Summary
In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.
Abstract
Het proces van myelinisatie is essentieel om een snelle en voldoende signaaltransductie in het zenuwstelsel mogelijk te maken. In het perifere zenuwstelsel gaan neuronen en Schwann-cellen een complexe interactie aan om de myelinisatie van axonen te beheersen. Verstoringen van deze interactie en afbraak van de myelineschede zijn kenmerken van inflammatoire neuropathieën en komen secundair voor bij neurodegeneratieve aandoeningen. Hier presenteren we een cocultuurmodel van dorsale wortelganglionexplantaten en Schwann-cellen, dat een robuuste myelinisatie van perifere axonen ontwikkelt om het proces van myelinisatie in het perifere zenuwstelsel te onderzoeken, axon-Schwann-celinteracties te bestuderen en de potentiële effecten van therapeutische middelen op elk celtype afzonderlijk te evalueren. Methodologisch werden dorsale wortelganglions van embryonale ratten (E13.5) geoogst, gedissocieerd van hun omringende weefsel en gedurende 3 dagen als volledige explantaten gekweekt. Schwann-cellen werden geïsoleerd van 3 weken oude volwassen ratten en ischiaszenuwen werden enzymatisch verteerd. De resulterende Schwann-cellen werden gezuiverd door magnetisch geactiveerde celsortering en gekweekt onder neureguline- en forskoline-verrijkte omstandigheden. Na 3 dagen dorsale wortel ganglion explantatiecultuur werden 30.000 Schwann-cellen toegevoegd aan één dorsale wortelganglionexplant in een medium dat ascorbinezuur bevat. De eerste tekenen van myelinisatie werden gedetecteerd op dag 10 van cocultuur, door verspreide signalen voor myeline basisch eiwit in immunocytochemische kleuring. Vanaf dag 14 werden myelineschedes gevormd en verspreid langs de axonen. Myelinisatie kan worden gekwantificeerd door myeline basiseiwitkleuring als een verhouding van het myelinisatiegebied en het axongebied, om rekening te houden met de verschillen in axonale dichtheid. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om verschillende aspecten van perifere myelinisatie in vitro te bestuderen, wat cruciaal is voor het begrijpen van de pathologie van en mogelijke behandelingsmogelijkheden voor demyelinisatie en neurodegeneratie bij inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten van het perifere zenuwstelsel.
Introduction
In het perifere zenuwstelsel (PNS) wordt snelle informatietransductie gemedieerd door met myeline omwikkelde axonen. De myelinisatie van axonen is essentieel om de snelle voortplanting van elektrische impulsen mogelijk te maken, omdat de geleidingssnelheid van de zenuwvezels correleert met de axondiameter en myelinedikte1. Sensorische signalering van de periferie naar het centrale zenuwstelsel (CZS) is afhankelijk van de activering van sensorische neuronen van de eerste orde die zich bevinden in vergrotingen van de dorsale wortel, genaamd dorsale wortelganglia (DRG). Voor de vorming en het onderhoud van myeline is continue communicatie tussen axonen en Schwann-cellen, de myeliniserende Glia-cellen in de PNS, verplicht2.
Veel ziekten van de PNS verstoren de transductie van informatie door primaire axonale of demyeliniserende schade, wat resulteert in hypesthesie of dysesthesie. Sensorische neuronen van de eerste orde hebben het vermogen om tot op zekere hoogte te regenereren na neuronale schade, door een complexe interactie tussen het neuron en de omliggende Schwann-cellen3. In dit geval kunnen Schwann-cellen cellulaire herprogrammering ondergaan om zowel axonaal als myeline-puin te verwijderen en axonale regeneratie te bevorderen, wat resulteert in remyelinisatie4. Het begrijpen van de mechanismen van myelinisatie in gezondheid en ziekte is belangrijk om mogelijke behandelingsopties te vinden voor demyeliniserende aandoeningen van de PNS. Myeline kan ook worden beschadigd door acuut neurotrauma en benaderingen om myelinisatie te bevorderen om functioneel herstel na perifeer zenuwletsel te bevorderen, worden onderzocht5.
Onze kennis van perifere myelinisatie heeft grotendeels geprofiteerd van myeliniserende coculturen van Schwann-cellen en sensorische neuronen. Sinds de eerste benaderingen werden toegepast 6,7,8, is myelinisatie intensief bestudeerd met behulp van verschillende cocultuursystemen9,10,11. Hier bieden we een snel en gemakkelijk protocol voor robuuste in vitro myelinisatie van dorsale wortelganglion axonen. Het protocol voor Schwann-celpreparatie is gebaseerd op het protocol van Andersen et al.12, eerder gepubliceerd in Pitarokoili et al.13. We gebruiken Schwann-cellen afkomstig van juveniele ratten en embryonale DRG-explantculturen voor de cocultuur, waarbij myelinisatie optreedt rond dag 14. Het doel van de methode is om een systeem te bieden om de vorming van myeline als gevolg van directe axon-Schwann-celinteractie te onderzoeken en om modulatoren van PNS-myelinisatie te bestuderen. In vergelijking met gedissocieerde neuronale celculturen zijn DRG-explantaten anatomisch meer bewaard gebleven en vormen ze lange axonale processen. Kwantificering van het gemyeliniseerde axongebied biedt een voldoende uitlezing voor myelinisatie in de cocultuur. De methode is een waardevol hulpmiddel om therapeutische verbindingen te screenen op hun potentiële effect op PNS-myelinisatie en kan ook worden gebruikt naast in vivo studies in diermodellen14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Schwann celkweek
- Coating voor Schwann celkweek
- Bedek de celkweekschalen onder steriele omstandigheden. Breng 2 ml 0,01% poly-L-lysine (PLL) aan op twee weefselkweekschalen (TC) van 60 mm en incubeer een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de PLL, was de TC-vaat 2x met gedestilleerd water en incubeer met 2 ml 1 μg/cm2 laminine een nacht op 4 °C. Was de TC vaat 2x met aqua dest, en laat de borden aan de lucht drogen.
- Medium voorbereiding voor Schwann celkweek
- Bereid 50 ml Schwann-celmedium door 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS), 2 μM forskoline, 10 nM neureguline en 50 μg / ml gentamycine toe te voegen aan Dulbecco's Modified Eagle′s Medium (DMEM) / F-12 (hoge glucose) onder steriele omstandigheden.
- Bereid 70 ml Leibovitz L-15 medium met 50 μg/ml gentamycine onder steriele omstandigheden.
- Voorbereiding van de heupzenuw
OPMERKING: Alle heupzenuwvoorbereidingsstappen worden uitgevoerd onder een schone bank.- Bereid één TC-schaal van 100 mm met 5 ml ijskoude Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder Ca 2+ en Mg2+, één TC-schaal van 100 mm met 5 ml ijskoud L-15-medium van Leibovitz en één TC-schaal van 100 mm met 5 ml ijskoud Leibovitz's L-15-medium en 50 μg/ml gentamycine.
- Reinig alle instrumenten door autoclaveren. Spuit de instrumenten en het werkgebied met 70% ethanol.
- Euthanaseer vijf 3 weken oude mannelijke Sprague Dawley-ratten met behulp van CO 2-inhalatie en onthoofding. Spuit de romp van de rat in met 70% ethanol.
- Open de dorsale linkerondermaat met een schaar en verwijder voorzichtig de biceps femoris-spier. Maak de heupzenuw los door een gladde verhoging met een gebogen tang, zodat de zenuw niet wordt gekneusd.
- Houd het meest proximale deel van de zenuw vast met de gebogen tang om de zenuw recht te maken en klem de zenuw zo hoog mogelijk met een schaar. Knip vervolgens de zenuw dicht bij de sacrale plexus en de poot met een schaar. Herhaal stap 1.3.4-1.3.5 voor de rechterkant.
OPMERKING: Zorg er bij het openen van de ledemaat voor dat u geen bloedvaten kneust. - Plaats met een tang de linker- en rechterheupzenuwen in een TC-schaal van 100 mm met ijskoude DPBS.
- Heupzenuw revisie
- Gebruik een tang om alle zenuwen over te brengen naar een 100 mm TC-schaal met ijskoud Leibovitz's L-15 medium en 50 μg / ml gentamycine. Blijf een stereomicroscoop gebruiken en verwijder vet, spieren en bloedvaten uit de zenuwen met twee paar fijne tangen. Pak de zenuwen vast met een tang en breng ze over op een 100 mm TC-schaal met ijskoud Leibovitz's L-15 medium.
- Identificeer de proximale en distale uiteinden van de heupzenuw. Verwijder het epineurium met één paar fijne tangen in een proximale tot distale richting, terwijl u het proximale zenuwuiteinde vasthoudt met het tweede paar fijne tangen.
- Breng de gezuiverde zenuwen over in een 100 mm TC-schaal met ijskoud Leibovitz's L-15 medium en 50 μg / ml gentamycine. Plaag de geïsoleerde zenuw fascikels om enkele zenuwvezels te scheiden en te isoleren met behulp van twee paar fijne tangen.
- Breng de zenuwvezels over in een buis van 50 ml met behulp van een serologische pipet van 10 ml en neem zo min mogelijk medium op. Voeg 50 ml Leibovitz's L-15 medium met 50 μg/ml gentamycine toe aan de zenuwvezels en sla een paar keer in de buis van 50 ml.
- Enzymatische vertering van de heupzenuw
OPMERKING: De volgende stappen (stappen 1.5-1.8, 2.1 en 2.2) worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.- Bereid de enzymatische verteringsoplossing met 0,25% dispase II, 0,05% type I collagenase en 50 μg/ml gentamycine in 10 ml DMEM (hoge glucose).
- Centrifugeer de buis op 188 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant met een serologische pipet van 25 ml en breng de pellet met het resterende L-15-medium van Leibovitz over in een TC-schaal van 60 mm met behulp van een pipet van 1.000 ml.
- Spoel de buis van 50 ml met 10 ml van de enzymatische spijsverteringsoplossing en voeg deze toe aan de schaal met de zenuwvezels. Verdeel het weefsel in de schaal voorzichtig met de punt van een pipet om het toegankelijke oppervlak voor de spijsvertering te maximaliseren.
- Incubeer bij 37 °C en 5% CO 2 gedurende 18 uur en stop de vertering door 10 ml 40% FCS toe te voegen aan de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks, zonder Ca2 en Mg2+ (HBSS).
- Celscheiding
- Breng de verteerde zenuwen over in een buis van 50 ml met behulp van een serologische pipet en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C op 188 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 10 ml DMEM met 10% FCS en 50 μg/ml gentamycine. Resuspensie van de pellet 20 keer vervolgensuspensie, met behulp van een pipetpunt van 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml en 200 μl.
- Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 100 μm en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 188 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet met 4 ml DMEM met 10% FCS en 50 μg/ml gentamycine.
- Voeg 2 ml van de celsuspensie toe aan elk van de twee PLL- en laminine-gecoate 60 mm TC-schalen en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Laat de platen 2 dagen onaangeroerd in de incubator om de cellen te beschermen tegen mechanische stress en om de hechting te ondersteunen.
- Schwann cel differentiatie
- Verwijder na 2 dagen het medium en spoel de platen voorzichtig 2x af met DMEM (hoge glucose), 10% FCS en 50 μg/ml gentamycine. Voeg daarna 2 ml Schwann-celmedium toe. Vervang het Schwann-celmedium elke 2edag en observeer het uiterlijk en de samenvloeiing van de cel met een microscoop.
OPMERKING: Schwann-cellen en DRG-explantaten moeten op een tijdige, gecoördineerde manier worden voorbereid voor de cocultuur. Zorg ervoor dat een rat met embryo's op E 13,5 beschikbaar is voor DRG-preparaat wanneer de Schwann-cellen dicht bij een samenvloeiing van 80% liggen.
- Verwijder na 2 dagen het medium en spoel de platen voorzichtig 2x af met DMEM (hoge glucose), 10% FCS en 50 μg/ml gentamycine. Voeg daarna 2 ml Schwann-celmedium toe. Vervang het Schwann-celmedium elke 2edag en observeer het uiterlijk en de samenvloeiing van de cel met een microscoop.
- Celtrypsinisatie en magnetische scheiding
OPMERKING: Voor voorbeeldige foto's van verschillende Schwann-celkweekstadia, zie aanvullende figuur 1.- Wanneer de cellen een samenvloeiing van ongeveer 80% (6-12 dagen cultuur) bereiken, wast u de platen zorgvuldig 2x met 3 ml DPBS en incubeert u met 2 ml 0,05% Trypsine / EDTA (voorverwarmd tot 37 ° C) gedurende 3 minuten. Wanneer de cellen loskomen van de bodem van de plaat, inactiveer dan de spijsvertering door de toevoeging van 2 ml DMEM met 10% FCS en 50 μg / ml gentamycine.
OPMERKING: Houd je aan een trypsinisatietijd van strikt 3 minuten en ga daarna snel te werk. - Resuspendie van de celpellet in 2 ml magnetische celscheidingsbuffer met DPBS met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 nM EDTA. Combineer 10 μL van de celsuspensie met 10 μL trypan blauw en tel de cellen met behulp van een kleurkamer.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 188 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en resuspensie van de celkorrel in 90 μL magnetische celscheidingsbuffer per 1 x 107 cellen. Voeg 10 μL Thy-1 microbeads per 1 x 107 cellen toe. Suspendien de oplossing een paar keer en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 8 °C.
- Voeg 2 ml van de magnetische celscheidingsbuffer toe aan de celsuspensie en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 300 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 500 μL magnetische celscheidingsbuffer.
- Bevochtig de magnetische celscheidingskolom met 1 ml van de magnetische celscheidingsbuffer. Plaats de magnetische celscheidingskolom in de magnetische celscheider. Breng de cellen aan op de magnetische celscheidingskolom. Verzamel de doorstroom en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C.
OPMERKING: Fibroblasten worden positief geselecteerd en blijven in de kolom, terwijl Schwann-cellen de kolom passeren. Fibroblasten kunnen worden verzameld met een stempel (bijvoorbeeld als een negatieve controle voor Schwann-celkleuringsprotocollen). - Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 1 ml van het cocultuurmedium (zie stap 3.1.1). Tel de cellen na het kleuren met trypan blauw en een kleurkamer.
- Wanneer de cellen een samenvloeiing van ongeveer 80% (6-12 dagen cultuur) bereiken, wast u de platen zorgvuldig 2x met 3 ml DPBS en incubeert u met 2 ml 0,05% Trypsine / EDTA (voorverwarmd tot 37 ° C) gedurende 3 minuten. Wanneer de cellen loskomen van de bodem van de plaat, inactiveer dan de spijsvertering door de toevoeging van 2 ml DMEM met 10% FCS en 50 μg / ml gentamycine.
2. DRG explantatie cultuur
- DRG groeimedium voorbereiding
- Bereid DRG-groeimedium voor door 2% B27, 2% paardenserum, 1% L-glutamine, 0,5% penicilline / streptomycine en 10 ng / ml zenuwgroeifactor (NGF) toe te voegen aan het neurobasale medium. Bewaar het groeimedium bij 4 °C.
OPMERKING: Het groeimedium kan gedurende 2 dagen worden gebruikt.
- Bereid DRG-groeimedium voor door 2% B27, 2% paardenserum, 1% L-glutamine, 0,5% penicilline / streptomycine en 10 ng / ml zenuwgroeifactor (NGF) toe te voegen aan het neurobasale medium. Bewaar het groeimedium bij 4 °C.
- Coating voor DRG explants
- Incubeer de afdekstroken in 70% ethanol gedurende 1 uur en plaats ze in de putjes van 4-well schalen met behulp van een gebogen tang. Nadat de ethanol is opgedroogd, breng 300 μL van 0,2 mg / ml poly-D-lysine (PDL) per put aan en incubeer 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.
- Was de coverslips 3x gedurende 5 min elk met DPBS achter elkaar. Verwijder de DPBS, breng 300 μL 1 μg/ml laminine aan op de coverslips en incubeer 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.
- Vervang na drie wasstappen met DPBS gedurende 5 minuten de DPBS door 190 μL DRG-groeimedium. Plaats de 4-putplaten in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- DRG-voorbereiding
OPMERKING: Oogst de DRG van embryonale ratten onder een schone bank.- Reinig voor de bereiding alle instrumenten met 70% ethanol. Vul 10 (twee per embryo) 35 mm TC-schalen met 2 ml ijskoude HBSS per schaal en twee 100 mm TC-schalen met 5 ml ijskoude HBSS per gerecht.
- Euthanaseer de zwangere ratten (volwassen vrouwelijke Sprague Dawley-ratten, E13.5) door CO 2-inademing en onthoofding.
- Spuit het lichaam met 70% ethanol en open de ventrale romp van de rat. Verwijder de baarmoeder voorzichtig en plaats deze in een 100 mm TC-schaal met ijskoude HBSS.
- Houd de baarmoeder vast met een gebogen tang en open de baarmoederwand met een fijne tang. Verwijder een vruchtzak en open deze voorzichtig door met een fijne tang in een gaatje te knijpen.
- Verwijder het embryo uit de omliggende weefsels, knip de navelstreng door en onthoofd het embryo met een fijne tang. Plaats de romp in een 100 mm TC-schaal gevuld met HBSS met behulp van een gebogen tang en een spatel.
- Verwijder snel alle embryo's uit de baarmoeder en breng ze over in één 100 mm TC-schaal gevuld met HBSS. Als er meer dan vijf embryo's zijn, bereid dan een extra 35 mm TC-schaal met 2 ml HBSS, volgens stap 2.3.1.
- Plaats voorzichtig een embryotorso in een 35 mm TC-schaal gevuld met HBSS met behulp van een spatel en een gebogen tang. Open onder een stereomicroscoop het dorsale deel van de romp om het embryo in twee helften te verdelen met behulp van een fijne tang en een microschaar. Draai de ene helft opzij en identificeer de streng DRG die zich in een lijn op het dorsale deel van het embryo bevindt.
- Knip de DRG als een hele streng uit met een fijne tang en een microschaar. Plaats de DRG in een verse TC-schaal van 35 mm gevuld met 2 ml HBSS en scheid een enkele DRG van het resterende weefsel met behulp van een fijne tang en een microschaar.
- DRG-celkweek
- Neem 4-putplaten met 190 μL DRG-groeimedium van de incubator naar de schone bank waar de DRG moet worden bereid. Breng een enkele DRG voorzichtig over in een put van een 4-well kweekplaat met behulp van een fijne tang en een spatel. Plaats de DRG in het midden van elke put, omdat een centrale positie belangrijk is voor de bevestiging van de DRG.
- Werk voortaan onder steriele omstandigheden. Plaats de explantatieculturen in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. Voeg de volgende dag voorzichtig 50 μL van het DRG-groeimedium toe aan elke put met behulp van een pipet van 100 ml.
- Observeer drg-explantatietrouw en axonuitgroei dagelijks met een microscoop en gooi DRG-explantaten weg die los zijn gekomen van de dekslip of axonen niet zijn ontgroeid op dag 3 van de cultuur.
OPMERKING: DRG-explantaten zijn erg kwetsbaar in de eerste dagen van de kweek en moeten met zorg worden behandeld, vooral bij het verplaatsen van de platen in en uit de incubator wanneer het medium wordt vervangen, of zelfs bij het sluiten van de incubatordeur. Het precieze volume van 190 μL medium per put is cruciaal om de DRG-explantaten op hun plaats te houden tijdens de eerste kweekdag. Losse DRG-explantaten kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd tijdens de dagelijkse controle, omdat ze in het medium zwemmen in plaats van zich aan de deklaag te hechten.
3. Cocultuur
- Overdracht van Schwann-cellen naar de DRG-explantatiecultuur
- Bereid het cocultuurmedium door 0,1% ascorbinezuur toe te voegen aan het DRG-groeimedium.
- Vervang op dag 3 van de DRG-explantatiecultuur voorzichtig het DRG-groeimedium door 250 μL van het cocultuurmedium met 30.000 Schwann-cellen (vanaf stap 1.8) per put.
- Bewaar de cocultuur van de DRG-explantaten en Schwann-cellen maximaal 22 dagen. Vervang om de dag 250 μL van het cocultuurmedium zorgvuldig en observeer het uiterlijk van de cellen met een microscoop.
OPMERKING: Voor een voorbeeld van DRG-axonen en Schwann-cellen in de cocultuur in de eerste dagen van de kweek, zie figuur 1.
- Immunocytochemische kleuring
OPMERKING: Ga uiterst voorzichtig om met de cocultuurmonsters tijdens de kleuringsprocedure, omdat ze gemakkelijk kunnen worden beschadigd.- Om de cellen op de coverslips te bevestigen, verwijdert u het medium langzaam, wast u 3x met DPBS voorzichtig en incubeert u gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA). Vervang de PFA door DPBS en bewaar de vaste cellen bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
LET OP: Draag bij het hanteren van 4% PFA de aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen. - Was de coverslips 3x met DPBS gedurende 5 min, en blokkeer vervolgens met een blokkeeroplossing (10% geitenserum, 10% runderserumalbumine [BSA], 0,1% gelatine en 0,05% Triton X-100) in DPBS gedurende 1 uur. Verdun de primaire antilichamen βIII-tubuline (1:7.500) en myelinebasisch eiwit (MBP) (1:750) in de blokkerende oplossing en incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Was de cellen 3x met DPBS gedurende 5 min. Gebruik fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen in een verdunning van 1: 1.000 in blokkerende oplossing en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Was de cellen 3x met DPBS gedurende 5 minuten en monteer de cellen op microscopische glaasjes met fluorescentiemontagemedium, inclusief 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). Bewaar de dia's in het donker bij 4 °C tot microscopische documentatie.
LET OP: Draag bij het hanteren van fluorescentiebevestigingsmedium de aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen.
- Om de cellen op de coverslips te bevestigen, verwijdert u het medium langzaam, wast u 3x met DPBS voorzichtig en incubeert u gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA). Vervang de PFA door DPBS en bewaar de vaste cellen bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
- Analyse
- Maak foto's van acht gedefinieerde gebieden rond de DRG-explant in het midden met behulp van een omgekeerde microscoop.
- Gebruik een softwaretoepassing voor beeldanalyse om de gebieden van βIII-tubulinepositieve axonen en myelinisatie gekleurd door MBP te kwantificeren.
- Bereken het percentage myelinisatie als een verhouding van de gemyeliniseerde axonen en niet-gemyeliniseerde axonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myelinisatie in de cocultuur werd beoordeeld op dag 10, 12, 14, 16, 18 en 20. De DRG-explantaten en Schwann-cellen werden gekleurd voor MBP, βIII-tubuline en DAPI. Het axonale netwerk in de cocultuur was dicht en veranderde niet zichtbaar in het tijdsverloop van de waarneming. De eerste tekenen van myeline, in de vorm van kleine fragmenten, waren detecteerbaar op dag 10 en namen toe op dag 12 (figuur 2). De MBP-positieve gebieden namen in de loop van de tijd toe tot dag 20 van cultuur. De myelinisatie werd gekwantificeerd als een verhouding van de MBP- en βIII-tubuline-positieve gebieden. Myelinisatie nam significant toe op dag 18 en 20 in vergelijking met dag 10 (figuur 3; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).
Figuur 1: Verschijning van Schwann-cellen en axonen in de cocultuur. Voorbeeldig beeld van de cocultuur op dag 3. Zwarte pijlen tonen dunne DRG-axonen en de witte pijl wijst naar een Schwann-cel met een langwerpige en spilvormige morfologie die aan een axon is bevestigd. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Myelinisatie in een cocultuur van DRG-explantaten en Schwann-cellen. Kleuring voor de neuronale marker βIII-tubuline en MBP werd uitgevoerd op dag 10, 12, 14, 16, 18 en 20, na het samenvoegen van beide culturen om de ontwikkeling van myelinisatie in de cocultuur te onderzoeken. De eerste tekenen van myelinisatie waren zichtbaar op dag 10 en 12 van cocultuur. Vanaf dag 14 was het MBP-signaal meer uitgesproken en werden met myeline omwikkelde axonen gedetecteerd. De myelinisatie nam toe met de tijd van cocultuur tot dag 20. Schaalstaven: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van myelinisatie. Op dag 10, 12, 14, 16, 18 en 20 van cocultuur werd myelinisatie beoordeeld door axonen te kleuren met βIII-tubuline en myeline met MBP. Het percentage gemyeliniseerde axonen werd bepaald door berekening van de verhouding tussen de MBP-positieve en βIII-tubuline gekleurde gebieden. Op dag 18 en 20 werden significante verschillen gedetecteerd ten opzichte van dag 10 van cocultuur. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM; n = 3. One-way ANOVA met Kruskal-Wallis en Dunn's meervoudige vergelijking post-hoc test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Stadia van Schwann-celcultuur. Voorbeeldige brightfieldfoto's van gekweekte Schwann-cellen (A) voor en (B) na magnetische celscheiding. Vóór magnetische celscheiding omvat de cultuur Schwann-cellen met een langwerpige en spindelvormige morfologie, platte en verspreide verschijnende fibroblasten en overblijfselen van bindweefsel. Om een zuiverdere cultuur van Schwann-cellen te bereiken, wordt magnetische celscheiding uitgevoerd. Schaalstaven: 200 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Myelinisatie van DRG-explantaten met en zonder extra Schwann-cellen. Het MBP-gekleurde gebied werd gebruikt om myelinisatie in de cocultuur op dag 14 te meten. De myelinisatie van DRG-explantaten was significant verhoogd als Schwann-cellen aan de cultuur werden toegevoegd (ongepaarde t-test, **p ≤ 0,01). n = 3. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Genexpressieanalyse in de cocultuur. Relatieve genexpressieniveaus van MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 en Olig1 werden geanalyseerd in cocultuurmonsters op dag 22 door qPCR (A). MBP en PMP22 waren de doelwitten met de hoogste genexpressieniveaus in de cocultuur. Een voorbeeldig beeld van qPCR-amplificatieproducten toegepast op een agarosegel toont de kwalitatieve abundantie van de doelen (B). De eerste en laatste rijstrook op de gel vertegenwoordigen een DNA-ladder (100 basenparen). n = 5. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een snel en gemakkelijk protocol voor het genereren van in vitro myelinisatie door twee afzonderlijke celtypeculturen, Schwann-cellen en dorsale wortelganglionexplantaten, samen te voegen.
Een cruciale stap van het protocol is de teelt van DRG-explantaten, vooral in de eerste dagen van de teelt. DRG zijn zeer kwetsbaar voordat een sterk axonaal netwerk wordt gebouwd en moeten zeer voorzichtig worden behandeld, bijvoorbeeld wanneer ze uit de incubator worden gehaald of tijdens een verandering van medium. DRG die loskomen van de bodem van de put en worden gevonden zwemmend in het medium vertonen een mislukte teelt. Voor Schwann-cellen kan het veranderen van proliferatiesnelheden als gevolg van verschillende teeltomstandigheden en supplementen (bijvoorbeeld serum in het medium) een uitdaging vormen voor de cocultuur. Als de cultuur wordt overwoekerd door een overmatig aantal Schwann-cellen, maakt deze los van de bodem van de put en wordt onbruikbaar. Een titratie van het Schwann-celnummer in de kweek wordt daarom aanbevolen. Tijdens het opstellen van het Schwann-celprotocol moeten zuiverheidstests worden uitgevoerd met behulp van SOX10- of S100-immunokleuring. Over het algemeen moet de behandeling van de cultuur, inclusief verandering van medium en was- en fixatiestappen, zorgvuldig worden uitgevoerd om een succesvol resultaat te garanderen. Het is belangrijk om het tijdstip van observatie te selecteren op basis van de onderzoeksinteresse; Dag 14 vertegenwoordigt het startpunt voor de eerste dichte gemyeliniseerde axonen en kan dus worden geselecteerd als het tijdspunt van observatie voor de initiatie van myelinisatie, terwijl latere tijdpunten meer complete myelinescheden bieden.
Omdat deze in vitro methode van myelinisatie alleen DRG- en Schwann-cellen omvat, lijkt het niet precies op het proces van myelinisatie in het organisme. Andere bijdragende factoren, zoals omringend weefsel, de micro-omgeving, immuuncellen en signalering van verre structuren, zijn niet vertegenwoordigd in dit model. Deze methode biedt echter een geschikt model om myelinisatie van de PNS te onderzoeken door de afzonderlijke analyse en manipulatie van beide celtypen 9,15,16. Schwann-cellen of DRG voor de cocultuur kunnen worden geoogst van zieke of behandelde dieren om de bijdrage van het specifieke celtype17,18 te ontcijferen. Bij gebruik van de late stadia van deze opstelling wordt het ten zeerste aanbevolen om een controlevoorwaarde op te nemen zonder bovendien Schwann-cellen toe te voegen, om de mogelijke effecten van van DRG afgeleide Schwann-cellen uit te sluiten. Onze ervaring is dat myelinisatie in DRG-explantaten zonder Schwann-cellen in significant mindere mate wordt gedetecteerd dan in de cocultuur (aanvullende figuur 2).
Het gebruik van DRG-explantaten biedt het voordeel van intacte structurele architectuur in vergelijking met gedissocieerde neuronale culturen. Immunofluorescente kleuring van myelinebasiseiwit (MBP) maakt het mogelijk om het gemyeliniseerde axongebied te kwantificeren en biedt een voldoende uitlezing voor myelinisatie in de cocultuur. Genexpressieanalyse van cocultuurmonsters op dag 22 onthulde de aanwezigheid van MBP, perifeer myeline-eiwit (PMP22), myeline-geassocieerd glycoproteïne (MAG), octameerbindingsfactor 6 (Oct6), ETS-gerelateerd gen 2 (Erg2) en oligodendrocytentranscriptiefactor 1 (Olig1), met de hoogste expressieniveaus voor MBP en PMP22 (aanvullende figuur 3). Daarom biedt het beschreven protocol een methode met verschillende doelopties voor myelinisatiemarkers in de cocultuur.
Mogelijke toepassingen van deze methode omvatten fundamentele onderzoeksbenaderingen over het proces van myelinisatie in de periferie, evenals de validatie van therapeutische verbindingen voor ziekten van de PNS, inclusief de schade van myeline.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Wij danken Prof. Dr. Ralf Gold en PD Dr. Gisa Ellrichmann voor hun advies en steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
- Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
- Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
- Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
- Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
- Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
- Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
- Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
- Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
- Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
- Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
- Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
- Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).
