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Studio degli effetti protettivi del platicodina D sulla steatosi epatica non alcolica in un modello in vitro indotto da acido palmitico

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64816
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo studia gli effetti protettivi della platycodin D sulla steatosi epatica non alcolica in un modello in vitro indotto dall'acido palmitico.

Abstract

L'incidenza della steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è aumentata a un ritmo allarmante in tutto il mondo. Platycodon grandiflorum è ampiamente usato come etnomedicina tradizionale per il trattamento di varie malattie ed è un tipico alimento funzionale che può essere incorporato nella dieta quotidiana. Gli studi hanno suggerito che il platycodin D (PD), uno dei principali ingredienti attivi di Platycodon grandiflorum, ha un'elevata biodisponibilità e mitiga significativamente il progresso della NAFLD, ma il meccanismo sottostante di questo non è ancora chiaro. Questo studio mira a studiare l'effetto terapeutico del PD contro la NAFLD in vitro. Le cellule AML-12 sono state pretrattate con acido palmitico (PA) da 300 μM per 24 ore per modellare la NAFLD in vitro. Quindi, le cellule sono state trattate con PD o non hanno ricevuto alcun trattamento PD per 24 ore. I livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono stati analizzati utilizzando la colorazione con 2′,7′-dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA) e il potenziale della membrana mitocondriale è stato determinato dal metodo di colorazione JC-1. Inoltre, i livelli di espressione proteica di LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1 nei lisati cellulari sono stati analizzati mediante western blotting. È stato riscontrato che il PD riduce significativamente i livelli di ROS e di potenziale della membrana mitocondriale nel gruppo trattato con PA rispetto al gruppo di controllo. Nel frattempo, il PD ha aumentato i livelli di LC3-II / LC3-I e diminuito i livelli di p62 / SQSTM1 nel gruppo trattato con PA rispetto al gruppo di controllo. I risultati hanno indicato che il PD ha migliorato la NAFLD in vitro riducendo lo stress ossidativo e stimolando l'autofagia. Questo modello in vitro è uno strumento utile per studiare il ruolo del PD nella NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), che è la radice essiccata di Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., è usato nella medicina tradizionale cinese (MTC). Viene prodotto principalmente nelle regioni nord-est, nord, est, centro e sud-ovest della Cina1. I componenti PG includono saponine triterpenoidi, polisaccaridi, flavonoidi, polifenoli, glicoli polietilenico, oli volatili e minerali2. PG ha una lunga storia di essere usato come alimento e una medicina a base di erbe in Asia. Tradizionalmente, questa erba è stata usata per fare medicina contro le malattie polmonari. La farmacologia moderna fornisce anche prove dell'efficacia della PG per il trattamento di altre malattie. Gli studi hanno dimostrato che PG ha un effetto terapeutico su una varietà di modelli di danno epatico indotti da farmaci. L'integrazione alimentare di estratti di PG o platycodin può migliorare l'obesità indotta dalla dieta ricca di grassi e le sue malattie metaboliche correlate 3,4,5. I polisaccaridi da PG possono essere utilizzati per il trattamento del danno epatico acuto causato da LPS/D-GalN nei topi6. Inoltre, le saponine dalle radici di PG migliorano la steatoepatite non alcolica (NASH) indotta dalla dieta ricca di grassi7. Inoltre, la platycodin D (PD), uno dei componenti terapeutici più importanti della PG, può migliorare l'espressione del recettore delle lipoproteine a bassa densità e l'assorbimento delle lipoproteine a bassa densità nelle cellule del carcinoma epatocellulare umano (HepG2)8. Inoltre, il PD può anche indurre apoptosi e inibire l'adesione, la migrazione e l'invasione nelle cellule HepG2 9,10. Pertanto, in questo studio, le cellule AML-12 dell'epatoma di topo vengono utilizzate per la costruzione di modelli in vitro e per studiare ulteriormente gli effetti farmacologici e i meccanismi sottostanti del PD in questo modello.

Il termine steatosi epatica non alcolica (NAFLD) si riferisce a un gruppo di malattie del fegato che include steatosi semplice, NASH, cirrosi e carcinoma epatocellulare11. Sebbene la patogenesi della NAFLD non sia completamente compresa, dalla classica teoria "two-hit" all'attuale teoria "multiple-hit", la resistenza all'insulina è considerata centrale nella patogenesi della NAFLD12,13,14. Gli studi hanno dimostrato che la resistenza all'insulina negli epatociti potrebbe portare ad un aumento degli acidi grassi liberi, che formano trigliceridi che si depositano nel fegato e causano il fegato a diventare grasso15,16. L'accumulo di grasso può portare a lipotossicità, disfunzione mitocondriale indotta da stress ossidativo, stress del reticolo endoplasmatico e rilascio di citochine infiammatorie, con conseguente patogenesi e progressione della NAFLD17,18. Inoltre, l'autofagia svolge anche un ruolo nella patogenesi della NAFLD, in quanto è coinvolta nella regolazione della sensibilità cellulare all'insulina, del metabolismo lipidico cellulare, del danno degli epatociti e dell'immunità innata 19,20,21.

Una varietà di modelli animali e modelli cellulari sono stati stabiliti per fornire una base per esplorare la patogenesi e potenziali bersagli terapeutici di NAFLD22,23. Tuttavia, i singoli modelli animali non possono imitare completamente tutti i processi patologici della NAFLD24. Le differenze individuali tra gli animali portano a diverse caratteristiche patologiche. L'utilizzo di linee cellulari epatiche o epatociti primari in studi in vitro di NAFLD garantisce la massima coerenza nelle condizioni sperimentali. La disregolazione del metabolismo lipidico epatico può portare a livelli più elevati di accumulo di goccioline lipidiche epatocitarie nella NAFLD25. Gli acidi grassi liberi come l'acido oleico e l'olio di palma sono stati utilizzati nel modello in vitro per imitare la NAFLD causata da una dieta ricca di grassi26,27. La linea cellulare di epatoblastoma umano HepG2 è spesso utilizzata nella costruzione di modelli NAFLD in vitro, ma, come linea cellulare tumorale, il metabolismo delle cellule HepG2 è significativamente diverso da quello delle cellule epatiche in normali condizioni fisiologiche28. Pertanto, l'utilizzo di epatociti primari o epatociti primari di topo per costruire il modello NAFLD in vitro per lo screening farmacologico è più vantaggioso rispetto all'utilizzo di linee cellulari tumorali. Confrontando l'esame sinergico degli effetti dei farmaci e dei bersagli terapeutici sia in modelli animali che in modelli di epatociti in vitro, sembra che l'utilizzo di epatociti murini per costruire il modello NAFLD in vitro abbia un migliore potenziale applicativo.

Gli acidi grassi liberi che entrano nel fegato vengono ossidati per produrre energia o immagazzinati come trigliceridi. Significativamente, gli acidi grassi liberi hanno una certa lipotossicità e possono indurre disfunzione cellulare e apoptosi12. L'acido palmitico (PA) è l'acido grasso saturo più abbondante nel plasma umano29. Quando le cellule nel tessuto non adiposo sono esposte ad alte concentrazioni di PA per lungo tempo, questo stimola la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e provoca stress ossidativo, accumulo lipidico e persino apoptosi30. Pertanto, molti ricercatori usano la PA come induttore per stimolare le cellule del fegato a produrre ROS e, quindi, costruire il modello di steatosi epatica in vitro e valutare gli effetti protettivi di alcuni principi attivi sulle cellule31,32,33,34. Questo studio introduce un protocollo per studiare gli effetti protettivi del PD su un modello cellulare di NAFLD indotto da PA.

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Protocol

Le cellule AML-12 (una normale linea cellulare di epatociti di topo) sono utilizzate per gli studi basati sulle cellule. Le celle sono ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Pretrattamento delle cellule AML-12 per modellare la NAFLD in vitro

  1. Mantenere le cellule in normali terreni di coltura cellulare (DMEM più F12 [1:1] di prosciutto contenente 0,005 mg/ml di insulina, 5 ng/mL di selenio, 0,005 mg/mL di transferrina, 40 ng/mL di desametasone e 10% di siero fetale bovino [FBS], vedi Tabella dei materiali) a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2.
  2. Seminare le cellule in piastre da 12 pozzetti (1 mL/pozzetto) con una densità di 2,8 x 105 celle/pozzetto.
    NOTA: Tutte le operazioni di digestione cellulare e di scambio medio vengono eseguite in un armadio di biosicurezza per evitare la contaminazione delle cellule.
  3. Rimuovere il terreno di coltura delle cellule dopo l'incubazione notturna (~ 10 h), quindi lavare le cellule due volte con 1 ml di terreno privo di siero (per pozzetto).
  4. Dividere la piastra cellulare a 12 pozzetti in quattro diversi gruppi di trattamento da sinistra a destra, tra cui (1) il gruppo di controllo, (2) il gruppo trattato con PD, (3) il gruppo trattato con PA e (4) il gruppo trattato con PA + PD.
    NOTA: Tre repliche di ciascun gruppo di trattamento sperimentale sono disposte dall'alto verso il basso sulla stessa piastra cellulare a 12 pozzetti.
  5. Aggiungere il terreno di coltura cellulare normale (1 mL/pozzetto) al gruppo di controllo e al gruppo trattato con PD e aggiungere il terreno di coltura cellulare normale (1 mL/pozzetto) integrato con 300 μM di PA al gruppo trattato con PA e PA + PD.
  6. Rimuovere il terreno di coltura delle cellule dopo 24 ore di incubazione, quindi lavare le cellule con 1 ml di terreno privo di siero (per pozzetto) due volte.
  7. Aggiungere al gruppo di controllo terreni di coltura cellulare normali (1 ml/pozzetto) integrati con un veicolo (dimetilsolfossido, DMSO, 0,1% v/v); aggiungere terreni di coltura cellulare normali (1 mL/pozzetto) integrati con 1 μM PD al gruppo trattato con PD; aggiungere terreni di coltura cellulare normali (1 mL/pozzetto) integrati con 300 μM PA al gruppo trattato con PA; aggiungere terreni di coltura cellulare normali (1 mL/pozzetto) integrati con 300 μM PA e 1 μM PD al gruppo trattato PA + PD.
  8. Dopo l'incubazione per ulteriori 24 ore, studiare gli effetti protettivi del PD sulle cellule utilizzando la colorazione con 2′,7′-dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA) (fase 2), colorazione JC-1 (fase 3) e western blotting (fase 4).
    NOTA: Tutte le operazioni di incubazione vengono effettuate a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2.

2. Misurazione della variazione della produzione di ROS

NOTA: I livelli intracellulari di ROS nelle cellule sono valutati sulla base del test di colorazione DCFH-DA.

  1. Alla fine del periodo di trattamento (fase 1.8), lavare le cellule con 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato per pozzetto (1x PBS, pH 7,4) tre volte, quindi colorare le cellule con 100 μL di 10 μM DCFH-DA per pozzetto (vedere Tabella dei materiali). Incubare le cellule al buio per 30 minuti.
    NOTA: Se non si osserva alcuna fluorescenza verde evidente dopo 30 minuti di incubazione, il tempo di incubazione della sonda e delle cellule può essere opportunamente aumentato (30-60 min). Se si osserva una sovraesposizione del valore di fluorescenza verde dopo 30 minuti di incubazione, il tempo di incubazione della sonda e delle cellule può essere opportunamente ridotto (15-30 min).
  2. Lavare le celle con 1x PBS (1 ml / pozzetto) tre volte. Aggiungere 1 mL di 1x PBS a ciascun pozzetto.
  3. Posizionare la piastra a 12 pozzetti sul palco del microscopio (vedi Tabella dei materiali), quindi utilizzare un obiettivo 20x per osservare la morfologia delle cellule (ingrandimento: 200x).
  4. Acquisire tre immagini di fluorescenza rappresentative (ingrandimento: 200x) per ciascun pozzetto al microscopio a fluorescenza utilizzando il canale fluorescente verde con una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.
    NOTA: Il canale fluorescente verde con una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm è raccomandato per rilevare il DCFH-DA. Inoltre, DCFH-DA può essere rilevato con le impostazioni dei parametri per GFP e FITC nel microscopio a fluorescenza35,36.
  5. Infine, elaborare le immagini con un software di acquisizione delle immagini (vedere Tabella dei materiali), quindi utilizzare il software ImageJ per calcolare l'intensità media di fluorescenza di ciascun gruppo o i rapporti dei diversi gruppi.
    NOTA: I dettagli tecnici del microscopio a fluorescenza e del software Image J utilizzati per il lavoro di imaging sono stati descritti in precedenza37,38.

3. Misurazione della variazione del potenziale di membrana mitocondriale

NOTA: I cambiamenti nel potenziale della membrana mitocondriale sono monitorati dal test di colorazione JC-1.

  1. Alla fine del periodo di trattamento (fase 1.8), lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS per pozzetto tre volte, quindi colorare le cellule con 100 μL di 5 μg/mL di soluzione di lavoro JC-1 (vedere Tabella dei materiali) per 30 minuti a 37 °C al buio.
    NOTA: Se non si osserva alcuna fluorescenza verde evidente dopo 30 minuti di incubazione, il tempo di incubazione della sonda e delle cellule può essere opportunamente aumentato (30-60 min). Se si osserva una sovraesposizione del valore di fluorescenza verde dopo 30 minuti di incubazione, il tempo di incubazione della sonda e delle cellule può essere opportunamente ridotto (15-30 min).
  2. Lavare le celle con 1x PBS (1 ml / pozzetto) tre volte. Aggiungere 1 mL di 1x PBS a ciascun pozzetto.
  3. Posizionare la piastra a 12 pozzetti sullo stadio del microscopio, quindi utilizzare un obiettivo 20x per osservare la morfologia delle cellule (ingrandimento: 200x).
  4. Cattura tre immagini di fluorescenza rappresentative (ingrandimento: 200x) per ciascun pozzetto sul microscopio a fluorescenza utilizzando il canale fluorescente verde con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 485 nm e 535 nm, rispettivamente, e il canale fluorescente rosso con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 550 nm e 600 nm, rispettivamente.
    NOTA: Il canale fluorescente verde con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 535 nm viene utilizzato per rilevare il monomero JC-1, che viene trattato come mitocondri depolarizzati 39,40,41, e il canale fluorescente rosso con una lunghezza d'onda di eccitazione di 550 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 600 nm viene utilizzato per rilevare il dimero JC-1, che viene trattato come mitocondri polarizzati 39,40,41.
  5. Infine, elaborare le immagini con il software di acquisizione delle immagini, quindi utilizzare il software Image J per calcolare l'intensità media di fluorescenza di ciascun gruppo o i rapporti dei diversi gruppi.
    NOTA: I dettagli tecnici del microscopio a fluorescenza e del software Image J utilizzati per il lavoro di imaging sono stati descritti in precedenza37,38.

4. Misurazione dei livelli di espressione proteica di LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1

  1. Dopo il trattamento (fase 1.8), lavare le celle tre volte con 1x PBS (1 mL/pozzetto) preraffreddato a 4 °C.
  2. Aggiungere tampone di lisi RIPA (100 μL/pozzetto) integrato con proteasi e un cocktail inibitore della fosfatasi (1x) (vedere Tabella dei materiali) alla piastra a 12 pozzetti e lisare su ghiaccio per 5 minuti.
  3. Raccogliere il lisato cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 12.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Determinare la concentrazione proteica dei surnatanti con il metodo BCA seguendo le procedure standard42.
  4. Aggiungere il buffer di caricamento del campione SDS-PAGE (5x, vedere la tabella dei materiali) ai surnatanti di lisato cellulare (rapporto volume = 1:4).
  5. Mescolare per vortice (ad alta velocità per ~ 15 s) e riscaldare i campioni miscelati a 100 ° C per 5 minuti per denaturare la proteina.
  6. Inserire il gel SDS-PAGE al 12% ben preparato nel serbatoio di elettroforesi, quindi aggiungere il tampone di up-sample SDS (1x) diluito con acqua ultrapura nella posizione limite di altezza.
    NOTA: Il gel SDS-PAGE viene preparato utilizzando un kit commerciale (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  7. Aggiungere il marcatore proteico (5 μL/pozzetto) e i campioni (20 μg/pozzetto) in diversi pozzetti del gel SDS-PAGE.
  8. Impostare la modalità di tensione stabile a 100 V ed eseguire l'elettroforesi per 80 minuti.
  9. Dopo l'elettroforesi SDS-PAGE, effettuare l'elettrotrasferimento delle proteine su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) (0,45 μM, vedi Tabella dei materiali) seguendo i rapporti precedentemente pubblicati43,44.
  10. Dopo l'elettrotrasferimento delle proteine, lavare la membrana PVDF con 10 mL di TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) due volte (5 min/tempo) in uno shaker a temperatura ambiente.
  11. Bloccare la membrana PVDF con 5 ml di albumina sierica bovina (BSA, 5%) in uno shaker a temperatura ambiente per 1 ora.
  12. Lavare la membrana PVDF con 10 ml di TBST tre volte (10 min/tempo). Quindi, incubare la membrana PVDF in 5 mL degli anticorpi primari specifici diluiti in tampone bloccante per LC3 (mouse mAb, 1:2.000), p62/SQSTM1 (di seguito denominato p62, mouse mAb, 1:2.000) e β-actina (mouse mAb, 1:2.000) (vedi Tabella dei materiali) per una notte a 4 °C.
  13. Lavare la membrana PVDF con 10 ml di TBST tre volte (10 min/tempo) a temperatura ambiente. Quindi, incubare la membrana PVDF con anticorpo secondario IgG (HRP) anti-topo di coniglio diluito in tampone bloccante (1:10.000) (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente e al riparo dalla luce per 2 ore.
  14. Lavare la membrana PVDF con 10 ml di TBST tre volte (10 min/tempo) a temperatura ambiente. Quindi, posizionare la membrana PVDF sull'involucro di plastica, aggiungere una quantità appropriata di soluzione di lavoro ECL (200 μL/membrana) (vedere Tabella dei materiali) e incubare per 2 minuti.
  15. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di lavoro ECL ed esporre la membrana PVDF nel sistema di imaging per lo sviluppo dell'immagine. Infine, utilizzare il software Image J per analizzare i valori di grigio di ciascuna banda.
    NOTA: I dettagli tecnici del western blotting e del software Image J utilizzati per il lavoro di imaging sono stati descritti in precedenza45,46.

5. Analisi statistica

  1. Presentare i dati degli esperimenti come media ± deviazione standard (SD).
  2. Eseguire l'analisi di significatività con lo strumento software statistico descritto in precedenza47.
  3. Calcola le differenze statistiche tra i due gruppi usando un t-test. Un valore P inferiore a 0,05 è considerato statisticamente significativo: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

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Representative Results

ROS intracellulari nelle cellule
Le cellule AML-12 sono state indotte con 300 μM PA per 24 ore ed è stato stabilito un modello di cellule NAFLD. Successivamente, le cellule sono state trattate con PD per 24 ore. Le cellule sono state etichettate con una sonda fluorescente DCFH-DA e la produzione di ROS è stata osservata al microscopio a fluorescenza. I risultati della colorazione DCFH-DA dei ROS intracellulari nelle cellule sono mostrati in Figura 1. I risultati hanno mostrato che il PD potrebbe ridurre significativamente il livello di ROS intracellulare nelle cellule incubate con 300 μM di PA (P < 0,01), indicando che il PD può ridurre lo stress ossidativo cellulare.

Potenziale di membrana mitocondriale delle cellule
Il mitocondrio è l'organello centrale governato dalla via intrinseca dell'apoptosi48,49,50. Pertanto, il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) delle cellule AML-12 che erano state incubate con PD per 24 ore è stato osservato al microscopio a fluorescenza dopo la colorazione JC-1. Come mostrato in Figura 2, la fluorescenza verde (monomeri JC-1, trattati come mitocondri depolarizzati 39,40,41) nelle cellule trattate con PA era superiore a quella nelle cellule non trattate. D'altra parte, la fluorescenza rossa (dimeri JC-1, trattati come mitocondri polarizzati 39,40,41) nelle cellule trattate con PA era inferiore rispetto alle cellule non trattate, indicando la depolarizzazione MMP indotta da PA nelle cellule. Inoltre, rispetto al gruppo modello, il rapporto tra monomeri JC-1 e dimeri è diminuito nel gruppo di trattamento con PD (P < 0,01), indicando che il PD potrebbe migliorare la depolarizzazione MMP indotta da PA.

I livelli di espressione proteica di LC3-II/LC3-I e p62
Questo studio ha anche studiato il potenziale ruolo del PD sulla via dell'autofagia studiando i livelli di espressione proteica delle proteine correlate all'autofagia LC3 e p62 nelle cellule mediante western blotting. Come mostrato nella Figura 3, il rapporto di LC3-II:LC3-I è diminuito significativamente (P < 0,005) e il livello di espressione proteica di p62 è aumentato dopo essere stato trattato con PA per 48 ore (P < 0,01). D'altra parte, il PD potrebbe ridurre significativamente il livello di espressione proteica di p62 (P < 0,01) e aumentare il rapporto di LC3-II: LC3-I (P < 0,05), indicando che il PD può ripristinare il flusso autofagico inibito dalla PA.

Figure 1
Figura 1: Effetti del PD sui ROS intracellulari nelle cellule come valutato mediante colorazione DCFH-DA . (A) La generazione di ROS è stata rilevata mediante microscopia a fluorescenza, 200x. Barra scala: 20 μm. (B) Variazioni relative della piega nei livelli di ROS in diversi gruppi. Ogni colonna rappresenta la media ± SD (n = 3). **P < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Effetti del PD sulla depolarizzazione MMP nelle cellule come valutato dalla colorazione JC-1 . (A) La depolarizzazione MMP è stata rilevata mediante microscopia a fluorescenza, 200x. Barra della scala: 20 μm. (B) Variazioni relative nel rapporto monomeri/dimeri JC-1 nei diversi gruppi. Ogni colonna rappresenta la media ± SD (n = 3). **P < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Effetti del PD sui livelli di espressione proteica di LC3-II/LC3-I e p62 nelle cellule come valutato mediante western blotting. (A) I livelli proteici di LC3, p62 e β-actina sono stati rilevati mediante western blotting. (B) Variazioni relative del rapporto LC3-II:LC3-I nei diversi gruppi. (C) Cambiamenti relativi della piega nell'espressione di p62 nei diversi gruppi. Ogni colonna rappresenta la media ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Gli studi hanno evidenziato il fatto che la NAFLD è una sindrome clinicopatologica, che va dal fegato grasso alla NASH, che può progredire verso la cirrosi e il cancro al fegato51. Una dieta ricca di grassi e uno stile di vita inattivo sono fattori di rischio tipici per la NAFLD. Sono state studiate sia terapie non farmacologiche che terapie farmacologiche per il trattamento della NAFLD51,52,53. Tuttavia, la patogenesi della NAFLD non è stata completamente chiarita. Il metodo qui descritto prevede un modello in vitro di NAFLD stabilito da cellule AML-12 stimolate da PA. Abbiamo studiato gli effetti protettivi del PD contro la NAFLD in questo modello e abbiamo scoperto che il PD attenuava l'aumento di ROS indotto da PA. Inoltre, il PD ha anche migliorato la depolarizzazione MMP indotta da PA. Inoltre, il PD potrebbe ridurre significativamente il livello di espressione proteica di p62 e aumentare il rapporto di LC3-II:LC3-I. Questi risultati sperimentali potrebbero fornire una base per l'applicazione del PD come principio farmaceutico attivo per il trattamento della NAFLD.

Come principale via di degradazione intracellulare, l'autofagia realizza il processo fisiologico di riciclaggio e riutilizzo delle materie prime nutrienti degradando i componenti in eccesso nelle cellule19,54. L'autofagia è anche un meccanismo di riparazione chiave per il corpo per mantenere "l'equilibrio yin-yang", ed è l'incarnazione microscopica della "trasformazione qi" in TCM55,56,57. Nel presente protocollo, oltre a rilevare i cambiamenti nella produzione di ROS e nella depolarizzazione MMP, il potenziale ruolo del PD sulla via dell'autofagia è stato studiato rilevando i livelli di espressione proteica delle proteine correlate all'autofagia LC-3 e p62 mediante western blotting. Dopo il trattamento delle cellule indotte da PA con PD, il rapporto di LC3-II: LC3-I è diminuito e l'accumulo di p62 è aumentato, indicando che il livello di autofagia è diminuito. I risultati sperimentali sono coerenti con altri rapporti di letteratura 20,34,58,59. Questo modello cellulare in vitro può aiutare a migliorare la comprensione della funzione biologica del PD e aiutare a studiare l'uso di altre sostanze TCM attive per il trattamento della NAFLD.

Ci sono alcuni passaggi critici nel processo sperimentale. Per determinare se il modello in vitro di NAFLD è stato stabilito con successo, i depositi di goccioline lipidiche possono essere confrontati nel normale controllo e nelle cellule del gruppo trattate con PA mediante colorazione Oil Red O, come descritto in precedenza60,61. Dopo la colorazione DCFH-DA o la colorazione JC-1, le sonde rimanenti che non entrano nelle cellule devono essere lavate via; In caso contrario, ciò causerà uno sfondo elevato durante l'acquisizione delle immagini a fluorescenza. Inoltre, il tempo (ad eccezione del tempo di incubazione) tra il caricamento e la misurazione delle sonde fluorescenti (DCFH-DA o JC-1) deve essere abbreviato per ridurre la possibilità di errori sperimentali. Inoltre, le concentrazioni di lavoro delle sonde fluorescenti (DCFH-DA o JC-1) possono essere regolate secondo necessità se il valore di fluorescenza delle cellule nel gruppo di controllo negativo è relativamente alto. In alternativa, il tempo di incubazione della soluzione di lavoro JC-1 e delle celle può essere opportunamente regolato entro un lasso di tempo di 15-60 minuti in base alle effettive condizioni sperimentali.

Ci sono anche alcune limitazioni in questo modello cellulare in vitro. Cellule come le cellule parenchimali epatiche, le cellule stellate epatiche, le cellule di Kupffer e le cellule endoteliali vascolari sono presenti nei tessuti epatici62. Pertanto, gli esperimenti solo su cellule parenchimali epatiche potrebbero non essere adeguati per spiegare gli effetti dei farmaci. Altri modelli cellulari devono anche essere utilizzati nella scoperta di farmaci anti-NAFLD. Inoltre, sono stati utilizzati sistemi di coltura cellulare tridimensionale (3D) per costruire modelli epatici e testare l'epatotossicità63,64. Gli studi futuri si concentreranno sullo sviluppo di modelli in vitro utilizzando tecniche di co-coltura e coltura cellulare 3D per un potenziale screening di farmaci anti-NAFLD.

Come malattia multisistemica, molti fattori svolgono un ruolo nello sviluppo e nella progressione della NAFLD, il che significa che un singolo modello animale o modello cellulare non può imitare completamente tutti i processi patologici di questa malattia65. L'eccessiva dipendenza dall'uso di modelli animali aumenta l'onere dello sviluppo di farmaci terapeutici. L'utilizzo di modelli cellulari in vitro nelle prime fasi dello sviluppo di farmaci anti-NAFLD è più pratico ed economico. In questo studio, una normale linea cellulare di epatociti di topo AML-12 è stata utilizzata per costruire il modello in vitro di NAFLD e l'effetto terapeutico del PD è stato convalidato in questo modello. In particolare, i risultati di questo studio forniscono una base per ulteriori ricerche sugli effetti anti-NAFLD del PD nei topi epatociti e modelli di epatociti primari.

In conclusione, viene presentato qui un modello in vitro per studiare gli effetti protettivi del PD contro la NAFLD. Questo potrebbe anche essere un utile modello in vitro per studiare l'efficacia di altre sostanze attive della MTC per il trattamento della NAFLD.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato da sovvenzioni della Commissione per la scienza e la tecnologia di Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 e jbky20210029) e della China Postdoctoral Science Foundation (n. 2021MD703919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004

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Questo mese in JoVE Numero 190 Platycodin D acido palmitico specie reattive dell'ossigeno potenziale di membrana mitocondriale autofagia
Studio degli effetti protettivi del platicodina D sulla steatosi epatica non alcolica in un modello <em>in vitro</em> indotto da acido palmitico
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Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., … More

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).

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