במערכת ההתרבות המשותפת של גרעיני השורש הגבי ותאי Schwann, ניתן ללמוד מיאלינציה של מערכת העצבים ההיקפית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לצפות ולכמת את המיאלינציה ההיקפית ולחקור את ההשפעות של תרכובות ריבית על מעטפת המיאלין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן
במאמר זה
סיכום
תקציר
תהליך המיאלינציה חיוני כדי לאפשר העברת אותות מהירה ומספקת במערכת העצבים. במערכת העצבים ההיקפית, נוירונים ותאי Schwann עוסקים באינטראקציה מורכבת כדי לשלוט במיאלינציה של אקסונים. הפרעות של אינטראקציה זו והתמוטטות של נדן המיאלין הם סימני היכר של נוירופתיות דלקתיות ומתרחשות באופן משני בהפרעות נוירודגנרטיביות. כאן, אנו מציגים מודל קוקולטורה של צמחי גנגליון שורש גבי ותאי Schwann, אשר מפתח מיאלינציה חזקה של אקסונים היקפיים כדי לחקור את תהליך המיאלינציה במערכת העצבים ההיקפית, לחקור אינטראקציות בין תאי אקסון-שוואן ולהעריך את ההשפעות האפשריות של חומרים טיפוליים על כל סוג תא בנפרד. מבחינה מתודולוגית, גנגליונים של שורש גבי של חולדות עובריות (E13.5) נקטפו, נותקו מהרקמה הסובבת אותם, ותורבתו כצמחים שלמים במשך 3 ימים. תאי Schwann בודדו מחולדות בוגרות בנות 3 שבועות, ועצבים סיאטיים עוכלו אנזימטית. תאי Schwann שהתקבלו טוהרו על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית וגודלו בתרבית בתנאים מועשרים בנוירגולין ובפורסקולין. לאחר 3 ימים של תרבית גנגליון שורש גבי, נוספו 30,000 תאי Schwann לצמח גנגליון שורש גבי אחד בתווך המכיל חומצה אסקורבית. הסימנים הראשונים של מיאלינציה התגלו ביום ה-10 של התרבות המשותפת, באמצעות אותות מפוזרים לחלבון בסיסי של מיאלין בצביעה אימונוציטוכימית. מהיום ה-14 ואילך נוצרו נדני המיאלין והתפשטו לאורך האקסונים. ניתן לכמת את המיאלינציה על ידי צביעת חלבון בסיסי במיאלין כיחס בין אזור המיאלינציה לאזור האקסון, כדי להסביר את ההבדלים בצפיפות האקסונלית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לחקור היבטים שונים של מיאלינציה היקפית במבחנה, שהיא חיונית להבנת הפתולוגיה של והזדמנויות טיפול אפשריות לדמיאלינציה וניוון עצבי במחלות דלקתיות וניווניות של מערכת העצבים ההיקפית.
מבוא
במערכת העצבים ההיקפית (PNS), העברת מידע מהירה מתווכת על ידי אקסונים עטופים במיאלין. המיאלינציה של אקסונים חיונית כדי לאפשר התפשטות מהירה של דחפים חשמליים, שכן מהירות ההולכה של סיבי העצב מתואמת לקוטר האקסון ועובי המיאלין1. איתות חושי מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית (CNS) מסתמך על הפעלה של נוירונים חושיים מסדר ראשון השוכנים בהגדלות של השורש הגבי, המכונים גרעיני שורש גבי (DRG). עבור היווצרות ותחזוקה של מיאלין, תקשורת רציפה בין אקסונים ותאי Schwann, שהם תאי Glia myelinating ב- PNS, היא חובה2.
מחלות רבות של מערכת העצבים הפארא-סימפתאית מפריעות להתמרה של מידע על-ידי נזק אקסונלי ראשוני או דמיאלינטינג,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בוצעו בהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. תרבית תאי Schwann
- ציפוי לתרבית תאי Schwann
- מצפים את כלי תרבית התאים בתנאים סטריליים. יש למרוח 2 מ"ל של 0.01% פולי-ל-ליזין (PLL) על שתי מנות תרבית רקמה (TC) בקוטר 60 מ"מ כל אחת ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- מוציאים את ה-PLL, שוטפים את צלחות ה-TC 2x במים מזוקקים, ודגרים עם 2 מ"ל של 1 מיקרוגרם/ס"מ2 למינין למשך הלילה ב-4°C. שטפו את כלי ה-TC 2x עם אקווה דסט ותנו לצלחות להתייבש באוויר.
- הכנה בינונית לתרבית תאי Schwann
- הכינו 50 מ"ל של מדיום תאי Schwann על ידי הוספת 10% ס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המיאלינציה בתרבות המשותפת הוערכה בימים 10, 12, 14, 16, 18 ו-20. צמחי DRG ותאי Schwann הוכתמו עבור MBP, βIII-tubulin ו- DAPI. הרשת האקסונלית בקוקולטורה הייתה צפופה ולא השתנתה באופן ניכר במהלך הזמן של התצפית. הסימנים הראשונים של מיאלין, בצורה של שברים קטנים, היו ניתנים לזיהוי ביום ה-10 והתגברו ביום ה-12 (איור 2). האזורים החיוביים ל-MBP גדלו עם הזמן עד היום ה-20 לתרבות. המיאלינציה כומתה כיחס בין האזורים החיוביים MBP ו-βIII-tubulin. המיאלינציה עלתה משמעותית בימים 18 ו-20 בהשוואה ליום 10 (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מהיר וקל ליצירת מיאלינציה חוץ גופית על ידי מיזוג שתי תרביות נפרדות מסוג תאים, תאי Schwann וצמחי גנגליון שורש גבי.
שלב קריטי בפרוטוקול הוא גידול צמחי DRG, במיוחד בימים הראשונים של התרבות. DRG הם שבירים מאוד לפני בניית רשת אקסונלית חזקה ויש לטפל בהם בזהירות רבה, למשל, כאשר מוציאים אותם מהאינקובטור או במהלך שינוי תווך. DRG שמתנתקים מקרקעית הבאר ונמצאים שוחים במדיום מראים טיפוח לא מוצלח. עבור תאי Schwann, שינוי שיעורי ההתרבות עקב תנאי גידול שונים ותוספי מזון (למשל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
תודות
אנו מודים לפרופ' ד"ר ראלף גולד ולד"ר גיזה אלריכמן על הייעוץ והתמיכה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Anti-MBP, ארנב | Novus Biologicals, Centannial, ארה"ב | ABIN446360 | |
| Anti-ß III-טובולין, עכבר | Biolegend, סן דייגו, ארה"ב | 657402 | |
| חומצה אסקורבית | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | A4403-100MG | |
| תוסף B27 | תרמו פישר מדעי, שוורטה, גרמניה | 17504-044 | |
| קצה מסנן ביוספרה, 100 ומיקרו; L | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| 70760212 קצה מסנן ביוספרה, 1250 ומיקרו; L | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| 701186210 קצה מסנן ביוספרה, 20 ומיקרו; L | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| 701114210 קצה מסנן ביוספרה, 300 ומיקרו; L | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| אלבומין סרום בקר | קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה | 8076.4 | |
| מסננת תאים, 100 ומיקרו; M | BD Bioscience, היידלברג, גרמניה | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, המבורג, גרמניה | 5811000015 | |
| CO2 חממת Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, גרמניה | ||
| כיסויים 12 מ"מ | Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה | P231.1 | |
| מלקחיים עדינים מעוקלים | Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, גרמניה | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | ||
| מים מזוקקים (מערכת טיהור מים) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, גרמניה | ||
| DPBS (ללא Ca2+ וללא Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | D8537-6X500ML | |
| אתנול | VWR, רדנור, ארה"ב | ||
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | F7524 | FCS חייב להיבדק עבור תרבית תאים של שוואן |
| מלקחיים עדינים (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה | 11252-20 | |
| מלקחיים | Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | F6886-10MG | |
| ג'לטין | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה | 5710064 | |
| עיזים נגד עכבר IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה | A11036 | |
| עז נגד ארנב IgG Alexa Fluor 568 | תרמו פישר מדעי, שוורטה, גרמניה | A11001 | |
| HBSS (ללא Ca2+ וללא Mg2+) | תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה | ||
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, הנאו, גרמניה | ||
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה | ||
| 51029882 סרום סוסים | Pan-Biotech, איידנבך, גרמניה | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, בת'סדה, ארה"ב | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | L2020-1MG | |
| לייבוביץ ואקוטי; s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, שוורטה, גרמניה | ||
| L-גלוטמין 200 mM | תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה | ||
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, גרמניה | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה | 15000-08 | |
| מיקרוסקופ | מוטיק, וצלר, גרמניה | מוטיק BA 400 | |
| מיקרוסקופ Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, גרמניה | 491917-0001-000 | |
| שקופית מיקרוסקופ | VWR, רדנור, ארה"ב | 630-1985 | |
| מפריד MiniMACS | Miltenyi Biotec , ברגיש גלדבאך, גרמניה | 130091632 | |
| עמודות MS | Miltenyi Biotec , ברגיש גלדבאך, גרמניה | 130-042-201 | |
| תא ספירת נויבאואר | עוזר, ארלנגן, גרמניה | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, רוקי היל, ארה"ב | 100-03 | |
| מדיום נוירובזאלי | תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה | ||
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | N1408 | |
| סרום עיזים רגיל | Biozol, Eching, גרמניה | S-1000 | |
| Nunclon & Delta; מנות מרובות, 4 באר | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | D6789 | |
| פרפורמלדהיד | אקרוס אורגני, ניו ג'רזי, ארה"ב | ||
| פניצילין/סטרפטומיצין | תרמו פישר מדעי, שוורטה, גרמניה | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, המבורג, גרמניה | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, המבורג, גרמניה | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | P6407-5MG | |
| פולי-L-ליזין | סיגמא אולדריץ' GmbH, שטיינהיים, גרמניה | צינורות תגובה P4707-50ML | |
| , 15 מ"ל | סארסטדט, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| צינורות תגובה, 50 מ"ל | סארסטדט, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| כלי תגובה, 1.5 מ"ל | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| 72690001 ארון בטיחות S2020 1.8 | תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה | ||
| מספריים | Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה | 14083-08 | |
| פיפטה סרולוגית, 10 מ"ל | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| פיפטה סרולוגית, 25 מ"ל | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| פיפטה סרולוגית, 5 מ"ל | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, גרמניה | 495015-0012-000 | |
| מספריים כירורגיים | Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה | 14007-14 | |
| TC צלחת 100, תא + | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| צלחת TC 35, תא + | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| צלחת TC 60, תא + | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | ||
| 833901300 Thy-1 Microbeads (ערכת MACS) | Miltenyi Biotec , ברגיש גלדבאך, גרמניה | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | תמיסת טריפן כחולה X100-500 מ"ל | |
| 0.4% | תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה | ||
| טריפסין (2.5%), ללא פנול אדום | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, גרמניה | 15090-046 | |
| טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום | תרמו פישר סיינטיפיק, שוורטה, גרמניה | 25300-054 | |
| סוג I קולגנאז | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, גרמניה | C1639 | |
| אמבט מים מסוג 1008 | GFL, בורגוודל, גרמניה | 4285 |
מקורות
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
