Este protocolo investiga los efectos protectores de la platycodin D sobre la enfermedad del hígado graso no alcohólico en un modelo in vitro inducido por ácido palmítico.
La incidencia de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) ha aumentado a un ritmo alarmante en todo el mundo. Platycodon grandiflorum es ampliamente utilizado como etnomedicina tradicional para el tratamiento de diversas enfermedades y es un alimento funcional típico que se puede incorporar a la dieta diaria. Los estudios han sugerido que la platycodin D (PD), uno de los principales ingredientes activos de Platycodon grandiflorum, tiene una alta biodisponibilidad y mitiga significativamente el progreso de NAFLD, pero el mecanismo subyacente de esto aún no está claro. Este estudio tiene como objetivo investigar el efecto terapéutico de la EP contra la EHGNA in vitro. Las células de AML-12 se trataron previamente con ácido palmítico (PA) de 300 μM durante 24 h para modelar NAFLD in vitro. Luego, las células fueron tratadas con EP o no recibieron tratamiento con EP durante 24 h. Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) se analizaron mediante tinción de diacetato de 2′,7′-dicloro-dihidrofluoresceína (DCFH-DA), y el potencial de membrana mitocondrial se determinó mediante el método de tinción JC-1. Además, los niveles de expresión proteica de LC3-II/LC3-I y p62/SQSTM1 en los lisados celulares se analizaron mediante western blotting. Se encontró que la EP disminuye significativamente los niveles de ROS y potencial de membrana mitocondrial en el grupo tratado con PA en comparación con el grupo control. Mientras tanto, la DP aumentó los niveles de LC3-II/LC3-I y disminuyó los niveles de p62/SQSTM1 en el grupo tratado con PA en comparación con el grupo control. Los resultados indicaron que la EP mejoró la NAFLD in vitro al reducir el estrés oxidativo y estimular la autofagia. Este modelo in vitro es una herramienta útil para estudiar el papel de la EP en la EHGNA.
Platycodon grandiflorus (PG), que es la raíz seca de Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., se utiliza en la medicina tradicional china (MTC). Se produce principalmente en las regiones noreste, norte, este, centro y suroeste de China1. Los componentes PG incluyen saponinas triterpenoides, polisacáridos, flavonoides, polifenoles, polietilenglicoles, aceites volátiles y minerales2. PG tiene una larga historia de ser utilizado como un alimento y una medicina herbal en Asia. Tradicionalmente, esta hierba se usaba para hacer medicamentos contra las enfermedades pulmonares. La farmacología moderna también proporciona evidencia de la eficacia de PG para tratar otras enfermedades. Los estudios han demostrado que PG tiene un efecto terapéutico en una variedad de modelos de lesión hepática inducida por fármacos. La suplementación dietética de extractos de PG o platycodin puede mejorar la obesidad inducida por la dieta alta en grasas y sus enfermedades metabólicas relacionadas 3,4,5. Los polisacáridos de PG se pueden utilizar para el tratamiento de la lesión hepática aguda causada por LPS / D-GalN en ratones6. Además, las saponinas de las raíces de PG mejoran la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta alta en grasas (EHNA)7. Además, la platycodin D (PD), uno de los componentes terapéuticos más importantes de PG, puede mejorar la expresión del receptor de lipoproteínas de baja densidad y la captación de lipoproteínas de baja densidad en células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2)8. Además, la EP también puede inducir apoptosis e inhibir la adhesión, migración e invasión en las células HepG2 9,10. Por lo tanto, en este estudio, las células de ratón de hepatoma AML-12 se utilizan para la construcción de modelos in vitro y para estudiar más a fondo los efectos farmacológicos y los mecanismos subyacentes de la EP en este modelo.
El término enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) se refiere a un grupo de enfermedades hepáticas que incluye esteatosis simple, NASH, cirrosis y carcinoma hepatocelular11. Aunque la patogénesis de NAFLD no se comprende completamente, desde la teoría clásica de “dos golpes” hasta la teoría actual de “múltiples golpes”, la resistencia a la insulina se considera central en la patogénesis de NAFLD12,13,14. Los estudios han demostrado que la resistencia a la insulina en los hepatocitos podría conducir a un aumento de los ácidos grasos libres, que forman triglicéridos que se depositan en el hígado y hacen que el hígado se vuelva graso15,16. La acumulación de grasa puede conducir a lipotoxicidad, disfunción mitocondrial inducida por estrés oxidativo, estrés del retículo endoplásmico y liberación de citoquinas inflamatorias, lo que resulta en la patogénesis y progresión de NAFLD17,18. Además, la autofagia también juega un papel en la patogénesis de NAFLD, ya que está involucrada en la regulación de la sensibilidad celular a la insulina, el metabolismo lipídico celular, la lesión de hepatocitos y la inmunidad innata 19,20,21.
Se han establecido una variedad de modelos animales y modelos celulares para proporcionar una base para explorar la patogénesis y los posibles objetivos terapéuticos de NAFLD22,23. Sin embargo, los modelos de un solo animal no pueden imitar completamente todos los procesos patológicos de NAFLD24. Las diferencias individuales entre los animales conducen a diferentes características patológicas. El uso de líneas celulares hepáticas o hepatocitos primarios en estudios in vitro de NAFLD garantiza la máxima consistencia en las condiciones experimentales. La desregulación del metabolismo lipídico hepático puede conducir a niveles más altos de acumulación de gotitas lipídicas de hepatocitos en NAFLD25. Los ácidos grasos libres como el ácido oleico y el aceite de palma han sido utilizados en el modelo in vitro para imitar la EHGNA causada por una dieta alta en grasas26,27. La línea celular de hepatoblastoma humano HepG2 se utiliza a menudo en la construcción de modelos de NAFLD in vitro, pero, como línea celular tumoral, el metabolismo de las células HepG2 es significativamente diferente del de las células hepáticas en condiciones fisiológicas normales28. Por lo tanto, el uso de hepatocitos primarios o hepatocitos primarios de ratón para construir el modelo in vitro de NAFLD para la detección de fármacos es más ventajoso que el uso de líneas celulares tumorales. Al comparar el examen sinérgico de los efectos de los fármacos y las dianas terapéuticas tanto en modelos animales como en modelos de hepatocitos in vitro, parece que el uso de hepatocitos de ratón para construir el modelo de hígado graso no alcohólico in vitro tiene un mejor potencial de aplicación.
Los ácidos grasos libres que entran en el hígado se oxidan para producir energía o se almacenan como triglicéridos. Significativamente, los ácidos grasos libres tienen cierta lipotoxicidad y pueden inducir disfunción celular y apoptosis12. El ácido palmítico (AP) es el ácido graso saturado más abundante en el plasma humano29. Cuando las células en el tejido no adiposo están expuestas a altas concentraciones de PA durante mucho tiempo, esto estimula la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y causa estrés oxidativo, acumulación de lípidos e incluso apoptosis30. Por lo tanto, muchos investigadores utilizan PA como inductor para estimular las células hepáticas para producir ROS y, así, construir el modelo de enfermedad del hígado graso in vitro y evaluar los efectos protectores de ciertas sustancias activas en las células31,32,33,34. Este estudio introduce un protocolo para investigar los efectos protectores de la EP en un modelo celular de NAFLD inducida por PA.
Estudios han destacado el hecho de que NAFLD es un síndrome clínico-patológico, que va desde el hígado graso hasta NASH, que puede progresar a cirrosis y cáncer de hígado51. Una dieta alta en grasas y un estilo de vida inactivo son factores de riesgo típicos para NAFLD. Tanto las terapias no farmacológicas como las terapias farmacológicas para el tratamiento de NAFLD se han investigado51,52,53. S…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de la Comisión de Ciencia y Tecnología de Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 y jbky20210029) y la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (No. 2021MD703919).
5% BSA Blocking Buffer | Solarbio, Beijing, China | SW3015 | |
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line | Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China | AML12 | |
Beyo ECL Plus | Beyotime, Shanghai, China | P0018S | |
Bio-safety cabinet | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | AC2-5S1 A2 | |
cellSens | Olympus, Tokyo, Japan | 1.8 | |
Culture CO2 Incubator | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | CCL-170B-8 | |
Dexamethasone | Beyotime, Shanghai, China | ST125 | |
Dimethyl sulfoxide | Solarbio, Beijing, China | D8371 | |
DMEM/F12 | Hyclone, Logan, UT, USA | SH30023.01 | |
Foetal Bovine Serum | Hyclone, Tauranga, New Zealand | SH30406.05 | |
Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 8.0 | |
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | ABclonal, Wuhan, China | AS003 | |
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane | Merck, Darmstadt, Germany | IPFL00010 | |
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× | Beyotime, Shanghai, China | C0341 | |
MAP LC3β Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-376404 | |
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 | Solarbio, Beijing, China | M8650 | |
Olympus Inverted Microscope IX53 | Olympus, Tokyo, Japan | IX53 | |
Palmitic Acid | Sigma, Germany | P0500 | |
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | Hyclone, Logan, UT, USA | SV30010 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Beyotime, Shanghai, China | ST506 | |
Phosphate Buffered Solution | Hyclone, Logan, UT, USA | BL302A | |
Platycodin D | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China | CSA: 58479-68-8 | |
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x | Beyotime, Shanghai, China | P1005 | |
Protein Marker | Solarbio, Beijing, China | PR1910 | |
Reactive Oxygen Species Assay Kit | Solarbio, Beijing, China | CA1410 | |
RIPA Lysis Buffer | Beyotime, Shanghai, China | P0013E | |
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit | Beyotime, Shanghai, China | P0012AC | |
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x | Beyotime, Shanghai, China | P0015 | |
Sigma Centrifuge | Sigma, Germany | 3K15 | |
SQSTM1/p62 Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-28359 | |
Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH, Austria | 1510002987 | |
WB Transfer Buffer,10x | Solarbio, Beijing, China | D1060 | |
β-Actin Mouse mAb | ABclonal, Wuhan, China | AC004 |