Summary

Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann

Published: February 10, 2023
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Summary

Dans le système de coculture des ganglions de la racine dorsale et des cellules de Schwann, la myélinisation du système nerveux périphérique peut être étudiée. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’observer et de quantifier la myélinisation périphérique et d’étudier les effets des composés d’intérêt sur la gaine de myéline.

Abstract

Le processus de myélinisation est essentiel pour permettre une transduction rapide et suffisante du signal dans le système nerveux. Dans le système nerveux périphérique, les neurones et les cellules de Schwann s’engagent dans une interaction complexe pour contrôler la myélinisation des axones. Les perturbations de cette interaction et la dégradation de la gaine de myéline sont caractéristiques des neuropathies inflammatoires et surviennent secondairement dans les troubles neurodégénératifs. Ici, nous présentons un modèle de coculture d’explants ganglionnaires de la racine dorsale et de cellules de Schwann, qui développe une myélinisation robuste des axones périphériques pour étudier le processus de myélinisation dans le système nerveux périphérique, étudier les interactions axones-cellules de Schwann et évaluer les effets potentiels des agents thérapeutiques sur chaque type de cellule séparément. Méthodologiquement, les ganglions radiculaires dorsaux de rats embryonnaires (E13.5) ont été récoltés, dissociés de leurs tissus environnants et cultivés comme explants entiers pendant 3 jours. Les cellules de Schwann ont été isolées chez des rats adultes âgés de 3 semaines et les nerfs sciatiques ont été digérés par voie enzymatique. Les cellules de Schwann résultantes ont été purifiées par tri cellulaire activé magnétiquement et cultivées dans des conditions enrichies en neuréguline et en forskoline. Après 3 jours de culture d’explantation de ganglions de la racine dorsale, 30 000 cellules de Schwann ont été ajoutées à un ganglion de la racine dorsale explant dans un milieu contenant de l’acide ascorbique. Les premiers signes de myélinisation ont été détectés au jour 10 de la coculture, par des signaux diffusés pour la protéine basique de la myéline dans la coloration immunocytochimique. À partir du jour 14, des gaines de myéline se sont formées et se sont propagées le long des axones. La myélinisation peut être quantifiée par coloration des protéines basiques de la myéline en tant que rapport de l’aire de myélinisation et de la zone axonale, pour tenir compte des différences de densité axonale. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’étudier divers aspects de la myélinisation périphérique in vitro, ce qui est crucial pour comprendre la pathologie et les possibilités de traitement de la démyélinisation et de la neurodégénérescence dans les maladies inflammatoires et neurodégénératives du système nerveux périphérique.

Introduction

Dans le système nerveux périphérique (SNP), la transduction rapide de l’information est médiée par des axones enveloppés de myéline. La myélinisation des axones est essentielle pour permettre la propagation rapide des impulsions électriques, puisque la vitesse de conduction des fibres nerveuses est corrélée au diamètre de l’axone et à l’épaisseur de la myéline1. La signalisation sensorielle de la périphérie au système nerveux central (SNC) repose sur l’activation de neurones sensoriels de premier ordre qui résident dans des élargissements de la racine dorsale, appelés ganglions de la racine dorsale (DRG). Pour la formation et le maintien de la myéline, une communication continue entre les axones et les cellules de Schwann, qui sont les cellules gliales myélinisantes dans le SNP, est obligatoire2.

De nombreuses maladies du SNP perturbent la transduction de l’information par des lésions axonales primaires ou démyélinisantes, entraînant une hypesthésie ou une dysesthésie. Les neurones sensoriels de premier ordre ont la capacité de se régénérer dans une certaine mesure après une lésion neuronale, par une interaction complexe entre le neurone et les cellules de Schwann environnantes3. Dans ce cas, les cellules de Schwann peuvent subir une reprogrammation cellulaire pour éliminer les débris axonaux et de myéline et favoriser la régénération axonale, entraînant une remyélinisation4. Comprendre les mécanismes de myélinisation dans la santé et la maladie est important, afin de trouver des options de traitement possibles pour les troubles démyélinisants du SNP. La myéline peut également être endommagée par un neurotraumatisme aigu, et des approches visant à promouvoir la myélinisation pour faire progresser la récupération fonctionnelle après une lésion nerveuse périphérique sont à l’étude5.

Notre connaissance de la myélinisation périphérique a largement bénéficié des cocultures myélinisantes de cellules de Schwann et de neurones sensoriels. Depuis que les premières approches ont été appliquées 6,7,8, la myélinisation a été étudiée intensément avec l’utilisation de différents systèmes de coculture 9,10,11. Ici, nous fournissons un protocole rapide et facile pour une myélinisation in vitro robuste des axones ganglionnaires de la racine dorsale. Le protocole pour la préparation des cellules de Schwann est basé sur le protocole d’Andersen et al.12, précédemment publié dans Pitarokoili et al.13. Nous utilisons des cellules de Schwann dérivées de rats juvéniles et des cultures embryonnaires d’explantation DRG pour la coculture, dans laquelle la myélinisation se produit vers le 14e jour. L’objectif de la méthode est de fournir un système pour étudier la formation de myéline à la suite de l’interaction directe axone-cellule de Schwann, et d’étudier les modulateurs de la myélinisation PNS. Par rapport aux cultures de cellules neuronales dissociées, les explants DRG sont plus anatomiquement préservés et forment de longs processus axonaux. La quantification de la zone de l’axone myélinisé fournit une lecture suffisante pour la myélinisation dans la coculture. La méthode est un outil précieux pour dépister les composés thérapeutiques pour leur effet potentiel sur la myélinisation PNS, et peut également être utilisée en plus des études in vivo dans des modèles animaux14.

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la Directive du Conseil des Communautés européennes sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. 1. Culture cellulaire de Schwann Enrobage pour culture cellulaire SchwannEnduire les boîtes de culture cellulaire dans des conditions stériles. Appliquer 2 mL de poly-L-lysine (PLL) à 0,01 % sur deux boîtes de culture tissulaire (TC) de 60 mm chacune et incuber pendant une nuit à 4 …

Representative Results

La myélinisation dans la coculture a été évaluée aux jours 10, 12, 14, 16, 18 et 20. Les explants DRG et les cellules de Schwann ont été colorés pour le MBP, la βIII-tubuline et le DAPI. Le réseau axonal dans la coculture était dense et n’a pas changé visiblement au cours de l’observation. Les premiers signes de myéline, sous forme de petits fragments, étaient détectables au jour 10 et ont augmenté au jour 12 (figure 2). Les zones positives pour le MBP ont augmenté au fi…

Discussion

Ici, nous présentons un protocole rapide et facile pour la génération de myélinisation in vitro en fusionnant deux cultures de type cellulaire distinctes, les cellules de Schwann et les explants ganglionnaires de la racine dorsale.

Une étape critique du protocole est la culture d’explants DRG, en particulier dans les premiers jours de culture. Les DRG sont très fragiles avant la construction d’un réseau axonal fort et doivent être manipulés avec beaucoup de précaution, p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Prof. Dr. Ralf Gold et la Dr. Gisa Ellrichmann pour leurs conseils et leur soutien.

Materials

Anti-MBP, rabbit Novus Biologicals, Centannial, USA ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse  Biolegend, San Diego, USA 657402
Ascorbic acid  Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  A4403-100MG
B27-supplement Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  70765210
Bovine serum albumin Carl Roth, Karlsruhe, Germany  8076.4
Cell strainer, 100 µM BD Bioscience, Heidelberg, Germany 352360
Centrifuge 5810-R Eppendorf AG, Hamburg, Germany 5811000015
CO2 Incubator Heracell Heraeus Instruments, Hanau, Germany  51017865
Coverslips 12 mm Carl Roth, Karlsruhe, Germany  P231.1
Curved fine forceps  Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11370-42
DAPI fluoromount-G(R) Biozol, Eching, Germany SBA-0100-20
Dispase II Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  4942078001
Distilled water (Water Purification System)  Millipore, Molsheim, France ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  D8537-6X500ML
Ethanol  VWR, Radnor, USA  1009862500
FCS Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  F7524 FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11252-20
Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11370-40
Forskolin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  F6886-10MG
Gelatin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  G1393-20ML
Gentamycin Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+ Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  14170138
HERAcell Incubator Heraeus Instruments, Hanau, Germany  51017865
Heraguard ECO 1.2 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  51029882
Horse serum Pan-Biotech, Aidenbach, Germany P30-0712
Image J Software HIH, Bethesda, USA
Laminin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  11415064
L-Glutamine 200 mM  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  25030024
MACS Multistand  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130042303
Microscissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 15000-08
Microscope  Motic, Wetzlar, Germany Motic BA 400
Microscope Axio observer 7 Zeiss, Oberkochen, Germany  491917-0001-000
Microscope slide VWR, Radnor, USA  630-1985
MiniMACS separator Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130091632
MS columns Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
Neubauer counting chamber  Assistant, Erlangen, Germany 40441  
Neuregulin Peprotech, Rocky Hill, USA 100-03
Neurobasal medium  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  21103049
NGF Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  N1408
Normal goat serum Biozol, Eching, Germany S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  D6789
Paraformaldehyde Acros Organics, New Jersey, USA  10342243
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15140-122
Pipetboy Eppendorf AG, Hamburg, Germany 4430000018 
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 2231300004
Poly-D-Lysin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  P6407-5MG
Poly-L-Lysin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  62554502
Reaction tubes, 50 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  62547254
Reaction vessels, 1.5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  72690001
Safety Cabinet S2020 1.8 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  51026640
Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14083-08
Serological pipette, 10 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861254025
Serological pipette, 25 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861685001
Serological pipette, 5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861253001
Spatula Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8 Zeiss, Oberkochen, Germany  495015-0012-000 
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14007-14
TC dish 100, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833902300
TC dish 35, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833900300
TC dish 60, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-094-523
Triton X-100  Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  25300-054
Type I Collagenase Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  C1639
Water bath type 1008 GFL, Burgwedel, Germany  4285

References

  1. Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
  2. Taveggia, C. Schwann cells-axon interaction in myelination. Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).
  3. Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
  4. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
  5. Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
  6. Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
  7. Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
  8. Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
  9. Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
  10. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  11. Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
  12. Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
  13. Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
  14. Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
  15. Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
  16. Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
  17. Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
  18. Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).

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Blusch, A., Sgodzai, M., Rilke, N., Motte, J., König, J., Pitarokoili, K., Grüter, T. In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells. J. Vis. Exp. (192), e64768, doi:10.3791/64768 (2023).

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