Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Undersøgelse af de beskyttende virkninger af Platycodin D på ikke-alkoholisk fedtleversygdom i en palmitinsyre-induceret in vitro-model

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64816
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol undersøger de beskyttende virkninger af platycodin D på ikke-alkoholisk fedtleversygdom i en palmitinsyre-induceret in vitro-model .

Abstract

Forekomsten af ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) er steget med alarmerende hastighed over hele verden. Platycodon grandiflorum anvendes i vid udstrækning som en traditionel etnomedicin til behandling af forskellige sygdomme og er en typisk funktionel mad, der kan indarbejdes i den daglige kost. Undersøgelser har antydet, at platycodin D (PD), en af de vigtigste aktive ingredienser i Platycodon grandiflorum, har høj biotilgængelighed og væsentligt mindsker udviklingen af NAFLD, men den underliggende mekanisme for dette er stadig uklar. Denne undersøgelse har til formål at undersøge den terapeutiske virkning af PD mod NAFLD in vitro. AML-12-celler blev forbehandlet med 300 μM palmitinsyre (PA) i 24 timer for at modellere NAFLD in vitro. Derefter blev cellerne enten behandlet med PD eller modtog ingen PD-behandling i 24 timer. Niveauerne af reaktive iltarter (ROS) blev analyseret under anvendelse af 2′,7′-dichlor-dihydro-fluorescein diacetat (DCFH-DA) farvning, og mitokondriemembranpotentialet blev bestemt ved JC-1 farvningsmetoden. Desuden blev proteinekspressionsniveauerne af LC3-II / LC3-I og p62 / SQSTM1 i cellelysaterne analyseret ved western blotting. PD viste sig at reducere ROS- og mitokondriemembranpotentialeniveauerne signifikant i den PA-behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. I mellemtiden øgede PD LC3-II / LC3-I-niveauerne og reducerede p62 / SQSTM1-niveauerne i den PA-behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. Resultaterne viste, at PD forbedrede NAFLD in vitro ved at reducere oxidativt stress og stimulere autofagi. Denne in vitro-model er et nyttigt værktøj til at studere PD's rolle i NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), som er den tørrede rod af Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., bruges i traditionel kinesisk medicin (TCM). Det produceres hovedsageligt i de nordøstlige, nordlige, østlige, centrale og sydvestlige regioner i Kina1. PG-komponenterne omfatter triterpenoidsaponiner, polysaccharider, flavonoider, polyphenoler, polyethylenglycoler, flygtige olier og mineraler2. PG har en lang historie med at blive brugt som mad og urtemedicin i Asien. Traditionelt blev denne urt brugt til at lave medicin mod lungesygdomme. Moderne farmakologi giver også bevis for effekten af PG til behandling af andre sygdomme. Undersøgelser har vist, at PG har en terapeutisk effekt på en række lægemiddelinducerede leverskademodeller. Kosttilskuddet af PG- eller platycodinekstrakter kan forbedre fedtfattig diætinduceret fedme og dets relaterede metaboliske sygdomme 3,4,5. Polysaccharider fra PG kan anvendes til behandling af akut leverskade forårsaget af LPS/D-GalN hos mus6. Desuden forbedrer saponiner fra PG's rødder fedtfattig diætinduceret ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH)7. Desuden kan platycodin D (PD), en af de vigtigste terapeutiske komponenter i PG, forbedre lipoproteinreceptorekspression med lav densitet og lipoproteinoptagelse med lav densitet i humane hepatocellulære carcinomceller (HepG2)8. Desuden kan PD også inducere apoptose og hæmme vedhæftning, migration og invasion i HepG2-celler 9,10. I denne undersøgelse anvendes således AML-12-celler fra mus til in vitro-modelkonstruktion og til yderligere undersøgelse af de farmakologiske virkninger og underliggende mekanismer for PD i denne model.

Udtrykket ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) refererer til en gruppe leversygdomme, der omfatter simpel steatose, NASH, skrumpelever og hepatocellulært carcinom11. Selvom patogenesen af NAFLD er ufuldstændigt forstået, fra den klassiske "to-hit" teori til den nuværende "multiple-hit" teori, anses insulinresistens for at være central i patogenesen af NAFLD12,13,14. Undersøgelser har vist, at insulinresistens i hepatocytter kan føre til øgede frie fedtsyrer, som danner triglycerider, der deponeres i leveren og får leveren til at blive fed15,16. Akkumuleringen af fedt kan føre til lipotoksicitet, oxidativ stressinduceret mitokondriel dysfunktion, endoplasmatisk retikulumstress og inflammatorisk cytokinfrigivelse, hvilket resulterer i patogenese og progression af NAFLD17,18. Derudover spiller autofagi også en rolle i patogenesen af NAFLD, da den er involveret i regulering af cellulær insulinfølsomhed, cellulær lipidmetabolisme, hepatocytskade og medfødt immunitet 19,20,21.

En række dyremodeller og cellulære modeller er blevet etableret for at danne grundlag for at udforske patogenesen og potentielle terapeutiske mål for NAFLD22,23. Imidlertid kan enkeltdyrmodeller ikke fuldt ud efterligne alle de patologiske processer i NAFLD24. Individuelle forskelle mellem dyr fører til forskellige patologiske træk. Anvendelse af levercellelinjer eller primære hepatocytter i in vitro-undersøgelser af NAFLD sikrer maksimal konsistens i de eksperimentelle betingelser. Hepatisk lipidmetabolisme dysregulering kan føre til højere niveauer af hepatocyt lipid dråbe akkumulering i NAFLD25. Frie fedtsyrer som oliesyre og palmeolie er blevet brugt i in vitro-modellen til at efterligne NAFLD forårsaget af en fedtrig diæt26,27. Den humane hepatoblastomcellelinje HepG2 bruges ofte til konstruktion af NAFLD-modeller in vitro, men som tumorcellelinje er metabolismen af HepG2-celler signifikant forskellig fra levercellernes under normale fysiologiske forhold28. Derfor er det mere fordelagtigt at anvende primære hepatocytter eller primære hepatocytter til mus til at konstruere in vitro NAFLD-modellen til lægemiddelscreening end at anvende tumorcellelinjer. Sammenligning af den synergistiske undersøgelse af lægemiddeleffekter og terapeutiske mål i både dyremodeller og in vitro hepatocytmodeller ser det ud til, at brug af musehepatocytter til at konstruere in vitro NAFLD-modellen har bedre anvendelsespotentiale.

Frie fedtsyrer, der kommer ind i leveren, oxideres for at producere energi eller opbevares som triglycerider. Signifikant har frie fedtsyrer en vis lipotoksicitet og kan fremkalde cellulær dysfunktion og apoptose12. Palmitinsyre (PA) er den mest rigelige mættede fedtsyre i humant plasma29. Når celler i ikke-fedtvæv udsættes for høje koncentrationer af PA i lang tid, stimulerer dette produktionen af reaktive iltarter (ROS) og forårsager oxidativ stress, lipidakkumulering og endda apoptose30. Derfor bruger mange forskere PA som en inducer til at stimulere leverceller til at producere ROS og dermed konstruere in vitro fedtleversygdomsmodellen og evaluere de beskyttende virkninger af visse aktive stoffer på celler31,32,33,34. Denne undersøgelse introducerer en protokol til undersøgelse af de beskyttende virkninger af PD på en cellemodel af NAFLD induceret af PA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

AML-12-celler (en normal musehepatocytcellelinje) anvendes til de cellebaserede undersøgelser. Cellerne fås fra en kommerciel kilde (se materialetabel).

1. Forbehandling af AML-12-cellerne til model af NAFLD in vitro

  1. Oprethold cellerne i normale cellekulturmedier (DMEM plus skinkens F12 [1:1] indeholdende 0,005 mg/ml insulin, 5 ng/ml selen, 0,005 mg/ml transferrin, 40 ng/ml dexamethason og 10% føtalt bovint serum [FBS], se materialetabel) ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5% CO2.
  2. Frø cellerne i plader med 12 brønde (1 ml / brønd) med en densitet på 2,8 x 105 celler / brønd.
    BEMÆRK: Alle cellefordøjelses- og medieudvekslingsoperationer udføres i et biosikkerhedsskab for at undgå forurening af cellerne.
  3. Fjern cellernes dyrkningsmedium efter inkubationen natten over (~ 10 timer), og vask derefter cellerne to gange med 1 ml serumfrie medier (pr. Hul).
  4. Opdel cellepladen med 12 brønde i fire forskellige behandlingsgrupper fra venstre mod højre, herunder (1) kontrolgruppen, (2) den PD-behandlede gruppe, (3) den PA-behandlede gruppe og (4) den PA + PD-behandlede gruppe.
    BEMÆRK: Tre replikater af hver eksperimentel behandlingsgruppe er arrangeret fra top til bund på den samme 12-brønds celleplade.
  5. De normale cellekulturmedier (1 ml/hul) tilsættes kontrolgruppen og den PD-behandlede gruppe, og de normale cellekulturmedier (1 ml/hul) suppleres med 300 μM PA til den PA-behandlede og PA + PD-behandlede gruppe.
  6. Fjern cellernes dyrkningsmedium efter 24 timers inkubation, og vask derefter cellerne med 1 ml serumfrie medier (pr. Brønd) to gange.
  7. Der tilsættes normale cellekulturmedier (1 ml/hul) suppleret med et vehikel (dimethylsulfoxid, DMSO, 0,1% v/v) til kontrolgruppen; der tilsættes normale cellekulturmedier (1 ml/hul) suppleret med 1 μM PD til den PD-behandlede gruppe; tilsætte normale cellekulturmedier (1 ml/hul) suppleret med 300 μM PA til den PA-behandlede gruppe; Der tilsættes normale cellekulturmedier (1 ml/hul) suppleret med 300 μM PA og 1 μM PD til den PA + PD-behandlede gruppe.
  8. Efter inkubation i yderligere 24 timer undersøges de beskyttende virkninger af PD på celler ved hjælp af 2′,7′-dichlordihydro-fluoresceindiacetatfarvning (DCFH-DA) (trin 2), JC-1-farvning (trin 3) og western blotting (trin 4).
    BEMÆRK: Alle inkubationsoperationer udføres ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5% CO2.

2. Måling af ændringen i ROS-produktionen

BEMÆRK: De intracellulære ROS-niveauer i cellerne vurderes ud fra DCFH-DA-farvningsassayet.

  1. Ved afslutningen af behandlingsperioden (trin 1.8) vaskes cellerne med 1 ml fosfatbufret saltvand pr. brønd (1x PBS, pH 7,4) tre gange, og cellerne farves derefter med 100 μL 10 μM DCFH-DA pr. hul (se materialetabel). Inkuber cellerne i mørke i 30 min.
    BEMÆRK: Hvis der ikke observeres nogen tydelig grøn fluorescens efter 30 minutters inkubation, kan inkubationstiden for sonden og cellerne øges passende (30-60 min). Hvis der observeres overeksponering af den grønne fluorescensværdi efter 30 minutters inkubation, kan inkubationstiden for sonden og cellerne reduceres passende (15-30 min).
  2. Cellerne vaskes med 1x PBS (1 ml/hul) tre gange. Der tilsættes 1 ml 1x PBS til hvert hul.
  3. Placer pladen med 12 brønde på mikroskopstadiet (se materialetabel), og brug derefter et 20x mål til at observere cellernes morfologi (forstørrelse: 200x).
  4. Der tages tre repræsentative fluorescensbilleder (forstørrelse: 200x) for hvert hul på fluorescensmikroskopet ved hjælp af den grønne fluorescerende kanal med en excitationsbølgelængde på 480 nm og en emissionsbølgelængde på 530 nm.
    BEMÆRK: Den grønne fluorescerende kanal med en excitationsbølgelængde på 480 nm og en emissionsbølgelængde på 530 nm anbefales til at detektere DCFH-DA. Derudover kan DCFH-DA detekteres med parameterindstillingerne for GFP og FITC i fluorescensmikroskopet35,36.
  5. Til sidst skal du behandle billederne med billedoptagelsessoftware (se materialetabel) og derefter bruge ImageJ-software til at beregne den gennemsnitlige fluorescensintensitet for hver gruppe eller forholdet mellem de forskellige grupper.
    BEMÆRK: De tekniske detaljer om fluorescensmikroskopet og Image J-softwaren, der anvendes til billeddannelsesarbejdet, er tidligere beskrevet37,38.

3. Måling af ændringen i mitokondriemembranpotentiale

BEMÆRK: Ændringerne i mitokondriemembranpotentialet overvåges af JC-1-farvningsanalysen.

  1. Ved afslutningen af behandlingsperioden (trin 1.8) vaskes cellerne med 1 ml 1x PBS pr. hul tre gange, og cellerne bejdses derefter med 100 μL 5 μg/ml JC-1 arbejdsløsning (se materialetabel) i 30 minutter ved 37 °C i mørke.
    BEMÆRK: Hvis der ikke observeres nogen tydelig grøn fluorescens efter 30 minutters inkubation, kan inkubationstiden for sonden og cellerne øges passende (30-60 min). Hvis der observeres overeksponering af den grønne fluorescensværdi efter 30 minutters inkubation, kan inkubationstiden for sonden og cellerne reduceres passende (15-30 min).
  2. Cellerne vaskes med 1x PBS (1 ml/hul) tre gange. Der tilsættes 1 ml 1x PBS til hvert hul.
  3. Placer pladen med 12 brønde på mikroskoptrinnet, og brug derefter et 20x mål til at observere cellernes morfologi (forstørrelse: 200x).
  4. Der tages tre repræsentative fluorescensbilleder (forstørrelse: 200x) for hvert hul på fluorescensmikroskopet ved hjælp af den grønne fluorescerende kanal med excitations- og emissionsbølgelængder på henholdsvis 485 nm og 535 nm og den røde fluorescerende kanal med excitations- og emissionsbølgelængder på henholdsvis 550 nm og 600 nm.
    BEMÆRK: Den grønne fluorescerende kanal med en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 535 nm bruges til at detektere JC-1-monomeren, som behandles som depolariserede mitokondrier 39,40,41, og den røde fluorescerende kanal med en excitationsbølgelængde på 550 nm og en emissionsbølgelængde på 600 nm bruges til at detektere JC-1-dimeren, som behandles som polariserede mitokondrier 39,40,41.
  5. Til sidst skal du behandle billederne med billedoptagelsessoftware og derefter bruge Image J-software til at beregne den gennemsnitlige fluorescensintensitet for hver gruppe eller forholdet mellem de forskellige grupper.
    BEMÆRK: De tekniske detaljer om fluorescensmikroskopet og Image J-softwaren, der anvendes til billeddannelsesarbejdet, er tidligere beskrevet37,38.

4. Måling af proteinekspressionsniveauerne for LC3-II/LC3-I og p62/SQSTM1

  1. Efter behandling (trin 1.8) vaskes cellerne tre gange med 1x PBS (1 ml/hul), der er forkølet ved 4 °C.
  2. Der tilsættes RIPA lysisbuffer (100 μL/hul) suppleret med protease og en fosfatasehæmmercocktail (1x) (se materialetabel) til 12-brøndspladen, og lysér på is i 5 min.
  3. Cellelysatet opsamles i 1,5 ml mikrocentrifugeglas og centrifugeres ved 12.000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Supernatanternes proteinkoncentration bestemmes efter BCA-metoden efter standardprocedure42.
  4. Der tilsættes SDS-PAGE-prøveindlæsningsbuffer (5x, se materialetabel) til cellelysatsupernatanterne (volumenforhold = 1:4).
  5. Bland ved hvirvelstrøm (ved høj hastighed i ~15 s), og opvarm de blandede prøver ved 100 °C i 5 minutter for at denaturere proteinet.
  6. Sæt den 12-velforberedte 12% SDS-PAGE-gel i elektroforesetanken, og tilsæt derefter SDS-opprøvebufferen (1x) fortyndet med ultrarent vand til højdegrænsepositionen.
    BEMÆRK: SDS-PAGE-gelen fremstilles ved hjælp af et kommercielt sæt (se materialetabellen) i henhold til producentens anvisninger.
  7. Tilsæt proteinmarkøren (5 μL / brønd) og prøver (20 μg / brønd) i forskellige huller i SDS-PAGE-gelen.
  8. Indstil stabil spændingstilstand til 100 V, og udfør elektroforesen i 80 minutter.
  9. Efter SDS-PAGE-elektroforesen udføres elektrooverførslen af proteinerne til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (0,45 μM, se materialetabel) efter tidligere offentliggjorte rapporter43,44.
  10. Efter elektrooverførslen af proteinerne vaskes PVDF-membranen med 10 ml TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) to gange (5 min/tid) i en ryster ved stuetemperatur.
  11. Bloker PVDF-membranen med 5 ml bovint serumalbumin (BSA, 5%) i en ryster ved stuetemperatur i 1 time.
  12. PVDF-membranen vaskes med 10 ml TBST tre gange (10 min/tid). Derefter inkuberes PVDF-membranen i 5 ml af de specifikke primære antistoffer fortyndet i blokerende buffer for LC3 (mus mAb, 1:2.000), p62/SQSTM1 (i det følgende benævnt p62, mus mAb, 1:2.000) og β-actin (mus mAb, 1:2.000) (se materialetabel) natten over ved 4 °C.
  13. PVDF-membranen vaskes med 10 ml TBST tre gange (10 min/tid) ved stuetemperatur. Derefter inkuberes PVDF-membranen med kanin-anti-mus IgG (HRP) sekundært antistof fortyndet i blokerende buffer (1:10.000) (se materialetabel) ved stuetemperatur og beskyttet mod lys i 2 timer.
  14. PVDF-membranen vaskes med 10 ml TBST tre gange (10 min/tid) ved stuetemperatur. Placer derefter PVDF-membranen på plastfolien, tilsæt en passende mængde ECL-arbejdsløsning (200 μL / membran) (se materialetabel) og inkuber i 2 minutter.
  15. Efter inkubation skal du fjerne ECL-arbejdsløsningen og udsætte PVDF-membranen i billeddannelsessystemet til billedudvikling. Til sidst skal du bruge Image J-softwaren til at analysere de grå værdier for hvert bånd.
    BEMÆRK: De tekniske detaljer i Western blotting og Image J-softwaren, der anvendes til billeddannelsesarbejdet, er tidligere beskrevet45,46.

5. Statistisk analyse

  1. Præsenter dataene fra eksperimenterne som gennemsnittet ± standardafvigelse (SD).
  2. Udfør analysen af signifikans med det tidligere beskrevne statistiske softwareværktøj47.
  3. Beregn de statistiske forskelle mellem de to grupper ved hjælp af en t-test. En P-værdi under 0,05 betragtes som statistisk signifikant: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intracellulær ROS i cellerne
AML-12-celler blev induceret med 300 μM PA i 24 timer, og en NAFLD-cellemodel blev etableret. Derefter blev cellerne behandlet med PD i 24 timer. Cellerne blev mærket med en DCFH-DA fluorescerende sonde, og ROS-produktion blev observeret under et fluorescensmikroskop. Resultaterne af DCFH-DA-farvning af intracellulær ROS i cellerne er vist i figur 1. Resultaterne viste, at PD signifikant kunne reducere niveauet af intracellulær ROS i cellerne inkuberet med 300 μM PA (P < 0,01), hvilket indikerer, at PD kan reducere cellulært oxidativt stress.

Mitokondriemembranpotentiale i cellerne
Mitokondriet er den centrale organel styret af den iboende apoptosevej48,49,50. Derfor blev mitokondriemembranpotentialet (MMP) af AML-12-celler, der var blevet inkuberet med PD i 24 timer, observeret under et fluorescensmikroskop efter JC-1-farvning. Som vist i figur 2 var den grønne fluorescens (JC-1-monomerer, behandlet som depolariserede mitokondrier 39,40,41) i de PA-behandlede celler højere end i de ubehandlede celler. På den anden side var den røde fluorescens (JC-1-dimerer, behandlet som polariserede mitokondrier 39,40,41) i de PA-behandlede celler lavere end i de ubehandlede celler, hvilket indikerer PA-induceret MMP-depolarisering i cellerne. Derudover faldt forholdet mellem JC-1-monomerer:dimerer sammenlignet med modelgruppen i PD-behandlingsgruppen (P < 0,01), hvilket indikerer, at PD kunne forbedre PA-induceret MMP-depolarisering.

Proteinekspressionsniveauerne for LC3-II/LC3-I og p62
Denne undersøgelse undersøgte også PD's potentielle rolle på autofagivejen ved at undersøge proteinekspressionsniveauerne af autofagi-relaterede proteiner LC3 og p62 i cellerne ved western blotting. Som vist i figur 3 faldt forholdet mellem LC3-II:LC3-I signifikant (P < 0,005), og proteinekspressionsniveauet for p62 steg efter behandling med PA i 48 timer (P < 0,01). På den anden side kunne PD signifikant reducere proteinekspressionsniveauet for p62 (P < 0,01) og øge forholdet mellem LC3-II: LC3-I (P < 0,05), hvilket indikerer, at PD kan genoprette den autofagiske flux hæmmet af PA.

Figure 1
Figur 1: Effekter af PD på intracellulær ROS i cellerne vurderet ved DCFH-DA-farvning . (A) ROS-generering blev påvist ved fluorescensmikroskopi, 200x. Skalastang: 20 μm. (B) Relative foldændringer i ROS-niveauerne i forskellige grupper. Hver kolonne repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3). **P < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Effekter af PD på MMP-depolarisering i cellerne vurderet ved JC-1-farvning. (A) MMP-depolarisering blev påvist ved fluorescensmikroskopi, 200x. Skalabjælke: 20 μm. (B) Relative ændringer i forholdet mellem JC-1 monomerer:dimerer i de forskellige grupper. Hver kolonne repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3). **P < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Effekter af PD på proteinekspressionsniveauerne af LC3-II/LC3-I og p62 i cellerne vurderet ved western blotting. (A) Proteinniveauerne af LC3, p62 og β-actin blev påvist ved western blotting. (B) Relative ændringer i forholdet LC3-II:LC3-I i de forskellige grupper. (C) Relative foldændringer i ekspressionen af p62 i de forskellige grupper. Hver kolonne repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Undersøgelser har fremhævet det faktum, at NAFLD er et klinisk patologisk syndrom, der spænder fra fedtlever til NASH, der kan udvikle sig til skrumpelever og leverkræft51. En fedtfattig kost og en inaktiv livsstil er typiske risikofaktorer for NAFLD. Både ikke-medicinske terapier og lægemiddelterapier til NAFLD-behandling er blevet undersøgt51,52,53. Imidlertid er patogenesen af NAFLD ikke blevet fuldt belyst. Metoden beskrevet her involverer en in vitro-model af NAFLD etableret af PA-stimulerede AML-12-celler. Vi undersøgte de beskyttende virkninger af PD mod NAFLD i denne model, og vi fandt ud af, at PD dæmpede den PA-inducerede stigning i ROS. Desuden forbedrede PD også PA-induceret MMP-depolarisering. Desuden kunne PD signifikant reducere proteinekspressionsniveauet for p62 og øge forholdet mellem LC3-II:LC3-I. Disse eksperimentelle resultater kunne danne grundlag for anvendelsen af PD som en aktiv farmaceutisk ingrediens til NAFLD-behandling.

Som en vigtig intracellulær nedbrydningsvej realiserer autofagi den fysiologiske proces med genbrug og genbrug af næringsstofråmaterialer ved at nedbryde overskydende komponenter i celler 19,54. Autofagi er også en vigtig reparationsmekanisme for kroppen til at opretholde "yin-yang balance", og det er den mikroskopiske legemliggørelse af "qi transformation" i TCM55,56,57. I denne protokol blev PD's potentielle rolle på autofagivejen ud over at detektere ændringerne i ROS-produktion og MMP-depolarisering undersøgt ved at detektere proteinekspressionsniveauerne for autofagirelaterede proteiner LC-3 og p62 ved western blotting. Efter behandlingen af PA-inducerede celler med PD faldt forholdet mellem LC3-II: LC3-I, og akkumuleringen af p62 steg, hvilket indikerer, at niveauet af autofagi faldt. De eksperimentelle resultater er i overensstemmelse med andre litteraturrapporter 20,34,58,59. Denne in vitro-cellemodel kan bidrage til at forbedre forståelsen af PD's biologiske funktion og hjælpe med at studere brugen af andre aktive TCM-stoffer til behandling af NAFLD.

Der er nogle kritiske trin i den eksperimentelle proces. For at afgøre, om in vitro NAFLD-modellen er etableret med succes, kan lipiddråbeaflejringerne sammenlignes i de normale kontrol- og PA-behandlede gruppeceller ved Oil Red O-farvning, som beskrevet tidligere60,61. Efter DCFH-DA-farvning eller JC-1-farvning skal de resterende sonder, der ikke kommer ind i cellerne, vaskes af; Ellers vil dette medføre en høj baggrund, når du tager fluorescensbillederne. Derudover skal tiden (undtagen inkubationstid) mellem påfyldning og måling af fluorescerende sonder (DCFH-DA eller JC-1) forkortes for at reducere muligheden for eksperimentelle fejl. Desuden kan arbejdskoncentrationerne af de fluorescerende sonder (DCFH-DA eller JC-1) justeres efter behov, hvis fluorescensværdien af cellerne i den negative kontrolgruppe er relativt høj. Alternativt kan inkubationstiden for JC-1-arbejdsløsningen og cellerne justeres passende inden for en tidsramme på 15-60 minutter i henhold til de faktiske eksperimentelle betingelser.

Der er også nogle begrænsninger i denne in vitro-cellemodel. Celler såsom hepatiske parenkymale celler, hepatiske stellatceller, Kupffer-celler og vaskulære endotelceller er til stede i levervæv62. Derfor er eksperimenter kun på hepatiske parenkymale celler muligvis ikke tilstrækkelige til at forklare virkningerne af lægemidler. Andre cellemodeller skal også bruges til anti-NAFLD-lægemiddelopdagelse. Derudover er tredimensionelle (3D) cellekultursystemer blevet brugt til at konstruere levermodeller og teste hepatotoksicitet63,64. Fremtidige undersøgelser vil fokusere på at udvikle in vitro-modeller ved hjælp af co-kultur og 3D-cellekulturteknikker til potentiel anti-NAFLD-lægemiddelscreening.

Som en multisystemsygdom spiller mange faktorer en rolle i udviklingen og progressionen af NAFLD, hvilket betyder, at en enkelt dyremodel eller cellemodel ikke fuldt ud kan efterligne alle de patologiske processer i denne sygdom65. Overdreven afhængighed af brugen af dyremodeller øger byrden ved terapeutisk lægemiddeludvikling. Brug af in vitro-cellemodeller i de tidlige stadier af anti-NAFLD-lægemiddeludvikling er mere praktisk og omkostningseffektiv. I denne undersøgelse blev en normal musehepatocytcellelinje AML-12 anvendt til at konstruere in vitro-modellen af NAFLD, og den terapeutiske virkning af PD blev valideret i denne model. Resultaterne af denne undersøgelse giver især grundlag for yderligere forskning i anti-NAFLD-virkningerne af PD i mus hepatocyt og primære hepatocytmodeller.

Afslutningsvis præsenteres en in vitro-model til undersøgelse af de beskyttende virkninger af PD mod NAFLD her. Dette kunne også være en nyttig in vitro-model til undersøgelse af effektiviteten af andre aktive stoffer i TCM til behandling af NAFLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde støttes af tilskud fra Chongqing Science and Technology Commission (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 og jbky20210029) og China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2021MD703919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480 (2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532 (2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71 (2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834 (2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622 (2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973 (2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479 (2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13 (2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128 (2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87 (2012).
  45. Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
  46. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590 (2014).
  47. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  48. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  49. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  50. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  51. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  52. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  53. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  54. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  55. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  56. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359 (2016).
  57. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976 (2021).
  58. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459 (2018).
  59. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  60. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  61. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  62. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  63. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060 (2020).
  64. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  65. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 190 Platycodin D palmitinsyre reaktive iltarter mitokondriemembranpotentiale autofagi
Undersøgelse af de beskyttende virkninger af Platycodin D på ikke-alkoholisk fedtleversygdom i en palmitinsyre-induceret <em>in vitro-model</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., … More

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter