Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64768
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Ruhr-University Bochum, St. Josef Hospital

Summary

במערכת ההתרבות המשותפת של גרעיני השורש הגבי ותאי Schwann, ניתן ללמוד מיאלינציה של מערכת העצבים ההיקפית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לצפות ולכמת את המיאלינציה ההיקפית ולחקור את ההשפעות של תרכובות ריבית על מעטפת המיאלין.

Abstract

תהליך המיאלינציה חיוני כדי לאפשר העברת אותות מהירה ומספקת במערכת העצבים. במערכת העצבים ההיקפית, נוירונים ותאי Schwann עוסקים באינטראקציה מורכבת כדי לשלוט במיאלינציה של אקסונים. הפרעות של אינטראקציה זו והתמוטטות של נדן המיאלין הם סימני היכר של נוירופתיות דלקתיות ומתרחשות באופן משני בהפרעות נוירודגנרטיביות. כאן, אנו מציגים מודל קוקולטורה של צמחי גנגליון שורש גבי ותאי Schwann, אשר מפתח מיאלינציה חזקה של אקסונים היקפיים כדי לחקור את תהליך המיאלינציה במערכת העצבים ההיקפית, לחקור אינטראקציות בין תאי אקסון-שוואן ולהעריך את ההשפעות האפשריות של חומרים טיפוליים על כל סוג תא בנפרד. מבחינה מתודולוגית, גנגליונים של שורש גבי של חולדות עובריות (E13.5) נקטפו, נותקו מהרקמה הסובבת אותם, ותורבתו כצמחים שלמים במשך 3 ימים. תאי Schwann בודדו מחולדות בוגרות בנות 3 שבועות, ועצבים סיאטיים עוכלו אנזימטית. תאי Schwann שהתקבלו טוהרו על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית וגודלו בתרבית בתנאים מועשרים בנוירגולין ובפורסקולין. לאחר 3 ימים של תרבית גנגליון שורש גבי, נוספו 30,000 תאי Schwann לצמח גנגליון שורש גבי אחד בתווך המכיל חומצה אסקורבית. הסימנים הראשונים של מיאלינציה התגלו ביום ה-10 של התרבות המשותפת, באמצעות אותות מפוזרים לחלבון בסיסי של מיאלין בצביעה אימונוציטוכימית. מהיום ה-14 ואילך נוצרו נדני המיאלין והתפשטו לאורך האקסונים. ניתן לכמת את המיאלינציה על ידי צביעת חלבון בסיסי במיאלין כיחס בין אזור המיאלינציה לאזור האקסון, כדי להסביר את ההבדלים בצפיפות האקסונלית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לחקור היבטים שונים של מיאלינציה היקפית במבחנה, שהיא חיונית להבנת הפתולוגיה של והזדמנויות טיפול אפשריות לדמיאלינציה וניוון עצבי במחלות דלקתיות וניווניות של מערכת העצבים ההיקפית.

Introduction

במערכת העצבים ההיקפית (PNS), העברת מידע מהירה מתווכת על ידי אקסונים עטופים במיאלין. המיאלינציה של אקסונים חיונית כדי לאפשר התפשטות מהירה של דחפים חשמליים, שכן מהירות ההולכה של סיבי העצב מתואמת לקוטר האקסון ועובי המיאלין1. איתות חושי מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית (CNS) מסתמך על הפעלה של נוירונים חושיים מסדר ראשון השוכנים בהגדלות של השורש הגבי, המכונים גרעיני שורש גבי (DRG). עבור היווצרות ותחזוקה של מיאלין, תקשורת רציפה בין אקסונים ותאי Schwann, שהם תאי Glia myelinating ב- PNS, היא חובה2.

מחלות רבות של מערכת העצבים הפארא-סימפתאית מפריעות להתמרה של מידע על-ידי נזק אקסונלי ראשוני או דמיאלינטינג, וכתוצאה מכך להיפסטזיה או דיססתזיה. לנוירונים חושיים מסדר ראשון יש את היכולת להתחדש במידה מסוימת לאחר נזק עצבי, על ידי אינטראקציה מורכבת בין תא העצב לבין תאי שוואן הסובבים אותו3. במקרה זה, תאי Schwann יכולים לעבור תכנות מחדש של תאים כדי לנקות פסולת אקסונלית כמו גם מיאלין ולקדם התחדשות אקסונלית, וכתוצאה מכך רמיאלינציה4. הבנת מנגנוני המיאלינציה בבריאות ובמחלות חשובה, על מנת למצוא אפשרויות טיפול אפשריות להפרעות דה-מיאלינציה של מערכת העצבים הפארא-סימפתטית. מיאלין יכול להיפגע גם על ידי נוירוטראומה חריפה, וגישות לקידום מיאלינציה לקידום התאוששות תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית נמצאות תחת חקירה5.

הידע שלנו על מיאלינציה היקפית הפיק תועלת רבה מתרביות מיאלינטיות של תאי Schwann ונוירונים חושיים. מאז הגישות הראשונות יושמו 6,7,8, myelination נחקר באופן אינטנסיבי עם שימוש במערכות coculture שונות9,10,11. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מהיר וקל עבור myelination in vitro חזק של אקסונים גנגליון שורש גבי. הפרוטוקול להכנת תאי Schwann מבוסס על הפרוטוקול של Andersen et al.12, שפורסם בעבר ב-Pitarokoili et al.13. אנו משתמשים בתאי Schwann שמקורם בחולדות צעירות ובתרביות DRG עובריות עבור התרבות המשותפת, שבה המיאלינציה מתרחשת בסביבות היום ה-14. מטרת השיטה היא לספק מערכת שתחקור את היווצרות המיאלין כתוצאה מאינטראקציה ישירה בין תאי אקסון-שואן, ולחקור מודולטורים של מיאלינציה של מערכת העצבים הפארא-סימפתטית. בהשוואה לתרביות תאים עצביים מנותקים, צמחי DRG נשמרים יותר אנטומית ויוצרים תהליכים אקסונליים ארוכים. כימות של אזור האקסון המיאלינטי מספק קריאה מספקת למיאלינציה בקוקולטור. השיטה היא כלי רב ערך לסינון תרכובות טיפוליות עבור השפעתן הפוטנציאלית על מיאלינציה של מערכת העצבים הפאראסימפת-דלקתית, וניתן להשתמש בה גם בנוסף למחקרי in vivo במודלים של בעלי חיים14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. תרבית תאי Schwann

  1. ציפוי לתרבית תאי Schwann
    1. מצפים את כלי תרבית התאים בתנאים סטריליים. יש למרוח 2 מ"ל של 0.01% פולי-ל-ליזין (PLL) על שתי מנות תרבית רקמה (TC) בקוטר 60 מ"מ כל אחת ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
    2. מוציאים את ה-PLL, שוטפים את צלחות ה-TC 2x במים מזוקקים, ודגרים עם 2 מ"ל של 1 מיקרוגרם/ס"מ2 למינין למשך הלילה ב-4°C. שטפו את כלי ה-TC 2x עם אקווה דסט ותנו לצלחות להתייבש באוויר.
  2. הכנה בינונית לתרבית תאי Schwann
    1. הכינו 50 מ"ל של מדיום תאי Schwann על ידי הוספת 10% סרום עגל עוברי מומת בחום (FCS), 2 מיקרומטר פורסקולין, 10 ננומטר נוירגולין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ל-Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)/F-12 (גלוקוז גבוה) בתנאים סטריליים.
    2. הכינו 70 מ"ל של מדיום L-15 של לייבוביץ עם 50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין בתנאים סטריליים.
  3. הכנת עצב סיאטי
    הערה: כל שלבי הכנת העצבים הסיאטיים מבוצעים תחת ספסל נקי.
    1. הכינו צלחת TC אחת של 100 מ"מ עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (DPBS) קר כקרח של Dulbecco ללא Ca2 + ו-Mg2+, צלחת TC אחת של 100 מ"מ עם 5 מ"ל של מדיום L-15 קר כקרח של לייבוביץ', וצלחת TC אחת של 100 מ"מ עם 5 מ"ל של L-15 בינוני קר כקרח של לייבוביץ' ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין.
    2. נקה את כל המכשירים על ידי autoclaving. רססו את המכשירים ואת אזור העבודה באתנול 70%.
    3. הרדימו חמש חולדות Sprague Dawley זכרים בני 3 שבועות באמצעות שאיפתCO2 ועריפת ראש. רססו את פלג הגוף העליון של החולדה באתנול 70%.
    4. פתח את הגפה השמאלית התחתונה הגבית עם מספריים והסר את שריר הירך הדו-ראשי בזהירות. שחררו את העצב הסיאטי על ידי הגבהה חלקה עם מלקחיים מעוקלים, והקפידו לא לחבול בעצב.
    5. החזיקו את החלק הפרוקסימלי ביותר של העצב עם המלקחיים המעוקלים כדי ליישר את העצב, וחתכו את העצב גבוה ככל האפשר באמצעות מספריים. לאחר מכן, חותכים את העצב קרוב למקלעת העצה ואת הכף עם מספריים. חזור על שלבים 1.3.4-1.3.5 עבור הצד הימני.
      הערה: בעת פתיחת האיבר, יש להקפיד שלא לגרום לחבלות בכלי דם.
    6. באמצעות מלקחיים, הכנס את העצבים הסיאטיים השמאלי והימני לתוך צלחת TC 100 מ"מ עם DPBS קר כקרח.
  4. שיפוץ עצבים סיאטיים
    1. השתמש במלקחיים כדי להעביר את כל העצבים לצלחת TC של 100 מ"מ עם מדיום L-15 קר כקרח של לייבוביץ' וגנטמיצין 50 מיקרוגרם/מ"ל. המשיכו להשתמש בסטריאומיקרוסקופ והוציאו שומן, שרירים וכלי דם מהעצבים בעזרת שני זוגות מלקחיים עדינים. תפסו את העצבים במלקחיים והעבירו אותם לצלחת TC של 100 מ"מ עם מדיום L-15 קר כקרח של לייבוביץ'.
    2. זהה את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של העצב הסיאטי. הסר את האפיניוריום עם זוג אחד של מלקחיים עדינים בכיוון פרוקסימלי עד דיסטלי, תוך החזקת קצה העצב הפרוקסימלי עם זוג המלקחיים העדינים השני.
    3. מעבירים את העצבים המטוהרים לצלחת TC של 100 מ"מ עם מדיום L-15 קר כקרח של לייבוביץ' וגנטמיצין 50 מיקרוגרם/מ"ל. להקניט את פשקווילי העצבים המבודדים כדי להפריד ולבודד סיבי עצב בודדים באמצעות שני זוגות של מלקחיים עדינים.
    4. מעבירים את סיבי העצב לצינור של 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל ותופסים כמה שפחות תווך. הוסף 50 מ"ל של מדיום L-15 של לייבוביץ' עם 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin לסיבי העצב וחתך כמה פעמים בצינור 50 מ"ל.
  5. עיכול אנזימטי של העצב הסיאטי
    הערה: השלבים הבאים (שלבים 1.5-1.8, 2.1 ו-2.2) מבוצעים בתנאים סטריליים.
    1. הכינו את תמיסת העיכול האנזימטית המכילה 0.25% dispase II, 0.05% collagenase מסוג I ו-50 מיקרוגרם/מ"ל gentamycin ב-10 מ"ל DMEM (גלוקוז גבוה).
    2. צנטריפוגה את הצינור ב 188 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant עם פיפטה סרולוגית 25 מ"ל, ולהעביר את הגלולה עם התווך L-15 של לייבוביץ' הנותר לתוך צלחת 60 מ"מ TC באמצעות פיפטה 1,000 מ"ל.
    3. שוטפים את הצינור 50 מ"ל עם 10 מ"ל של פתרון העיכול האנזימטי ומוסיפים אותו לצלחת המכילה את סיבי העצבים. מפזרים את הרקמה בצלחת בזהירות עם קצה פיפטה כדי למקסם את פני השטח הנגישים לעיכול.
    4. יש לדגור על 37°C ו-5% CO 2 למשך 18 שעות, ולעצור את העיכול על ידי הוספת 10 מ"ל של 40% FCS בתמיסת המלח המאוזנת של הנקס, ללא Ca2 ו-Mg2+ (HBSS).
  6. הפרדת תאים
    1. מעבירים את העצבים המעוכלים לתוך צינור 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית וצנטריפוגה ב 188 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל DMEM המכיל 10% FCS ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין. השהה מחדש את הגלולה 20 פעמים לאחר מכן, באמצעות 10 מ"ל, 5 מ"ל, 2 מ"ל, 1 מ"ל ו 200 מיקרוליטר פיפטה חוד.
    2. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר וצנטריפוגה במהירות של 188 x גרם למשך 10 דקות ב- 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה עם 4 מ"ל DMEM המכיל 10% FCS ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין.
    3. הוסף 2 מ"ל של תרחיף התא לכל אחת משתי צלחות TC 60 מ"מ מצופות PLL ולמינין, ודגור ב-37°C ו-5% CO2. השאירו את הלוחות ללא מגע במשך יומיים באינקובטור כדי להגן על התאים מפני לחץ מכני ולתמוך בהידבקות.
  7. התמיינות תאי Schwann
    1. לאחר יומיים, הסר את המדיום ושטוף בזהירות את הצלחות 2x עם DMEM (גלוקוז גבוה), 10% FCS, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של מדיום תא Schwann. החלף את מדיום התא Schwannכל 2 nd day, והתבונן במראה התא ובמפגש באמצעות מיקרוסקופ.
      הערה: תאי Schwann וצמחי DRG צריכים להיות מוכנים בזמן ובאופן מתואם עבור התרבות המשותפת. ודא שחולדה עם עוברים ב- E 13.5 זמינה להכנת DRG כאשר תאי Schwann קרובים למפגש של 80%.
  8. טריפסיניזציה של תאים והפרדה מגנטית
    הערה: לתמונות לדוגמה של שלבי תרבית תאי Schwann שונים, ראו איור משלים 1.
    1. כאשר התאים מגיעים למפגש של כ 80% (6-12 ימים של תרבית), בזהירות לשטוף את הצלחות 2x עם 3 מ"ל של DPBS לדגור עם 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA (מחומם מראש ל 37 ° C) במשך 3 דקות. כאשר התאים מתנתקים מתחתית הצלחת, משביתים את העיכול על ידי תוספת של 2 מ"ל DMEM עם 10% FCS ו- 50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין.
      הערה: היצמדו לזמן טריפסיניזציה של 3 דקות בלבד, והמשיכו במהירות לאחר מכן.
    2. השהה מחדש את גלולת התא ב-2 מ"ל של מאגר הפרדת תאים מגנטי המכיל DPBS עם אלבומין בסרום בקר (BSA) 0.5% ו-2 ננומטר EDTA. ערבבו 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של כחול טריפאן וספרו את התאים באמצעות תא צביעה.
    3. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 188 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 90 μL של חיץ הפרדת תאים מגנטי לכל 1 x 107 תאים. הוסף 10 μL של מיקרו-כדוריות Thy-1 לכל 1 x 107 תאים. השהה מחדש את התמיסה מספר פעמים ודגר במשך 15 דקות בחושך ב 8 מעלות צלזיוס.
    4. הוסף 2 מ"ל של מאגר הפרדת התאים המגנטי לתרחיף התא ולצנטריפוגה ב- 300 x גרם למשך 10 דקות ב- 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר הפרדת תאים מגנטי.
    5. יש להרטיב את עמוד הפרדת התאים המגנטי עם 1 מ"ל של מאגר הפרדת התאים המגנטי. מקם את עמודת הפרדת התאים המגנטית במפריד התא המגנטי. החל את התאים על עמודת הפרדת התאים המגנטית. לאסוף את הזרימה דרך צנטריפוגה ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות.
      הערה: פיברובלסטים נבחרים באופן חיובי ונשארים בעמודה, בעוד שתאי Schwann עוברים את העמודה. ניתן לאסוף פיברובלסטים עם חותמת (למשל, כבקרה שלילית לפרוטוקולי צביעת תאי Schwann).
    6. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום החקלאות המשותפת (ראו שלב 3.1.1). ספרו את התאים לאחר צביעה עם כחול טריפאן ותא צביעה.

2. תרבית DRG explant

  1. הכנת מדיום גידול DRG
    1. הכינו מדיום גידול DRG על ידי הוספת 2% B27, 2% סרום סוסים, 1% L-גלוטמין, 0.5% פניצילין/סטרפטומיצין ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה עצבי (NGF) למדיום הנוירובזאלי. יש לאחסן את מדיום הגידול בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: ניתן להשתמש במדיום הגידול במשך יומיים.
  2. ציפוי עבור explants DRG
    1. יש לדגור על הכיסויים באתנול 70% למשך שעה ולהניח בבארות של כלים בעלי 4 בארות באמצעות מלקחיים מעוקלים. לאחר שהאתנול התייבש, יש למרוח 300 μL של 0.2 מ"ג/מ"ל פולי-D-ליזין (PDL) לכל באר ולדגור למשך הלילה ב-37°C ו-5% CO2.
    2. שטפו את הכיסויים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם DPBS ברצף. יש להסיר את ה-DPBS, למרוח 300 μL של 1 מיקרוגרם/מ"ל למינין על הכיסויים, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
    3. לאחר שלושה שלבי כביסה עם DPBS במשך 5 דקות, החלף את DPBS עם 190 μL של מדיום גידול DRG. הכניסו את צלחות 4 הבארות לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
  3. הכנת DRG
    הערה: קצרו את ה-DRG של חולדות עובריות מתחת לספסל נקי.
    1. לפני ההכנה, לנקות את כל המכשירים עם 70% אתנול. מלאו 10 (שניים לכל עובר) צלחות TC בקוטר 35 מ"מ ב-2 מ"ל HBSS קר כקרח לכל מנה, ושתי צלחות TC בקוטר 100 מ"מ ב-5 מ"ל HBSS קר כקרח לכל מנה.
    2. הרדימו את החולדות ההרות (נקבות בוגרות של חולדות Sprague Dawley, E13.5) על ידי שאיפתCO2 ועריפת ראשים.
    3. רססו את הגוף באתנול 70% ופתחו את פלג הגוף העליון הגחוני של החולדה. בזהירות להסיר את הרחם ולהניח אותו לתוך צלחת 100 מ"מ TC עם HBSS קר כקרח.
    4. החזיקו את הרחם באמצעות מלקחיים מעוקלים ופתחו את דופן הרחם בעזרת מלקחיים עדינים. מוציאים שק מי שפיר אחד ופותחים אותו בזהירות על ידי צביטת חור במלקחיים עדינים.
    5. הוציאו את העובר מהרקמות הסובבות, חתכו את חבל הטבור וערפו את ראשו באמצעות מלקחיים עדינים. הכניסו את פלג הגוף העליון לצלחת TC בקוטר 100 מ"מ מלאה ב-HBSS באמצעות מלקחיים מעוקלים ומרית.
    6. הוציאו במהירות את כל העוברים מהרחם והעבירו אותם לצלחת TC אחת של 100 מ"מ מלאה ב- HBSS. אם יש יותר מחמישה עוברים, הכינו צלחת TC נוספת של 35 מ"מ עם 2 מ"ל של HBSS, לפי שלב 2.3.1.
    7. הניחו בעדינות פלג גוף עליון של עובר אחד לתוך צלחת TC בקוטר 35 מ"מ מלאה ב-HBSS באמצעות מרית ומלקחיים מעוקלים. תחת סטריאומיקרוסקופ, פתחו את החלק הגבי של פלג הגוף העליון כדי לחלק את העובר לשני חצאים באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים זעירים. סובבו חצי אחד הצידה וזהו את גדיל ה-DRG הממוקם בקו בחלק הגבי של העובר.
    8. גזרו את ה-DRG כגדיל שלם בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים זעירים. מניחים את ה-DRG בכלי TC טרי בקוטר 35 מ"מ מלא ב-2 מ"ל HBSS, ומפרידים DRG בודד מהרקמה הנותרת באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים זעירים.
  4. תרבית תאי DRG
    1. קח צלחות 4 בארות המכילות 190 מיקרוליטר של מדיום גידול DRG מהאינקובטור לספסל הנקי שבו יש להכין את ה- DRG. מעבירים בזהירות DRG בודד לבאר אחת של צלחת תרבית בת 4 בארות בעזרת מלקחיים עדינים ומרית. מקם את DRG במרכז כל באר, שכן מיקום מרכזי חשוב לחיבור של DRG.
    2. עבודה בתנאים סטריליים מעתה והלאה. מקמו את תרביות הצמחים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. למחרת, להוסיף 50 μL של מדיום הגידול DRG בזהירות לכל באר באמצעות פיפטה 100 מ"ל.
    3. צפו במיקרוסקופ מדי יום בהיצמדות לצמחי DRG ובצמיחת אקסונים באמצעות מיקרוסקופ, והשליכו צמחי DRG שהתנתקו מהכיסוי, או שלא הצליחו לצמוח מעבר לאקסונים ביום השלישי לתרבית.
      הערה: צמחי DRG הם שבירים מאוד בימים הראשונים של התרבית ויש לטפל בהם בזהירות, במיוחד בעת הזזת הצלחות פנימה והחוצה מהאינקובטור כאשר המדיום משתנה, או אפילו בעת סגירת דלת האינקובטור. הנפח המדויק של 190 מיקרוליטר מדיום לכל באר הוא חיוני כדי לשמור על צמחי DRG במקומם במהלך היום הראשון של התרבית. ניתן לזהות בקלות צמחי DRG רופפים במהלך הבקרה היומיומית, מכיוון שהם שוחים בתווך במקום להיצמד לכיסוי.

3. קוקולטורה

  1. העברה של תאי Schwann לתרבית explant DRG
    1. הכינו את מדיום החקלאות על ידי הוספת 0.1% חומצה אסקורבית למדיום הגידול DRG.
    2. ביום השלישי של תרבית הצמחים של DRG, החליפו בזהירות את מדיום הגידול של DRG ב-250 מיקרוליטר של מדיום החקלאות המשותפת המכיל 30,000 תאי Schwann (משלב 1.8) לכל באר.
    3. שמור את התרבות המשותפת של צמחי DRG ותאי Schwann למשך עד 22 יום. החלף 250 μL של מדיום coculture בזהירות כל יומיים, ולבחון את המראה של התאים באמצעות מיקרוסקופ.
      הערה: לדוגמה של אקסוני DRG ותאי Schwann בתרבות המשותפת בימים הראשונים של התרבית, ראו איור 1.
  2. צביעה אימונוציטוכימית
    הערה: טפל בדגימות הקוקולטורה בזהירות רבה במהלך הליך הצביעה, מכיוון שהן יכולות להינזק בקלות.
    1. כדי לתקן את התאים על הכיסויים, להסיר את המדיום לאט, לשטוף 3x עם DPBS בזהירות, לדגור 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות. החלף את ה- PFA ב- DPBS, ואחסן את התאים הקבועים ב- 4 ° C למשך עד שבוע אחד.
      אזהרה: בעת טיפול ב-4% PFA, יש ללבוש את ציוד המגן האישי המומלץ.
    2. יש לשטוף את הכיסויים 3 פעמים עם DPBS למשך 5 דקות, ולאחר מכן לחסום עם תמיסה חוסמת (10% סרום עיזים, 10% אלבומין בסרום בקר [BSA], 0.1% ג'לטין ו-0.05% טריטון X-100) ב-DPBS למשך שעה אחת. לדלל את הנוגדנים העיקריים βIII-tubulin (1:7,500) ואת חלבון בסיסי מיאלין (MBP) (1:750) בתמיסת החסימה, ולדגור לילה ב 4 ° C.
    3. שטפו את התאים 3x עם DPBS במשך 5 דקות. השתמשו בנוגדנים משניים מצומדים בצבע פלואורסצנטי בדילול של 1:1,000 בתמיסה חוסמת, ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT).
    4. שטפו את התאים 3x עם DPBS במשך 5 דקות, והרכיבו את התאים על שקופיות מיקרוסקופיות עם אמצעי הרכבה פלואורסצנטיים, כולל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). אחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורה של 4°C עד לתיעוד מיקרוסקופי.
      התראה: בעת טיפול במדיום הרכבה פלואורסצנטי, יש ללבוש את ציוד המגן האישי המומלץ.
  3. ניתוח
    1. צלמו שמונה אזורים מוגדרים המקיפים את ה-DRG במרכז באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
    2. השתמש ביישום תוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת את האזורים של אקסונים חיוביים βIII-tubulin ומיאלינציה המוכתמים על ידי MBP.
    3. חשב את אחוז המיאלינציה כיחס בין אקסונים myelinated ואקסונים non-myelinated.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המיאלינציה בתרבות המשותפת הוערכה בימים 10, 12, 14, 16, 18 ו-20. צמחי DRG ותאי Schwann הוכתמו עבור MBP, βIII-tubulin ו- DAPI. הרשת האקסונלית בקוקולטורה הייתה צפופה ולא השתנתה באופן ניכר במהלך הזמן של התצפית. הסימנים הראשונים של מיאלין, בצורה של שברים קטנים, היו ניתנים לזיהוי ביום ה-10 והתגברו ביום ה-12 (איור 2). האזורים החיוביים ל-MBP גדלו עם הזמן עד היום ה-20 לתרבות. המיאלינציה כומתה כיחס בין האזורים החיוביים MBP ו-βIII-tubulin. המיאלינציה עלתה משמעותית בימים 18 ו-20 בהשוואה ליום 10 (איור 3; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001).

Figure 1
איור 1: הופעה של תאי Schwann ואקסונים בתרבות המשותפת. תמונה מופתית של התרבות המשותפת ביום השלישי. החצים השחורים מראים אקסוני DRG דקים, והחץ הלבן מצביע על תא Schwann עם מורפולוגיה מוארכת בצורת ציר המחוברת לאקסון. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מיאלינציה בתרבות משותפת של צמחי DRG ותאי Schwann. צביעה עבור הסמן העצבי βIII-tubulin ו- MBP בוצעה בימים 10, 12, 14, 16, 18 ו- 20, לאחר שהצטרפו לשתי התרבויות כדי לחקור את התפתחות המיאלינציה בתרבות המשותפת. סימנים ראשונים של מיאלינציה נראו בימים 10 ו -12 של coculture. מהיום ה-14 ואילך, אות ה-MBP היה בולט יותר, ואקסונים עטופים במיאלין זוהו. המיאלינציה גדלה עם הזמן של coculture עד היום ה -20. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: כימות המיאלינציה. בימים 10, 12, 14, 16, 18 ו-20 של קוקולטור, המיאלינציה הוערכה על ידי צביעת אקסונים עם βIII-tubulin, ומיאלין עם MBP. אחוז האקסונים המיאלינטים נקבע על ידי חישוב היחס בין האזורים המוכתמים MBP חיובי ו- βIII-tubulin. הבדלים משמעותיים התגלו בימים 18 ו-20 בהשוואה ליום 10 של התרבות המשותפת. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM; n = 3. ANOVA חד-כיווני עם Kruskal-Wallis ומבחן ההשוואה המרובים של דאן לאחר הוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: שלבים של תרבית תאי Schwann. תמונות מופתיות של שדה בהיר של תאי Schwann בתרבית (A) לפני ו-(B) אחרי הפרדת תאים מגנטית. לפני הפרדת התאים המגנטית, התרבית כוללת תאי שוואן בעלי מורפולוגיה מוארכת ובצורת ציר, פיברובלסטים שטוחים ומפוזרים ושרידים של רקמת חיבור. כדי להשיג תרבית טהורה יותר של תאי Schwann, מתבצעת הפרדת תאים מגנטית. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: מיאלינציה של צמחי DRG עם וללא תאי Schwann נוספים. האזור המוכתם ב-MBP שימש למדידת מיאלינציה בתרבות המשותפת ביום ה-14. המיאלינציה של צמחי DRG גדלה באופן משמעותי אם הוסיפו תאי Schwann לתרבית (מבחן t לא מזווג, **p ≤ 0.01). n = 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: ניתוח ביטוי גנים בתרבות המשותפת. רמות ביטוי גנים יחסיות של MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 ו-Olig1 נותחו בדגימות קוקולטורה ביום ה-22 על ידי qPCR (A). MBP ו-PMP22 היו המטרות עם רמות ביטוי הגנים הגבוהות ביותר בתרבות המשותפת. תמונה לדוגמה של מוצרי הגברה qPCR המיושמים על ג'ל אגרוז מדגימה את השפע האיכותי של המטרות (B). הנתיב הראשון והאחרון בג'ל מייצגים סולם DNA (100 זוגות בסיסים). n = 5. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מהיר וקל ליצירת מיאלינציה חוץ גופית על ידי מיזוג שתי תרביות נפרדות מסוג תאים, תאי Schwann וצמחי גנגליון שורש גבי.

שלב קריטי בפרוטוקול הוא גידול צמחי DRG, במיוחד בימים הראשונים של התרבות. DRG הם שבירים מאוד לפני בניית רשת אקסונלית חזקה ויש לטפל בהם בזהירות רבה, למשל, כאשר מוציאים אותם מהאינקובטור או במהלך שינוי תווך. DRG שמתנתקים מקרקעית הבאר ונמצאים שוחים במדיום מראים טיפוח לא מוצלח. עבור תאי Schwann, שינוי שיעורי ההתרבות עקב תנאי גידול שונים ותוספי מזון (למשל, סרום בתווך) יכול להוות אתגר עבור coculture. אם התרבית גדלה יתר על המידה על ידי מספר מופרז של תאי שוואן, היא מתנתקת מתחתית הבאר והופכת לבלתי שמישה. לכן מומלץ טיטרציה של מספר תא Schwann בתרבית. במהלך הקמת פרוטוקול תאי Schwann, יש לבצע בדיקות טוהר, באמצעות SOX10 או S100 immunostaining. באופן כללי, הטיפול בתרבות, כולל שינוי מדיום וכן שלבי כביסה וקיבוע, חייב להתבצע בזהירות כדי להבטיח תוצאה מוצלחת. חשוב לבחור את נקודת הזמן של התצפית על פי העניין המחקרי; יום 14 מייצג את נקודת ההתחלה של האקסונים הצפופים הראשונים של המיאלינציה, ולכן ניתן לבחור אותו כנקודת הזמן של התצפית להתחלת המיאלינציה, בעוד שנקודות זמן מאוחרות יותר מציעות מעטה מיאלין שלם יותר.

מכיוון ששיטת מיאלינציה זו במבחנה כוללת רק תאי DRG ו- Schwann, היא אינה דומה בדיוק לתהליך המיאלינציה באורגניזם. גורמים תורמים אחרים, כגון הרקמה הסובבת, המיקרו-סביבה, תאי מערכת החיסון ואיתות ממבנים מרוחקים, אינם מיוצגים במודל זה. עם זאת, שיטה זו מספקת מודל מתאים לחקר המיאלינציה של מערכת העצבים הפארא-סימפתטית על-ידי ניתוח ומניפולציה נפרדים של שני סוגי התאים 9,15,16. תאי Schwann או DRG עבור coculture ניתן לקצור מבעלי חיים חולים או מטופלים כדי לפענח את התרומה של סוג התא הספציפי17,18. בעת שימוש בשלבים המאוחרים של התקנה זו, מומלץ מאוד לכלול תנאי בקרה מבלי להוסיף בנוסף תאי Schwann, כדי לשלול את ההשפעות האפשריות של תאי Schwann שמקורם ב- DRG. מניסיוננו, מיאלינציה בצמחי DRG ללא תאי Schwann מזוהה במידה פחותה משמעותית מאשר בחקלאות משותפת (איור משלים 2).

השימוש בצמחי DRG מספק את היתרון של ארכיטקטורה מבנית שלמה בהשוואה לתרבויות עצביות מנותקות. צביעה אימונופלואורסצנטית של חלבון בסיסי מיאלין (MBP) מאפשרת לכמת את אזור האקסון המיאלינטי, ומספקת קריאה מספקת למיאלינציה בתרבות המשותפת. ניתוח ביטוי גנים של דגימות קוקולטורה ביום ה-22 גילה נוכחות של MBP, חלבון מיאלין היקפי (PMP22), גליקופרוטאין הקשור למיאלין (MAG), גורם קושר אוקטמר 6 (Oct6), גן 2 הקשור ל-ETS (Erg2) וגורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 1 (Olig1), עם רמות הביטוי הגבוהות ביותר עבור MBP ו-PMP22 (איור משלים 3). לפיכך, הפרוטוקול המתואר מספק שיטה עם מספר אפשרויות יעד לסמני מיאלינציה בתרבות המשותפת.

יישומים פוטנציאליים של שיטה זו כוללים גישות מחקר בסיסיות על תהליך המיאלינציה בפריפריה, כמו גם אימות של תרכובות טיפוליות למחלות של PNS, כולל הנזק של המיאלין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לפרופ' ד"ר ראלף גולד ולד"ר גיזה אלריכמן על הייעוץ והתמיכה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-MBP, rabbit Novus Biologicals, Centannial, USA ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse  Biolegend, San Diego, USA 657402
Ascorbic acid  Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  A4403-100MG
B27-supplement Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  70765210
Bovine serum albumin Carl Roth, Karlsruhe, Germany  8076.4
Cell strainer, 100 µM BD Bioscience, Heidelberg, Germany 352360
Centrifuge 5810-R Eppendorf AG, Hamburg, Germany 5811000015
CO2 Incubator Heracell Heraeus Instruments, Hanau, Germany  51017865
Coverslips 12 mm Carl Roth, Karlsruhe, Germany  P231.1
Curved fine forceps  Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11370-42
DAPI fluoromount-G(R) Biozol, Eching, Germany SBA-0100-20
Dispase II Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  4942078001
Distilled water (Water Purification System)  Millipore, Molsheim, France ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  D8537-6X500ML
Ethanol  VWR, Radnor, USA  1009862500
FCS Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  F7524 FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11252-20
Forceps Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 11370-40
Forskolin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  F6886-10MG
Gelatin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  G1393-20ML
Gentamycin Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  14170138
HERAcell Incubator Heraeus Instruments, Hanau, Germany  51017865
Heraguard ECO 1.2 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  51029882
Horse serum Pan-Biotech, Aidenbach, Germany P30-0712
Image J Software HIH, Bethesda, USA
Laminin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  11415064
L-Glutamine 200 mM  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  25030024
MACS Multistand  Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130042303
Microscissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 15000-08
Microscope  Motic, Wetzlar, Germany Motic BA 400
Microscope Axio observer 7 Zeiss, Oberkochen, Germany  491917-0001-000
Microscope slide VWR, Radnor, USA  630-1985
MiniMACS separator Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130091632
MS columns Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
Neubauer counting chamber  Assistant, Erlangen, Germany 40441  
Neuregulin Peprotech, Rocky Hill, USA 100-03
Neurobasal medium  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  21103049
NGF Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  N1408
Normal goat serum Biozol, Eching, Germany S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  D6789
Paraformaldehyde Acros Organics, New Jersey, USA  10342243
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15140-122
Pipetboy Eppendorf AG, Hamburg, Germany 4430000018 
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 2231300004
Poly-D-Lysin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  P6407-5MG
Poly-L-Lysin Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  62554502
Reaction tubes, 50 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  62547254
Reaction vessels, 1.5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  72690001
Safety Cabinet S2020 1.8 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  51026640
Scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14083-08
Serological pipette, 10 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861254025
Serological pipette, 25 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861685001
Serological pipette, 5 mL Sarstedt, Nümbrecht, Germany  861253001
Spatula Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8 Zeiss, Oberkochen, Germany  495015-0012-000 
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany 14007-14
TC dish 100, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833902300
TC dish 35, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833900300
TC dish 60, cell + Sarstedt, Nümbrecht, Germany  833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-094-523
Triton X-100  Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%  Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany  25300-054
Type I Collagenase Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany  C1639
Water bath type 1008 GFL, Burgwedel, Germany  4285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
  2. Taveggia, C. Schwann cells-axon interaction in myelination. Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).
  3. Gordon, T. Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).
  4. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).
  5. Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies. Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).
  6. Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen. The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).
  7. Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
  8. Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation. The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).
  9. Paivalainen, S., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).
  10. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140 (4), 898-913 (2017).
  11. Taveggia, C., Bolino, A. DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures. Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).
  12. Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves. Scientific Reports. 6, 31781 (2016).
  13. Pitarokoili, K., et al. Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).
  14. Grüter, T., et al. Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).
  15. Lehmann, H. C., Höke, A. Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).
  16. Joshi, A. R., et al. Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP). Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).
  17. Klimas, R., et al. Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis. Brain Communications. 3 (4), (2021).
  18. Szepanowski, F., et al. LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 192
מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blusch, A., Sgodzai, M., Rilke, N.,… More

Blusch, A., Sgodzai, M., Rilke, N., Motte, J., König, J., Pitarokoili, K., Grüter, T. In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells. J. Vis. Exp. (192), e64768, doi:10.3791/64768 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter