Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Undersøke de beskyttende effektene av platycodin d på ikke-alkoholholdig fettleversykdom i en palmitinsyreindusert in vitro-modell

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64816
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen undersøker den beskyttende effekten av platycodin D på ikke-alkoholholdig fettleversykdom i en palmitinsyreindusert in vitro-modell .

Abstract

Forekomsten av ikke-alkoholholdig fettleversykdom (NAFLD) har økt med en alarmerende hastighet over hele verden. Platycodon grandiflorum er mye brukt som en tradisjonell etnomedisin for behandling av ulike sykdommer og er en typisk funksjonell mat som kan innlemmes i det daglige kostholdet. Studier har antydet at platycodin D (PD), en av de viktigste aktive ingrediensene i Platycodon grandiflorum, har høy biotilgjengelighet og reduserer fremdriften av NAFLD betydelig, men den underliggende mekanismen for dette er fortsatt uklar. Denne studien tar sikte på å undersøke den terapeutiske effekten av PD mot NAFLD in vitro. AML-12-celler ble forbehandlet med 300 μM palmitinsyre (PA) i 24 timer for å modellere NAFLD in vitro. Deretter ble cellene enten behandlet med PD eller fikk ingen PD-behandling i 24 timer. Nivåene av reaktive oksygenarter (ROS) ble analysert ved bruk av 2',7'-diklor-dihydro-fluoresceindiacetat (DCFH-DA) farging, og mitokondriemembranpotensialet ble bestemt ved JC-1-fargemetoden. Videre ble proteinuttrykksnivåene av LC3-II / LC3-I og p62 / SQSTM1 i cellelysatene analysert ved vestlig blotting. PD ble funnet å signifikant redusere ROS og mitokondriemembranpotensialnivåene i den PA-behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. I mellomtiden økte PD LC3-II / LC3-I-nivåene og reduserte p62 / SQSTM1-nivåene i den PA-behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Resultatene indikerte at PD forbedret NAFLD in vitro ved å redusere oksidativt stress og stimulere autofagi. Denne in vitro-modellen er et nyttig verktøy for å studere PDs rolle i NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), som er den tørkede roten til Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., brukes i tradisjonell kinesisk medisin (TCM). Den produseres hovedsakelig i nordøst-, nord-, øst-, sentral- og sørvestregionene i Kina1. PG-komponentene inkluderer triterpenoid saponiner, polysakkarider, flavonoider, polyfenoler, polyetylenglykoler, flyktige oljer og mineraler2. PG har en lang historie med å bli brukt som mat og urtemedisin i Asia. Tradisjonelt ble denne urten brukt til å lage medisin mot lungesykdommer. Moderne farmakologi gir også bevis på effekten av PG for behandling av andre sykdommer. Studier har vist at PG har en terapeutisk effekt på en rekke legemiddelinduserte leverskademodeller. Kosttilskudd av PG eller platycodin-ekstrakter kan forbedre fettrik diettindusert fedme og relaterte metabolske sykdommer 3,4,5. Polysakkarider fra PG kan brukes til behandling av akutt leverskade forårsaket av LPS / D-GalN hos mus6. Videre forbedrer saponiner fra røttene til PG fettfattig diettindusert ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH)7. Videre kan platycodin D (PD), en av de viktigste terapeutiske komponentene i PG, forbedre lipoproteinreseptorekspresjon med lav tetthet og lipoproteinopptak med lav tetthet i humant hepatocellulært karsinom (HepG2) celler8. Videre kan PD også indusere apoptose og hemme adhesjon, migrasjon og invasjon i HepG2-celler 9,10. I denne studien brukes således mushepatom AML-12-celler til in vitro-modellkonstruksjon og for å studere farmakologiske effekter og underliggende mekanismer for PD i denne modellen.

Begrepet ikke-alkoholholdig fettleversykdom (NAFLD) refererer til en gruppe leversykdommer som inkluderer enkel steatose, NASH, skrumplever og hepatocellulært karsinom11. Selv om patogenesen til NAFLD er ufullstendig forstått, fra den klassiske "to-hit" -teorien til den nåværende "multiple-hit" -teorien, anses insulinresistens å være sentral i patogenesen til NAFLD12,13,14. Studier har vist at insulinresistens i hepatocytter kan føre til økte frie fettsyrer, som danner triglyserider som avsettes i leveren og forårsaker at leveren blir fet15,16. Akkumuleringen av fett kan føre til lipotoksisitet, oksidativ stressindusert mitokondriell dysfunksjon, endoplasmatisk retikulumstress og inflammatorisk cytokinfrigivelse, noe som resulterer i patogenesen og progresjonen av NAFLD17,18. I tillegg spiller autofagi også en rolle i patogenesen til NAFLD, da den er involvert i regulering av cellulær insulinfølsomhet, cellulær lipidmetabolisme, hepatocyttskade og medfødt immunitet 19,20,21.

En rekke dyremodeller og cellulære modeller er etablert for å gi grunnlag for å utforske patogenesen og potensielle terapeutiske mål for NAFLD22,23. Imidlertid kan enkeltdyrmodeller ikke fullt ut etterligne alle de patologiske prosessene i NAFLD24. Individuelle forskjeller mellom dyr fører til forskjellige patologiske egenskaper. Bruk av levercellelinjer eller primære hepatocytter i in vitro-studier av NAFLD sikrer maksimal konsistens i eksperimentelle forhold. Dysregulering av lipidmetabolisme i lever kan føre til høyere nivåer av akkumulering av hepatocyttlipiddråper i NAFLD25. Frie fettsyrer som oljesyre og palmeolje har blitt brukt i in vitro-modellen for å etterligne NAFLD forårsaket av et fettfattig kosthold26,27. Den humane hepatoblastomcellelinjen HepG2 brukes ofte i konstruksjonen av NAFLD-modeller in vitro, men som en tumorcellelinje er metabolismen av HepG2-celler signifikant forskjellig fra leverceller under normale fysiologiske forhold28. Derfor er bruk av primære hepatocytter eller musprimære hepatocytter for å konstruere in vitro NAFLD-modellen for legemiddelscreening mer fordelaktig enn å bruke tumorcellelinjer. Sammenligning av synergistisk undersøkelse av legemiddeleffekter og terapeutiske mål i både dyremodeller og in vitro hepatocyttmodeller, ser det ut til at bruk av musehepatocytter for å konstruere in vitro NAFLD-modellen har bedre applikasjonspotensial.

Frie fettsyrer som kommer inn i leveren oksideres for å produsere energi eller lagres som triglyserider. Signifikant har frie fettsyrer en viss lipotoksisitet og kan indusere cellulær dysfunksjon og apoptose12. Palmitinsyre (PA) er den mest tallrike mettede fettsyren i humant plasma29. Når celler i ikke-fettvev blir utsatt for høye konsentrasjoner av PA i lang tid, stimulerer dette produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) og forårsaker oksidativt stress, lipidakkumulering og til og med apoptose30. Derfor bruker mange forskere PA som en induktor for å stimulere leverceller til å produsere ROS og dermed konstruere in vitro fettleversykdomsmodellen og evaluere de beskyttende effektene av visse aktive stoffer på celler31,32,33,34. Denne studien introduserer en protokoll for å undersøke de beskyttende effektene av PD på en cellemodell av NAFLD indusert av PA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

AML-12-celler (en normal hepatocyttcellelinje fra mus) brukes til cellebaserte studier. Cellene hentes fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse).

1. Forbehandling av AML-12-cellene for å modellere NAFLD in vitro

  1. Vedlikehold cellene i normale cellekulturmedier (DMEM pluss Hams F12 [1:1] som inneholder 0,005 mg/ml insulin, 5 ng/ml selen, 0,005 mg/ml transferrin, 40 ng/ml deksametason og 10 % føtal bovint serum [FBS], se materialfortegnelse) ved 37 °C i fuktet atmosfære med 5 % CO2.
  2. Frø cellene i 12-brønnsplater (1 ml / brønn) med en tetthet på 2,8 x 105 celler / brønn.
    MERK: All cellefordøyelse og middels utvekslingsoperasjoner utføres i et biosikkerhetsskap for å unngå forurensning av cellene.
  3. Fjern kulturmediet til cellene etter inkubasjonen over natten (~ 10 timer), og vask deretter cellene to ganger med 1 ml serumfrie medier (per brønn).
  4. Del 12-brønncelleplaten i fire forskjellige behandlingsgrupper fra venstre til høyre, inkludert (1) kontrollgruppen, (2) den PD-behandlede gruppen, (3) den PA-behandlede gruppen og (4) den PA + PD-behandlede gruppen.
    MERK: Tre replikater av hver eksperimentelle behandlingsgruppe er arrangert fra topp til bunn på samme 12-brønns celleplate.
  5. Legg til det normale cellekulturmediet (1 ml / brønn) til kontrollgruppen og den PD-behandlede gruppen, og legg til det normale cellekulturmediet (1 ml / brønn) supplert med 300 μM PA til den PA-behandlede og PA + PD-behandlede gruppen.
  6. Fjern kulturmediet til cellene etter 24 timers inkubasjon, og vask deretter cellene med 1 ml serumfritt medium (per brønn) to ganger.
  7. Legg til normale cellekulturmedier (1 ml / brønn) supplert med et kjøretøy (dimetylsulfoksid, DMSO, 0,1% v / v) til kontrollgruppen; legge til normale cellekulturmedier (1 ml / brønn) supplert med 1 μM PD til den PD-behandlede gruppen; legge til normale cellekulturmedier (1 ml/brønn) supplert med 300 μM PA til den PA-behandlede gruppen; legge til normale cellekulturmedier (1 ml/brønn) supplert med 300 μM PA og 1 μM PD til den PA + PD-behandlede gruppen.
  8. Etter inkubering i ytterligere 24 timer, undersøk de beskyttende effektene av PD på celler ved bruk av 2',7'-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) farging (trinn 2), JC-1-farging (trinn 3) og vestlig blotting (trinn 4).
    MERK: Alle inkubasjonsoperasjoner utføres ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO2.

2. Måling av endringen i ROS-produksjonen

MERK: De intracellulære ROS-nivåene i cellene vurderes basert på DCFH-DA-fargeanalysen.

  1. På slutten av behandlingsperioden (trinn 1.8) vasker du cellene med 1 ml fosfatbufret saltvann per brønn (1x PBS, pH 7,4) tre ganger, og farger deretter cellene med 100 μL på 10 μM DCFH-DA per brønn (se materialtabell). Inkuber cellene i mørket i 30 minutter.
    MERK: Hvis ingen åpenbar grønn fluorescens observeres etter 30 min inkubasjon, kan inkubasjonstiden til sonden og cellene økes hensiktsmessig (30-60 min). Hvis overeksponering av den grønne fluorescensverdien observeres etter 30 minutters inkubasjon, kan inkubasjonstiden til sonden og cellene reduseres hensiktsmessig (15-30 min).
  2. Vask cellene med 1x PBS (1 ml / brønn) tre ganger. Tilsett 1 ml 1x PBS til hver brønn.
  3. Plasser 12-brønnsplaten på mikroskoptrinnet (se materialfortegnelse), og bruk deretter et 20x objektiv for å observere morfologien til cellene (forstørrelse: 200x).
  4. Ta tre representative fluorescensbilder (forstørrelse: 200x) for hver brønn på fluorescensmikroskopet ved hjelp av den grønne fluorescerende kanalen med en eksitasjonsbølgelengde på 480 nm og en utslippsbølgelengde på 530 nm.
    MERK: Den grønne fluorescerende kanalen med en eksitasjonsbølgelengde på 480 nm og en utslippsbølgelengde på 530 nm anbefales for å oppdage DCFH-DA. I tillegg kan DCFH-DA detekteres med parameterinnstillingene for GFP og FITC i fluorescensmikroskopet35,36.
  5. Til slutt behandler du bildene med bildeinnsamlingsprogramvare (se Materialfortegnelse), og bruker deretter ImageJ-programvare til å beregne gjennomsnittlig fluorescensintensitet for hver gruppe eller forholdet mellom de forskjellige gruppene.
    MERK: De tekniske detaljene til fluorescensmikroskopet og Image J-programvaren som ble brukt til bildearbeidet, er beskrevet tidligere37,38.

3. Måling av endringen i mitokondriemembranpotensialet

MERK: Endringene i mitokondriemembranpotensialet overvåkes av JC-1-fargeanalysen.

  1. På slutten av behandlingsperioden (trinn 1.8) vaskes cellene med 1 ml 1x PBS per brønn tre ganger, og deretter farges cellene med 100 μL 5 μg/ml JC-1 arbeidsløsning (se Materialfortegnelse) i 30 minutter ved 37 °C i mørket.
    MERK: Hvis ingen åpenbar grønn fluorescens observeres etter 30 min inkubasjon, kan inkubasjonstiden til sonden og cellene økes hensiktsmessig (30-60 min). Hvis overeksponering av den grønne fluorescensverdien observeres etter 30 minutters inkubasjon, kan inkubasjonstiden til sonden og cellene reduseres hensiktsmessig (15-30 min).
  2. Vask cellene med 1x PBS (1 ml / brønn) tre ganger. Tilsett 1 ml 1x PBS til hver brønn.
  3. Plasser 12-brønnsplaten på mikroskopstadiet, og bruk deretter et 20x objektiv for å observere morfologien til cellene (forstørrelse: 200x).
  4. Ta tre representative fluorescensbilder (forstørrelse: 200x) for hver brønn på fluorescensmikroskopet ved hjelp av den grønne fluorescerende kanalen med eksitasjons- og utslippsbølgelengder på henholdsvis 485 nm og 535 nm, og den røde fluorescerende kanalen med eksitasjons- og utslippsbølgelengder på henholdsvis 550 nm og 600 nm.
    MERK: Den grønne fluorescerende kanalen med en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en utslippsbølgelengde på 535 nm brukes til å oppdage JC-1-monomeren, som behandles som depolariserte mitokondrier 39,40,41, og den røde fluorescerende kanalen med en eksitasjonsbølgelengde på 550 nm og en utslippsbølgelengde på 600 nm brukes til å oppdage JC-1-dimeren, som behandles som polariserte mitokondrier 39,40,41.
  5. Til slutt, behandle bildene med bildeinnsamlingsprogramvare, og bruk deretter Image J-programvare for å beregne gjennomsnittlig fluorescensintensitet for hver gruppe eller forholdene mellom de forskjellige gruppene.
    MERK: De tekniske detaljene til fluorescensmikroskopet og Image J-programvaren som ble brukt til bildearbeidet, er beskrevet tidligere37,38.

4. Måling av proteinekspresjonsnivåene av LC3-II / LC3-I og p62 / SQSTM1

  1. Etter behandling (trinn 1.8), vask cellene tre ganger med 1x PBS (1 ml/brønn) som er forkjølt ved 4 °C.
  2. Tilsett RIPA lysisbuffer (100 μL/brønn) supplert med protease og en fosfatasehemmercocktail (1x) (se materialtabell) til 12-brønnsplaten, og lys på is i 5 min.
  3. Samle cellelysatet i 1,5 ml mikrosentrifugerør, og sentrifuger ved 12 000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Bestem proteinkonsentrasjonen av supernatantene ved BCA-metoden ved å følge standardprosedyrene42.
  4. Legg til SDS-PAGE prøvelastingsbuffer (5x, se Materialfortegnelse) til cellelysatsupernatantene (volumforhold = 1:4).
  5. Bland ved vortexing (ved høy hastighet for ~ 15 s), og varm de blandede prøvene ved 100 ° C i 5 minutter for å denaturere proteinet.
  6. Sett den 12-godt forberedte 12% SDS-PAGE-gelen i elektroforesetanken, og tilsett deretter SDS-oppprøvebufferen (1x) fortynnet med ultrarent vann til høydegrenseposisjonen.
    MERK: SDS-PAGE gel fremstilles ved hjelp av et kommersielt sett (se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens instruksjoner.
  7. Tilsett proteinmarkøren (5 μL/brønn) og prøver (20 μg/brønn) i forskjellige brønner i SDS-PAGE-gelen.
  8. Sett stabil spenningsmodus på 100 V, og utfør elektroforesen i 80 minutter.
  9. Etter SDS-PAGE-elektroforesen, utfør elektrooverføringen av proteinene til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (0,45 μM, se materialtabell) etter tidligere publiserte rapporter43,44.
  10. Etter elektrooverføring av proteinene, vask PVDF-membranen med 10 ml TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) to ganger (5 min / tid) i en shaker ved romtemperatur.
  11. Blokker PVDF-membranen med 5 ml bovint serumalbumin (BSA, 5%) i en shaker ved romtemperatur i 1 time.
  12. Vask PVDF-membranen med 10 ml TBST tre ganger (10 min/tid). Deretter inkuberer du PVDF-membranen i 5 ml av de spesifikke primære antistoffene fortynnet i blokkeringsbuffer for LC3 (mus mAb, 1:2,000), p62/SQSTM1 (heretter kalt p62, mus mAb, 1:2,000) og β-aktin (mus mAb, 1:2,000) (se materialfortegnelse) over natten ved 4 °C.
  13. Vask PVDF-membranen med 10 ml TBST tre ganger (10 min/tid) ved romtemperatur. Deretter inkuberer du PVDF-membranen med kaninens anti-mus IgG (HRP) sekundære antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer (1:10 000) (se materialfortegnelse) ved romtemperatur og skjermet for lys i 2 timer.
  14. Vask PVDF-membranen med 10 ml TBST tre ganger (10 min/tid) ved romtemperatur. Plasser deretter PVDF-membranen på plastfolien, tilsett en passende mengde ECL-arbeidsløsning (200 μL/membran) (se materialfortegnelse) og inkuber i 2 minutter.
  15. Etter inkubering, fjern ECL-arbeidsløsningen og eksponer PVDF-membranen i bildesystemet for bildeutvikling. Til slutt bruker du Image J-programvaren til å analysere de grå verdiene til hvert bånd.
    MERK: De tekniske detaljene til den vestlige blotting- og Image J-programvaren som brukes til bildearbeidet har blitt beskrevet tidligere45,46.

5. Statistisk analyse

  1. Presentere dataene fra forsøkene som gjennomsnitt ± standardavvik (SD).
  2. Utfør signifikansanalysen med det statistiske programvareverktøyet beskrevet tidligere47.
  3. Beregn de statistiske forskjellene mellom de to gruppene ved hjelp av en t-test. En P-verdi under 0,05 regnes som statistisk signifikant: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intracellulær ROS i cellene
AML-12-celler ble indusert med 300 μM PA i 24 timer, og en NAFLD-cellemodell ble etablert. Deretter ble cellene behandlet med PD i 24 timer. Cellene ble merket med en DCFH-DA fluorescerende sonde, og ROS-produksjon ble observert under et fluorescensmikroskop. Resultatene av DCFH-DA-fargingen av intracellulær ROS i cellene er vist i figur 1. Resultatene viste at PD kunne redusere nivået av intracellulær ROS signifikant i cellene inkubert med 300 μM PA (P < 0,01), noe som indikerer at PD kan redusere cellulært oksidativt stress.

Mitokondriell membranpotensial av cellene
Mitokondrien er den sentrale organellen som styres av den indre apoptoseveien48,49,50. Derfor ble mitokondriemembranpotensialet (MMP) til AML-12-celler som hadde blitt inkubert med PD i 24 timer, observert under et fluorescensmikroskop etter JC-1-farging. Som vist i figur 2 var den grønne fluorescensen (JC-1-monomerer, behandlet som depolariserte mitokondrier 39,40,41) i de PA-behandlede cellene høyere enn i de ubehandlede cellene. På den annen side var den røde fluorescensen (JC-1-dimerer, behandlet som polariserte mitokondrier 39,40,41) i de PA-behandlede cellene lavere enn i de ubehandlede cellene, noe som indikerer PA-indusert MMP-depolarisering i cellene. I tillegg, sammenlignet med modellgruppen, ble forholdet mellom JC-1-monomerer: dimerer redusert i PD-behandlingsgruppen (P < 0,01), noe som indikerer at PD kunne forbedre PA-indusert MMP-depolarisering.

Proteinuttrykksnivåene av LC3-II / LC3-I og p62
Denne studien undersøkte også PDs potensielle rolle på autofagibanen ved å undersøke proteinuttrykksnivåene av autofagirelaterte proteiner LC3 og p62 i cellene ved vestlig blotting. Som vist i figur 3 ble forholdet mellom LC3-II:LC3-I signifikant redusert (P < 0,005), og proteinuttrykksnivået på p62 økte etter behandling med PA i 48 timer (P < 0,01). På den annen side kan PD signifikant redusere proteinuttrykksnivået av p62 (P < 0,01) og øke forholdet mellom LC3-II: LC3-I (P < 0,05), noe som indikerer at PD kan gjenopprette autofagisk fluks hemmet av PA.

Figure 1
Figur 1: Effekter av PD på intracellulær ROS i cellene vurdert ved DCFH-DA-farging . (A) ROS-generering ble detektert ved fluorescensmikroskopi, 200x. Skala bar: 20 μm. (B) Relative fold endringer i ROS nivåer i ulike grupper. Hver kolonne representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 3). **P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Effekter av PD på MMP-depolarisering i cellene vurdert ved JC-1-farging. (A) MMP-depolarisering ble påvist ved fluorescensmikroskopi, 200x. Skala bar: 20 μm. (B) Relative endringer i JC-1 monomerer: dimerer ratio i de forskjellige gruppene. Hver kolonne representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 3). **P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekter av PD på proteinuttrykksnivåene av LC3-II/LC3-I og p62 i cellene vurdert ved vestlig blotting. (A) Proteinnivåene av LC3, p62 og β-aktin ble detektert ved vestlig blotting. (B) Relative endringer i forholdet LC3-II:LC3-I i de forskjellige gruppene. (C) Relative foldeendringer i uttrykket av p62 i de forskjellige gruppene. Hver kolonne representerer gjennomsnittlig ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Studier har fremhevet det faktum at NAFLD er et kliniskpatologisk syndrom, alt fra fettlever til NASH, som kan utvikle seg til skrumplever og leverkreft51. Et fettrikt kosthold og en inaktiv livsstil er typiske risikofaktorer for NAFLD. Både ikke-medisinske terapier og narkotikaterapier for NAFLD-behandling har blitt undersøkt51,52,53. Patogenesen til NAFLD er imidlertid ikke fullstendig klarlagt. Metoden beskrevet her innebærer en in vitro-modell av NAFLD etablert av PA-stimulerte AML-12-celler. Vi undersøkte de beskyttende effektene av PD mot NAFLD i denne modellen, og vi fant at PD dempet den PA-induserte økningen i ROS. Dessuten forbedret PD også PA-indusert MMP-depolarisering. Videre kan PD redusere proteinuttrykksnivået på p62 betydelig og øke forholdet mellom LC3-II: LC3-I. Disse eksperimentelle resultatene kan gi grunnlag for anvendelse av PD som en aktiv farmasøytisk ingrediens for NAFLD-behandling.

Som en viktig intracellulær nedbrytningsvei realiserer autofagi den fysiologiske prosessen med resirkulering og gjenbruk av næringsstoffer ved å nedbryte overflødige komponenter i celle19,54. Autofagi er også en viktig reparasjonsmekanisme for kroppen for å opprettholde "yin-yang-balansen", og det er den mikroskopiske utførelsen av "qi-transformasjon" i TCM55,56,57. I denne protokollen, i tillegg til å oppdage endringene i ROS-produksjon og MMP-depolarisering, ble PDs potensielle rolle på autofagibanen undersøkt ved å påvise proteinuttrykksnivåene til autofagirelaterte proteiner LC-3 og p62 ved vestlig blotting. Etter behandling av PA-induserte celler med PD ble forholdet mellom LC3-II:LC3-I redusert, og akkumuleringen av p62 økte, noe som indikerer at autofaginivået sank. De eksperimentelle resultatene stemmer overens med andre litteraturrapporter 20,34,58,59. Denne in vitro-cellemodellen kan bidra til å forbedre forståelsen av den biologiske funksjonen til PD og bidra til å studere bruken av andre aktive TCM-stoffer for behandling av NAFLD.

Det er noen kritiske trinn i den eksperimentelle prosessen. For å avgjøre om in vitro NAFLD-modellen er vellykket etablert, kan lipiddråpeavsetningene sammenlignes i normale kontroll- og PA-behandlede gruppeceller ved Oil Red O-farging, som beskrevet tidligere60,61. Etter DCFH-DA-farging eller JC-1-farging må de resterende sondene som ikke kommer inn i cellene vaskes av; Ellers vil dette føre til en høy bakgrunn når du tar fluorescensbildene. I tillegg må tiden (unntatt inkubasjonstiden) mellom lasting og måling av fluorescerende sonder (DCFH-DA eller JC-1) forkortes for å redusere muligheten for eksperimentelle feil. Videre kan arbeidskonsentrasjonene til fluorescerende sonder (DCFH-DA eller JC-1) justeres etter behov hvis fluorescensverdien til cellene i den negative kontrollgruppen er relativt høy. Alternativt kan inkubasjonstiden til JC-1-arbeidsløsningen og cellene justeres hensiktsmessig innen en tidsramme på 15-60 minutter i henhold til de faktiske eksperimentelle forholdene.

Det er også noen begrensninger i denne in vitro cellemodellen. Celler som hepatiske parenkymale celler, hepatiske stellatceller, Kupffer-celler og vaskulære endotelceller er tilstede i levervev62. Derfor kan eksperimenter bare på hepatiske parenkymceller ikke være tilstrekkelige til å forklare effekten av legemidler. Andre cellemodeller må også brukes i anti-NAFLD-narkotikaoppdagelse. I tillegg har tredimensjonale (3D) cellekultursystemer blitt brukt til å konstruere levermodeller og teste levertoksisitet63,64. Fremtidige studier vil fokusere på å utvikle in vitro-modeller ved hjelp av samkultur og 3D-cellekulturteknikker for potensiell anti-NAFLD-medikamentscreening.

Som en multisystemsykdom spiller mange faktorer en rolle i utviklingen og utviklingen av NAFLD, noe som betyr at en enkelt dyremodell eller cellemodell ikke fullt ut kan etterligne alle de patologiske prosessene i denne sykdommen65. Overdreven avhengighet av bruk av dyremodeller øker byrden av terapeutisk medisinutvikling. Bruk av in vitro-cellemodeller i de tidlige stadiene av anti-NAFLD-legemiddelutvikling er mer praktisk og kostnadseffektivt. I denne studien ble en normal musehepatocyttcellelinje AML-12 brukt til å konstruere in vitro-modellen til NAFLD, og den terapeutiske effekten av PD ble validert i denne modellen. Spesielt gir resultatene av denne studien grunnlag for videre forskning på anti-NAFLD-effektene av PD i mus hepatocytt og primære hepatocyttmodeller.

Avslutningsvis presenteres en in vitro-modell for å studere de beskyttende effektene av PD mot NAFLD her. Dette kan også være en nyttig in vitro-modell for å undersøke effekten av andre aktive stoffer i TCM for behandling av NAFLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av tilskudd fra Chongqing Science and Technology Commission (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 og jbky20210029) og China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2021MD703919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480 (2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532 (2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71 (2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834 (2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622 (2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973 (2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479 (2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13 (2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128 (2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87 (2012).
  45. Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
  46. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590 (2014).
  47. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  48. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  49. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  50. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  51. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  52. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  53. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  54. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  55. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  56. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359 (2016).
  57. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976 (2021).
  58. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459 (2018).
  59. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  60. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  61. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  62. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  63. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060 (2020).
  64. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  65. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 190 Platycodin D palmitinsyre reaktive oksygenarter mitokondriemembranpotensial autofagi
Undersøke de beskyttende effektene av platycodin d på ikke-alkoholholdig fettleversykdom i en palmitinsyreindusert <em>in vitro-modell</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., … More

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter