Summary
후근 신경절과 슈반 세포의 공동 배양 시스템에서 말초 신경계의 수초화를 연구 할 수 있습니다. 이 모델은 말초 수초화를 관찰 및 정량화하고 미엘린 외피에 대한 관심 화합물의 효과를 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다.
Abstract
수초화 과정은 신경계에서 빠르고 충분한 신호 전달을 가능하게 하는 데 필수적입니다. 말초 신경계에서 뉴런과 슈반 세포는 축삭의 수초화를 제어하기 위해 복잡한 상호 작용에 관여합니다. 이러한 상호 작용의 교란과 수초의 파괴는 염증성 신경병증의 특징이며 신경퇴행성 장애에서 이차적으로 발생합니다. 여기에서 우리는 말초 신경계의 수초화 과정을 조사하고, 축삭-슈반 세포 상호 작용을 연구하고, 각 세포 유형에 대한 치료제의 잠재적 효과를 개별적으로 평가하기 위해 말초 축삭의 강력한 수초화를 개발하는 후근 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양 모델을 제시합니다. 방법론적으로, 배아 쥐(E13.5)의 등쪽 뿌리 신경절을 수확하고, 주변 조직으로부터 해리시키고, 3일 동안 전체 외식편으로 배양하였다. 슈반 세포는 3 주령의 성인 쥐로부터 분리되었고, 좌골 신경은 효소에 의해 소화되었다. 생성된 슈반 세포는 자기 활성화 세포 분류에 의해 정제되고 뉴레귤린 및 포스콜린이 풍부한 조건 하에서 배양되었습니다. 후근 신경절 외식편 배양 3일 후, 30,000개의 슈반 세포를 아스코르브산을 함유하는 배지에서 하나의 후근 신경절 외식편에 첨가했습니다. 수초화의 첫 징후는 면역세포화학적 염색에서 미엘린 염기성 단백질에 대한 산란 신호를 통해 공동 배양 10일째에 검출되었습니다. 14일째부터 수초가 형성되어 축삭을 따라 전파되었습니다. 수초화는 축삭 밀도의 차이를 설명하기 위해 수초화 면적과 축삭 면적의 비율로 미엘린 염기성 단백질 염색으로 정량화할 수 있습니다. 이 모델은 시험관 내에서 말초 수초화의 다양한 측면을 연구할 수 있는 실험 기회를 제공하며, 이는 말초 신경계의 염증 및 신경퇴행성 질환에서 탈수초화 및 신경변성의 병리와 가능한 치료 기회를 이해하는 데 중요합니다.
Introduction
말초 신경계(PNS)에서 빠른 정보 전달은 미엘린으로 둘러싸인 축삭에 의해 매개됩니다. 축삭의 수초화는 전기 자극의 빠른 전파를 가능하게 하는 데 필수적인데, 이는 신경 섬유의 전도 속도가 축삭 직경 및 미엘린 두께와 상관관계가 있기 때문입니다1. 말초에서 중추신경계(CNS)로의 감각 신호 전달은 후근 신경절(DRG)이라고 하는 후근의 확대에 존재하는 1차 감각 뉴런의 활성화에 의존합니다. 미엘린의 형성과 유지를 위해, PNS의 수초화 신경교세포인 축삭과 슈반 세포 사이의 지속적인 소통은 필수적이다2.
PNS의 많은 질병은 일차 축삭 또는 탈수초 손상에 의한 정보 전달을 방해하여 감각 이상 또는 감각 이상을 유발합니다. 1차 감각 뉴런은 뉴런 손상 후 뉴런과 주변 슈반 세포 사이의 복잡한 상호작용에 의해 어느 정도 재생될 수 있는 능력을 가지고 있다3. 이 경우, 슈반 세포는 세포 재프로그래밍을 통해 축삭 및 미엘린 파편을 제거하고 축삭 재생을 촉진하여 재수초화를 일으킬 수 있다4. PNS의 탈수초성 장애에 대한 가능한 치료 옵션을 찾기 위해서는 건강과 질병에서 수초화의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 미엘린은 또한 급성 신경외상에 의해 손상될 수 있으며, 말초 신경 손상 후 기능 회복을 촉진하기 위해 수초화를 촉진하는 접근법이 연구 중이다5.
말초 수초화에 대한 우리의 지식은 Schwann 세포와 감각 뉴런의 수초 공배양으로부터 크게 도움이 되었습니다. 첫 번째 접근법이 적용된 이래로 6,7,8, 수초화는 다른 공동 배양 시스템 9,10,11을 사용하여 집중적으로 연구되었습니다. 여기에서 우리는 후근 신경절 축삭의 강력한 시험관 내 수초화를 위한 빠르고 쉬운 프로토콜을 제공합니다. Schwann 세포 준비를 위한 프로토콜은 이전에 Pitarokoili et al.13에 발표된 Andersen et al.12의 프로토콜을 기반으로 합니다. 우리는 어린 쥐에서 유래한 Schwann 세포와 배아 DRG 외식편 배양을 사용하여 공동 배양을 수행하며, 이 배양에서 수초화가 약 14일에 발생합니다. 이 방법의 목표는 직접적인 축삭-슈반 세포 상호작용의 결과로서 미엘린의 형성을 조사하는 시스템을 제공하고, PNS 수초화의 조절제를 연구하는 것이다. 해리된 신경 세포 배양과 비교하여 DRG 외식편은 해부학적으로 더 보존되고 긴 축삭 돌기를 형성합니다. 수초화된 축삭 영역의 정량화는 공배양에서 수초화에 대한 충분한 판독값을 제공합니다. 상기 방법은 PNS 수초화에 대한 그의 잠재적 효과에 대해 치료 화합물을 스크리닝하는 데 유용한 도구이며, 또한 동물 모델에서 생체내 연구 이외에 활용될 수 있다14.
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Protocol
모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 공동체 협의회 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 슈반 세포 배양
- Schwann 세포 배양용 코팅
- 무균 상태에서 세포 배양 접시를 코팅합니다. 0.01% 폴리-L-라이신(PLL) 2mL를 각각 2개의 60mm 조직 배양(TC) 접시에 바르고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- PLL을 제거하고 TC 접시를 증류수로 2배 세척한 다음 4°C에서 밤새 1μg/cm2 라미닌 2mL와 함께 배양합니다. TC 접시를 아쿠아 데스트로 2번 씻고 접시를 자연 건조시킵니다.
- Schwann 세포 배양을 위한 배지 준비
- 멸균 조건에서 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)/F-12(고포도당)에 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS), 2μM 포스콜린, 10nM 뉴레굴린 및 50μg/mL 겐타마이신을 추가하여 50mL의 Schwann 세포 배지를 준비합니다.
- 멸균 조건에서 70μg/mL 겐타마이신으로 Leibovitz의 L-15 배지 50mL를 준비합니다.
- 좌골 신경 준비
알림: 모든 좌골 신경 준비 단계는 깨끗한 벤치에서 수행됩니다.- Ca 2+ 및 Mg2+가 없는 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL가 포함된 100mm TC 접시 1개, 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지 5mL가 포함된 100mm TC 접시 1개, 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지 50mL와 겐타마이신 50μg/mL가 포함된 100mm TC 접시 1개를 준비합니다.
- 고압증기멸균으로 모든 기구를 청소하십시오. 기구와 작업 공간에 70% 에탄올을 뿌립니다.
- CO2 흡입 및 참수를 사용하여 3주령의 수컷 Sprague Dawley 쥐 5마리를 안락사시킵니다. 쥐의 몸통에 70 % 에탄올을 뿌립니다.
- 가위로 등쪽 좌측을 열고 이두근 대퇴골 근육을 조심스럽게 제거합니다. 구부러진 집게로 부드럽게 올리면 좌골 신경을 풀어 신경을 멍들게하지 않도록하십시오.
- 구부러진 집게로 신경의 가장 근위 부분을 잡고 신경을 곧게 펴고 가위를 사용하여 신경을 최대한 높게 자릅니다. 그런 다음 가위로 천골 신경총과 발에 가까운 신경을 잘라냅니다. 오른쪽에 대해 1.3.4-1.3.5단계를 반복합니다.
알림: 팔다리를 열 때 혈관에 멍이 들지 않도록 주의하십시오. - 집게를 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 좌골 신경을 얼음처럼 차가운 DPBS가 있는 100mm TC 접시에 넣습니다.
- 좌골 신경 재건
- 집게를 사용하여 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-100 배지와 15 μg/mL 겐타마이신이 있는 50mm TC 접시에 모든 신경을 옮깁니다. 실체 현미경을 계속 사용하고 두 쌍의 미세 집게로 신경에서 지방, 근육 및 혈관을 제거합니다. 집게로 신경을 잡고 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-100 매체가 있는 15mm TC 접시에 옮깁니다.
- 좌골 신경의 근위부와 말단부를 확인하십시오. 한 쌍의 미세 집게로 근위부에서 원위 방향으로 한 쌍의 미세 집게로 신경외막을 제거하고 두 번째 쌍의 미세 집게로 근위 신경 끝을 유지합니다.
- 정제된 신경을 얼음처럼 차가운 Leibovitz의 L-15 배지와 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 100mm TC 접시에 옮깁니다. 두 쌍의 미세 집게를 사용하여 단일 신경 섬유를 분리하고 분리하기 위해 분리된 신경 다발을 애타게 합니다.
- 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 신경 섬유를 50mL 튜브로 옮기고 가능한 한 적은 배지를 차지합니다. 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 Leibovitz의 L-15 배지 50mL를 신경 섬유에 넣고 50mL 튜브에서 몇 번 죽였습니다.
- 좌골 신경의 효소 소화
알림: 다음 단계(단계 1.5-1.8, 2.1 및 2.2)는 무균 조건에서 수행됩니다.- 10mL의 DMEM(고포도당)에 0.25% dispase II, 0.05% type I collagenase 및 50μg/mL gentamycin을 포함하는 효소 분해 용액을 준비합니다.
- 튜브를 4°C에서 5분 동안 188 x g 로 원심분리하고, 25mL 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고, 1,000mL 피펫을 사용하여 나머지 Leibovitz의 L-15 배지와 함께 펠릿을 60mm TC 접시에 옮깁니다.
- 50mL 튜브를 효소 분해 용액 10mL로 헹구고 신경 섬유가 들어있는 접시에 넣습니다. 소화를 위해 접근 가능한 표면을 최대화하기 위해 피펫의 끝으로 접시의 조직을 조심스럽게 분배하십시오.
- 37°C 및 5% CO2에서 18시간 동안 인큐베이션하고,Ca2 및Mg2+ (HBSS) 없이 행크스 평형염 용액에 40% FCS 10mL를 첨가하여 소화를 중지시킨다.
- 세포 분리
- 소화된 신경을 혈청학적 피펫과 원심분리기를 사용하여 50°C에서 10분 동안 188 x g 에서 4mL 튜브로 옮깁니다. 상층액을 버리고 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 10mL의 DMEM에 펠릿을 재현탁합니다. 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL 및 200 μL 피펫 팁을 사용하여 펠렛을 20회 재현탁합니다.
- 세포 현탁액을 100 μm 세포 여과기를 통해 여과하고, 4°C에서 10분 동안 188 x g 에서 원심분리하였다. 상층액을 버리고 10% FCS와 50μg/mL 겐타마이신을 함유한 4mL의 DMEM으로 펠릿을 재현탁합니다.
- 2 mL의 세포 현탁액을 2개의 PLL- 및 라미닌-코팅된 60 mm TC 디쉬 각각에 첨가하고, 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이션한다. 인큐베이터에서 2 일 동안 플레이트를 그대로 두어 세포를 기계적 스트레스로부터 보호하고 부착을 지원합니다.
- 슈반 세포 분화
- 2일 후 배지를 제거하고 DMEM(고포도당), 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신으로 플레이트를 2배 조심스럽게 헹굽니다. 그런 다음 Schwann 세포 배지 2mL를 추가합니다. Schwann 세포 배지를 2일마다 교체하고 현미경을 사용하여 세포 모양과 밀도를 관찰합니다.
참고: Schwann 세포와 DRG 외식편은 공동 배양을 위해 시기 적절하고 조정된 방식으로 준비되어야 합니다. Schwann 세포가 80%의 합류도에 가까울 때 E 13.5의 배아가 있는 쥐가 DRG 준비에 사용할 수 있는지 확인하십시오.
- 2일 후 배지를 제거하고 DMEM(고포도당), 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신으로 플레이트를 2배 조심스럽게 헹굽니다. 그런 다음 Schwann 세포 배지 2mL를 추가합니다. Schwann 세포 배지를 2일마다 교체하고 현미경을 사용하여 세포 모양과 밀도를 관찰합니다.
- 세포 트립신 처리 및 자기 분리
참고: 다양한 Schwann 세포 배양 단계의 예시 사진은 보충 그림 1을 참조하십시오.- 세포가 약 80%(배양 6-12일)의 밀도에 도달하면 플레이트를 3mL의 DPBS로 2배 조심스럽게 세척하고 2mL의 0.05% 트립신/EDTA(37°C로 예열)와 함께 3분 동안 배양합니다. 세포가 플레이트 바닥에서 분리되면 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 DMEM 2mL를 추가하여 소화를 비활성화합니다.
알림: 트립신 처리 시간을 엄격하게 3분으로 유지하고 그 후 빠르게 진행하십시오. - 0.5% 소혈청알부민(BSA) 및 2nM EDTA가 포함된 DPBS를 포함하는 2mL의 자기 세포 분리 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 10 μL의 세포 현탁액과 10 μL의 트리판 블루를 결합하고 염색 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.
- 세포 현탁액을 4°C에서 10분 동안 188 x g 에서 원심분리하고, 세포 펠릿을 1 x 10 7 세포 당 90 μL의자기 세포 분리 완충액에 재현탁시킨다. 1 x 107 세포당 10 μL의 Thy-1 마이크로비드를 추가합니다. 용액을 몇 번 재현탁하고 8°C의 암실에서 15분 동안 배양합니다.
- 2mL의 자기 세포 분리 완충액을 세포 현탁액에 넣고 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 자기 세포 분리 완충액에 재현탁합니다.
- 자성 세포 분리 컬럼에 1mL의 자성 세포 분리 완충액을 적십니다. 자기 셀 분리 컬럼을 자기 셀 분리기에 놓습니다. 셀을 자성 셀 분리 컬럼에 적용합니다. 흐름을 수집하고 4°C에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
참고: 섬유아세포는 양성으로 선택되고 컬럼에 남아 있는 반면 Schwann 세포는 컬럼을 통과합니다. 섬유아세포는 스탬프로 수집할 수 있습니다(예: 슈반 세포 염색 프로토콜에 대한 음성 대조군으로서). - 상청액을 버리고 펠렛을 1mL의 공배양 배지에 재현탁합니다(단계 3.1.1 참조). 트립판 블루로 염색한 후 세포를 염색 챔버에서 계수한다.
- 세포가 약 80%(배양 6-12일)의 밀도에 도달하면 플레이트를 3mL의 DPBS로 2배 조심스럽게 세척하고 2mL의 0.05% 트립신/EDTA(37°C로 예열)와 함께 3분 동안 배양합니다. 세포가 플레이트 바닥에서 분리되면 10% FCS 및 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 DMEM 2mL를 추가하여 소화를 비활성화합니다.
2. DRG 체외이식편 배양
- DRG 성장 배지 준비
- 신경기저 배지에 2% B27, 2% 말 혈청, 1% L-글루타민, 0.5% 페니실린/스트렙토마이신 및 10ng/mL 신경 성장 인자(NGF)를 추가하여 DRG 성장 배지를 준비합니다. 성장 배지를 4°C에서 보관한다.
참고: 성장 배지는 2일 동안 사용할 수 있습니다.
- 신경기저 배지에 2% B27, 2% 말 혈청, 1% L-글루타민, 0.5% 페니실린/스트렙토마이신 및 10ng/mL 신경 성장 인자(NGF)를 추가하여 DRG 성장 배지를 준비합니다. 성장 배지를 4°C에서 보관한다.
- DRG 외식편용 코팅
- 커버 슬립을 70 % 에탄올에서 1 시간 동안 배양하고 곡선 집게를 사용하여 4 웰 접시의 우물에 넣습니다. 에탄올이 건조된 후 웰당 0.2mg/mL 폴리-D-라이신(PDL) 300μL를 바르고 37°C 및 5%CO2에서 밤새 배양합니다.
- 커버슬립을 DPBS로 각각 3분 동안 5번 연속으로 세척합니다. DPBS를 제거하고 커버슬립에 1μg/mL 라미닌 300μL을 바르고 37°C 및 5%CO2에서 밤새 배양합니다.
- 5분 동안 DPBS로 3회 세척 단계 후 DPBS를 190μL의 DRG 성장 배지로 교체합니다. 4-웰 플레이트를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다.
- DRG 준비
알림: 깨끗한 벤치 아래에서 배아 쥐의 DRG를 수확합니다.- 준비하기 전에 모든 기구를 70% 에탄올로 세척하십시오. 접시당 2mL의 얼음처럼 차가운 HBSS로 35mm TC 접시 10개(배아당 2개)를 채우고 접시당 5mL의 얼음처럼 차가운 HBSS로 100mm TC 접시 2개를 채웁니다.
- 임신한 래트(성인 암컷 Sprague Dawley rats, E13.5)를CO2 흡입 및 참수로 안락사시킨다.
- 몸에 70 % 에탄올을 뿌리고 쥐의 복부 몸통을 엽니 다. 자궁을 조심스럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 HBSS가 있는 100mm TC 접시에 넣습니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 자궁을 잡고 미세한 집게로 자궁벽을 엽니다. 하나의 양막을 제거하고 미세한 집게로 구멍을 꼬집어 조심스럽게 엽니 다.
- 주변 조직에서 배아를 제거하고 탯줄을 자르고 미세한 집게를 사용하여 배아를 참수합니다. 구부러진 집게와 주걱을 사용하여 HBSS로 채워진 100mm TC 접시에 몸통을 넣습니다.
- 자궁에서 모든 배아를 신속하게 제거하고 HBSS로 채워진 하나의 100mm TC 접시에 옮깁니다. 배아가 5개 이상인 경우 2.3.1단계에 따라 2mL의 HBSS가 포함된 추가 35mm TC 접시를 준비합니다.
- 주걱과 구부러진 집게를 사용하여 HBSS로 채워진 35mm TC 접시에 배아 몸통 하나를 부드럽게 넣습니다. 실체 현미경으로 몸통의 등쪽 부분을 열어 미세한 집게와 미세 가위를 사용하여 배아를 두 부분으로 나눕니다. 절반을 옆으로 돌리고 배아의 등쪽 부분에 일렬로 위치한 DRG 가닥을 확인하십시오.
- 가는 집게와 마이크로 가위를 사용하여 DRG 전체를 잘라냅니다. 35mL의 HBSS로 채워진 신선한 2mm TC 접시에 DRG를 넣고 미세 집게와 마이크로 가위를 사용하여 나머지 조직에서 단일 DRG를 분리합니다.
- DRG 세포 배양
- 190μL의 DRG 성장 배지가 들어 있는 4웰 플레이트를 인큐베이터에서 DRG를 준비할 클린 벤치로 가져갑니다. 미세 집게와 주걱을 사용하여 단일 DRG를 4웰 배양 플레이트의 한 웰에 조심스럽게 옮깁니다. DRG를 부착하려면 중앙 위치가 중요하므로 DRG를 각 웰의 중앙에 배치합니다.
- 이제부터 무균 상태에서 작업하십시오. 체외이식편 배양물을 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 다음날, 100 mL 피펫을 사용하여 50 μL의 DRG 성장 배지를 각 웰에 조심스럽게 첨가한다.
- 매일 현미경을 사용하여 DRG 외식편 부착 및 축삭 성장을 관찰하고 배양 3일째에 커버슬립에서 분리되었거나 축삭을 능가하지 못한 DRG 외식편을 버립니다.
참고: DRG 외식편은 배양 첫날에 매우 약하므로 특히 배지를 교체할 때 플레이트를 인큐베이터 안팎으로 이동할 때 또는 인큐베이터 문을 닫을 때에도 주의해서 다루어야 합니다. 웰당 190μL의 배지의 정확한 부피는 배양 첫날 동안 DRG 외식편을 제자리에 유지하는 데 중요합니다. 느슨한 DRG 외식편은 커버 슬립에 달라 붙지 않고 매체에서 수영하기 때문에 일상적인 통제 중에 쉽게 식별 할 수 있습니다.
3. 공동 문화
- Schwann 세포를 DRG 외식편 배양으로 전달
- DRG 성장 배지에 0.1% 아스코르브산을 첨가하여 공배양 배지를 준비합니다.
- DRG 외식편 배양 3일째에 DRG 성장 배지를 웰당 30,000개의 Schwann 세포(1.8단계로부터)를 포함하는 보조 배양 배지 250μL로 조심스럽게 교체합니다.
- DRG 외식편과 Schwann 세포의 공동 배양을 최대 22일 동안 유지합니다. 250 μL의 공배양 배지를 격일로 조심스럽게 교체하고 현미경을 사용하여 세포의 모양을 관찰합니다.
참고: 배양 첫 번째 날에 공동 배양된 DRG 축삭 및 Schwann 세포의 예는 그림 1을 참조하십시오.
- 면역세포화학적 염색
참고: 공동 배양 샘플은 쉽게 손상될 수 있으므로 염색 절차 중에 매우 조심스럽게 다루십시오.- 커버슬립에 세포를 고정하려면 배지를 천천히 제거하고 DPBS로 3배 세척한 다음 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 10분 동안 배양합니다. PFA를 DPBS로 교체하고 고정된 세포를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
주의 : 4% PFA를 취급할 때는 권장되는 개인 보호 장비를 착용하십시오. - 커버슬립을 DPBS로 5분 동안 3번 세척한 다음 차단 용액(10% 염소 혈청, 10% 소 혈청 알부민[BSA], 0.1% 젤라틴 및 0.05% Triton X-100)으로 1시간 동안 차단합니다. 1차 항체인 βIII-튜불린(1:7,500)과 미엘린 염기성 단백질(MBP)(1:750)을 블로킹 용액에 희석하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 세포를 DPBS로 5분 동안 3배 세척합니다. 형광 염료 접합 2차 항체를 블로킹 용액에 1:1,000으로 희석하여 사용하고 실온(RT)에서 2시간 동안 배양합니다.
- 세포를 DPBS로 3분 동안 5배 세척하고 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 포함한 형광 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 세포를 장착합니다. 현미경으로 문서화될 때까지 슬라이드를 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
주의 : 형광 장착 매체를 다룰 때는 권장되는 개인 보호 장비를 착용하십시오.
- 커버슬립에 세포를 고정하려면 배지를 천천히 제거하고 DPBS로 3배 세척한 다음 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 10분 동안 배양합니다. PFA를 DPBS로 교체하고 고정된 세포를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
- 분석
- 도립 현미경을 사용하여 중앙의 DRG 체편을 둘러싼 8개의 정의된 영역의 사진을 찍습니다.
- 이미지 분석 소프트웨어 애플리케이션을 사용하여 MBP로 염색된 βIII-튜불린 양성 축삭 및 수초화 영역을 정량화합니다.
- 수초화 축삭과 비수초 축삭의 비율로 수초화 비율을 계산합니다.
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Representative Results
공동 배양의 수초화는 10일, 12일, 14일, 16일, 18일 및 20일에 평가되었습니다. DRG 외식편 및 Schwann 세포를 MBP, βIII-튜불린 및 DAPI에 대해 염색하였다. 공동 배양의 축삭 네트워크는 밀도가 높았고 관찰 시간 경과에 따라 눈에 띄게 변하지 않았습니다. 작은 파편 형태의 미엘린의 첫 징후는 10 일째에 검출 가능했고 12 일째에 증가했다 (그림 2). MBP 양성 영역은 배양 20일까지 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 수초화는 MBP 및 βIII-튜불린 양성 영역의 비율로 정량화되었습니다. 수초화는 10일에 비해 18일과 20일에 유의하게 증가했다(그림 3; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001).
그림 1: 공배양에서 Schwann 세포와 축삭의 모습. 3일차 공동 문화의 예시 사진. 검은색 화살표는 얇은 DRG 축삭을 나타내고 흰색 화살표는 축삭에 부착된 길쭉한 방추형 형태가 있는 Schwann 세포를 가리킵니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DRG 외식편과 Schwann 세포의 공동 배양에서의 수초화. 뉴런 마커 βIII-튜불린 및 MBP에 대한 염색은 공배양에서 수초화의 발달을 조사하기 위해 두 배양에 합류한 후 10일, 12일, 14일, 16일, 18일 및 20일에 수행되었습니다. 수초화의 첫 징후는 공동 배양 10일과 12일에 나타났습니다. 14일째부터 MBP 신호가 더 뚜렷해졌고 미엘린으로 둘러싸인 축삭이 검출되었습니다. 수초화는 20일까지 공동 배양 시간에 따라 증가했습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 수초화의 정량화. 공문화 10일, 12일, 14일, 16일, 18일 및 20일에 축삭을 βIII-튜불린으로 염색하고 미엘린을 MBP로 염색하여 수초화를 평가했습니다. 수초화 축삭의 백분율은 MBP 양성 및 βIII-튜불린 염색 영역의 비율을 계산하여 결정되었습니다. 공동 배양 10일차와 비교하여 18일차와 20일차에 상당한 차이가 발견되었습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표현되고; n = 3입니다. Kruskal-Wallis 및 Dunn의 다중 비교 사후 검정을 사용한 일원 분산 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 슈반 세포 배양 단계. 자성 세포 분리 전 및 (B) 배양된 Schwann 세포의 예시적인 명시야 사진. 자기 세포 분리 전에 배양에는 길쭉한 방추형 형태, 평평하고 넓게 보이는 섬유아세포 및 결합 조직의 잔여물을 갖는 Schwann 세포가 포함됩니다. Schwann 세포의 보다 순수한 배양을 달성하기 위해 자기 세포 분리가 수행됩니다. 스케일 바: 200 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 추가 Schwann 세포가 있거나 없는 DRG 외식편의 수초화. MBP 염색 영역은 14일째에 공동 배양에서 수초화를 측정하는 데 사용되었습니다. Schwann 세포가 배양물에 첨가된 경우 DRG 외식편의 수초화가 유의하게 증가하였다(unpaired t-test, **p ≤ 0.01). n = 3입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 공배양에서의 유전자 발현 분석. MBP, PMP22, MAG, Oct6, Egr2 및 Olig1의 상대적 유전자 발현 수준을 qPCR(A)에 의해 22일째에 공배양 샘플에서 분석하였다. MBP와 PMP22는 공배양에서 가장 높은 유전자 발현 수준을 가진 표적이었습니다. 아가로스 겔에 적용된 qPCR 증폭 산물의 예시적인 사진은 표적의 정성적 풍부도를 입증한다 (B). 겔 상의 첫 번째 및 마지막 레인은 DNA 사다리(100개의 염기쌍)를 나타낸다. n = 5입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 두 개의 개별 세포 유형 배양인 Schwann 세포와 후근 신경절 외식편을 병합하여 시험관 내 수초화 생성을 위한 빠르고 쉬운 프로토콜을 제시합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 특히 배양 첫날에 DRG 외식편을 재배하는 것입니다. DRG는 강력한 축삭 네트워크가 구축되기 전에 매우 약하기 쉬우며, 예를 들어 인큐베이터에서 꺼내거나 배지를 교체하는 동안 매우 조심스럽게 다루어야 합니다. 우물 바닥에서 분리되어 매체에서 수영하는 DRG는 실패한 재배를 보여줍니다. Schwann 세포의 경우, 다양한 배양 조건 및 보충제(예: 배지 내 혈청)로 인한 증식 속도 변화는 공배양에 대한 도전이 될 수 있습니다. 배양 물이 과도한 수의 슈반 세포에 의해 자라면 우물 바닥에서 분리되어 사용할 수 없게됩니다. 따라서 배양에서 Schwann 세포 수를 적정하는 것이 좋습니다. Schwann 세포 프로토콜을 설정하는 동안 SOX10 또는 S100 면역염색을 사용하여 순도 테스트를 수행해야 합니다. 일반적으로 배지 교체, 세척 및 고정 단계를 포함한 배양 처리는 성공적인 결과를 보장하기 위해 신중하게 수행되어야 합니다. 연구 관심에 따라 관찰 시점을 선택하는 것이 중요합니다. 14일은 첫 번째 조밀한 수초화 축삭의 시작점을 나타내므로 수초화 개시를 위한 관찰 시점으로 선택할 수 있는 반면, 이후 시점은 보다 완전한 수초를 제공합니다.
이 시험관 내 수초화 방법은 DRG 및 Schwann 세포만을 포함하기 때문에 유기체의 수초화 과정과 정확히 유사하지 않습니다. 주변 조직, 미세 환경, 면역 세포 및 먼 구조의 신호 전달과 같은 다른 기여 요인은 이 모델에 나타나지 않습니다. 그러나, 이 방법은 두 세포 유형 9,15,16의 개별적인 분석 및 조작에 의해 PNS의 수초화를 조사하기에 적합한 모델을 제공한다. 공배양을 위한 슈반 세포 또는 DRG는 특정 세포 유형의 기여도를 해독하기 위해 병에 걸린 또는 처리된 동물로부터 수확할 수 있다17,18. 이 설정의 후기 단계를 사용할 때 DRG 유래 Schwann 세포의 가능한 영향을 배제하기 위해 Schwann 세포를 추가로 추가하지 않고 제어 조건을 포함하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에 따르면, Schwann 세포가 없는 DRG 외식편에서의 수초화는 공배양에서보다 훨씬 적은 정도로 검출됩니다(보충 그림 2).
DRG 외식편을 사용하면 해리된 신경 배양과 비교하여 손상되지 않은 구조 구조의 이점을 얻을 수 있습니다. 미엘린 염기성 단백질(MBP)의 면역형광 염색은 수초화된 축삭 영역을 정량화할 수 있게 하고, 공배양에서 수초화에 대한 충분한 판독값을 제공합니다. 22일째 공배양 샘플의 유전자 발현 분석은 MBP, 말초 미엘린 단백질(PMP22), 미엘린 관련 당단백질(MAG), 옥타머 결합 인자 6(Oct6), ETS 관련 유전자 2(Erg2) 및 희소돌기아교세포 전사 인자 1(Olig1)의 존재를 밝혀냈으며, MBP 및 PMP22에 대한 발현 수준이 가장 높았습니다(보충 그림 3). 따라서 설명된 프로토콜은 공동 배양에서 수초화 마커에 대한 몇 가지 표적 옵션을 가진 방법을 제공합니다.
이 방법의 잠재적 응용에는 말초의 수초화 과정에 대한 기본 연구 접근법뿐만 아니라 미엘린의 손상을 포함한 PNS의 질병에 대한 치료 화합물의 검증이 포함됩니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
조언과 지원을 해주신 Ralf Gold 교수님과 Gisa Ellrichmann 박사님께 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-MBP, rabbit | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, mouse | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8076.4 | |
| Cell strainer, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Germany | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Coverslips 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P231.1 | |
| Curved fine forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germany | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | 4942078001 | |
| Distilled water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, France | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 31331093 | |
| DPBS (no Ca2+ and no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, USA | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F7524 | FCS must be tested for Schwann cell culture |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | F6886-10MG | |
| Gelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ and no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51029882 | |
| Horse serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Germany | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15000-08 | |
| Microscope | Motic, Wetzlar, Germany | Motic BA 400 | |
| Microscope Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 491917-0001-000 | |
| Microscope slide | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130091632 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
| Neubauer counting chamber | Assistant, Erlangen, Germany | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | N1408 | |
| Normal goat serum | Biozol, Eching, Germany | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 well | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, USA | 10342243 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 4430000018 | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | P4707-50ML | |
| Reaction tubes, 15 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62554502 | |
| Reaction tubes, 50 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 62547254 | |
| Reaction vessels, 1.5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| Safety Cabinet S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 51026640 | |
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14083-08 | |
| Serological pipette, 10 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861254025 | |
| Serological pipette, 25 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861685001 | |
| Serological pipette, 5 mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 861253001 | |
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 10094-13 | |
| Stereomicroscope Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germany | 495015-0012-000 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14007-14 | |
| TC dish 100, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833902300 | |
| TC dish 35, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833900300 | |
| TC dish 60, cell + | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 833901300 | |
| Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | X100-500ML | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%), no phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 15090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 25300-054 | |
| Type I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany | C1639 | |
| Water bath type 1008 | GFL, Burgwedel, Germany | 4285 |
References
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