Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التحقيق في الآثار الوقائية للبلاتيكودين D على مرض الكبد الدهني غير الكحولي في نموذج المختبر الناجم عن حمض النخيل

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64816
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University
* These authors contributed equally

Summary

يبحث هذا البروتوكول في الآثار الوقائية للبلاتيكودين D على مرض الكبد الدهني غير الكحولي في نموذج المختبر الناجم عن حمض البالمتيك.

Abstract

يتزايد حدوث مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) بمعدل ينذر بالخطر في جميع أنحاء العالم. يستخدم Platycodon grandiflorum على نطاق واسع كطب عرقي تقليدي لعلاج الأمراض المختلفة وهو غذاء وظيفي نموذجي يمكن دمجه في النظام الغذائي اليومي. أشارت الدراسات إلى أن platycodin D (PD) ، أحد المكونات النشطة الرئيسية في Platycodon grandiflorum ، لديه توافر بيولوجي مرتفع ويخفف بشكل كبير من تقدم NAFLD ، لكن الآلية الأساسية لذلك لا تزال غير واضحة. تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق في التأثير العلاجي لمرض باركنسون ضد NAFLD في المختبر. تمت معالجة خلايا AML-12 مسبقا بحمض البالمتيك 300 ميكرومتر (PA) لمدة 24 ساعة لنمذجة NAFLD في المختبر. بعد ذلك ، تم علاج الخلايا إما بمرض باركنسون أو لم تتلق أي علاج لمرض باركنسون لمدة 24 ساعة. تم تحليل مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام تلطيخ ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلوريسئين (DCFH-DA) ، وتم تحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا بطريقة تلطيخ JC-1. علاوة على ذلك ، تم تحليل مستويات التعبير البروتيني ل LC3-II / LC3-I و p62 / SQSTM1 في محللات الخلية عن طريق النشاف الغربي. وجد أن PD يقلل بشكل كبير من مستويات إمكانات غشاء ROS والميتوكوندريا في المجموعة المعالجة ب PA مقارنة بالمجموعة الضابطة. وفي الوقت نفسه ، زاد PD من مستويات LC3-II / LC3-I وخفض مستويات p62 / SQSTM1 في المجموعة المعالجة ب PA مقارنة بالمجموعة الضابطة. أشارت النتائج إلى أن PD خفف من NAFLD في المختبر عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي وتحفيز الالتهام الذاتي. هذا النموذج في المختبر هو أداة مفيدة لدراسة دور PD في NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG) ، وهو الجذر المجفف ل Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC ، يستخدم في الطب الصيني التقليدي (TCM). يتم إنتاجه بشكل رئيسي في المناطق الشمالية الشرقية والشمالية والشرقية والوسطى والجنوبية الغربية من الصين1. تشمل مكونات PG الصابونين ثلاثي التربينويد ، والسكريات ، والفلافونويد ، والبوليفينول ، والبولي إيثيلين جلايكول ، والزيوت المتطايرة ، والمعادن2. PG لها تاريخ طويل من استخدامها كغذاء ودواء عشبي في آسيا. تقليديا ، تم استخدام هذه العشبة لصنع الدواء ضد أمراض الرئة. يوفر علم الصيدلة الحديث أيضا دليلا على فعالية PG لعلاج الأمراض الأخرى. أظهرت الدراسات أن PG له تأثير علاجي على مجموعة متنوعة من نماذج إصابة الكبد التي يسببها الدواء. المكملات الغذائية من PG أو platycodin المستخلصات يمكن أن تخفف من السمنة التي يسببها النظام الغذائي عالي الدهون والأمراض الأيضية المرتبطة بها3،4،5. يمكن استخدام السكريات من PG لعلاج إصابة الكبد الحادة الناجمة عن LPS / D-GalN في الفئران6. علاوة على ذلك ، فإن الصابونين من جذور PG يحسن من التهاب الكبد الدهني غير الكحولي الناجم عن النظام الغذائي عالي الدهون (NASH)7. علاوة على ذلك ، يمكن أن يعزز platycodin D (PD) ، أحد أهم المكونات العلاجية ل PG ، تعبير مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة وامتصاص البروتين الدهني منخفض الكثافة في خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية (HepG2)8. علاوة على ذلك ، يمكن أن يحفز PD أيضا موت الخلايا المبرمج ويمنع الالتصاق والهجرة والغزو في خلايا HepG2 9,10. وهكذا ، في هذه الدراسة ، يتم استخدام خلايا الورم الكبدي AML-12 في الفأر لبناء نموذج في المختبر ولمزيد من الدراسة للتأثيرات الدوائية والآليات الأساسية لمرض باركنسون في هذا النموذج.

يشير مصطلح مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) إلى مجموعة من أمراض الكبد التي تشمل التنكس الدهني البسيط ، و NASH ، وتليف الكبد ، وسرطان الخلايا الكبدية11. على الرغم من أن التسبب في NAFLD غير مفهوم بشكل كامل ، من نظرية "الضربتين" الكلاسيكية إلى نظرية "الضربات المتعددة" الحالية ، تعتبر مقاومة الأنسولين مركزية في التسبب في NAFLD12،13،14. أظهرت الدراسات أن مقاومة الأنسولين في خلايا الكبد يمكن أن تؤدي إلى زيادة الأحماض الدهنية الحرة ، والتي تشكل الدهون الثلاثية التي تترسب في الكبد وتتسبب في أن يصبح الكبد دهنيا15,16. يمكن أن يؤدي تراكم الدهون إلى السمية الدهنية ، واختلال وظائف الميتوكوندريا الناجم عن الإجهاد التأكسدي ، وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية ، وإطلاق السيتوكين الالتهابي ، مما يؤدي إلى التسبب في مرض وتطور NAFLD17,18. بالإضافة إلى ذلك ، يلعب الالتهام الذاتي أيضا دورا في التسبب في NAFLD ، حيث يشارك في تنظيم حساسية الأنسولين الخلوي ، واستقلاب الدهون الخلوية ، وإصابة خلايا الكبد ، والمناعة الفطرية19،20،21.

تم إنشاء مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية والنماذج الخلوية لتوفير أساس لاستكشاف التسبب في المرض والأهداف العلاجية المحتملة ل NAFLD22,23. ومع ذلك ، لا يمكن للنماذج الحيوانية الفردية تقليد جميع العمليات المرضية ل NAFLD24 بشكل كامل. الاختلافات الفردية بين الحيوانات تؤدي إلى سمات مرضية مختلفة. يضمن استخدام خطوط خلايا الكبد أو خلايا الكبد الأولية في الدراسات المختبرية ل NAFLD أقصى قدر من الاتساق في الظروف التجريبية. يمكن أن يؤدي عدم تنظيم استقلاب الدهون الكبدية إلى مستويات أعلى من تراكم قطرات الدهون في خلايا الكبد في NAFLD25. تم استخدام الأحماض الدهنية الحرة مثل حمض الأوليك وزيت النخيل في النموذج في المختبر لتقليد NAFLD الناجم عن اتباع نظام غذائي غني بالدهون26,27. غالبا ما يستخدم خط خلايا الورم الأرومي الكبدي البشري HepG2 في بناء نماذج NAFLD في المختبر ، ولكن كخط خلية ورمية ، يختلف استقلاب خلايا HepG2 اختلافا كبيرا عن استقلاب خلايا الكبد في ظل الظروف الفسيولوجية العادية28. لذلك ، فإن استخدام خلايا الكبد الأولية أو خلايا الكبد الأولية للفأر لبناء نموذج NAFLD في المختبر لفحص الأدوية أكثر فائدة من استخدام خطوط الخلايا السرطانية. بمقارنة الفحص التآزري لتأثيرات الأدوية والأهداف العلاجية في كل من النماذج الحيوانية ونماذج خلايا الكبد في المختبر ، يبدو أن استخدام خلايا الكبد الفأرية لبناء نموذج NAFLD في المختبر لديه إمكانات تطبيق أفضل.

تتأكسد الأحماض الدهنية الحرة التي تدخل الكبد لإنتاج الطاقة أو تخزن في صورة دهون ثلاثية. بشكل ملحوظ ، الأحماض الدهنية الحرة لها سمية دهنية معينة وقد تحفز الخلل الخلوي وموت الخلاياالمبرمج 12. حمض البالمتيك (PA) هو أكثر الأحماض الدهنية المشبعة وفرة في البلازما البشرية29. عندما تتعرض الخلايا في الأنسجة غير الدهنية لتركيزات عالية من PA لفترة طويلة ، فإن هذا يحفز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ويسبب الإجهاد التأكسدي وتراكم الدهون وحتى موت الخلايا المبرمج30. لذلك ، يستخدم العديد من الباحثين PA كمحفز لتحفيز خلايا الكبد لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، وبالتالي ، بناء نموذج مرض الكبد الدهني في المختبر وتقييم الآثار الوقائية لبعض المواد الفعالة على الخلايا31،32،33،34. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا للتحقيق في الآثار الوقائية لمرض باركنسون على نموذج خلية من NAFLD الناجم عن السلطة الفلسطينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تستخدم خلايا AML-12 (خط خلايا الكبد الطبيعي للفأر) في الدراسات القائمة على الخلايا. يتم الحصول على الخلايا من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. المعالجة المسبقة لخلايا AML-12 لنمذجة NAFLD في المختبر

  1. الحفاظ على الخلايا في وسائط زراعة الخلايا الطبيعية (DMEM بالإضافة إلى Ham's F12 [1: 1] التي تحتوي على 0.005 مجم / مل من الأنسولين ، و 5 نانوغرام / مل من السيلينيوم ، و 0.005 مجم / مل من الترانسفيرين ، و 40 نانوغرام / مل من ديكساميثازون ، و 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] ، انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2.
  2. بذر الخلايا في 12 لوحة بئر (1 مل / بئر) بكثافة 2.8 × 105 خلايا / بئر.
    ملاحظة: يتم إجراء جميع عمليات هضم الخلايا والتبادل المتوسط في خزانة السلامة الحيوية لتجنب تلويث الخلايا.
  3. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا بعد الحضانة الليلية (~ 10 ساعات) ، ثم اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من الوسائط الخالية من المصل (لكل بئر).
  4. قسم صفيحة الخلية المكونة من 12 بئرا إلى أربع مجموعات معالجة مختلفة من اليسار إلى اليمين ، بما في ذلك (1) المجموعة الضابطة ، (2) المجموعة المعالجة ب PD ، (3) المجموعة المعالجة ب PA ، و (4) المجموعة المعالجة PA + PD.
    ملاحظة: يتم ترتيب ثلاث نسخ متماثلة من كل مجموعة معالجة تجريبية من أعلى إلى أسفل على نفس لوحة الخلايا المكونة من 12 بئرا.
  5. أضف وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) إلى المجموعة الضابطة والمجموعة المعالجة ب PD ، وأضف وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) المكملة ب 300 ميكرومتر من PA إلى المجموعة المعالجة ب PA و PA + PD.
  6. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا بعد 24 ساعة من الحضانة ، ثم اغسل الخلايا ب 1 مل من الوسائط الخالية من المصل (لكل بئر) مرتين.
  7. إضافة وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) مكملة بمركبة (ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO ، 0.1٪ v / v) إلى المجموعة الضابطة ؛ إضافة وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) مكملة ب 1 ميكرومتر PD إلى المجموعة المعالجة ب PD ؛ إضافة وسائط زراعة الخلايا العادية (1 مل / بئر) مكملة ب 300 ميكرومتر PA إلى المجموعة المعالجة ب PA ؛ إضافة وسائط زراعة الخلايا الطبيعية (1 مل / بئر) مكملة ب 300 ميكرومتر PA و 1 ميكرومتر PD إلى المجموعة المعالجة PA + PD.
  8. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة إضافية ، تحقق من التأثيرات الوقائية لمرض باركنسون على الخلايا باستخدام تلطيخ ثنائي أسيتات ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلوريسئين 2 ′ (DCFH-DA) (الخطوة 2) ، تلطيخ JC-1 (الخطوة 3) ، والنشاف الغربي (الخطوة 4).
    ملاحظة: تتم جميع عمليات الحضانة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO2.

2. قياس التغير في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية

ملاحظة: يتم تقييم مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في الخلايا بناء على مقايسة تلطيخ DCFH-DA.

  1. في نهاية فترة المعالجة (الخطوة 1.8) ، اغسل الخلايا ب 1 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات لكل بئر (1x PBS ، درجة الحموضة 7.4) ثلاث مرات ، ثم قم بتلطيخ الخلايا ب 100 ميكرولتر من 10 ميكرومتر DCFH-DA لكل بئر (انظر جدول المواد). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: إذا لم يلاحظ أي مضان أخضر واضح بعد 30 دقيقة من الحضانة ، يمكن زيادة وقت حضانة المسبار والخلايا بشكل مناسب (30-60 دقيقة). إذا لوحظ التعرض المفرط لقيمة التألق الأخضر بعد 30 دقيقة من الحضانة ، يمكن تقليل وقت حضانة المسبار والخلايا بشكل مناسب (15-30 دقيقة).
  2. اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS (1 مل / بئر) ثلاث مرات. أضف 1 مل من 1x PBS إلى كل بئر.
  3. ضع اللوحة المكونة من 12 بئرا على مرحلة المجهر (انظر جدول المواد) ، ثم استخدم هدفا 20x لمراقبة مورفولوجيا الخلايا (التكبير: 200x).
  4. التقط ثلاث صور مضان تمثيلية (التكبير: 200x) لكل بئر على المجهر الفلوري باستخدام قناة الفلورسنت الخضراء بطول موجة إثارة يبلغ 480 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 530 نانومتر.
    ملاحظة: يوصى باستخدام قناة الفلورسنت الخضراء ذات الطول الموجي للإثارة 480 نانومتر وطول موجة الانبعاث 530 نانومتر للكشف عن DCFH-DA. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اكتشاف DCFH-DA باستخدام إعدادات المعلمات ل GFP و FITC في المجهر الفلوري35,36.
  5. أخيرا ، قم بمعالجة الصور باستخدام برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد) ، ثم استخدم برنامج ImageJ لحساب متوسط شدة التألق لكل مجموعة أو نسب المجموعات المختلفة.
    ملاحظة: تم وصف التفاصيل الفنية للمجهر الفلوري وبرنامج Image J المستخدم في أعمال التصوير سابقا37,38.

3. قياس التغير في إمكانات غشاء الميتوكوندريا

ملاحظة: تتم مراقبة التغيرات في إمكانات غشاء الميتوكوندريا بواسطة مقايسة تلطيخ JC-1.

  1. في نهاية فترة العلاج (الخطوة 1.8) ، اغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS لكل بئر ثلاث مرات ، ثم قم بتلطيخ الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول عمل JC-1 5 ميكروغرام / مل (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
    ملاحظة: إذا لم يلاحظ أي مضان أخضر واضح بعد 30 دقيقة من الحضانة ، يمكن زيادة وقت حضانة المسبار والخلايا بشكل مناسب (30-60 دقيقة). إذا لوحظ التعرض المفرط لقيمة التألق الأخضر بعد 30 دقيقة من الحضانة ، يمكن تقليل وقت حضانة المسبار والخلايا بشكل مناسب (15-30 دقيقة).
  2. اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS (1 مل / بئر) ثلاث مرات. أضف 1 مل من 1x PBS إلى كل بئر.
  3. ضع اللوحة المكونة من 12 بئرا على مرحلة المجهر ، ثم استخدم هدفا 20x لمراقبة مورفولوجيا الخلايا (التكبير: 200x).
  4. التقط ثلاث صور فلورية تمثيلية (التكبير: 200x) لكل بئر على المجهر الفلوري باستخدام قناة الفلورسنت الخضراء ذات الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث 485 نانومتر و 535 نانومتر ، على التوالي ، وقناة الفلورسنت الحمراء بأطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 550 نانومتر و 600 نانومتر على التوالي.
    ملاحظة: يتم استخدام قناة الفلورسنت الخضراء ذات الطول الموجي للإثارة 485 نانومتر وطول موجة الانبعاث 535 نانومتر للكشف عن مونومر JC-1 ، والذي يتم التعامل معه على أنه ميتوكوندريا غير مستقطبة39،40،41 ، وتستخدم قناة الفلورسنت الحمراء بطول موجة إثارة يبلغ 550 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 600 نانومتر للكشف عن خافت JC-1 ، والتي تعامل على أنها ميتوكوندريا مستقطبة39،40،41.
  5. أخيرا ، قم بمعالجة الصور باستخدام برنامج الحصول على الصور ، ثم استخدم برنامج Image J لحساب متوسط شدة التألق لكل مجموعة أو نسب المجموعات المختلفة.
    ملاحظة: تم وصف التفاصيل الفنية للمجهر الفلوري وبرنامج Image J المستخدم في أعمال التصوير سابقا37,38.

4. قياس مستويات تعبير البروتين ل LC3-II / LC3-I و p62 / SQSTM1

  1. بعد العلاج (الخطوة 1.8) ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (1 مل / بئر) تم تبريده مسبقا عند 4 درجات مئوية.
  2. أضف محلول تحلل RIPA (100 ميكرولتر / بئر) المكمل بالبروتياز وكوكتيل مثبط الفوسفاتيز (1x) (انظر جدول المواد) إلى لوحة 12 بئرا ، وتحلل على الثلج لمدة 5 دقائق.
  3. اجمع الخلية المحللة في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تحديد تركيز البروتين من المواد الطافية بطريقة BCA باتباع الإجراءات القياسية42.
  4. أضف المخزن المؤقت لتحميل عينة SDS-PAGE (5x ، انظر جدول المواد) إلى طافات الخلية المحللة (نسبة الحجم = 1: 4).
  5. امزجه بواسطة الدوامة (بسرعة عالية لمدة ~ 15 ثانية) ، وقم بتسخين العينات المختلطة عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشويه البروتين.
  6. ضع جل SDS-PAGE 12٪ المجهز جيدا 12٪ في خزان الرحلان الكهربائي ، ثم أضف المخزن المؤقت لعينة SDS (1x) المخفف بالماء النقي للغاية إلى موضع حد الارتفاع.
    ملاحظة: يتم تحضير جل SDS-PAGE باستخدام مجموعة تجارية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  7. أضف علامة البروتين (5 ميكرولتر / بئر) وعينات (20 ميكروغرام / بئر) إلى آبار مختلفة من جل SDS-PAGE.
  8. اضبط وضع الجهد المستقر على 100 فولت ، وقم بإجراء الرحلان الكهربائي لمدة 80 دقيقة.
  9. بعد الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، قم بإجراء النقل الكهربائي للبروتينات إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) (0.45 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) بعد التقارير المنشورة سابقا43,44.
  10. بعد النقل الكهربائي للبروتينات ، اغسل غشاء PVDF ب 10 مل من TBST (1x TBS ، 0.1٪ Tween 20) مرتين (5 دقائق / مرة) في شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  11. سد غشاء PVDF مع 5 مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA ، 5٪) في شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  12. اغسل غشاء PVDF ب 10 مل من TBST ثلاث مرات (10 دقائق / وقت). بعد ذلك ، احتضان غشاء PVDF في 5 مل من الأجسام المضادة الأولية المحددة المخففة في المخزن المؤقت المانع ل LC3 (الماوس mAb ، 1: 2,000) ، p62 / SQSTM1 (المشار إليه فيما يلي باسم p62 ، mAb الماوس ، 1: 2,000) ، و β-actin (الماوس mAb ، 1: 2,000) (انظر جدول المواد) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  13. اغسل غشاء PVDF ب 10 مل من TBST ثلاث مرات (10 دقائق / وقت) في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضان غشاء PVDF بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب IgG (HRP) مخفف في حاجز مانع (1: 10,000) (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة ومحمي من الضوء لمدة 2 ساعة.
  14. اغسل غشاء PVDF ب 10 مل من TBST ثلاث مرات (10 دقائق / وقت) في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع غشاء PVDF على الغلاف البلاستيكي ، وأضف كمية مناسبة من محلول عمل ECL (200 ميكرولتر / غشاء) (انظر جدول المواد) ، واحتضانه لمدة 2 دقيقة.
  15. بعد الحضانة ، قم بإزالة حل عمل ECL ، وكشف غشاء PVDF في نظام التصوير لتطوير الصورة. أخيرا ، استخدم برنامج Image J لتحليل القيم الرمادية لكل نطاق.
    ملاحظة: تم وصف التفاصيل الفنية لبرنامج النشاف الغربي والصورة J المستخدم في أعمال التصوير سابقا45,46.

5. التحليل الإحصائي

  1. قدم البيانات من التجارب كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD).
  2. قم بإجراء تحليل الأهمية باستخدام أداة البرنامج الإحصائي الموضحة سابقا47.
  3. احسب الفروق الإحصائية بين المجموعتين باستخدام اختبار t. تعتبر القيمة P التي تقل عن 0.05 ذات دلالة إحصائية: * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، ** P < 0.005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في الخلايا
تم تحفيز خلايا AML-12 ب 300 ميكرومتر PA لمدة 24 ساعة ، وتم إنشاء نموذج خلية NAFLD. في وقت لاحق ، عولجت الخلايا مع PD لمدة 24 ساعة. تم تمييز الخلايا بمسبار الفلورسنت DCFH-DA ، ولوحظ إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية تحت مجهر مضان. تظهر نتائج تلطيخ DCFH-DA لأنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في الشكل 1. أظهرت النتائج أن PD يمكن أن يقلل بشكل كبير من مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في الخلايا المحتضنة ب 300 ميكرومتر من PA (P < 0.01) ، مما يشير إلى أن PD يمكن أن يقلل من الإجهاد التأكسدي الخلوي.

إمكانات غشاء الميتوكوندريا للخلايا
الميتوكوندريا هي العضية المركزية التي يحكمها مسار موت الخلايا المبرمج الجوهري48،49،50. لذلك ، لوحظت إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) لخلايا AML-12 التي تم تحضينها باستخدام PD لمدة 24 ساعة تحت مجهر مضان بعد تلطيخ JC-1. كما هو موضح في الشكل 2 ، كان التألق الأخضر (مونومرات JC-1 ، المعالجة على أنها ميتوكوندريا غير مستقطبة39،40،41) في الخلايا المعالجة ب PA أعلى منها في الخلايا غير المعالجة. من ناحية أخرى ، كان التألق الأحمر (ثنائيات JC-1 ، التي تعامل على أنها ميتوكوندريا مستقطبة39،40،41) في الخلايا المعالجة ب PA أقل منها في الخلايا غير المعالجة ، مما يشير إلى إزالة استقطاب MMP الناجم عن PA في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، مقارنة بمجموعة النموذج ، انخفضت نسبة مونومرات JC-1: dimers في مجموعة معالجة PD (P < 0.01) ، مما يشير إلى أن PD يمكن أن يحسن إزالة استقطاب MMP الناجم عن PA.

مستويات التعبير البروتيني ل LC3-II / LC3-I و p62
بحثت هذه الدراسة أيضا في الدور المحتمل لمرض باركنسون على مسار الالتهام الذاتي من خلال التحقيق في مستويات تعبير البروتين للبروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي LC3 و p62 في الخلايا عن طريق النشاف الغربي. كما هو موضح في الشكل 3 ، انخفضت نسبة LC3-II: LC3-I بشكل ملحوظ (P < 0.005) ، وزاد مستوى تعبير البروتين p62 بعد معالجته ب PA لمدة 48 ساعة (P < 0.01). من ناحية أخرى ، يمكن أن يقلل PD بشكل كبير من مستوى تعبير البروتين p62 (P < 0.01) ويزيد من نسبة LC3-II: LC3-I (P < 0.05) ، مما يشير إلى أن PD قد يعيد تدفق الالتهام الذاتي الذي تثبطه PA.

Figure 1
الشكل 1: تأثيرات PD على أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا في الخلايا كما تم تقييمها بواسطة تلطيخ DCFH-DA . (أ) تم الكشف عن توليد ROS بواسطة المجهر الفلوري ، 200x. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. (ب) تغيرات الطيات النسبية في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في مجموعات مختلفة. يمثل كل عمود متوسط ± SD (n = 3). ** P < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تأثيرات PD على إزالة استقطاب MMP في الخلايا كما تم تقييمها بواسطة تلطيخ JC-1 . (أ) تم الكشف عن إزالة استقطاب MMP بواسطة المجهر الفلوري ، 200x. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. (ب) التغيرات النسبية في مونومرات JC-1: نسبة الدايمرات في المجموعات المختلفة. يمثل كل عمود متوسط ± SD (n = 3). ** P < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تأثيرات PD على مستويات التعبير البروتيني ل LC3-II / LC3-I و p62 في الخلايا كما تم تقييمها بواسطة النشاف الغربي. (أ) تم الكشف عن مستويات البروتين في LC3 و p62 و β-actin بواسطة النشاف الغربي. (ب) التغيرات النسبية في نسبة LC3-II:LC3-I في المجموعات المختلفة. (ج) تغيرات الطيات النسبية في تعبير p62 في المجموعات المختلفة. يمثل كل عمود متوسط ± SD (n = 3). *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أبرزت الدراسات حقيقة أن NAFLD هي متلازمة سريرية مرضية ، تتراوح من الكبد الدهني إلى NASH ، والتي يمكن أن تتطور إلى تليف الكبد وسرطان الكبد51. يعد النظام الغذائي عالي الدهون ونمط الحياة غير النشط من عوامل الخطر النموذجية لمرض الكبد الدهني غير الكحولي. تم بحث كل من العلاجات غير الدوائية والعلاجات الدوائية لعلاج NAFLD51،52،53. ومع ذلك ، لم يتم توضيح التسبب في NAFLD بشكل كامل. تتضمن الطريقة الموصوفة هنا نموذجا في المختبر من NAFLD تم إنشاؤه بواسطة خلايا AML-12 المحفزة ب PA. قمنا بالتحقيق في الآثار الوقائية ل PD ضد NAFLD في هذا النموذج ، ووجدنا أن PD خفف من الزيادة التي يسببها PA في أنواع الأكسجين التفاعلية. إلى جانب ذلك ، قام PD أيضا بتحسين إزالة استقطاب MMP الناجم عن PA. علاوة على ذلك ، يمكن أن يقلل PD بشكل كبير من مستوى تعبير البروتين ل p62 ويزيد من نسبة LC3-II: LC3-I. يمكن أن توفر هذه النتائج التجريبية أساسا لتطبيق PD كمكون صيدلاني نشط لعلاج NAFLD.

كمسار رئيسي للتدهور داخل الخلايا ، يدرك الالتهام الذاتي العملية الفسيولوجية لإعادة تدوير وإعادة استخدام المواد الخام المغذية عن طريق تحلل المكونات الزائدة في الخلايا19,54. الالتهام الذاتي هو أيضا آلية إصلاح رئيسية للجسم للحفاظ على "توازن يين يانغ" ، وهو تجسيد مجهري ل "تحويل تشي" في الطب الصيني التقليدي55،56،57. في البروتوكول الحالي ، بالإضافة إلى الكشف عن التغيرات في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية وإزالة استقطاب MMP ، تم التحقيق في الدور المحتمل لمرض باركنسون على مسار الالتهام الذاتي من خلال الكشف عن مستويات التعبير البروتيني للبروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي LC-3 و p62 عن طريق النشاف الغربي. بعد معالجة الخلايا التي يسببها PA مع PD ، انخفضت نسبة LC3-II: LC3-I ، وزاد تراكم p62 ، مما يشير إلى انخفاض مستوى الالتهام الذاتي. تتوافق النتائج التجريبية مع تقارير الأدبيات الأخرى20،34،58،59. قد يساعد نموذج الخلية في المختبر هذا في تحسين فهم الوظيفة البيولوجية لمرض باركنسون ويساعد في دراسة استخدام مواد الطب الصيني التقليدي النشطة الأخرى لعلاج NAFLD.

هناك بعض الخطوات الحاسمة في العملية التجريبية. لتحديد ما إذا كان نموذج NAFLD في المختبر قد تم إنشاؤه بنجاح ، يمكن مقارنة رواسب قطرات الدهون في خلايا المجموعة الضابطة الطبيعية وخلايا المجموعة المعالجة ب PA عن طريق تلطيخ Oil Red O ، كما هو موضح سابقا60,61. بعد تلطيخ DCFH-DA أو تلطيخ JC-1 ، يجب غسل المجسات المتبقية التي لا تدخل الخلايا ؛ خلاف ذلك ، سيؤدي ذلك إلى خلفية عالية عند التقاط الصور الفلورية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تقصير الوقت (باستثناء وقت الحضانة) بين تحميل وقياس مجسات الفلورسنت (DCFH-DA أو JC-1) لتقليل احتمالية حدوث أخطاء تجريبية. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل تركيزات العمل لمجسات الفلورسنت (DCFH-DA أو JC-1) حسب الحاجة إذا كانت قيمة مضان الخلايا في مجموعة التحكم السلبية عالية نسبيا. بدلا من ذلك ، يمكن تعديل وقت حضانة حل العمل JC-1 والخلايا بشكل مناسب في غضون إطار زمني من 15-60 دقيقة وفقا للظروف التجريبية الفعلية.

هناك أيضا بعض القيود في نموذج الخلية في المختبر. توجد خلايا مثل الخلايا الكبدية المتنية والخلايا النجمية الكبدية وخلايا كوبفر والخلايا البطانية الوعائية في أنسجة الكبد62. لذلك ، قد لا تكون التجارب على خلايا متني الكبد كافية لشرح آثار الأدوية. يجب أيضا استخدام نماذج الخلايا الأخرى في اكتشاف الأدوية المضادة ل NAFLD. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) لبناء نماذج الكبد واختبار السمية الكبدية63,64. ستركز الدراسات المستقبلية على تطوير نماذج في المختبر باستخدام تقنيات الثقافة المشتركة وزراعة الخلايا 3D لفحص الأدوية المحتملة المضادة ل NAFLD.

كمرض متعدد الأنظمة ، تلعب العديد من العوامل دورا في تطور وتطور NAFLD ، مما يعني أن نموذجا حيوانيا واحدا أو نموذجا خلويا لا يمكنه تقليد جميع العمليات المرضية لهذا المرضبشكل كامل 65. الاعتماد المفرط على استخدام النماذج الحيوانية يزيد من عبء تطوير الأدوية العلاجية. يعد استخدام نماذج الخلايا في المختبر في المراحل المبكرة من تطوير الأدوية المضادة ل NAFLD أكثر عملية وفعالية من حيث التكلفة. في هذه الدراسة ، تم استخدام خط خلية كبد الفأر الطبيعي AML-12 لبناء نموذج في المختبر من NAFLD ، وتم التحقق من التأثير العلاجي لمرض باركنسون في هذا النموذج. والجدير بالذكر أن نتائج هذه الدراسة توفر أساسا لمزيد من البحث حول التأثيرات المضادة ل NAFLD لمرض باركنسون في خلايا الكبد في الفئران ونماذج خلايا الكبد الأولية.

في الختام ، يتم تقديم نموذج في المختبر لدراسة الآثار الوقائية ل PD ضد NAFLD هنا. يمكن أن يكون هذا أيضا نموذجا مفيدا في المختبر للتحقيق في فعالية المواد الفعالة الأخرى من الطب الصيني التقليدي لعلاج NAFLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من خلال منح من لجنة تشونغتشينغ للعلوم والتكنولوجيا (cstc2020jxjl-jbky10002 و jbky20200026 و cstc2021jscx-dxwtBX0013 و jbky20210029) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (رقم 2021MD703919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480 (2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532 (2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71 (2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834 (2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622 (2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973 (2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479 (2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13 (2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128 (2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87 (2012).
  45. Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
  46. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590 (2014).
  47. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  48. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  49. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  50. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  51. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  52. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  53. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  54. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  55. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  56. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359 (2016).
  57. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976 (2021).
  58. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459 (2018).
  59. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  60. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  61. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  62. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  63. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060 (2020).
  64. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  65. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 190 ، Platycodin D ، حمض النخيل ، أنواع الأكسجين التفاعلية ، إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، الالتهام الذاتي
التحقيق في الآثار الوقائية للبلاتيكودين D على مرض الكبد الدهني غير الكحولي في نموذج <em>المختبر</em> الناجم عن حمض النخيل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., … More

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter