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Medicine

Untersuchung der protektiven Wirkung von Platycodin D auf die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung in einem Palmitinsäure-induzierten In-vitro-Modell

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64816
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll untersucht die protektive Wirkung von Platycodin D auf die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung in einem Palmitinsäure-induzierten In-vitro-Modell .

Abstract

Das Auftreten der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) hat weltweit alarmierend zugenommen. Platycodon grandiflorum wird häufig als traditionelle Ethnomedizin zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt und ist ein typisches funktionelles Lebensmittel, das in die tägliche Ernährung integriert werden kann. Studien deuten darauf hin, dass Platycodin D (PD), einer der Hauptwirkstoffe in Platycodon grandiflorum, eine hohe Bioverfügbarkeit aufweist und das Fortschreiten der NAFLD signifikant abschwächt, aber der zugrunde liegende Mechanismus ist noch unklar. Ziel dieser Studie ist es, die therapeutische Wirkung von Parkinson gegen NAFLD in vitro zu untersuchen. AML-12-Zellen wurden mit 300 μM Palmitinsäure (PA) für 24 h vorbehandelt, um NAFLD in vitro zu modellieren. Dann wurden die Zellen entweder mit Parkinson behandelt oder erhielten 24 Stunden lang keine Parkinson-Behandlung. Die Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurden mittels 2′,7′-Dichlor-Dihydro-Fluorescein-Diacetat (DCFH-DA)-Färbung analysiert, und das mitochondriale Membranpotential wurde durch die JC-1-Färbemethode bestimmt. Darüber hinaus wurden die Proteinexpressionsniveaus von LC3-II/LC3-I und p62/SQSTM1 in den Zelllysaten mittels Western Blot analysiert. Es wurde festgestellt, dass Parkinson die ROS- und Mitochondrienmembranpotentialspiegel in der PA-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert. Währenddessen erhöhte die Parkinson-Krankheit die LC3-II/LC3-I-Spiegel und senkte die p62/SQSTM1-Spiegel in der PA-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Ergebnisse zeigten, dass Parkinson die NAFLD in vitro verbesserte, indem es oxidativen Stress reduzierte und die Autophagie stimulierte. Dieses In-vitro-Modell ist ein nützliches Werkzeug, um die Rolle von Parkinson bei NAFLD zu untersuchen.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), die getrocknete Wurzel von Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., wird in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) verwendet. Es wird hauptsächlich in den nordöstlichen, nördlichen, östlichen, zentralen und südwestlichen Regionen Chinasproduziert 1. Zu den PG-Komponenten gehören Triterpenoid-Saponine, Polysaccharide, Flavonoide, Polyphenole, Polyethylenglykole, ätherische Öle und Mineralien2. PG hat eine lange Geschichte der Verwendung als Lebensmittel und Kräutermedizin in Asien. Traditionell wurde dieses Kraut zur Herstellung von Medikamenten gegen Lungenkrankheiten verwendet. Die moderne Pharmakologie liefert auch Hinweise auf die Wirksamkeit von PG bei der Behandlung anderer Krankheiten. Studien haben gezeigt, dass PG eine therapeutische Wirkung auf eine Vielzahl von medikamenteninduzierten Leberschädigungsmodellen hat. Die Nahrungsergänzung mit PG- oder Platycodin-Extrakten kann fettreiche, ernährungsbedingte Fettleibigkeit und die damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen lindern 3,4,5. Polysaccharide aus PG können zur Behandlung von akuten Leberschäden verwendet werden, die durch LPS/D-GalN bei Mäusen verursacht werden6. Darüber hinaus verbessern Saponine aus den Wurzeln von PG die fettreiche, diätinduzierte nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH)7. Darüber hinaus kann Platycodin D (PD), eine der wichtigsten therapeutischen Komponenten von PG, die Expression von Lipoproteinrezeptoren niedriger Dichte und die Aufnahme von Lipoproteinen niedriger Dichte in humanen hepatozellulären Karzinomzellen (HepG2) verbessern8. Darüber hinaus kann Parkinson auch Apoptose induzieren und Adhäsion, Migration und Invasion in HepG2-Zellen hemmen 9,10. Daher werden in dieser Studie Hepatoma-AML-12-Zellen der Maus für die In-vitro-Modellkonstruktion und zur weiteren Untersuchung der pharmakologischen Wirkungen und der zugrunde liegenden Mechanismen der Parkinson-Krankheit in diesem Modell verwendet.

Der Begriff nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) bezieht sich auf eine Gruppe von Lebererkrankungen, zu denen einfache Steatose, NASH, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinomgehören 11. Obwohl die Pathogenese der NAFLD von der klassischen "Two-Hit"-Theorie bis zur aktuellen "Multiple-Hit"-Theorie unvollständig verstanden ist, wird die Insulinresistenz als zentral für die Pathogenese der NAFLDangesehen 12,13,14. Studien haben gezeigt, dass eine Insulinresistenz in Hepatozyten zu einem erhöhten Anteil an freien Fettsäuren führen kann, die Triglyceride bilden, die sich in der Leber ablagern und dazu führen, dass die Leber fett wird15,16. Die Ansammlung von Fett kann zu Lipotoxizität, oxidativem Stress induzierter mitochondrialer Dysfunktion, endoplasmatischem Retikulumstress und entzündlicher Zytokinfreisetzung führen, was zur Pathogenese und Progression von NAFLD17,18 führt. Darüber hinaus spielt die Autophagie auch eine Rolle bei der Pathogenese der NAFLD, da sie an der Regulierung der zellulären Insulinsensitivität, des zellulären Fettstoffwechsels, der Hepatozytenschädigung und der angeborenen Immunität beteiligt ist 19,20,21.

Eine Vielzahl von Tiermodellen und zellulären Modellen wurde etabliert, um eine Grundlage für die Erforschung der Pathogenese und potenzieller therapeutischer Ziele von NAFLD22,23 zu schaffen. Einzeltiermodelle können jedoch nicht alle pathologischen Prozesse von NAFLD24 vollständig nachahmen. Individuelle Unterschiede zwischen Tieren führen zu unterschiedlichen pathologischen Merkmalen. Die Verwendung von Leberzelllinien oder primären Hepatozyten in In-vitro-Studien der NAFLD gewährleistet eine maximale Konsistenz unter den experimentellen Bedingungen. Eine Dysregulation des hepatischen Lipidstoffwechsels kann bei NAFLD25 zu einer höheren Akkumulation von Hepatozyten-Lipidtröpfchen führen. Freie Fettsäuren wie Ölsäure und Palmöl wurden im In-vitro-Modell verwendet, um NAFLD nachzuahmen, die durch eine fettreiche Ernährung verursacht wurde26,27. Die humane Hepatoblastom-Zelllinie HepG2 wird häufig bei der Konstruktion von NAFLD-Modellen in vitro verwendet, aber als Tumorzelllinie unterscheidet sich der Metabolismus von HepG2-Zellen signifikant von dem von Leberzellen unter normalen physiologischen Bedingungen28. Daher ist die Verwendung von primären Hepatozyten oder primären Hepatozyten der Maus zur Konstruktion des In-vitro-NAFLD-Modells für das Wirkstoffscreening vorteilhafter als die Verwendung von Tumorzelllinien. Vergleicht man die synergistische Untersuchung von Arzneimittelwirkungen und therapeutischen Zielen sowohl in Tiermodellen als auch in vitro-Hepatozytenmodellen, so scheint es, dass die Verwendung von Maushepatozyten zur Konstruktion des In-vitro-NAFLD-Modells ein besseres Anwendungspotenzial hat.

Freie Fettsäuren, die in die Leber gelangen, werden zur Energiegewinnung oxidiert oder als Triglyceride gespeichert. Bezeichnenderweise weisen freie Fettsäuren eine gewisse Fettotoxizität auf und können zelluläre Funktionsstörungen und Apoptose induzieren12. Palmitinsäure (PA) ist die am häufigsten vorkommende gesättigte Fettsäure im menschlichen Plasma29. Wenn Zellen in nicht-adipösem Gewebe über einen längeren Zeitraum hohen Konzentrationen von PA ausgesetzt sind, stimuliert dies die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und verursacht oxidativen Stress, Lipidakkumulation und sogar Apoptose30. Daher verwenden viele Forscher PA als Induktor, um Leberzellen zur Produktion von ROS anzuregen und so das In-vitro-Modell der Fettlebererkrankung zu konstruieren und die schützende Wirkung bestimmter Wirkstoffe auf Zellen zu bewerten31,32,33,34. Diese Studie stellt ein Protokoll zur Untersuchung der protektiven Wirkungen von Parkinson auf ein Zellmodell von NAFLD vor, das durch PA induziert wird.

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Protocol

AML-12-Zellen (eine normale Hepatozyten-Zelllinie der Maus) werden für die zellbasierten Studien verwendet. Die Zellen werden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Vorbehandlung der AML-12-Zellen zur Modellierung der NAFLD in vitro

  1. Halten Sie die Zellen in normalen Zellkulturmedien (DMEM plus Ham's F12 [1:1] mit 0,005 mg/ml Insulin, 5 ng/ml Selen, 0,005 mg/ml Transferrin, 40 ng/ml Dexamethason und 10 % fötalem Rinderserum [FBS], siehe Materialtabelle) bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 auf.
  2. Säen Sie die Zellen in 12-Well-Platten (1 ml / Well) mit einer Dichte von 2,8 x 105 Zellen / Well.
    HINWEIS: Alle Zellverdauungs- und Medienaustauschvorgänge werden in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt, um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.
  3. Entfernen Sie das Kulturmedium der Zellen nach der Inkubation über Nacht (~ 10 h) und waschen Sie die Zellen dann zweimal mit 1 ml serumfreiem Medium (pro Vertiefung).
  4. Teilen Sie die 12-Well-Zellplatte von links nach rechts in vier verschiedene Behandlungsgruppen auf, darunter (1) die Kontrollgruppe, (2) die mit Parkinson behandelte Gruppe, (3) die mit PA behandelte Gruppe und (4) die mit PA + PD behandelte Gruppe.
    HINWEIS: Drei Replikate jeder experimentellen Behandlungsgruppe sind von oben nach unten auf derselben 12-Well-Zellplatte angeordnet.
  5. Fügen Sie die normalen Zellkulturmedien (1 ml/Well) zur Kontrollgruppe und zur mit Parkinson behandelten Gruppe hinzu und fügen Sie die normalen Zellkulturmedien (1 ml/Well), die mit 300 μM PA ergänzt sind, zur PA-behandelten und PA + PD-behandelten Gruppe hinzu.
  6. Entfernen Sie das Kulturmedium der Zellen nach 24 Stunden Inkubation und waschen Sie die Zellen dann zweimal mit 1 ml serumfreiem Medium (pro Vertiefung).
  7. Fügen Sie der Kontrollgruppe normale Zellkulturmedien (1 ml/Well) hinzu, die mit einem Vehikel (Dimethylsulfoxid, DMSO, 0,1% v/v) ergänzt werden. Zugabe normaler Zellkulturmedien (1 ml/Well), die mit 1 μM PD ergänzt sind, zur PD-behandelten Gruppe; Zugabe normaler Zellkulturmedien (1 ml/Well), ergänzt mit 300 μM PA, zur PA-behandelten Gruppe; Fügen Sie der PA + PD-behandelten Gruppe normale Zellkulturmedien (1 ml/Well) hinzu, die mit 300 μM PA und 1 μM PD ergänzt wurden.
  8. Untersuchen Sie nach einer Inkubation von weiteren 24 Stunden die schützenden Wirkungen von Parkinson auf Zellen mittels 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)-Färbung (Schritt 2), JC-1-Färbung (Schritt 3) und Western-Blot (Schritt 4).
    HINWEIS: Alle Inkubationsvorgänge werden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 durchgeführt.

2. Messung der Veränderung der ROS-Produktion

HINWEIS: Die intrazellulären ROS-Spiegel in den Zellen werden auf der Grundlage des DCFH-DA-Färbeassays bewertet.

  1. Waschen Sie die Zellen am Ende des Behandlungszeitraums (Schritt 1.8) dreimal mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung pro Vertiefung (1x PBS, pH 7,4) und färben Sie die Zellen dann mit 100 μl 10 μM DCFH-DA pro Vertiefung (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln.
    HINWEIS: Wenn nach 30 Minuten Inkubation keine offensichtliche grüne Fluoreszenz beobachtet wird, kann die Inkubationszeit der Sonde und der Zellen entsprechend verlängert werden (30-60 Minuten). Wenn nach 30 min Inkubation eine Überbelichtung des grünen Fluoreszenzwertes beobachtet wird, kann die Inkubationszeit der Sonde und der Zellen entsprechend verkürzt werden (15-30 min).
  2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS (1 ml/Well). Fügen Sie 1 ml 1x PBS zu jeder Vertiefung hinzu.
  3. Legen Sie die 12-Well-Platte auf den Mikroskoptisch (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie dann ein 20-faches Objektiv, um die Morphologie der Zellen zu beobachten (Vergrößerung: 200-fach).
  4. Nehmen Sie drei repräsentative Fluoreszenzbilder (Vergrößerung: 200x) für jede Vertiefung am Fluoreszenzmikroskop auf, indem Sie den grünen Fluoreszenzkanal mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm verwenden.
    HINWEIS: Der grüne Fluoreszenzkanal mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm wird empfohlen, um den DCFH-DA zu detektieren. Zusätzlich kann DCFH-DA mit den Parametereinstellungen für GFP und FITC im Fluoreszenzmikroskop35,36 detektiert werden.
  5. Verarbeiten Sie schließlich die Bilder mit einer Bilderfassungssoftware (siehe Materialtabelle) und berechnen Sie dann mit der ImageJ-Software die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Gruppe oder die Verhältnisse der verschiedenen Gruppen.
    ANMERKUNG: Die technischen Details des Fluoreszenzmikroskops und der Bild-J-Software, die für die Bildgebungsarbeiten verwendet wurden, wurden zuvorbeschrieben 37,38.

3. Messung der Änderung des mitochondrialen Membranpotentials

HINWEIS: Die Änderungen des mitochondrialen Membranpotentials werden durch den JC-1-Färbetest überwacht.

  1. Waschen Sie die Zellen am Ende des Behandlungszeitraums (Schritt 1.8) dreimal mit 1 ml 1x PBS pro Vertiefung und färben Sie die Zellen dann mit 100 μl 5 μg/ml JC-1-Arbeitslösung (siehe Materialtabelle) 30 min lang bei 37 °C im Dunkeln.
    HINWEIS: Wenn nach 30 Minuten Inkubation keine offensichtliche grüne Fluoreszenz beobachtet wird, kann die Inkubationszeit der Sonde und der Zellen entsprechend verlängert werden (30-60 Minuten). Wenn nach 30 min Inkubation eine Überbelichtung des grünen Fluoreszenzwertes beobachtet wird, kann die Inkubationszeit der Sonde und der Zellen entsprechend verkürzt werden (15-30 min).
  2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS (1 ml/Well). Fügen Sie 1 ml 1x PBS zu jeder Vertiefung hinzu.
  3. Legen Sie die 12-Well-Platte auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie dann ein 20-faches Objektiv, um die Morphologie der Zellen zu beobachten (Vergrößerung: 200-fach).
  4. Nehmen Sie drei repräsentative Fluoreszenzbilder (Vergrößerung: 200x) für jede Vertiefung am Fluoreszenzmikroskop auf, wobei Sie den grünen Fluoreszenzkanal mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 nm bzw. 535 nm und den roten Fluoreszenzkanal mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 550 nm bzw. 600 nm verwenden.
    HINWEIS: Der grüne Fluoreszenzkanal mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm wird verwendet, um das JC-1-Monomer zu detektieren, das als depolarisierte Mitochondrien 39,40,41 behandelt wird, und der rote Fluoreszenzkanal mit einer Anregungswellenlänge von 550 nm und einer Emissionswellenlänge von 600 nm wird verwendet, um das JC-1-Dimer zu detektieren. die als polarisierte Mitochondrien 39,40,41 behandelt werden.
  5. Verarbeiten Sie schließlich die Bilder mit einer Bilderfassungssoftware und verwenden Sie dann die Software Image J, um die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Gruppe oder die Verhältnisse der verschiedenen Gruppen zu berechnen.
    ANMERKUNG: Die technischen Details des Fluoreszenzmikroskops und der Bild-J-Software, die für die Bildgebungsarbeiten verwendet wurden, wurden zuvorbeschrieben 37,38.

4. Messung der Proteinexpressionsniveaus von LC3-II/LC3-I und p62/SQSTM1

  1. Waschen Sie die Zellen nach der Behandlung (Schritt 1.8) dreimal mit 1x PBS (1 ml/Well), das auf 4 °C vorgekühlt wurde.
  2. RIPA-Lysepuffer (100 μl/Well), ergänzt mit Protease und einem Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (1x) (siehe Materialtabelle), auf die 12-Well-Platte geben und 5 Minuten lang auf Eis lysieren.
  3. Das Zelllysat wird in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt und bei 12.000 x g 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Überstände nach der BCA-Methode gemäß den Standardverfahren42.
  4. Fügen Sie den Zelllysatüberständen einen SDS-PAGE-Probenladepuffer (5x, siehe Materialtabelle) hinzu (Volumenverhältnis = 1:4).
  5. Mischen Sie durch Vortexen (bei hoher Geschwindigkeit für ~ 15 s) und erhitzen Sie die gemischten Proben bei 100 °C für 5 Minuten, um das Protein zu denaturieren.
  6. Geben Sie das 12-fach gut vorbereitete 12%ige SDS-PAGE-Gel in den Elektrophoresetank und geben Sie dann den mit Reinstwasser verdünnten SDS-Up-Sample-Puffer (1x) bis zur Höhenbegrenzungsposition hinzu.
    HINWEIS: Das SDS-PAGE-Gel wird mit einem handelsüblichen Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.
  7. Geben Sie den Proteinmarker (5 μl/Well) und die Proben (20 μg/Well) in verschiedene Vertiefungen des SDS-PAGE-Gels.
  8. Stellen Sie den stabilen Spannungsmodus auf 100 V ein und führen Sie die Elektrophorese 80 Minuten lang durch.
  9. Führen Sie nach der SDS-PAGE-Elektrophorese den Elektrotransfer der Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (0,45 μM, siehe Materialtabelle) gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten43,44 durch.
  10. Nach dem Elektrotransfer der Proteine wird die PVDF-Membran mit 10 mL TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) zweimal (5 min/Zeit) in einem Shaker bei Raumtemperatur gewaschen.
  11. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 5 ml Rinderserumalbumin (BSA, 5%) in einem Schüttler bei Raumtemperatur für 1 h.
  12. Waschen Sie die PVDF-Membran dreimal (10 min/Zeit) mit 10 ml TBST. Anschließend wird die PVDF-Membran in 5 ml der spezifischen Primärantikörper inkubiert, die in Blockierungspuffer für LC3 (Maus-mAb, 1:2.000), p62/SQSTM1 (im Folgenden als p62, Maus-mAb 1:2.000 bezeichnet) und β-Aktin (Maus-mAb, 1:2.000) (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 °C verdünnt sind.
  13. Waschen Sie die PVDF-Membran dreimal (10 min/Zeit) mit 10 ml TBST bei Raumtemperatur. Anschließend wird die PVDF-Membran mit einem Kaninchen-Anti-Maus-IgG (HRP)-Sekundärantikörper inkubiert, der in Blockpuffer (1:10.000) (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur verdünnt und 2 h lang vor Licht geschützt ist.
  14. Waschen Sie die PVDF-Membran dreimal (10 min/Zeit) mit 10 ml TBST bei Raumtemperatur. Legen Sie dann die PVDF-Membran auf die Plastikfolie, fügen Sie eine geeignete Menge ECL-Arbeitslösung (200 μl/Membran) hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.
  15. Entfernen Sie nach der Inkubation die ECL-Arbeitslösung und legen Sie die PVDF-Membran zur Bildentwicklung im Bildgebungssystem frei. Verwenden Sie schließlich die Image J-Software, um die Grauwerte der einzelnen Bänder zu analysieren.
    ANMERKUNG: Die technischen Details der Western-Blotting- und Image-J-Software, die für die Bildgebungsarbeiten verwendet wurden, wurden zuvorbeschrieben 45,46.

5. Statistische Analyse

  1. Präsentieren Sie die Daten aus den Experimenten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD).
  2. Führen Sie die Signifikanzanalyse mit dem zuvor beschriebenen statistischen Softwaretool47 durch.
  3. Berechnen Sie die statistischen Unterschiede zwischen den beiden Gruppen mit einem t-Test. Ein P-Wert unter 0,05 gilt als statistisch signifikant: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

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Representative Results

Intrazelluläre ROS in den Zellen
AML-12-Zellen wurden mit 300 μM PA für 24 h induziert und ein NAFLD-Zellmodell wurde etabliert. Anschließend wurden die Zellen 24 h lang mit Parkinson behandelt. Die Zellen wurden mit einer DCFH-DA-Fluoreszenzsonde markiert und die ROS-Produktion wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Ergebnisse der DCFH-DA-Färbung von intrazellulärem ROS in den Zellen sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass Parkinson den Gehalt an intrazellulärer ROS in den Zellen, die mit 300 μM PA (P < 0,01) inkubiert wurden, signifikant reduzieren konnte, was darauf hindeutet, dass Parkinson den zellulären oxidativen Stress reduzieren kann.

Mitochondriales Membranpotential der Zellen
Das Mitochondrium ist die zentrale Organelle, die durch den intrinsischen Apoptoseweg48,49,50 gesteuert wird. Daher wurde das mitochondriale Membranpotential (MMP) von AML-12-Zellen, die 24 h lang mit Parkinson inkubiert worden waren, nach der JC-1-Färbung unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Wie in Abbildung 2 gezeigt, war die grüne Fluoreszenz (JC-1-Monomere, behandelt als depolarisierte Mitochondrien 39,40,41) in den PA-behandelten Zellen höher als in den unbehandelten Zellen. Andererseits war die rote Fluoreszenz (JC-1-Dimere, behandelt als polarisierte Mitochondrien 39,40,41) in den PA-behandelten Zellen niedriger als in den unbehandelten Zellen, was auf eine PA-induzierte MMP-Depolarisation in den Zellen hinweist. Darüber hinaus nahm das Verhältnis von JC-1-Monomeren zu Dimeren im Vergleich zur Modellgruppe in der PD-Behandlungsgruppe ab (P < 0,01), was darauf hindeutet, dass Parkinson die PA-induzierte MMP-Depolarisation verbessern könnte.

Die Proteinexpressionsniveaus von LC3-II/LC3-I und p62
Diese Studie untersuchte auch die mögliche Rolle von Parkinson auf den Autophagieweg, indem sie die Proteinexpressionsniveaus der Autophagie-verwandten Proteine LC3 und p62 in den Zellen durch Western Blot untersuchte. Wie in Abbildung 3 gezeigt, nahm das Verhältnis von LC3-II:LC3-I signifikant ab (P < 0,005) und das Proteinexpressionsniveau von p62 stieg nach 48-stündiger Behandlung mit PA an (P < 0,01). Auf der anderen Seite könnte Parkinson das Proteinexpressionsniveau von p62 signifikant reduzieren (P < 0,01) und das Verhältnis von LC3-II:LC3-I (P < 0,05) erhöhen, was darauf hindeutet, dass Parkinson den durch PA gehemmten autophagischen Fluss wiederherstellen kann.

Figure 1
Abbildung 1: Auswirkungen von Parkinson auf intrazelluläre ROS in den Zellen, bewertet durch DCFH-DA-Färbung . (A) Die ROS-Erzeugung wurde durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen, 200x. Maßstabsbalken: 20 μm. (B) Relative Faltungsänderungen der ROS-Werte in verschiedenen Gruppen. Jede Spalte stellt den Mittelwert ± SD (n = 3) dar. **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Auswirkungen von Parkinson auf die MMP-Depolarisation in den Zellen, bewertet durch JC-1-Färbung. (A) Die MMP-Depolarisation wurde durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen, 200x. Maßstabsbalken: 20 μm. (B) Relative Änderungen des Verhältnisses von JC-1-Monomeren zu Dimeren in den verschiedenen Gruppen. Jede Spalte stellt den Mittelwert ± SD (n = 3) dar. **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Auswirkungen von Parkinson auf die Proteinexpressionsniveaus von LC3-II/LC3-I und p62 in den Zellen, bewertet durch Western Blotting. (A) Die Proteingehalte von LC3, p62 und β-Aktin wurden durch Western Blot nachgewiesen. (B) Relative Veränderungen des LC3-II:LC3-I-Verhältnisses in den verschiedenen Gruppen. (C) Relative Faltungsänderungen in der Expression von p62 in den verschiedenen Gruppen. Jede Spalte stellt den Mittelwert ± SD (n = 3) dar. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Studien haben die Tatsache hervorgehoben, dass NAFLD ein klinisch-pathologisches Syndrom ist, das von Fettleber bis NASH reicht und zu Leberzirrhose und Leberkrebs führen kann51. Eine fettreiche Ernährung und ein inaktiver Lebensstil sind typische Risikofaktoren für NAFLD. Sowohl nicht-medikamentöse Therapien als auch medikamentöse Therapien zur NAFLD-Behandlung wurden erforscht 51,52,53. Die Pathogenese der NAFLD ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Bei der hier beschriebenen Methode handelt es sich um ein In-vitro-Modell der NAFLD, das von PA-stimulierten AML-12-Zellen erstellt wurde. Wir untersuchten die schützenden Wirkungen von Parkinson gegen NAFLD in diesem Modell und fanden heraus, dass Parkinson den PA-induzierten Anstieg der ROS abschwächte. Außerdem verbesserte die Parkinson-Krankheit auch die PA-induzierte MMP-Depolarisation. Darüber hinaus könnte die Parkinson-Krankheit das Proteinexpressionsniveau von p62 signifikant reduzieren und das Verhältnis von LC3-II:LC3-I erhöhen. Diese experimentellen Ergebnisse könnten eine Grundlage für die Anwendung von Parkinson als pharmazeutischer Wirkstoff für die NAFLD-Behandlung bilden.

Als wichtiger intrazellulärer Abbauweg realisiert die Autophagie den physiologischen Prozess des Recyclings und der Wiederverwendung von Nährstoffrohstoffen durch den Abbau überschüssiger Komponenten in Zellen19,54. Autophagie ist auch ein wichtiger Reparaturmechanismus für den Körper, um das "Yin-Yang-Gleichgewicht" aufrechtzuerhalten, und es ist die mikroskopische Verkörperung der "Qi-Transformation" in TCM55,56,57. Im vorliegenden Protokoll wurde neben dem Nachweis der Veränderungen in der ROS-Produktion und der MMP-Depolarisation auch die potenzielle Rolle von Parkinson auf den Autophagieweg untersucht, indem die Proteinexpressionsniveaus der Autophagie-bezogenen Proteine LC-3 und p62 durch Western Blot nachgewiesen wurden. Nach der Behandlung von PA-induzierten Zellen mit Parkinson nahm das Verhältnis von LC3-II: LC3-I ab und die Akkumulation von p62 nahm zu, was darauf hindeutet, dass der Grad der Autophagie abnahm. Die experimentellen Ergebnisse stimmen mit anderen Literaturberichten 20,34,58,59 überein. Dieses In-vitro-Zellmodell kann dazu beitragen, das Verständnis der biologischen Funktion von Parkinson zu verbessern und die Verwendung anderer aktiver TCM-Substanzen zur Behandlung von NAFLD zu untersuchen.

Es gibt einige kritische Schritte im experimentellen Prozess. Um festzustellen, ob das in vitro NAFLD-Modell erfolgreich etabliert ist, können die Lipidtröpfchenablagerungen in den normalen Kontroll- und PA-behandelten Gruppenzellen durch Ölrot-O-Färbung verglichen werden, wie zuvor beschrieben60,61. Nach der DCFH-DA-Färbung oder der JC-1-Färbung müssen die verbleibenden Sonden, die nicht in die Zellen gelangen, abgewaschen werden. Andernfalls führt dies zu einem hohen Hintergrund bei der Aufnahme der Fluoreszenzbilder. Darüber hinaus muss die Zeit (mit Ausnahme der Inkubationszeit) zwischen der Beladung und Messung der Fluoreszenzsonden (DCFH-DA oder JC-1) verkürzt werden, um die Möglichkeit von Versuchsfehlern zu verringern. Darüber hinaus können die Arbeitskonzentrationen der Fluoreszenzsonden (DCFH-DA oder JC-1) nach Bedarf angepasst werden, wenn der Fluoreszenzwert der Zellen in der Negativkontrollgruppe relativ hoch ist. Alternativ kann die Inkubationszeit der JC-1-Arbeitslösung und der Zellen innerhalb eines Zeitrahmens von 15-60 min entsprechend den tatsächlichen Versuchsbedingungen entsprechend eingestellt werden.

Es gibt auch einige Einschränkungen in diesem In-vitro-Zellmodell. Zellen wie Leberparenchymzellen, hepatische Sternzellen, Kupffer-Zellen und vaskuläre Endothelzellen sind im Lebergewebe vorhanden62. Daher sind Experimente nur an Leberparenchymzellen möglicherweise nicht ausreichend, um die Wirkung von Medikamenten zu erklären. Andere Zellmodelle müssen auch bei der Entdeckung von Anti-NAFLD-Medikamenten verwendet werden. Darüber hinaus wurden dreidimensionale (3D) Zellkultursysteme verwendet, um Lebermodelle zu konstruieren und die Hepatotoxizität zu testen63,64. Zukünftige Studien werden sich auf die Entwicklung von In-vitro-Modellen unter Verwendung von Co-Kultur- und 3D-Zellkulturtechniken für ein potenzielles Anti-NAFLD-Wirkstoff-Screening konzentrieren.

Da es sich um eine Multisystemerkrankung handelt, spielen viele Faktoren eine Rolle bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der NAFLD, was bedeutet, dass ein einzelnes Tiermodell oder Zellmodell nicht alle pathologischen Prozesse dieser Krankheit vollständig nachahmenkann 65. Die übermäßige Abhängigkeit von der Verwendung von Tiermodellen erhöht die Belastung durch die Entwicklung therapeutischer Medikamente. Die Verwendung von In-vitro-Zellmodellen in den frühen Stadien der Entwicklung von Anti-NAFLD-Medikamenten ist praktischer und kostengünstiger. In dieser Studie wurde eine normale Maus-Hepatozyten-Zelllinie AML-12 verwendet, um das In-vitro-Modell der NAFLD zu konstruieren, und die therapeutische Wirkung der Parkinson-Krankheit wurde in diesem Modell validiert. Insbesondere bilden die Ergebnisse dieser Studie eine Grundlage für weitere Forschungen zu den Anti-NAFLD-Effekten von Parkinson in Hepatozyten- und primären Hepatozytenmodellen von Mäusen.

Abschließend wird hier ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der protektiven Wirkungen von Parkinson gegen NAFLD vorgestellt. Dies könnte auch ein nützliches In-vitro-Modell sein, um die Wirksamkeit anderer Wirkstoffe der TCM zur Behandlung von NAFLD zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird durch Zuschüsse der Chongqing Science and Technology Commission (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 und jbky20210029) und der China Postdoctoral Science Foundation (Nr. 2021MD703919) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004

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Diesen Monat in JoVE Ausgabe 190 Platycodin D Palmitinsäure reaktive Sauerstoffspezies mitochondriales Membranpotential Autophagie
Untersuchung der protektiven Wirkung von Platycodin D auf die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung in einem Palmitinsäure-induzierten <em>In-vitro-Modell</em>
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Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., … More

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).

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