Vi introducerer en metode til kvantificering af Stentor-tilvænning ved hjælp af et mikrocontroller-kortbundet apparat, der kan levere mekaniske impulser ved en bestemt kraft og frekvens. Vi inkluderer også metoder til samling af apparatet og opsætning af eksperimentet på en måde, der minimerer eksterne forstyrrelser.
Læring er normalt forbundet med et komplekst nervesystem, men der er stigende tegn på, at livet på alle niveauer, ned til enkeltceller, kan vise intelligent adfærd. I både naturlige og kunstige systemer er læring den adaptive opdatering af systemparametre baseret på ny information, og intelligens er et mål for den beregningsproces, der letter læring. Stentor coeruleus er en encellet damboende organisme, der udviser habituation, en form for læring, hvor et adfærdsmæssigt respons falder efter en gentagen stimulus. Stentor kontraherer som reaktion på mekanisk stimulering, hvilket er en tilsyneladende flugtrespons fra akvatiske rovdyr. Imidlertid inducerer gentagne forstyrrelser med lav kraft tilvænning, demonstreret ved en progressiv reduktion i sammentrækningssandsynlighed. Her introducerer vi en metode til kvantificering af Stentor-tilvænning ved hjælp af et mikrocontroller-kortbundet apparat, der kan levere mekaniske impulser ved en bestemt kraft og frekvens, herunder metoder til opbygning af apparatet og opsætning af eksperimentet på en måde, der minimerer eksterne forstyrrelser. I modsætning til de tidligere beskrevne tilgange til mekanisk stimulering af Stentor tillader denne enhed, at stimuleringskraften varieres under computerstyring i løbet af et enkelt eksperiment, hvilket i høj grad øger de forskellige inputsekvenser, der kan anvendes. At forstå tilvænning på niveau med en enkelt celle vil hjælpe med at karakterisere læringsparadigmer, der er uafhængige af komplekse kredsløb.
Læring er normalt forbundet med et komplekst nervesystem, men der er stigende tegn på, at livet på alle niveauer, ned til enkeltceller, kan vise intelligent adfærd. I både naturlige og kunstige systemer er læring den adaptive opdatering af systemparametre baseret på ny information1, og intelligens er et mål for beregningsprocessen, der letter læring2.
Stentor coeruleus er en encellet damboende organisme, der udviser habituation, en form for læring, hvor et adfærdsmæssigt respons falder efter en gentagen stimulus3. Stentor trækker sig sammen som reaktion på mekanisk stimulering3, som er en tilsyneladende flugtrespons fra akvatiske rovdyr. Imidlertid inducerer gentagne forstyrrelser med lav kraft tilvænning, demonstreret ved en progressiv reduktion i sammentrækningssandsynlighed3. Den vante Stentor trækker sig stadig sammen efter at have modtaget mekanisk stimuleringmed høj kraft 4 eller fotisk stimulering5. Disse observationer, der stemmer overens med Thompson og Spencers klassiske kriterier for tilvænning hos dyr6, tyder stærkt på, at den oprindelige kontraktile responsforringelse skyldes læring snarere end træthed eller ATP-udtømning. Som en fritlevende celle kan Stentor studeres uden meget interferens fra omgivende celler, som det ville være tilfældet i et flercellet væv. Flere yderligere funktioner gør Stentor til et medgørligt system til at studere læring: dets store størrelse (1 mm), dets kvantificerbare tilvænningsrespons3, den lette injektion og mikromanipulation7, det fuldt sekventerede genom8 og tilgængeligheden af RNA-interferens (RNAi) værktøjer9. Brug af denne modelorganisme til at udforske celleindlæring uden hjerne eller nervesystem kræver en reproducerbar procedure til stimulering af Stentor-celler og måling af responsen.
Her introducerer vi en metode til kvantificering af Stentor-tilvænning ved hjælp af et mikrocontroller-kortbundet apparat, der kan levere mekaniske impulser ved en bestemt kraft og frekvens, herunder metoder til opbygning af apparatet og opsætning af eksperimentet på en måde, der minimerer eksterne forstyrrelser (figur 1). At forstå tilvænning på niveau med en enkelt celle vil hjælpe med at karakterisere læringsparadigmer, der er uafhængige af komplekse kredsløb.
Figur 1: Opsætning af tilvænningseksperiment. Petri-pladen, der indeholder Stentor , placeres oven på tilvænningsanordningens fleksible metallineal. Tilvænningsanordningens anker rammer derefter metallinealen med en bestemt kraft og frekvens, hvilket producerer en stimulusbølge over cellefeltet. USB-mikroskopkameraet registrerer Stentors reaktioner på stimuleringen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt over arbejdsgangen for tilvænningseksperimentet. Figuren viser de grundlæggende trin, der er involveret i at studere Stentor ved hjælp af tilvænningsenheden. Figuren blev skabt med BioRender.com. Tilpasset fra “Process Flowchart”, af BioRender.com (2022). Hentet fra https://app.biorender.com/biorender-templates. Klik her for at se en større version af denne figur.
De mest kritiske trin i protokollen vedrører at sikre, at Stentor forbliver under optimale betingelser for sammentrækninger. Sammentrækningsresponsen i tilvænningsanalysen kræver, at Stentors er forankret til en overflade ved hjælp af deres klæbrige holdfast, da de sjældent trækker sig sammen, når de svømmer frit. Bundfladen på den 35 mm Petri-plade, der anvendes til tilvænningsforsøg, er imidlertid typisk ikke befordrende for forankring, medmindre den er belagt med polyornithin. Desuden kan Stentor ikke udsættes for mekanisk forstyrrelse i mindst 2 timer før starten af tilvænningseksperimentet, fordi Stentor-glemselstidsskalaen er 2-6 h3. Hvis Stentor modtager mekanisk stimulering inden for 2 timer efter tilvænningseksperimentets starttidspunkt, er der en mulighed for, at denne forudgående stimulering vil fremkalde et lille niveau af tilvænning forud for eksperimentet og derved reducere sammentrækningssandsynligheden, efter at tilvænningsanordningen leverer den første mekaniske puls. Endelig er det i analysefasen vigtigt kun at tælle antallet af Stentor, der trækker sig sammen efter en puls – snarere end tilfældige spontane sammentrækninger, der opstår før pulsleveringen – for at opnå en nøjagtig aflæsning af den brøkdel af celler, der kontraherede som reaktion på den mekaniske stimulering.
Protokollen kan let ændres til at studere forskellige typer tilvænningsdynamikker ved at ændre kraften og frekvensen af de mekaniske impulser, der leveres af tilvænningsanordningen. Dette giver også mulighed for at udforske andre former for læring, såsom sensibilisering, der kan forekomme i Stentor. Selve mikrocontrollerkortets programkode kan også justeres for at levere forskellige mønstre af mekaniske vandhaner til Stentor.
Et potentielt problem at fejlfinde med denne protokol er den lave frekvens af Stentor-forankring, hvilket kan begrænse antallet af Stentor, der kan observeres i tilvænningseksperimentet. Forankringsfrekvensen reduceres undertiden i Stentor-kulturer, der ikke for nylig er blevet fodret eller er forurenet. For at løse dette problem skal man vaske et nyt parti Stentor for at starte en ny kultur og fodre dem regelmæssigt i henhold til protokollen beskrevet i Lin et al.10.
Denne protokol er begrænset, idet kun en enkelt plade Stentor kan testes ad gangen, hvilket resulterer i målinger med relativt lav kapacitet. Desuden tillader den nuværende software ikke automatisering af enkeltcellebilledanalyse. De fleste data, der er indsamlet, er derfor på befolkningsniveau. Fremtidige modeller af tilvænningsenheden og billedanalyseværktøjer kan lette enkeltcelleeksperimenter med høj kapacitet.
Tilvænning i Stentor er tidligere blevet undersøgt ved hjælp af metoder beskrevet af Wood3, men denne nye protokol gør det muligt at automatisere eksperimenter. Automatisering giver ikke kun forskeren mulighed for reproducerbart at levere mekaniske impulser med en bestemt kraft og frekvens, men letter også langsigtede tilvænningseksperimenter, da enheden kan lades køre uden tilsyn i dagevis. Desuden reducerer brugen af en stepmotor i stedet for solenoiden, der anvendes i Woods eksperimenter3 , risikoen for afmagnetisering over tid og tillader også styrken af stimulus at blive varieret i løbet af et enkelt eksperiment.
At studere cellulær tilvænning kan afsløre klinisk indsigt i tilstande som opmærksomhedsunderskud / hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD) og Tourettes syndrom, hvor tilvænning er nedsat11. Stentor tilvænningsmekanismer kan også afsløre nye ikke-synaptiske læringsparadigmer uafhængigt af komplekse cellulære kredsløb. Endelig kan indsigt i enkeltcelleindlæring inspirere til metoder til omprogrammering af celler i flercellet væv – en anden potentiel vej til bekæmpelse af sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tatyana Makushok for utallige diskussioner om Stentor-læring . Dette arbejde blev finansieret af NSF-tilskud MCB-2012647 og af NIH-tilskud R35 GM130327 samt af I2CELL-prisen fra Foundation Fourmentin-Guilbert.
0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |