Summary
No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.
Abstract
O processo de mielinização é essencial para permitir a transdução rápida e suficiente do sinal no sistema nervoso. No sistema nervoso periférico, neurônios e células de Schwann se envolvem em uma interação complexa para controlar a mielinização dos axônios. Distúrbios dessa interação e quebra da bainha de mielina são características das neuropatias inflamatórias e ocorrem secundariamente em doenças neurodegenerativas. Aqui, apresentamos um modelo de cocultura de explantes do gânglio da raiz dorsal e células de Schwann, que desenvolve uma mielinização robusta de axônios periféricos para investigar o processo de mielinização no sistema nervoso periférico, estudar as interações axônio-célula de Schwann e avaliar os potenciais efeitos dos agentes terapêuticos sobre cada tipo celular separadamente. Metodologicamente, gânglios da raiz dorsal de ratos embrionários (E13.5) foram colhidos, dissociados de seu tecido circundante e cultivados como explantes inteiros por 3 dias. Células de Schwann foram isoladas de ratos adultos com 3 semanas de idade, e os nervos ciáticos foram digeridos enzimaticamente. As células de Schwann resultantes foram purificadas por triagem celular ativada por magnetismo e cultivadas sob condições enriquecidas com neuregulina e forskolina. Após 3 dias de cultura do explante do gânglio da raiz dorsal, 30.000 células de Schwann foram adicionadas a um explante do gânglio da raiz dorsal em meio contendo ácido ascórbico. Os primeiros sinais de mielinização foram detectados no 10º dia de cocultivo, através de sinais esparsos para proteína básica de mielina na coloração imunocitoquímica. A partir do 14º dia, bainhas de mielina foram formadas e propagadas ao longo dos axônios. A mielinização pode ser quantificada pela coloração da proteína básica da mielina como uma razão entre a área de mielinização e a área axonal, para explicar as diferenças na densidade axonal. Este modelo oferece oportunidades experimentais para o estudo de vários aspectos da mielinização periférica in vitro, o que é crucial para a compreensão da patologia e possíveis oportunidades de tratamento para desmielinização e neurodegeneração em doenças inflamatórias e neurodegenerativas do sistema nervoso periférico.
Introduction
No sistema nervoso periférico (SNP), a rápida transdução de informação é mediada por axônios envoltos em mielina. A mielinização dos axônios é essencial para permitir a rápida propagação dos impulsos elétricos, uma vez que a velocidade de condução das fibras nervosas correlaciona-se com o diâmetro do axônio e a espessura da mielina1. A sinalização sensorial da periferia para o sistema nervoso central (SNC) depende da ativação de neurônios sensoriais de primeira ordem que residem em ampliações da raiz dorsal, denominados gânglios da raiz dorsal (DRG). Para a formação e manutenção da mielina,é obrigatória a comunicação contínua entre os axônios e as células de Schwann, que são as células mielinizantes da Glia no SNP2.
Muitas doenças dos SPN perturbam a transdução de informações por dano axonal primário ou desmielinizante, resultando em hipoestesia ou disestesia. Os neurônios sensoriais de primeira ordem têm a capacidade de se regenerar até certo ponto após dano neuronal, por meio de uma complexa interação entre o neurônio e as células de Schwanncircundantes 3. Nesse caso, as células de Schwann podem sofrer reprogramação celular para limpar debris axonais e mielínicos e promover regeneração axonal, resultando em remielinização4. A compreensão dos mecanismos da mielinização na saúde e na doença é importante, a fim de encontrar possíveis opções de tratamento para as desordens desmielinizantes dos SPN. A mielina também pode ser lesada por neurotrauma agudo, e abordagens para promover mielinização para avançar na recuperação funcional após lesão de nervo periférico estão sendo investigadas5.
Nosso conhecimento da mielinização periférica tem se beneficiado em grande parte das coculturas mielinizantes de células de Schwann e neurônios sensoriais. Desde as primeirasabordagens 6,7,8, a mielinização tem sido intensamente estudada com o uso de diferentes sistemas de cocultura9,10,11. Aqui, fornecemos um protocolo rápido e fácil para mielinização in vitro robusta de axônios ganglionares da raiz dorsal. O protocolo para preparação de células de Schwann é baseado no protocolo de Andersen et al.12, publicado anteriormente em Pitarokoili et al.13. Utilizamos células de Schwann derivadas de ratos juvenis e culturas embrionárias de explantes DRG para a cocultura, na qual a mielinização ocorre por volta do 14º dia. O objetivo do método é fornecer um sistema para investigar a formação de mielina como resultado da interação direta axônio-célula de Schwann, e estudar moduladores da mielinização do SNP. Em comparação com culturas de células neuronais dissociadas, os explantes DRG são mais anatomicamente preservados e formam processos axonais longos. A quantificação da área do axônio mielinizado fornece uma leitura suficiente para mielinização na cocultura. O método é uma ferramenta valiosa para triagem de compostos terapêuticos quanto ao seu potencial efeito sobre a mielinização dos SPN, podendo também ser utilizado em complemento a estudos in vivo em modelosanimais14.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Cultura de células de Schwann
- Revestimento para cultura de células de Schwann
- Revestir as placas de cultura celular em condições estéreis. Aplicar 2 mL de poli-L-lisina (PLL) a 0,01% em duas placas de cultura de tecidos (CT) de 60 mm cada e incubar durante a noite a 4 °C.
- Retire o PLL, lave as placas de TC 2x com água destilada e incube com 2 mL de laminina 1 μg/cm2 durante a noite a 4 °C. Lave as placas TC 2x com aqua dest, e deixe as placas secarem ao ar.
- Preparo do meio para cultura de células de Schwann
- Preparar 50 mL de meio celular de Schwann adicionando 10% de soro fetal inativado por calor (FCS), 2 μM de forskolina, 10 nM de neuregulina e 50 μg/mL de gentamicina ao meio de Dulbecco Modified Eagle (DMEM)/F-12 (alta glicose) em condições estéreis.
- Preparar 70 mL de meio L-15 de Leibovitz com 50 μg/mL de gentamicina em condições estéreis.
- Preparo do nervo ciático
NOTA: Todas as etapas de preparação do nervo ciático são realizadas sob uma bancada limpa.- Preparar uma placa TC de 100 mm com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco gelada (DPBS) sem Ca 2+ e Mg2+, uma placa de TC de 100 mm com 5 mL de meio L-15 de Leibovitz gelado e uma placa de TC de 100 mm com 5 mL de meio L-15 de Leibovitz gelado e 50 μg/mL de gentamicina.
- Limpe todos os instrumentos por autoclavagem. Borrife os instrumentos e a área de trabalho com etanol 70%.
- Eutanásia de cinco ratos machos Sprague Dawley com 3 semanas de idade usando inalação e decapitação de CO2 . Borrifar o tronco do rato com etanol 70%.
- Abra o dorso inferior esquerdo com tesoura e remova o músculo bíceps femoral cuidadosamente. Solte o nervo ciático por elevação suave com pinça curva, garantindo não machucar o nervo.
- Segure a parte mais proximal do nervo com a pinça curva para endireitar o nervo e prenda o nervo o mais alto possível usando uma tesoura. Em seguida, clipe o nervo próximo ao plexo sacral e à pata com tesoura. Repita as etapas 1.3.4-1.3.5 para o lado direito.
NOTA: Ao abrir o membro, tome cuidado para não machucar nenhum vaso sanguíneo. - Usando pinças, colocar os nervos ciáticos esquerdo e direito em uma placa de TC de 100 mm com DPBS gelada.
- Remodelação do nervo ciático
- Use pinça para transferir todos os nervos para uma placa de TC de 100 mm com meio L-15 de Leibovitz gelado e gentamicina de 50 μg/mL. Continue usando um estereomicroscópio e remova gordura, músculo e vasos sanguíneos dos nervos com dois pares de pinças finas. Pegue os nervos com pinça e transfira-os para um prato TC de 100 mm com o meio L-15 de Leibovitz gelado.
- Identificar as extremidades proximal e distal do nervo ciático. Remova o epineuro com um par de pinças finas no sentido proximal a distal, mantendo a extremidade proximal do nervo com o segundo par de pinças finas.
- Transferir os nervos purificados para uma placa de TC de 100 mm com meio L-15 de Leibovitz gelado e gentamicina 50 μg/mL. Provocar os fascículos nervosos isolados para separar e isolar fibras nervosas únicas usando dois pares de pinças finas.
- Transfira as fibras nervosas para um tubo de 50 mL usando uma pipeta sorológica de 10 mL e use o mínimo de meio possível. Adicionar 50 mL de meio L-15 de Leibovitz com 50 μg/mL de gentamicina às fibras nervosas e rodar algumas vezes no tubo de 50 mL.
- Digestão enzimática do nervo ciático
Observação : as próximas etapas (etapas 1.5-1.8, 2.1 e 2.2) são executadas em condições estéreis.- Preparar a solução de digestão enzimática contendo 0,25% dispase II, 0,05% colagenase tipo I e 50 μg/mL de gentamicina em 10 mL de DMEM (glicose alta).
- Centrifugar o tubo a 188 x g durante 5 minutos a 4 °C, remover o sobrenadante com uma pipeta serológica de 25 ml e transferir o pellet com o restante meio L-15 de Leibovitz para uma placa TC de 60 mm utilizando uma pipeta de 1.000 ml.
- Enxaguar o tubo de 50 mL com 10 mL da solução de digestão enzimática e adicioná-lo à placa que contém as fibras nervosas. Distribua o tecido no prato cuidadosamente com a ponta de uma pipeta para maximizar a superfície acessível para a digestão.
- Incubar a 37 °C e 5% CO 2 por 18 h e interromper a digestão adicionando 10 mL de SFB a 40% em solução salina balanceada de Hanks, sem Ca2 e Mg2+ (HBSS).
- Separação celular
- Transfira os nervos digeridos para um tubo de 50 mL usando uma pipeta sorológica e centrífuga a 188 x g por 10 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 mL de DMEM contendo SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL. Ressuspender o pellet 20 vezes posteriormente, usando uma ponteira de pipeta de 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL e 200 μL.
- Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 100 μm e centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 4 mL de DMEM contendo SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL.
- Adicionar 2 ml da suspensão celular a cada uma das duas placas de TC de 60 mm revestidas com PLL e laminina e incubar a 37 °C e 5% de CO2. Deixe as placas intactas por 2 dias na incubadora para proteger as células do estresse mecânico e suportar a aderência.
- Diferenciação celular de Schwann
- Após 2 dias, retirar o meio e enxaguar cuidadosamente as placas 2x com DMEM (glicose alta), SFB a 10% e gentamicina 50g/mL. Em seguida, adicionar 2 mL de meio celular de Schwann. Substitua o meio celular de Schwann a cada 2dias e observe a aparência e confluência das células usando um microscópio.
NOTA: As células de Schwann e os explantes DRG precisam ser preparados de forma oportuna e coordenada para o cocultivo. Certifique-se de que um rato com embriões em E 13.5 está disponível para preparação de DRG quando as células de Schwann estiverem próximas de uma confluência de 80%.
- Após 2 dias, retirar o meio e enxaguar cuidadosamente as placas 2x com DMEM (glicose alta), SFB a 10% e gentamicina 50g/mL. Em seguida, adicionar 2 mL de meio celular de Schwann. Substitua o meio celular de Schwann a cada 2dias e observe a aparência e confluência das células usando um microscópio.
- Tripsinização celular e separação magnética
NOTA: Para obter imagens exemplares de diferentes estágios de cultura de células de Schwann, consulte a Figura Suplementar 1.- Quando as células atingirem uma confluência de cerca de 80% (6-12 dias de cultura), lavar cuidadosamente as placas 2x com 3 mL de DPBS e incubar com 2 mL de tripsina/EDTA a 0,05% (pré-aquecido a 37 °C) por 3 min. Quando as células se desprendem do fundo da placa, inativam a digestão pela adição de 2 mL de DMEM com SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL.
NOTA: Mantenha um tempo de tripsinização de estritamente 3 min, e prossiga rapidamente depois. - Ressuspender o pellet celular em 2 mL de tampão de separação magnética contendo DPBS com albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e EDTA 2 nM. Combinar 10 μL da suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e contar as células usando uma câmara de coloração.
- Centrifugar a suspensão celular a 188 x g durante 10 min a 4 °C e ressuspender a pastilha celular em 90 μL de tampão de separação de células magnéticas por 1 x 107 células. Adicionar 10 μL de microesferas Thy-1 por 1 x 107 células. Ressuspender a solução algumas vezes e incubar durante 15 minutos no escuro a 8 °C.
- Adicionar 2 ml do tampão de separação de células magnéticas à suspensão celular e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão de separação de células magnéticas.
- Umedeça a coluna de separação de células magnéticas com 1 mL do tampão de separação de células magnéticas. Coloque a coluna de separação de células magnéticas no separador de células magnéticas. Aplique as células à coluna de separação de células magnéticas. Recolher o fluxo e centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min.
NOTA: Os fibroblastos são selecionados positivamente e permanecem na coluna, enquanto as células de Schwann passam pela coluna. Os fibroblastos podem ser coletados com um carimbo (por exemplo, como controle negativo para protocolos de coloração de células de Schwann). - Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet em 1 ml do meio de cocultura (ver passo 3.1.1). Contar as células após coloração com azul de tripano e uma câmara de coloração.
- Quando as células atingirem uma confluência de cerca de 80% (6-12 dias de cultura), lavar cuidadosamente as placas 2x com 3 mL de DPBS e incubar com 2 mL de tripsina/EDTA a 0,05% (pré-aquecido a 37 °C) por 3 min. Quando as células se desprendem do fundo da placa, inativam a digestão pela adição de 2 mL de DMEM com SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL.
2. Cultura de explantes DRG
- Preparação do meio de crescimento DRG
- Preparar o meio de crescimento DRG adicionando 2% de B27, 2% de soro de cavalo, 1% de L-glutamina, 0,5% de penicilina/estreptomicina e 10 ng/mL de fator de crescimento nervoso (NGF) ao meio neurobasal. Conservar o meio de cultura a 4 °C.
NOTA: O meio de crescimento pode ser usado por 2 dias.
- Preparar o meio de crescimento DRG adicionando 2% de B27, 2% de soro de cavalo, 1% de L-glutamina, 0,5% de penicilina/estreptomicina e 10 ng/mL de fator de crescimento nervoso (NGF) ao meio neurobasal. Conservar o meio de cultura a 4 °C.
- Revestimento para explantes DRG
- Incubar as lamínulas em etanol 70% por 1 h e colocar nos poços de placas de 4 poços usando pinças curvas. Após a secagem do etanol, aplicar 300 μL de poli-D-lisina (PDL) 0,2 mg/mL por poço e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO2.
- Lave as lamínulas 3x por 5 min cada com DPBS consecutivamente. Retirar o DPBS, aplicar 300 μL de 1 μg/mL de laminina nas lamínulas e incubar durante a noite a 37 °C e 5% CO2.
- Após três etapas de lavagem com DPBS por 5 min, substitua o DPBS por 190 μL de meio de crescimento DRG. Coloque as placas de 4 poços na incubadora a 37 °C e 5% CO2.
- Preparação para DRG
NOTA: Colher o DRG de ratos embrionários sob uma bancada limpa.- Antes do preparo, limpe todos os instrumentos com etanol 70%. Encher 10 (duas por embrião) placas de TC de 35 mm com 2 mL de HBSS gelado por prato, e duas placas de TC de 100 mm com 5 mL de HBSS gelado por prato.
- Eutanásia das ratas prenhes (fêmeas adultas de ratos Sprague Dawley, E13.5) por inalação e decapitação de CO2 .
- Borrifar o corpo com etanol 70% e abrir o tronco ventral do rato. Retire cuidadosamente o útero e coloque-o em uma placa TC de 100 mm com HBSS gelado.
- Segure o útero usando pinças curvas e abra a parede do útero com pinças finas. Retire um saco amniótico e abra-o cuidadosamente apertando um orifício com pinça fina.
- Remova o embrião dos tecidos circundantes, corte o cordão umbilical e decapite o embrião usando pinças finas. Coloque o tronco em uma placa de TC de 100 mm preenchida com HBSS usando pinça curva e uma espátula.
- Retire rapidamente todos os embriões do útero e transfira-os para uma placa de 100 mm de TC preenchida com HBSS. Se houver mais de cinco embriões, preparar uma placa adicional de 35 mm de TC com 2 mL de HBSS, de acordo com a etapa 2.3.1.
- Coloque delicadamente um tronco embrionário em uma placa TC de 35 mm cheia de HBSS usando uma espátula e pinça curva. Sob um estereomicroscópio, abra a parte dorsal do tronco para dividir o embrião em duas metades usando pinça fina e microtesoura. Vire uma metade para o lado e identifique o fio de DRG localizado em uma linha na parte dorsal do embrião.
- Corte o fio DRG como um todo usando pinças finas e micro tesouras. Coloque o DRG em uma placa de TC de 35 mm fresca preenchida com 2 mL de HBSS e separe um único DRG do tecido restante usando pinça fina e microtesoura.
- Cultura de células DRG
- Leve placas de 4 poços contendo 190 μL de meio de crescimento DRG da incubadora para a bancada limpa onde o DRG deve ser preparado. Transfira um único DRG cuidadosamente para um poço de uma placa de cultura de 4 poços usando pinça fina e uma espátula. Coloque o DRG no centro de cada poço, pois uma posição central é importante para a fixação do DRG.
- Trabalhe em condições estéreis a partir de agora. Colocar as culturas de explantes na estufa a 37 °C e 5% de CO2. No dia seguinte, adicionar cuidadosamente 50 μL do meio de crescimento DRG a cada poço usando uma pipeta de 100 mL.
- Observe a aderência do explante DRG e a expansão do axônio usando um microscópio diariamente, e descarte os explantes DRG que se desprenderam da lamínula ou não conseguiram superar os axônios no dia 3 de cultura.
OBS: Os explantes DRG são muito frágeis nos primeiros dias de cultivo e precisam ser manuseados com cuidado, principalmente ao movimentar as placas para dentro e para fora da incubadora quando o meio é trocado, ou mesmo ao fechar a porta da incubadora. O volume preciso de 190 μL de meio por poço é crucial para manter os explantes DRG no local durante o primeiro dia de cultivo. Explantes DRG soltos podem ser facilmente identificados durante o controle diário, pois nadam no meio em vez de aderir à lamínula.
3. Cocultura
- Transferência de células de Schwann para a cultura de explantes DRG
- Preparar o meio de cocultura adicionando ácido ascórbico a 0,1% ao meio de cultura DRG.
- No dia 3 da cultura do explante DRG, substituir cuidadosamente o meio de crescimento DRG por 250 μL do meio de cocultura contendo 30.000 células de Schwann (a partir da etapa 1.8) por poço.
- Manter a cocultura dos explantes DRG e células de Schwann por até 22 dias. Substitua cuidadosamente 250 μL do meio de cocultura a cada dois dias e observe a aparência das células usando um microscópio.
NOTA: Para obter um exemplo de axônios DRG e células de Schwann na cocultura nos primeiros dias de cultura, consulte a Figura 1.
- Coloração imunocitoquímica
OBS: Manusear as amostras de cocultura com extremo cuidado durante o procedimento de coloração, pois elas podem ser danificadas facilmente.- Para fixar as células nas lamínulas, retire o meio lentamente, lave 3x com DPBS cuidadosamente e incube em paraformaldeído (PFA) a 4% por 10 min. Substitua o PFA por DPBS e armazene as células fixas a 4 °C por até 1 semana.
CUIDADO: Ao manusear 4% de PFA, use o equipamento de proteção individual recomendado. - Lavar as lamínulas 3x com DPBS por 5 min, em seguida, bloquear com solução de bloqueio (10% de soro de cabra, 10% de albumina de soro bovino [BSA], 0,1% de gelatina e 0,05% de Triton X-100) em DPBS por 1 h. Diluir os anticorpos primários βIII-tubulina (1:7.500) e proteína básica da mielina (MBP) (1:750) na solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4 °C.
- Lave as células 3x com DPBS por 5 min. Use anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente em uma diluição de 1:1.000 em solução de bloqueio e incube por 2 h à temperatura ambiente (TR).
- Lavar as células 3x com DPBS por 5 min e montar as células em lâminas microscópicas com meio de montagem de fluorescência, incluindo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Conservar as lâminas no escuro a 4 °C até documentação microscópica.
CUIDADO: Ao manusear o meio de montagem com fluorescência, use o equipamento de proteção individual recomendado.
- Para fixar as células nas lamínulas, retire o meio lentamente, lave 3x com DPBS cuidadosamente e incube em paraformaldeído (PFA) a 4% por 10 min. Substitua o PFA por DPBS e armazene as células fixas a 4 °C por até 1 semana.
- Análise
- Tire fotos de oito regiões definidas ao redor do explante DRG no centro usando um microscópio invertido.
- Utilizar um software de análise de imagens para quantificar as áreas de axônios βIII-tubulina positiva e mielinização coradas pela MBP.
- Calcular a porcentagem de mielinização como uma proporção dos axônios mielinizados e axônios não mielinizados.
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Representative Results
A mielinização na cocultura foi avaliada nos dias 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Os explantes DRG e as células de Schwann foram corados para MBP, βIII-tubulina e DAPI. A rede axonal na cocultura foi densa e não se alterou visivelmente no decorrer do tempo de observação. Os primeiros sinais de mielina, na forma de pequenos fragmentos, foram detectáveis no 10º dia e aumentaram no 12º dia (Figura 2). As áreas positivas para PAM aumentaram ao longo do tempo até o 20º dia de cultura. A mielinização foi quantificada pela razão entre as áreas positivas para PAM e βIII-tubulina. A mielinização aumentou significativamente nos dias 18 e 20 em comparação com o dia 10 (Figura 3; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).
Figura 1: Aparecimento das células de Schwann e axônios na cocultura. Retrato exemplar da cocultura no dia 3. As setas pretas mostram axônios DRG finos, e a seta branca aponta para uma célula de Schwann com uma morfologia alongada e fusiforme ligada a um axônio. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mielinização em cocultura de explantes DRG e células de Schwann. A coloração para o marcador neuronal βIII-tubulina e PAM foi realizada nos dias 10, 12, 14, 16, 18 e 20, após a união das duas culturas para investigar o desenvolvimento de mielinização na cocultura. Os primeiros sinais de mielinização foram visíveis nos dias 10 e 12 de cocultivo. A partir do 14º dia, o sinal da PAM foi mais pronunciado, sendo detectados axônios envoltos em mielina. A mielinização aumentou com o tempo de cocultura até o 20º dia. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação da mielinização. Nos dias 10, 12, 14, 16, 18 e 20 de cocultura, a mielinização foi avaliada pela coloração dos axônios com βIII-tubulina e mielina com MBP. A porcentagem de axônios mielinizados foi determinada pelo cálculo da razão entre as áreas coradas pela PAM positiva e pela βIII-tubulina. Diferenças significativas foram detectadas nos dias 18 e 20 em comparação com o dia 10 de cocultivo. Os dados foram expressos como média ± EPM; n = 3. ANOVA one-way com Kruskal-Wallis e teste post-hoc de comparações múltiplas de Dunn. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Estágios da cultura de células de Schwann. Imagens exemplares de campo claro de células de Schwann cultivadas (A) antes e (B) após a separação de células magnéticas. Antes da separação magnética de células, a cultura inclui células de Schwann com morfologia alongada e fusiforme, fibroblastos de aparência plana e disseminada e restos de tecido conjuntivo. Para obter uma cultura mais pura de células de Schwann, a separação magnética de células é realizada. Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2: Mielinização de explantes DRG com e sem células de Schwann adicionais. A área corada pela PAM foi utilizada para medir a mielinização na cocultura no 14º dia. A mielinização dos explantes DRG foi significativamente aumentada se células de Schwann fossem adicionadas à cultura (teste t não pareado, **p ≤ 0,01). n = 3. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 3: Análise da expressão gênica na cocultura. Os níveis relativos de expressão gênica de MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 e Olig1 foram analisados em amostras de cocultura no dia 22 por qPCR (A). MBP e PMP22 foram os alvos com maiores níveis de expressão gênica na cocultura. Uma imagem exemplar de produtos de amplificação por qPCR aplicados a um gel de agarose demonstra a abundância qualitativa dos alvos (B). A primeira e a última faixas do gel representam uma escada de DNA (100 pares de bases). n = 5. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, apresentamos um protocolo rápido e fácil para a geração de mielinização in vitro através da fusão de duas culturas de tipos celulares distintas, células de Schwann e explantes do gânglio da raiz dorsal.
Uma etapa crítica do protocolo é o cultivo de explantes DRG, especialmente nos primeiros dias de cultivo. Os DRG são muito frágeis antes que uma rede axonal forte seja construída e devem ser manuseados com muito cuidado, por exemplo, quando retirados da incubadora ou durante uma mudança de meio. DRG que se desprendem do fundo do poço e são encontrados nadando no meio mostram cultivo malsucedido. Para as células de Schwann, alterar as taxas de proliferação devido a diferentes condições de cultivo e suplementos (por exemplo, soro no meio) pode representar um desafio para a cocultura. Se a cultura é coberta por um número excessivo de células de Schwann, ela se desprende do fundo do poço e se torna inutilizável. Recomenda-se, portanto, a titulação do número de células de Schwann na cultura. Durante o estabelecimento do protocolo de células de Schwann, testes de pureza devem ser realizados, utilizando imunomarcação SOX10 ou S100. Em geral, o manuseio da cultura, incluindo a troca do meio, bem como as etapas de lavagem e fixação, devem ser realizados cuidadosamente para garantir um resultado bem-sucedido. É importante selecionar o ponto de observação de acordo com o interesse da pesquisa; O dia 14 representa o ponto de partida para os primeiros axônios mielinizados densos, e assim pode ser selecionado como o ponto de observação para o início da mielinização, enquanto os pontos de tempo posteriores oferecem bainhas de mielina mais completas.
Como este método in vitro de mielinização compreende apenas células DRG e Schwann, ele não se assemelha exatamente ao processo de mielinização no organismo. Outros fatores contribuintes, como o tecido circundante, o microambiente, as células imunes e a sinalização de estruturas distantes, não estão representados neste modelo. No entanto, esse método fornece um modelo adequado para investigar a mielinização do SNP por meio da análise e manipulação separadas de ambos os tipos celulares9,15,16. Células de Schwann ou DRG para a cocultura podem ser colhidas de animais doentes ou tratados para decifrar a contribuição do tipo celular específico17,18. Ao usar os estágios finais dessa configuração, é altamente recomendável incluir uma condição de controle sem adicionar adicionalmente células de Schwann, para descartar os possíveis efeitos das células de Schwann derivadas do DRG. Em nossa experiência, a mielinização em explantes DRG sem células de Schwann é detectada em menor grau do que na cocultura (Figura 2 Suplementar).
O uso de explantes DRG fornece a vantagem da arquitetura estrutural intacta em comparação com culturas neuronais dissociadas. A coloração imunofluorescente da proteína básica da mielina (MBP) permite quantificar a área do axônio mielinizado e fornece uma leitura suficiente para mielinização na cocultura. A análise da expressão gênica das amostras de cocultura no dia 22 revelou a presença de MBP, proteína de mielina periférica (PMP22), glicoproteína associada à mielina (MAG), octamer-binding factor 6 (Oct6), ETS-related gene 2 (Erg2) e oligodendrocyte transcription factor 1 (Olig1), com os maiores níveis de expressão para MBP e PMP22 (Figura Suplementar 3). Assim, o protocolo descrito fornece um método com várias opções de alvos para marcadores de mielinização na cocultura.
Potenciais aplicações deste método incluem abordagens de pesquisa básica sobre o processo de mielinização na periferia, bem como a validação de compostos terapêuticos para doenças do SNP, incluindo o dano da mielina.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Prof. Dr. Ralf Gold e à Dra. Gisa Ellrichmann pela assessoria e apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
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