Summary
Nel sistema di cocoltura dei gangli della radice dorsale e delle cellule di Schwann, può essere studiata la mielinizzazione del sistema nervoso periferico. Questo modello offre opportunità sperimentali per osservare e quantificare la mielinizzazione periferica e per studiare gli effetti dei composti di interesse sulla guaina mielinica.
Abstract
Il processo di mielinizzazione è essenziale per consentire una rapida e sufficiente trasduzione del segnale nel sistema nervoso. Nel sistema nervoso periferico, i neuroni e le cellule di Schwann si impegnano in una complessa interazione per controllare la mielinizzazione degli assoni. I disturbi di questa interazione e la rottura della guaina mielinica sono segni distintivi delle neuropatie infiammatorie e si verificano secondariamente nei disturbi neurodegenerativi. Qui, presentiamo un modello di cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale e cellule di Schwann, che sviluppa una robusta mielinizzazione degli assoni periferici per studiare il processo di mielinizzazione nel sistema nervoso periferico, studiare le interazioni assone-cellule di Schwann e valutare separatamente i potenziali effetti degli agenti terapeutici su ciascun tipo di cellula. Metodologicamente, i gangli delle radici dorsali di ratti embrionali (E13.5) sono stati raccolti, dissociati dal tessuto circostante e coltivati come espianti interi per 3 giorni. Le cellule di Schwann sono state isolate da ratti adulti di 3 settimane e i nervi sciatici sono stati digeriti enzimaticamente. Le cellule di Schwann risultanti sono state purificate mediante selezione cellulare attivata magneticamente e coltivate in condizioni arricchite di neuregulina e forskolina. Dopo 3 giorni di coltura dell'espianto del ganglio della radice dorsale, 30.000 cellule di Schwann sono state aggiunte a un espianto di ganglio della radice dorsale in un mezzo contenente acido ascorbico. I primi segni di mielinizzazione sono stati rilevati il giorno 10 della cocoltura, attraverso segnali sparsi per la proteina basica della mielina nella colorazione immunocitochimica. Dal giorno 14 in poi, le guaine mieliniche si sono formate e propagate lungo gli assoni. La mielinizzazione può essere quantificata dalla colorazione delle proteine basiche della mielina come rapporto tra l'area di mielinizzazione e l'area assone, per tenere conto delle differenze nella densità assonale. Questo modello offre opportunità sperimentali per studiare vari aspetti della mielinizzazione periferica in vitro, che è cruciale per comprendere la patologia e le possibili opportunità di trattamento per la demielinizzazione e la neurodegenerazione nelle malattie infiammatorie e neurodegenerative del sistema nervoso periferico.
Introduction
Nel sistema nervoso periferico (PNS), la rapida trasduzione dell'informazione è mediata da assoni avvolti dalla mielina. La mielinizzazione degli assoni è essenziale per consentire la rapida propagazione degli impulsi elettrici, poiché la velocità di conduzione delle fibre nervose è correlata al diametro dell'assone e allo spessore della mielina1. La segnalazione sensoriale dalla periferia al sistema nervoso centrale (SNC) si basa sull'attivazione di neuroni sensoriali di primo ordine che risiedono negli allargamenti della radice dorsale, chiamati gangli della radice dorsale (DRG). Per la formazione e il mantenimento della mielina, la comunicazione continua tra assoni e cellule di Schwann, che sono le cellule della glia mielinica nel PNS, è obbligatoria2.
Molte malattie del PNS disturbano la trasduzione delle informazioni da parte di danni assonali primari o demielinizzanti, con conseguente ipestesia o disestesia. I neuroni sensoriali di primo ordine hanno la capacità di rigenerarsi in una certa misura dopo il danno neuronale, da una complessa interazione tra il neurone e le cellule di Schwann circostanti3. In questo caso, le cellule di Schwann possono subire una riprogrammazione cellulare per eliminare i detriti assonale e mielinico e promuovere la rigenerazione assonale, con conseguente rimielinizzazione4. Comprendere i meccanismi della mielinizzazione nella salute e nella malattia è importante, al fine di trovare possibili opzioni di trattamento per i disturbi demielinizzanti del PNS. La mielina può anche essere danneggiata da neurotraumi acuti e gli approcci per promuovere la mielinizzazione per far avanzare il recupero funzionale dopo la lesione del nervo periferico sono in fase di indagine5.
La nostra conoscenza della mielinizzazione periferica ha beneficiato in gran parte delle cocolture mieliniche di cellule di Schwann e neuroni sensoriali. Da quando sono stati applicati i primi approcci 6,7,8, la mielinizzazione è stata studiata intensamente con l'uso di diversi sistemi di cocoltura 9,10,11. Qui, forniamo un protocollo rapido e semplice per la mielinizzazione in vitro robusta degli assoni del ganglio della radice dorsale. Il protocollo per la preparazione delle cellule di Schwann si basa sul protocollo di Andersen et al.12, precedentemente pubblicato su Pitarokoili et al.13. Utilizziamo cellule di Schwann derivate da ratti giovani e colture embrionali di espianti DRG per la cocoltura, in cui la mielinizzazione si verifica intorno al giorno 14. L'obiettivo del metodo è quello di fornire un sistema per studiare la formazione di mielina come risultato dell'interazione diretta assone-cellule di Schwann e di studiare i modulatori della mielinizzazione PNS. Rispetto alle colture cellulari neuronali dissociate, gli espianti di DRG sono più anatomicamente conservati e formano lunghi processi assonali. La quantificazione dell'area dell'assone mielinica fornisce una lettura sufficiente per la mielinizzazione nella cocoltura. Il metodo è uno strumento prezioso per lo screening dei composti terapeutici per il loro potenziale effetto sulla mielinizzazione PNS e può anche essere utilizzato in aggiunta agli studi in vivo in modelli animali14.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Coltura cellulare di Schwann
- Rivestimento per coltura cellulare Schwann
- Rivestire i piatti di coltura cellulare in condizioni sterili. Applicare 2 ml di poli-L-lisina (PLL) allo 0,01% su due piatti di coltura tissutale (TC) da 60 mm ciascuno e incubare per una notte a 4 °C.
- Rimuovere il PLL, lavare le stoviglie TC 2x con acqua distillata e incubare con 2 ml di 1 μg/cm2 di laminina per una notte a 4 °C. Lavare i piatti TC 2 volte con acqua dest e lasciare asciugare i piatti all'aria.
- Preparazione media per la coltura cellulare di Schwann
- Preparare 50 ml di terreno cellulare di Schwann aggiungendo il 10% di siero fetale di vitello inattivato dal calore (FCS), 2 μM di forskolina, 10 nM di neuregulina e 50 μg/mL di gentamicina al terreno di Dulbecco Modified Eagle (DMEM) / F-12 (alto glucosio) in condizioni sterili.
- Preparare 70 mL di terreno L-15 di Leibovitz con 50 μg/mL di gentamicina in condizioni sterili.
- Preparazione del nervo sciatico
NOTA: Tutte le fasi di preparazione del nervo sciatico vengono eseguite sotto una panca pulita.- Preparare un piatto TC da 100 mm con 5 ml di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco ghiacciata (DPBS) senza Ca 2+ e Mg2+, una capsula TC da 100 mm con 5 ml di terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato e una capsula TC da 100 mm con 5 ml di terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato e 50 μg/mL di gentamicina.
- Pulire tutti gli strumenti in autoclave. Spruzzare gli strumenti e l'area di lavoro con etanolo al 70%.
- Eutanasia cinque ratti Sprague Dawley maschi di 3 settimane usando l'inalazione e la decapitazione di CO2 . Spruzzare il torso del ratto con etanolo al 70%.
- Aprire l'arto inferiore sinistro dorsale con le forbici e rimuovere con cura il muscolo bicipite femorale. Allentare il nervo sciatico con un'elevazione liscia con una pinza curva, assicurandosi di non ferire il nervo.
- Tenere la parte più prossimale del nervo con la pinza curva per raddrizzare il nervo e tagliare il nervo il più in alto possibile usando le forbici. Quindi, tagliare il nervo vicino al plesso sacrale e la zampa con le forbici. Ripetere i passaggi 1.3.4-1.3.5 per il lato destro.
NOTA: Durante l'apertura dell'arto, fare attenzione a non lividi nei vasi sanguigni. - Usando una pinza, metti i nervi sciatici sinistro e destro in un piatto TC da 100 mm con DPBS ghiacciato.
- Ristrutturazione del nervo sciatico
- Utilizzare una pinza per trasferire tutti i nervi in un piatto TC da 100 mm con terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato e gentamicina da 50 μg/ml. Continuare a utilizzare uno stereomicroscopio e rimuovere grasso, muscoli e vasi sanguigni dai nervi con due paia di pinze sottili. Afferrare i nervi con una pinza e trasferirli su un piatto TC da 100 mm con il mezzo L-15 di Leibovitz ghiacciato.
- Identificare le estremità prossimali e distali del nervo sciatico. Rimuovere l'epineurium con un paio di pinze fini in direzione da prossimale a distale, tenendo l'estremità del nervo prossimale con il secondo paio di pinze sottili.
- Trasferire i nervi purificati in un piatto TC da 100 mm con terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato e gentamicina da 50 μg/ml. Prendere in giro i fasci nervosi isolati per separare e isolare singole fibre nervose usando due paia di pinze sottili.
- Trasferire le fibre nervose in un tubo da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL e occupare il minor mezzo possibile. Aggiungere 50 ml di terreno L-15 di Leibovitz con 50 μg/mL di gentamicina alle fibre nervose e uccidere alcune volte nel tubo da 50 ml.
- Digestione enzimatica del nervo sciatico
NOTA: i passaggi successivi (passaggi 1.5-1.8, 2.1 e 2.2) vengono eseguiti in condizioni sterili.- Preparare la soluzione di digestione enzimatica contenente 0,25% dispasi II, 0,05% collagenasi di tipo I e 50 μg/mL di gentamicina in 10 mL di DMEM (alto contenuto di glucosio).
- Centrifugare il tubo a 188 x g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica da 25 ml e trasferire il pellet con il terreno L-15 rimanente di Leibovitz in un piatto TC da 60 mm utilizzando una pipetta da 1.000 ml.
- Risciacquare il tubo da 50 mL con 10 mL della soluzione di digestione enzimatica e aggiungerlo al piatto contenente le fibre nervose. Distribuire con cura il fazzoletto nel piatto con la punta di una pipetta per massimizzare la superficie accessibile per la digestione.
- Incubare a 37 °C e 5% di CO 2 per 18 ore e interrompere la digestione aggiungendo 10 ml di FCS al 40% nella soluzione salina bilanciata di Hanks, senza Ca2 e Mg2+ (HBSS).
- Separazione cellulare
- Trasferire i nervi digeriti in una provetta da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica e centrifugare a 188 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di DMEM contenente il 10% di FCS e 50 μg/mL di gentamicina. Risospendere il pellet 20 volte successivamente, utilizzando una punta per pipetta da 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml e 200 μL.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 μm e centrifugare a 188 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 4 ml di DMEM contenente il 10% di FCS e 50 μg/mL di gentamicina.
- Aggiungere 2 mL di sospensione cellulare a ciascuna delle due piastre TC da 60 mm rivestite di PLL e laminina e incubare a 37 °C e al 5% di CO2. Lasciare intatte le piastre per 2 giorni nell'incubatore per proteggere le cellule dalle sollecitazioni meccaniche e per sostenere l'aderenza.
- Differenziazione cellulare di Schwann
- Dopo 2 giorni, rimuovere il mezzo e sciacquare accuratamente le piastre 2 volte con DMEM (alto glucosio), 10% FCS e 50 μg / mL di gentamicina. Successivamente, aggiungere 2 ml di mezzo cellulare di Schwann. Sostituire il mezzo cellulare di Schwann ogni 2° giorno e osservare l'aspetto e la confluenza cellulare utilizzando un microscopio.
NOTA: Le cellule di Schwann e gli espianti di DRG devono essere preparati in modo tempestivo e coordinato per la cocoltura. Assicurarsi che un ratto con embrioni a E 13,5 sia disponibile per la preparazione di DRG quando le cellule di Schwann sono vicine a una confluenza dell'80%.
- Dopo 2 giorni, rimuovere il mezzo e sciacquare accuratamente le piastre 2 volte con DMEM (alto glucosio), 10% FCS e 50 μg / mL di gentamicina. Successivamente, aggiungere 2 ml di mezzo cellulare di Schwann. Sostituire il mezzo cellulare di Schwann ogni 2° giorno e osservare l'aspetto e la confluenza cellulare utilizzando un microscopio.
- Tripsinizzazione cellulare e separazione magnetica
NOTA: Per immagini esemplari di diversi stadi di coltura cellulare di Schwann, vedere la Figura supplementare 1.- Quando le cellule raggiungono una confluenza di circa l'80% (6-12 giorni di coltura), lavare accuratamente le piastre 2 volte con 3 ml di DPBS e incubare con 2 ml di tripsina/EDTA allo 0,05% (preriscaldato a 37 °C) per 3 minuti. Quando le cellule si staccano dal fondo della piastra, inattivare la digestione con l'aggiunta di 2 ml di DMEM con FCS al 10% e 50 μg / mL di gentamicina.
NOTA: attenersi a un tempo di tripsinizzazione di 3 minuti e procedere rapidamente in seguito. - Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di tampone magnetico di separazione cellulare contenente DPBS con albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA) e 2 nM EDTA. Combinare 10 μL della sospensione cellulare con 10 μL di blu tripano e contare le cellule utilizzando una camera di colorazione.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 188 x g per 10 minuti a 4 °C e risospendere il pellet cellulare in 90 μL di tampone di separazione magnetica per 1 x 107 cellule. Aggiungere 10 μL di microsfere Thy-1 per 1 x 107 cellule. Risospendere la soluzione alcune volte e incubare per 15 minuti al buio a 8 °C.
- Aggiungere 2 mL del tampone di separazione magnetica alla sospensione della cella e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone di separazione magnetica cellulare.
- Inumidire la colonna di separazione delle celle magnetiche con 1 mL del tampone di separazione della cella magnetica. Posizionare la colonna di separazione delle celle magnetiche nel separatore di celle magnetiche. Applicare le celle alla colonna di separazione delle celle magnetiche. Raccogliere il flusso e centrifugare a 300 x g a 4 °C per 10 minuti.
NOTA: I fibroblasti sono selezionati positivamente e rimangono nella colonna, mentre le cellule di Schwann passano la colonna. I fibroblasti possono essere raccolti con un timbro (ad esempio, come controllo negativo per i protocolli di colorazione delle cellule di Schwann). - Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL del terreno di coltura (cfr. punto 3.1.1). Contare le cellule dopo la colorazione con tripano blu e una camera di colorazione.
- Quando le cellule raggiungono una confluenza di circa l'80% (6-12 giorni di coltura), lavare accuratamente le piastre 2 volte con 3 ml di DPBS e incubare con 2 ml di tripsina/EDTA allo 0,05% (preriscaldato a 37 °C) per 3 minuti. Quando le cellule si staccano dal fondo della piastra, inattivare la digestione con l'aggiunta di 2 ml di DMEM con FCS al 10% e 50 μg / mL di gentamicina.
2. Coltura di espianti DRG
- Preparazione del terreno di crescita DRG
- Preparare il terreno di crescita DRG aggiungendo il 2% di B27, il 2% di siero di cavallo, l'1% di L-glutammina, lo 0,5% di penicillina / streptomicina e il fattore di crescita del nervo (NGF) 10 ng / mL al mezzo neurobasale. Conservare il terreno di coltura a 4 °C.
NOTA: Il terreno di coltura può essere utilizzato per 2 giorni.
- Preparare il terreno di crescita DRG aggiungendo il 2% di B27, il 2% di siero di cavallo, l'1% di L-glutammina, lo 0,5% di penicillina / streptomicina e il fattore di crescita del nervo (NGF) 10 ng / mL al mezzo neurobasale. Conservare il terreno di coltura a 4 °C.
- Rivestimento per espianti DRG
- Incubare i coprivetrini in etanolo al 70% per 1 ora e metterli nei pozzetti di piatti a 4 pozzetti usando una pinza curva. Dopo che l'etanolo si è asciugato, applicare 300 μL di 0,2 mg/ml di poli-D-lisina (PDL) per pozzetto e incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO2.
- Lavare i vetrini 3 volte per 5 minuti ciascuno con DPBS consecutivamente. Togliere il DPBS, applicare 300 μL di 1 μg/mL di laminina sui vetrini di copertura e incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO2.
- Dopo tre fasi di lavaggio con DPBS per 5 minuti, sostituire il DPBS con 190 μL di terreno di coltura DRG. Posizionare le piastre a 4 pozzetti nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
- Preparazione DRG
NOTA: Raccogliere il DRG di ratti embrionali sotto un banco pulito.- Prima della preparazione, pulire tutti gli strumenti con etanolo al 70%. Riempire 10 (due per embrione) piatti TC da 35 mm con 2 ml di HBSS ghiacciato per piatto e due piatti TC da 100 mm con 5 ml di HBSS ghiacciato per piatto.
- Eutanasia dei ratti gravidi (femmine adulte di ratti Sprague Dawley, E13.5) mediante inalazione e decapitazione di CO2 .
- Spruzzare il corpo con etanolo al 70% e aprire il busto ventrale del ratto. Rimuovere con cura l'utero e inserirlo in un piatto TC da 100 mm con HBSS ghiacciato.
- Tenere l'utero con una pinza curva e aprire la parete dell'utero con una pinza fine. Rimuovere un sacco amniotico e aprirlo con attenzione pizzicando un foro con una pinza sottile.
- Rimuovere l'embrione dai tessuti circostanti, tagliare il cordone ombelicale e decapitare l'embrione usando una pinza sottile. Posizionare il busto in un piatto TC da 100 mm riempito con HBSS usando una pinza curva e una spatola.
- Rimuovere rapidamente tutti gli embrioni dall'utero e trasferirli in un piatto TC da 100 mm riempito con HBSS. Se ci sono più di cinque embrioni, preparare un ulteriore piatto TC da 35 mm con 2 ml di HBSS, secondo il punto 2.3.1.
- Posizionare delicatamente un tronco embrionale in un piatto TC da 35 mm riempito con HBSS usando una spatola e una pinza curva. Sotto uno stereomicroscopio, aprire la parte dorsale del busto per dividere l'embrione in due metà usando una pinza sottile e micro forbici. Girare una metà di lato e identificare il filamento di DRG situato in una linea nella parte dorsale dell'embrione.
- Ritagliare il DRG nel suo insieme usando una pinza fine e micro forbici. Posizionare il DRG in un piatto TC fresco da 35 mm riempito con 2 ml di HBSS e separare un singolo DRG dal tessuto rimanente usando una pinza fine e microforbici.
- Coltura cellulare DRG
- Prelevare piastre a 4 pozzetti contenenti 190 μL di terreno di coltura DRG dall'incubatore al banco pulito dove devono essere preparati i DRG. Trasferire con cura un singolo DRG in un pozzetto di una piastra di coltura a 4 pozzetti usando una pinza fine e una spatola. Posizionare il DRG al centro di ciascun pozzetto, poiché una posizione centrale è importante per il fissaggio del DRG.
- Lavorare in condizioni sterili d'ora in poi. Porre le colture espiantate nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. Il giorno successivo, aggiungere attentamente 50 μL del terreno di coltura DRG a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta da 100 ml.
- Osservare l'aderenza all'espianto DRG e la crescita degli assoni usando un microscopio ogni giorno e scartare gli espianti DRG che si sono staccati dal coprislip o non sono riusciti a superare gli assoni il giorno 3 della coltura.
NOTA: Gli espianti DRG sono molto fragili nei primi giorni di coltura e devono essere maneggiati con cura, specialmente quando si spostano le piastre dentro e fuori dall'incubatore quando il terreno viene cambiato, o anche quando si chiude la porta dell'incubatore. Il volume preciso di 190 μL di terreno per pozzetto è fondamentale per mantenere gli espianti DRG in posizione durante il primo giorno di coltura. Gli espianti di DRG sciolti possono essere identificati facilmente durante il controllo quotidiano, poiché nuotano nel mezzo invece di aderire al coprifoglio.
3. Cocultura
- Trasferimento di cellule di Schwann alla coltura di espianti DRG
- Preparare il terreno di cocoltura aggiungendo lo 0,1% di acido ascorbico al terreno di coltura DRG.
- Il giorno 3 della coltura di espianto DRG, sostituire con cura il terreno di coltura DRG con 250 μL del terreno di coltura contenente 30.000 cellule di Schwann (dal punto 1.8) per pozzetto.
- Mantenere la cocoltura degli espianti DRG e delle cellule di Schwann per un massimo di 22 giorni. Sostituire attentamente 250 μL del terreno di coltura a giorni alterni e osservare l'aspetto delle cellule usando un microscopio.
NOTA: Per un esempio di assoni DRG e cellule di Schwann nella cocoltura nei primi giorni di coltura, vedere la Figura 1.
- Colorazione immunocitochimica
NOTA: Maneggiare i campioni di cocoltura con estrema attenzione durante la procedura di colorazione, poiché possono essere danneggiati facilmente.- Per fissare le cellule sui vetrini, rimuovere lentamente il substrato, lavare accuratamente 3 volte con DPBS e incubare in paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti. Sostituire il PFA con DPBS e conservare le celle fisse a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
ATTENZIONE: Quando si maneggia il 4% di PFA, indossare i dispositivi di protezione individuale raccomandati. - Lavare i vetrini 3 volte con DPBS per 5 minuti, quindi bloccare con soluzione bloccante (siero di capra al 10%, albumina sierica bovina al 10% [BSA], gelatina allo 0,1% e Triton X-100 allo 0,05%) in DPBS per 1 ora. Diluire gli anticorpi primari βIII-tubulina (1:7.500) e la proteina basica della mielina (MBP) (1:750) nella soluzione bloccante e incubare per una notte a 4 °C.
- Lavare le celle 3 volte con DPBS per 5 minuti. Utilizzare anticorpi secondari coniugati con coloranti fluorescenti in una diluizione di 1:1.000 in soluzione bloccante e incubare per 2 ore a temperatura ambiente (RT).
- Lavare le cellule 3 volte con DPBS per 5 minuti e montare le cellule su vetrini microscopici con mezzo di montaggio a fluorescenza, incluso 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Conservare i vetrini al buio a 4 °C fino a documentazione microscopica.
ATTENZIONE: Quando si maneggia il mezzo di montaggio a fluorescenza, indossare i dispositivi di protezione individuale raccomandati.
- Per fissare le cellule sui vetrini, rimuovere lentamente il substrato, lavare accuratamente 3 volte con DPBS e incubare in paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti. Sostituire il PFA con DPBS e conservare le celle fisse a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
- Analisi
- Scatta foto di otto regioni definite che circondano l'espianto DRG al centro usando un microscopio invertito.
- Utilizzare un'applicazione software di analisi delle immagini per quantificare le aree degli assoni positivi alla tubulina βIII e della mielinizzazione colorata da MBP.
- Calcolare la percentuale di mielinizzazione come rapporto tra assoni mielinizzati e assoni non mielinici.
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Representative Results
La mielinizzazione nella cocultura è stata valutata nei giorni 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Gli espianti DRG e le cellule di Schwann sono stati colorati per MBP, βIII-tubulina e DAPI. La rete assonale nella cocultura era densa e non cambiava visibilmente nel corso dell'osservazione. I primi segni di mielina, sotto forma di piccoli frammenti, erano rilevabili il giorno 10 e aumentavano il giorno 12 (Figura 2). Le aree MBP-positive sono aumentate nel tempo fino al giorno 20 della cultura. La mielinizzazione è stata quantificata come rapporto tra le aree MBP e βIII-tubulina positiva. La mielinizzazione è aumentata significativamente nei giorni 18 e 20 rispetto al giorno 10 (Figura 3; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).
Figura 1: Comparsa delle cellule di Schwann e degli assoni nella cocoltura. Quadro esemplare della cocultura del giorno 3. Le frecce nere mostrano sottili assoni DRG e la freccia bianca indica una cella di Schwann con una morfologia allungata e a forma di fuso attaccata a un assone. Barra scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Mielinizzazione in una cocoltura di espianti di DRG e cellule di Schwann. La colorazione per il marcatore neuronale βIII-tubulina e MBP è stata eseguita nei giorni 10, 12, 14, 16, 18 e 20, dopo aver unito entrambe le colture per studiare lo sviluppo della mielinizzazione nella cocoltura. I primi segni di mielinizzazione erano visibili nei giorni 10 e 12 della cocultura. Dal giorno 14 in poi, il segnale MBP è stato più pronunciato e sono stati rilevati assoni avvolti nella mielina. La mielinizzazione è aumentata con il tempo della cocultura fino al giorno 20. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Quantificazione della mielinizzazione. Nei giorni 10, 12, 14, 16, 18 e 20 della cocoltura, la mielinizzazione è stata valutata colorando gli assoni con βIII-tubulina e la mielina con MBP. La percentuale di assoni mielinizzati è stata determinata calcolando il rapporto tra le aree MBP positive e βIII-tubulina. Differenze significative sono state rilevate nei giorni 18 e 20 rispetto al giorno 10 della cocultura. I dati sono espressi come media ± SEM; n = 3. ANOVA unidirezionale con Kruskal-Wallis e test post-hoc di confronto multiplo di Dunn. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Fasi della coltura cellulare di Schwann. Immagini esemplari in campo chiaro di cellule di Schwann in coltura (A) prima e (B) dopo la separazione magnetica delle cellule. Prima della separazione cellulare magnetica, la coltura comprende cellule di Schwann con una morfologia allungata e a forma di fuso, fibroblasti piatti e diffusi e resti di tessuto connettivo. Per ottenere una coltura più pura delle cellule di Schwann, viene eseguita la separazione magnetica delle cellule. Barre scala: 200 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Mielinizzazione degli espianti di DRG con e senza cellule di Schwann aggiuntive. L'area colorata MBP è stata utilizzata per misurare la mielinizzazione nella cocultura il giorno 14. La mielinizzazione degli espianti di DRG è aumentata significativamente se le cellule di Schwann sono state aggiunte alla coltura (test t spaiato, **p ≤ 0,01). n = 3. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Analisi dell'espressione genica nella cocoltura. I livelli relativi di espressione genica di MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 e Olig1 sono stati analizzati in campioni di cocoltura il giorno 22 mediante qPCR (A). MBP e PMP22 erano i bersagli con i più alti livelli di espressione genica nella cocoltura. Un quadro esemplare dei prodotti di amplificazione qPCR applicati ad un gel di agarosio dimostra l'abbondanza qualitativa dei bersagli (B). La prima e l'ultima corsia sul gel rappresentano una scala di DNA (100 coppie di basi). n = 5. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Qui, presentiamo un protocollo rapido e facile per la generazione di mielinizzazione in vitro fondendo due colture di tipo cellulare separate, cellule di Schwann e espianti di ganglio della radice dorsale.
Un passaggio critico del protocollo è la coltivazione di espianti DRG, soprattutto nei primi giorni di coltura. I DRG sono molto fragili prima che venga costruita una forte rete assonale e devono essere maneggiati con molta attenzione, ad esempio, quando vengono estratti dall'incubatore o durante un cambio di mezzo. DRG che si staccano dal fondo del pozzo e si trovano a nuotare nel mezzo mostrano una coltivazione infruttuosa. Per le cellule di Schwann, il cambiamento dei tassi di proliferazione a causa di diverse condizioni di coltivazione e integratori (ad esempio, siero nel mezzo) può rappresentare una sfida per la cocoltura. Se la coltura è ricoperta da un numero eccessivo di cellule di Schwann, si stacca dal fondo del pozzo e diventa inutilizzabile. Si raccomanda pertanto una titolazione del numero di cellule di Schwann nella coltura. Durante la definizione del protocollo cellulare di Schwann, devono essere eseguiti test di purezza, utilizzando l'immunocolorazione SOX10 o S100. In generale, la manipolazione della coltura, compreso il cambio del mezzo e le fasi di lavaggio e fissaggio, devono essere eseguite con attenzione per garantire un risultato positivo. È importante selezionare il punto temporale di osservazione in base all'interesse della ricerca; Il giorno 14 rappresenta il punto di partenza per i primi assoni mielinici densi, e quindi può essere selezionato come punto di osservazione temporale per l'inizio della mielinizzazione, mentre i punti temporali successivi offrono guaine mieliniche più complete.
Poiché questo metodo in vitro di mielinizzazione comprende solo cellule DRG e Schwann, non assomiglia esattamente al processo di mielinizzazione nell'organismo. Altri fattori che contribuiscono, come il tessuto circostante, il microambiente, le cellule immunitarie e la segnalazione da strutture distanti, non sono rappresentati in questo modello. Tuttavia, questo metodo fornisce un modello adatto per studiare la mielinizzazione del PNS mediante l'analisi separata e la manipolazione di entrambi i tipi di cellule 9,15,16. Le cellule di Schwann o DRG per la cocoltura possono essere raccolte da animali malati o trattati per decifrare il contributo del tipo di cellula specifica17,18. Quando si utilizzano le ultime fasi di questa configurazione, si consiglia vivamente di includere una condizione di controllo senza aggiungere ulteriori celle di Schwann, per escludere i possibili effetti delle celle di Schwann derivate da DRG. Nella nostra esperienza, la mielinizzazione negli espianti di DRG senza cellule di Schwann viene rilevata in misura significativamente minore rispetto alla cocoltura (Figura supplementare 2).
L'uso di espianti DRG offre il vantaggio di un'architettura strutturale intatta rispetto alle colture neuronali dissociate. La colorazione immunofluorescente della proteina basica della mielina (MBP) consente di quantificare l'area degli assoni mielinici e fornisce una lettura sufficiente per la mielinizzazione nella cocoltura. L'analisi dell'espressione genica dei campioni di cocoltura il giorno 22 ha rivelato la presenza di MBP, proteina mielinica periferica (PMP22), glicoproteina associata alla mielina (MAG), fattore legante l'ottamero 6 (Oct6), gene 2 correlato all'ETS (Erg2) e fattore di trascrizione degli oligodendrociti 1 (Olig1), con i più alti livelli di espressione per MBP e PMP22 (Figura supplementare 3). Quindi, il protocollo descritto fornisce un metodo con diverse opzioni target per i marcatori di mielinizzazione nella cocultura.
Le potenziali applicazioni di questo metodo includono approcci di ricerca di base sul processo di mielinizzazione nella periferia, nonché la convalida di composti terapeutici per le malattie del PNS, incluso il danno della mielina.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il Prof. Dr. Ralf Gold e il PD Dr. Gisa Ellrichmann per i loro consigli e supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
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