiede 2-3 ore per essere completata ed è necessaria per garantire il completo lavaggio dei conservanti utilizzati dal produttore per stabilizzare la colonna.
    2. Lasciare che la soluzione di lavaggio si ritiri al di sotto della fritta (un disco protettivo di materiale bianco nella parte superiore del mezzo della colonna), quindi trasferire con attenzione la soluzione virale purificata raccolta nel passaggio 1.8 nella parte superiore della colonna. Lasciare che la soluzione ricca di virus si ritiri sotto la fritta, quindi iniziare a riempire la colonna con PBS-glicerolo.
      NOTA: una funzione della fritta è quella di impedire che la colonna si asciughi. Di conseguenza, vengono tollerati brevi ritardi prima che venga aggiunto più eluente alla colonna.
    3. Raccogliere l'eluato in 12 provette sterili per microcentrifuga, 0,5 mL per frazione.
  10. Determinare la resa virale.
    1. Determinare le frazioni virali di picco utilizzando la spettrofotometria. Preparare una diluizione 1:100 di ogni frazione in PBS e misurare l'OD260 in uno spettrofotometro, usando una diluizione 1:100 del solo buffer come bianco. Le particelle virali dovrebbero eluire nel volume del vuoto, iniziando intorno alla frazione 6. Raggruppare le frazioni contenenti le letture OD260 più elevate.
    2. Effettuare una diluizione 1:100 delle frazioni virali aggregate e rimisurare l'OD260. Calcolare la concentrazione finale di particelle virali e il numero di IVP nelle frazioni aggregate utilizzando la seguente formula: particelle virali per mL = OD260 × 100 (questo corregge il fattore di diluizione) × 1012. Una stima generale è che l'1% delle particelle virali sono IVP, in quanto tali: IVP / mL = OD 260 × 100 × 10 10 o IVP / μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. Aliquot le frazioni virali aggregate (contenenti 5 x 10da 7 a 1 x 108 IVP) in provette sterili per microcentrifuga o crioviali. Conservare i campioni a -80 °C.

2. Trasduzione della vescica dei roditori

NOTA: Se non si ha familiarità con questa tecnica, si raccomanda di limitare a 2-4 il numero di animali trasdotti contemporaneamente. Ciò può essere ottenuto scaglionando gli orari di inizio per ciascun animale, in particolare durante il trattamento detergente nella fase 2.2, e quindi l'incubazione del virus nella fase 2.3. I ricercatori esperti possono trasdurre fino a sei animali alla volta.

  1. Cateterizzare la vescica
    1. Anestetizzare topi femmina C57Bl/6J (tipicamente 8-10 settimane, ~20-25 g) o femmine di ratti Sprague Dawley (tipicamente 2-3 mesi, ~250 g) usando un vaporizzatore con un cono nasale attaccato. Calibrare il vaporizzatore per produrre il 3,0% (v/v) di isoflurano, il 97% (v/v) di O 2 per i topi o il 4,0% (v/v) di isoflurano, il 96% (v/v) di O2 per i ratti. Confermare che gli animali siano anestetizzati assicurandosi che non rispondano al pizzicamento delle dita dei piedi (in genere dopo 1-2 minuti).
    2. Mantenere la temperatura corporea dell'animale posizionando gli animali su un pad riscaldato. Monitorare l'animale durante tutto il protocollo di trasduzione per assicurarsi che gli animali siano anestetizzati e non provino alcun dolore durante questa procedura.
    3. Ridurre l'isoflurano all'1,5% (v/v) per i topi o al 2,0% (v/v) per i ratti e mantenere gli animali sotto anestesia per tutta la durata del protocollo.
    4. Per evitare l'introduzione di aria nella vescica, riempire la porzione di catetere di plastica di un catetere IV (vedere la tabella dei materiali) e l'hub associato con PBS sterile utilizzando una pipetta di trasferimento.
    5. Con l'animale in posizione supina, tamponare il meato esterno con alcol al 70% e inserire il catetere sterile nel meato esterno, poi nell'uretra e poi nella vescica.
      1. Per eseguire questo compito, utilizzare una pinza fine per afferrare delicatamente il tessuto che forma il meato esterno ed estenderlo verticalmente, lontano dall'animale. Usando l'altra mano, inserire con attenzione il catetere verticalmente di circa 3-4 mm nel meato uretrale (un tumulo di carne appena sopra l'apertura della vagina). Quindi, a causa di una curva nell'uretra, abbassare il catetere, inserito nel meato esterno, verso la coda dell'animale, che facilita il suo ingresso nella porzione dell'uretra che passa sotto l'osso pubico e infine nella vescica.
        . NOTA: Soprattutto nel caso del topo, il catetere potrebbe essere troppo lungo e non più di 1,0-1,1 cm di esso deve essere inserito nell'animale. Altrimenti, ne deriveranno danni alla mucosa della vescica. Per evitare ciò, contrassegnare il catetere ~ 1 cm sotto la sua punta, quindi non inserire il catetere oltre questo segno.
    6. Lasciare che l'urina nella vescica fuoriesca. Rimuovere l'eventuale residuo di urina eseguendo la manovra di Credé: massaggiare e premere delicatamente sulla protuberanza della vescica nella zona addominale inferiore.
  2. Rendere l'urotelio ricettivo alla trasduzione trattandolo con una soluzione detergente.
    1. Lavare la vescica del topo o del ratto attaccando una siringa sterile da 1 mL piena di PBS all'hub del catetere. Iniettare 100 μL di PBS sterile nella vescica del topo (o 450 μL nel caso della vescica di ratto). Staccare la siringa dal catetere e lasciare drenare il PBS. Se necessario, eseguire la manovra di Crede per rimuovere il liquido vescicale in eccesso.
    2. Instillare 100 μL di N-dodecil-β-D-maltoside (DDM) allo 0,1% (p/v) (disciolto in PBS e 0,2 μm filtrato-sterilizzato) nella vescica del topo utilizzando una siringa sterile da 1 ml. Trattenere il DDM nella vescica per 10 minuti lasciando la siringa in posizione. Nei ratti, il volume di DDM è aumentato a 450 μL.
    3. Rimuovere il DDM dalla vescica staccando la siringa e lasciandola fuoriuscire. Eseguire la manovra di Crede se necessario.
  3. Introdurre il virus nella vescica.
    1. Collegare una siringa sterile da 1 mL all'hub del catetere e instillare nella vescica 0,5 x 10da 7 a 1 x 108 IVP di adenovirus (preparato nella fase 1), diluito in 100 μL di PBS sterile per i topi o 450 μL per i ratti. Lasciare la siringa attaccata al catetere per evitare che la soluzione virale fuoriesca.
    2. Dopo 30 minuti, staccare la siringa e lasciare che la soluzione virale evacui la vescica su un tampone monouso. Tamponare qualsiasi soluzione virale residua con una salvietta assorbente, eliminare il tampone e pulire i rifiuti biopericolosi.
      NOTA: Il glicerolo è citotossico. Pertanto, il volume massimo di soluzione virale instillata nei topi è limitato a 5 μL (che se diluito in 100 μL di PBS comporterebbe una concentrazione finale di glicerolo di ~ 0,5% [v / v]). Inoltre, è possibile migliorare l'efficienza della trasduzione aumentando il numero di IVP instillati ed estendendo l'incubazione del virus a 45 minuti.
    3. Passaggio facoltativo: la vescica può essere risciacquata con PBS come descritto al precedente punto 2.2.1; tuttavia, questo non è obbligatorio.
  4. Lascia che l'animale si riprenda.
    1. Cessare il flusso di isoflurano e consentire all'animale di riprendersi ed essere completamente mobile prima di riportarlo nella sua gabbia, in particolare se gli animali sono alloggiati in gruppo.
      NOTA: Poiché la trasduzione del virus di per sé non causa sintomi osservabili del tratto urinario inferiore o dolore, di solito non è necessario un trattamento post-chirurgico. Tuttavia, se il transgene codificato è tossico, possono essere necessari analgesici post-procedura o antibiotici come richiesto dall'istituzione.
  5. Analizzare gli effetti dell'espressione transgenica 12-72 ore dopo il trattamento utilizzando metodi come l'ibridazione mRNA in situ, western blot o immunofluorescenza 9,10,23 (vedere i risultati rappresentativi).

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Representative Results

Preparazione del virus
Un esempio di purificazione del virus mediante centrifugazione a gradiente di densità è mostrato nella Figura 1A. La banda rosa chiaro, che si trova all'interfaccia tra il materiale cellulare caricato e lo strato di CsCl da 1,25 g/ml, è composta principalmente da cellule disgregate e dai loro detriti (vedi freccia magenta in Figura 1A). Deriva il suo colore rosato dalla piccola quantità di terreno di coltura che viene riportato dal passaggio 1.5 del protocollo. Le particelle virali di interesse, che appaiono come una banda bianca lattea, si trovano all'interfaccia delle soluzioni CsCl da 1,25 g/mL e CsCl da 1,40 g/mL (vedere freccia gialla nella figura 1A). Si può anche osservare una banda di materiale che galleggia 2-3 mm sopra le particelle virali arricchite (vedi sottile freccia nera in Figura 1A). Comprende virus e detriti non assemblati, contiene pochi IVP e dovrebbe essere evitato quando si raccoglie il campione di virus.

L'ulteriore purificazione del virus e lo scambio di tampone utilizzando una colonna PD10 sono rappresentati nella Figura 1B e le letture OD260 delle frazioni risultanti dopo l'eluizione sono mostrate nella Figura 1C. Il volume vuoto di queste colonne è di circa 3 ml, e quindi il virus inizia ad apparire nella frazione 6 e raggiunge il picco nella frazione 9. In questo esperimento, le frazioni 6-9 sono state raggruppate. Mentre le frazioni 6 e 7 sono relativamente basse nelle particelle virali, contengono virus sufficiente per meritare il recupero e servono a diluire le frazioni di titoli molto alti a una concentrazione più ragionevole. Le frazioni 10-12 non sono state incluse in quanto l'aumento di OD260 nella frazione 11 indica la possibile presenza di un secondo picco contaminante, che è variamente osservato in questi preparati. La frazione aggregata avrà tipicamente 1 x 107 a 1 x 108 IVP / μL e il rendimento atteso sarebbe nell'ordine di 1 x 10 10 a 2 x10 11 IVP totale. Questa è una quantità sufficiente di virus per eseguire centinaia di trasduzioni. Mentre è possibile titolare il virus mediante saggi di placca o contando colonie di cellule che esprimono proteine fluorescenti22, la regola dell'1% è sufficiente nella maggior parte dei casi. Questa regola afferma che l'1% delle particelle virali purificate, stimate misurando l'OD260 del campione, sono IVP. Le aliquote di virus conservate a -80 °C hanno una durata di conservazione di 2-5 anni, anche se l'infettività diminuisce a lungo termine. Le aliquote del virus scongelate possono essere ricongelate a -80 °C una sola volta senza una significativa perdita di infettività. Tuttavia, lo scongelamento e il congelamento ripetuti influiscono negativamente sull'infettività virale.

Trasduzione della vescica
Un primo passo importante nella valutazione dell'impatto della trasduzione è confermare l'espressione del transgene. Questo può essere valutato utilizzando diverse tecniche, tra cui strumenti che rilevano l'mRNA (ad esempio, RNAScope), l'analisi western blot o l'uso dell'immunofluorescenza 9,10,23. La Figura 2 è un esempio di urotelio di topo che è stato trasdotto con un adenovirus che codifica per l'ormone della crescita umano marcato con epitopo V5 (V5-hGH)23. Questa proteina è confezionata in vescicole discoidali/fusiformi e può essere esocitata durante il riempimento della vescica19,23. L'analisi Western blot dei lisati uroteliali ha rivelato l'espressione di V5-hGH nell'urotelio delle vesciche trasdotte, ma non in quelle non trasdotte (Figura 2A). L'espressione è stata confermata anche dall'immunofluorescenza, in questo caso utilizzando anticorpi che hanno riconosciuto hGH o il tag dell'epitopo V5 (le vesciche non trasdotte mancavano di segnale, non mostrate) (Figura 2B).

Un ulteriore esempio è la trasduzione della vescica di ratto con un virus che codifica CLDN2, una proteina24,25 associata alla giunzione stretta che forma i pori. CLDN2 aumenta il flusso paracellulare di cationi (incluso K+) e la sua sovraespressione provoca infiammazione e sviluppo di dolore viscerale10. L'analisi Western blot ha confermato l'espressione di CLND2 nelle vesciche di ratto trasdotte con adenovirus codificante Cldn2, ma non in quelle trasdotte con un virus di controllo codificante GFP (Figura 2C). In generale, la GFP non è considerata tossica quando espressa nelle cellule e serve quindi come controllo utile. L'uso della GFP consente inoltre allo sperimentatore di confermare che la trasduzione sta funzionando. L'analisi di immunofluorescenza ha ulteriormente confermato l'espressione esogena di CLDN2 in cellule ombrello uroteliali trasdotte con virus codificanti Cldn2 cDNA (segnale rosso in Figura 2D). Inoltre, simile al CLDN2 endogeno (non mostrato), il CLDN2 espresso è localizzato nelle giunzioni strette marcate con TJP1, così come le superfici basolaterali delle cellule ombrello (CLDN2 è etichettato in verde nella Figura 2E)10. Nel caso dell'espressione di CLDN2, era più alta un giorno dopo la trasduzione, ma poi si è ritirata ed era appena rilevabile dopo 15 giorni.

Una seconda considerazione è, quali tipi di cellule saranno presi di mira dalla trasduzione adenovirale. Mentre nei ratti è possibile trasdurre principalmente lo strato cellulare ombrello19, nel topo, tutti gli strati dell'urotelio possono essere trasdotti, sebbene la trasduzione degli strati intermedi e basali delle cellule possa essere variabile. È importante sottolineare che, nell'intera parete della vescica, solo l'urotelio viene trasdotto e nessun altro tessuto è preso di mira dall'adenovirus instillato (Figura 3).

Mentre le analisi delle cellule trasdotte possono essere eseguite a livello di singola cellula, quando si esplora un fenotipo complessivo della vescica, è necessario trasdurre la maggior parte delle cellule uroteliali. Pertanto, è importante definire l'efficienza della trasduzione (cioè, quale frazione di cellule uroteliali viene trasdotta). Ad esempio, nel caso dell'adenovirus che esprime Cldn2, il >95% delle cellule ombrello è stato trasdotto (vedi Figura 2D). Un ulteriore esempio è il campo immagine mostrato in Figura 3, dove contando il numero di celle ombrello trasdotte (in questo caso, esprimendo il sensore Ca2+ GCAMP5G), rivela un'efficienza che si avvicina al 95%. Tuttavia, è necessario esaminare le cellule in campi casuali presi in tutta la parete della vescica per ottenere una stima accurata e imparziale dell'efficienza di trasduzione.

Figure 1
Figura 1: Purificazione dell'adenovirus. (A) Le particelle di adenovirus prodotte dalle cellule HEK293T infette sono state purificate mediante centrifugazione su un gradiente discontinuo di CsCl costituito da uno strato di 1,4 g/mL CsCl, uno strato di 1,25 g/mL CsCl e uno strato di campione (S) diluito in soluzione Tris-EDTA. Il materiale cellulare (freccia rosa) si accumula all'interfaccia S/1.25, mentre l'adenovirus purificato galleggia all'interfaccia 1.25/1.4 (freccia gialla). Una piccola banda di virus assemblato in modo improprio galleggia sopra quest'ultimo (sottile freccia nera). (B) La banda ricca di adenovirus nel gradiente viene recuperata utilizzando un ago e il CsCl viene rimosso dall'adenovirus mediante filtrazione su gel utilizzando una colonna PD10 riempita con Sephadex G25 equilibrata con PBS contenente glicerolo al 10,0% (v / v). La superficie del Sephadex è protetta da una fritta porosa e plastica. (C) Le frazioni, 0,5 ml, sono state raccolte dalla colonna PD10. L'OD260 delle frazioni è stato misurato in uno spettrofotometro e i valori tracciati. Le frazioni ricche di virus si eluiscono nel volume del vuoto, che inizia alla frazione 6 e si estende alla frazione 9. Le frazioni raggruppate per questo esperimento rappresentativo sono ombreggiate in blu. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Trasduzione dell'urotelio della vescica dei roditori con adenovirus codificanti V5-hGH o CLDN2. (A) L'urotelio di topo è stato lasciato non trasdotto (UT) o trasdotto con adenovirus codificanti V5 epitopo marcato ormone della crescita umano (hGH). Dopo 24 ore, le vesciche sono state recuperate, i lisati uroteliali sono stati preparati e sottoposti all'elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato poliacrilammide e l'espressione di V5-hGH è stata confermata utilizzando western blots sondati con un anticorpo contro hGH. (B) Rilevazione di V5-hGH in urotelio di topo sezionato e colorato utilizzando anticorpi contro hGH (verde) o l'epitopo V5 (rosso) e anticorpi secondari marcati con fluorofori. L'immunofluorescenza è stata catturata utilizzando la microscopia confocale. I campioni sono stati controcolorati con TO-PRO3 per etichettare i nuclei. (C-F) L'urotelio di ratto è stato trasdotto con un virus che codifica per il ratto CLDN2 (nome comune claudina-2) o GFP (nome comune proteina fluorescente verde) come controllo. (C) Rilevazione di CLDN2 esogeno mediante western blotting utilizzando un nuovo anticorpo CLDN2. Si noti che il CLDN2 endogeno è espresso a bassi livelli e non viene rilevato in questo esperimento. (D) La trasduzione dello strato cellulare ombrello è rivelata mediante immunofluorescenza e microscopia confocale. I bordi della cellula sono rivelati co-colorando il tessuto con FITC-falloidina, che etichetta il citoscheletro corticale di actina. (E) Rilevazione di CLDN2 esogeni e TJP1 (nome comune ZO1) mediante immunofluorescenza e microscopia confocale di urotelio intero o in sezione trasversale. Piccole frecce bianche indicano la posizione della giunzione stretta e piccole punte di freccia magenta segnano la posizione degli accumuli intracellulari di CLDN2 nel citoplasma cellulare. Questi sono stati precedentemente rivelati essere CLDN210 associati a Golgi. (F) Dopo la trasduzione, gli animali sono stati sottoposti a eutanasia nei giorni indicati dopo l'infezione. L'espressione esogena di CLDN2 è stata rilevata utilizzando western blotting. Gli animali che esprimevano GFP sono stati sottoposti a eutanasia dopo il giorno 1. I dati in Figura 2C-E sono stati modificati da Montalbetti et al.10, e sono riprodotti con il permesso dell'American Physiological Society. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Efficienza della trasduzione adenovirale. L'urotelio della vescica di topo è stato trasdotto con un adenovirus che codifica per il sensore di calcio GCaMP5G. I pannelli superiori mostrano la colorazione per GCaMP5G (rilevata utilizzando un anticorpo alla proteina fluorescente verde; GFP, verde), i pannelli centrali mostrano la distribuzione dei nuclei colorati con DAPI (blu) e l'actina marcata con rhodamine-falloidina (rosso), e i pannelli inferiori sono una fusione dei tre segnali. Le punte di freccia bianche nel pannello inferiore sono le rare celle dell'ombrello che non vengono trasdotte. L'efficienza complessiva della trasduzione delle cellule ombrello in questa immagine è ~ 95%. Si noti che solo l'urotelio viene trasdotto. Le regioni ingrandite sono ingrandite nei pannelli a destra. La regione nel riquadro 1 comprende principalmente celle ombrello trasdotte. La regione nel riquadro 2 è l'urotelio che mostra una trasduzione efficiente delle cellule ombrello, ma una trasduzione meno efficiente degli strati cellulari sottostanti. LP = lamina propria; ME = muscularis externa; Se = sierosa; Ut = urotelio. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Mentre Ramesh et al. si sono concentrati sullo sviluppo di strategie per utilizzare la trasduzione adenovirale nel trattamento del cancro della vescica 18, rapporti più recenti hanno dimostrato l'utilità di queste tecniche nello studio della normale biologia uroteliale / fisiologia e fisiopatologia 10,18,19,20,21 . Le caratteristiche importanti di questo approccio includono quanto segue: (i) Nell'intera parete della vescica del roditore, solo l'urotelio viene trasdotto 10,19,20,21,22. Nel caso dei ratti, la trasduzione è per lo più limitata allo strato cellulare dell'ombrello, mentre nei topi, l'intero urotelio può essere mirato; (ii) Questo approccio può essere utilizzato per esprimere proteine o siRNA 10,19,20,21,22; (iii) L'efficienza della trasduzione può avvicinarsi al 70%-95% (ad esempio, vedi figura 3)18,20; (iv) Un giorno dopo la trasduzione, l'ultrastruttura dell'urotelio, l'integrità del tessuto, la presenza di una barriera ad alta resistenza (valutata misurando la resistenza transepiteliale) e l'espressione dei marcatori di differenziazione uroteliale sono "normali"10,19. L'unico effetto morfologico osservato finora è una diminuzione del diametro delle cellule dell'ombrello (se visto dall'alto); tuttavia, tornano alle loro dimensioni normali dopo 3-4 giorni10,19; (v) L'urotelio può essere trasdotto con un massimo di tre diversi adenovirus contemporaneamente18; (vi) L'espressione transgenica può essere alterata titolando il numero di IVP, che influenza la quantità di espressione proteica, allungando o accorciando il tempo di incubazione prima che l'animale venga sacrificato, o utilizzando diversi promotori come un sistema regolato da tet-et (tet-off)19. In quest'ultimo caso, si può co-esprimere un virus che codifica per il transattivatore/tet-repressore, e quindi modulare l'espressione del transgene alterando la concentrazione di doxiciclina nella dieta dell'animale.

Mentre il protocollo generale è relativamente semplice, ci sono alcuni passaggi critici che devono essere considerati quando si eseguono questi esperimenti. Uno di questi è la disponibilità di stock di virus ad alto titolo che sono di ragionevole purezza. Gli adenovirus possono essere ottenuti da venditori commerciali, da nuclei di produzione di virus istituzionali, da altri ricercatori, oppure possono essere prodotti internamente. Nel caso di quest'ultimo, il sistema AdEasy del laboratorio Bert Vogelstein è raccomandato perché i suoi componenti possono essere acquistati da Addgene e gli adenovirus generati con questo approccio funzionano bene nella trasduzione uroteliale4. Questa tecnica consente di generare adenovirus che codificano cDNA grandi fino a 8 Kb utilizzando il plasmide di imballaggio pAdEasy-1 (l'inserto sostituisce i geni virali E1 ed E3), le cellule batteriche pAdEasier-1 (che codificano i geni adenovirali necessari per produrre virus) e la produzione di adenovirus difettosi di replicazione nelle cellule HEK293T (che esprimono la proteina E1 virale richiesta). Tuttavia, la sostituzione del plasmide di imballaggio pAdEasy-1 con il plasmide di imballaggio pAdEasy-2 aumenta le dimensioni dell'imballaggio di ulteriori 2,7 kB, ma richiede l'uso di una linea cellulare diversa (cellule 911 embrionali umane trasformate in E1) poiché i virus mancano del gene precoce E4 oltre a E1 ed E34. L'espressione dei siRNA può essere realizzata utilizzando diversi sistemi, tra cui pAdloss, che è descritto in dettaglio in Kasahara et al.26. Mentre può essere possibile utilizzare terreno di coltura cellulare ricco di virus per trasdurre l'urotelio, questo metodo può essere inaffidabile. Invece, l'amplificazione del virus su larga scala, la purificazione del gradiente CsCl, seguita dalla filtrazione su gel, forniscono il modo più affidabile per generare grandi quantità di virus ad alto titolo. La relativa stabilità del virus a -80 °C, unita a rese relativamente elevate di virus, rende questo un modo ideale per avere uno stock consistente di virus che può essere utilizzato in un gran numero di esperimenti.

Ulteriori passaggi critici in questo protocollo includono quelli associati al protocollo di trasduzione. Questi includono l'uso di PBS (senza cationi bivalenti) come agente di lavaggio e diluente e l'uso di detergente DDM. Poiché il complesso giunzionale dipende da Ca2+ per il corretto funzionamento, PBS probabilmente promuove l'ingresso virale interrompendo la barriera associata alla giunzione. Anche il DDM è fondamentale; come riportato da Ramesh et al., l'efficienza della trasduzione dell'adenovirus è estremamente bassa in assenza di trattamento detergente18. Tuttavia, la modalità di azione del detergente non è chiara. Un'incubazione di 10 minuti con DDM è l'ideale, ma può essere ridotta a 5 minuti; Tuttavia, non è consigliabile che l'incubazione si protragga oltre i 10 minuti poiché il detergente può causare danni imprevisti ai tessuti sottostanti. La quantità di virus utilizzata è un parametro critico, con concentrazioni più elevate che generalmente portano a maggiori quantità di espressione transgenica e maggiori efficienze di trasduzione. Tuttavia, la concentrazione virale ottimale che fornisce la migliore combinazione di espressione, efficienza e fenotipo deve essere determinata empiricamente. Come concentrazione iniziale, si raccomanda un intervallo da 5,0 x 106 a 2,0 x 107 IVP per animale. A seconda della proteina espressa, ciò si traduce in efficienze nell'intervallo 70%-95% 10,19,20,21,22; tuttavia, alcuni costrutti di GTPasi dominante-negativa sono meno efficienti (30%-50%) e richiedono un approccio di analisi a cella singola 4,20. Queste differenze di efficienza possono riflettere il turnover del transgene, la sua tossicità o la purezza e la resa del virus utilizzato per la trasduzione. Quest'ultimo può essere escluso eseguendo saggi di placca. Sebbene non sia ipercritico, il tempo in cui il virus rimane nella vescica deve essere abbastanza lungo da consentire al virus di attaccarsi al suo recettore CXADR. Tempi inferiori a 30 minuti possono ridurre l'efficienza della trasduzione, mentre estendere il periodo di incubazione a 45 minuti può aumentare l'efficienza; tuttavia, questo può essere transgene-dipendente. L'ultimo passo critico in questo protocollo è determinare per quanto tempo l'animale sarà trattenuto prima che un fenotipo venga valutato. I transgeni mostrano la massima espressione dopo 1-2 giorni19, ma l'espressione può diminuire dopo. Nel caso dei siRNA, dipende dal tasso di turnover della proteina stessa. Ad esempio, quando si esprimono siRNA che mirano all'espressione di Rab11a, una GTPasi della famiglia Rab, si osserva una downregulation efficiente solo 72 ore dopo la trasduzione23. Pertanto, le proteine a vita lunga (con emivite misurate in giorni) potrebbero non essere bersagli adatti utilizzando questo approccio.

Lo sperimentatore dovrebbe anche essere consapevole delle avvertenze associate a questo approccio. In primo luogo, la sua utilità può essere limitata ai roditori femmina a causa delle difficoltà nel cateterizzare i roditori maschi attraverso il loro pene. Tuttavia, può essere tecnicamente possibile eseguire questo protocollo nei maschi introducendo un catetere nella cupola della vescica, simile alla preparazione impiegata quando si esegue la cistometria9. Ciò consentirebbe di introdurre un detergente o un virus ed eseguire lavaggi secondo necessità. Un secondo avvertimento è che la sovraespressione delle proteine può esaurire i percorsi e le risorse cellulari, che possono portare a eventi come l'aggregazione proteica, l'attivazione delle vie di stress cellulare e la morte27. Pertanto, è generalmente saggio limitare l'espressione del transgene a livelli non tossici (a meno che, naturalmente, questa non sia l'intenzione dell'espressione transgenica), come valutato utilizzando marcatori di stress cellulare e morte cellulare. Un terzo avvertimento è che in alcuni contesti, l'espressione di adenovirus a lungo termine può innescare risposte immunitarie28. Mentre non ci sono prove che la trasduzione adenovirale dell'urotelio di per sé stimoli le risposte immunitarie10, questo è transgene-dipendente e, come notato sopra, la sovraespressione di CLDN2 porta alla cistite.

Attualmente, i ricercatori hanno una varietà di metodi che possono utilizzare per modulare l'espressione genica e proteica nell'urotelio, tra cui l'uso di topi knockout uroteliali transgenici o condizionali, l'uso di reagenti di trasfezione o l'uso della trasduzione adenovirale. Quest'ultimo metodo, oggetto di questo protocollo, è relativamente facile, efficiente e riproducibile. Oltre alla spesa iniziale dei reagenti di coltura cellulare necessari per generare le scorte virali, la grande quantità di virus prodotta (sufficiente per eseguire centinaia di trasduzioni), si traduce in un costo relativamente basso su base animale. La trasduzione adenovirale può essere sfruttata per studiare la biologia uroteliale. Ad esempio, la trasduzione adenovirale è stata utilizzata per definire l'importanza delle GTPasi della famiglia Rho e della famiglia Rab, dei fattori di scambio guanina-nucleotide, dei frammenti motori della miosina e di ADAM17 nell'esocitosi e nell'endocitosi 10,19,20,21,22, e la trasduzione adenovirale è stata recentemente utilizzata per studiare la meccanotrasduzione uroteliale9 . Allo stesso modo, la trasduzione adenovirale può essere rilevante quando si esplorano e si trattano malattie umane. Ad esempio, Ramesh et al. inizialmente proposto la trasduzione adenovirale può essere un modo utile per colpire le cellule tumorali18. Mentre i loro studi erano più un approccio proof-of-principle, si può immaginare che l'espressione di tossine nelle cellule tumorali o l'espressione di epitopi che potrebbero essere riconosciuti dal sistema immunitario sarebbero strategie utili. La trasduzione adenovirale può anche essere utile per comprendere le malattie in cui la sovraespressione o la sottoespressione dei prodotti genici porta alla malattia. Ad esempio, le biopsie dalle vesciche di pazienti con cistite interstiziale mostrano un aumento di 90 volte dell'espressione di CLDN2 29. È interessante notare che la sovraespressione di CLDN2 utilizzando la trasduzione adenovirale replica molti dei sintomi di questa malattia nei ratti10. Pertanto, CLDN2 potrebbe essere un obiettivo nel trattamento di pazienti con questo disturbo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da un progetto pilota attraverso P30DK079307 (a M.G.D.), NIH grant R01DK119183 (a G.A. e MDC), NIH grant R01DK129473 (a G.A.), un premio per lo sviluppo della carriera dell'American Urology Association e una sovvenzione della Winters Foundation (a NM), dal Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), e da S10OD028596 (a G.A.), che ha finanziato l'acquisto del sistema confocale utilizzato per catturare alcune delle immagini presentate in questo manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

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References

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Biologia Numero 188
Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus
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Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

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