Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Исследование защитных эффектов платикодина D на неалкогольную жировую болезнь печени в модели, индуцированной пальмитиновой кислотой in vitro

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64816
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University
* These authors contributed equally

Summary

В этом протоколе исследуются защитные эффекты платикодина D на неалкогольную жировую болезнь печени в модели, индуцированной пальмитиновой кислотой in vitro .

Abstract

Заболеваемость неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП) растет с угрожающей скоростью во всем мире. Platycodon grandiflorum широко используется в качестве традиционной этномедицины для лечения различных заболеваний и является типичной функциональной пищей, которая может быть включена в повседневный рацион. Исследования показали, что платикодин D (PD), один из основных активных ингредиентов Platycodon grandiflorum, обладает высокой биодоступностью и значительно смягчает прогрессирование НАЖБП, но основной механизм этого до сих пор неясен. Это исследование направлено на изучение терапевтического эффекта БП против НАЖБП in vitro. Клетки AML-12 предварительно обрабатывали 300 мкМ пальмитиновой кислотой (ПА) в течение 24 ч для моделирования НАЖБП in vitro. Затем клетки либо обрабатывали БП, либо не получали лечения БП в течение 24 часов. Уровни активных форм кислорода (АФК) анализировали с помощью окрашивания 2',7'-дихлордигидро-флуоресцеинового диацетата (DCFH-DA), а мембранный потенциал митохондрий определяли методом окрашивания JC-1. Кроме того, уровни экспрессии белков LC3-II/LC3-I и p62/SQSTM1 в лизатах клеток анализировали методом вестерн-блоттинга. Было обнаружено, что БП значительно снижает уровни АФК и митохондриального мембранного потенциала в группе, получавшей ПА, по сравнению с контрольной группой. Между тем, БП повышала уровни LC3-II/LC3-I и снижала уровни p62/SQSTM1 в группе, получавшей PA, по сравнению с контрольной группой. Результаты показали, что БП улучшает НАЖБП in vitro , уменьшая окислительный стресс и стимулируя аутофагию. Эта модель in vitro является полезным инструментом для изучения роли БП в НАЖБП.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), который является высушенным корнем Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., используется в традиционной китайской медицине (ТКМ). Он в основном производится в северо-восточных, северных, восточных, центральных и юго-западных регионах Китая1. Компоненты PG включают тритерпеноидные сапонины, полисахариды, флавоноиды, полифенолы, полиэтиленгликоли, летучие масла и минералы2. PG имеет долгую историю использования в качестве пищи и растительного лекарственного средства в Азии. Традиционно эта трава использовалась для изготовления лекарств от болезней легких. Современная фармакология также предоставляет доказательства эффективности ПГ для лечения других заболеваний. Исследования показали, что ПГ оказывает терапевтическое действие на различные модели лекарственно-индуцированного повреждения печени. Пищевые добавки PG или экстрактов платикодина могут улучшить ожирение, вызванное диетой с высоким содержанием жиров, и связанные с ним метаболические заболевания 3,4,5. Полисахариды из PG можно использовать для лечения острого повреждения печени, вызванного LPS / D-GalN у мышей6. Кроме того, сапонины из корней PG улучшают вызванный диетой неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)7. Кроме того, платикодин D (PD), один из наиболее важных терапевтических компонентов PG, может усиливать экспрессию рецепторов липопротеинов низкой плотности и поглощение липопротеинов низкой плотности в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2)8. Кроме того, БП может также индуцировать апоптоз и ингибировать адгезию, миграцию и инвазию в клетках HepG2 9,10. Таким образом, в данном исследовании клетки AML-12 гепатомы мыши используются для построения модели in vitro и для дальнейшего изучения фармакологических эффектов и основных механизмов БП в этой модели.

Термин неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) относится к группе заболеваний печени, которая включает простой стеатоз, НАСГ, цирроз и гепатоцеллюлярную карциному11. Хотя патогенез НАЖБП до конца не изучен, от классической теории «двух ударов» до современной теории «множественного удара» резистентность к инсулину считается центральной в патогенезе НАЖБП12,13,14. Исследования показали, что резистентность к инсулину в гепатоцитах может привести к увеличению количества свободных жирных кислот, которые образуют триглицериды, которые откладываются в печени и заставляют печень становиться жирной15,16. Накопление жира может привести к липотоксичности, митохондриальной дисфункции, вызванной окислительным стрессом, стрессу эндоплазматического ретикулума и высвобождению воспалительных цитокинов, что приводит к патогенезу и прогрессированию НАЖБП17,18. Кроме того, аутофагия также играет роль в патогенезе НАЖБП, поскольку она участвует в регуляции клеточной чувствительности к инсулину, клеточном липидном обмене, повреждении гепатоцитов и врожденном иммунитете 19,20,21.

Было создано множество животных моделей и клеточных моделей, чтобы обеспечить основу для изучения патогенеза и потенциальных терапевтических мишеней НАЖБП22,23. Однако модели на отдельных животных не могут полностью имитировать все патологические процессы НАЖБП24. Индивидуальные различия между животными приводят к разным патологическим особенностям. Использование клеточных линий печени или первичных гепатоцитов в исследованиях НАЖБП in vitro обеспечивает максимальную согласованность в экспериментальных условиях. Нарушение регуляции липидного обмена в печени может привести к более высоким уровням накопления липидных капель гепатоцитов в НАЖБП25. Свободные жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и пальмовое масло, использовались в модели in vitro для имитации НАЖБП, вызванной диетой с высоким содержанием жиров26,27. Клеточная линия гепатобластомы человека HepG2 часто используется при построении моделей НАЖБП in vitro, но, как линия опухолевых клеток, метаболизм клеток HepG2 значительно отличается от метаболизма клеток печени в нормальных физиологических условиях28. Таким образом, использование первичных гепатоцитов или первичных гепатоцитов мыши для построения модели НАЖБП in vitro для скрининга лекарств является более выгодным, чем использование линий опухолевых клеток. Сравнивая синергетическое исследование эффектов лекарств и терапевтических мишеней как на животных моделях, так и на моделях гепатоцитов in vitro, представляется, что использование гепатоцитов мыши для построения модели НАЖБП in vitro имеет лучший потенциал применения.

Свободные жирные кислоты, поступающие в печень, окисляются для производства энергии или хранятся в виде триглицеридов. Важно отметить, что свободные жирные кислоты обладают определенной липотоксичностью и могут вызывать клеточную дисфункцию и апоптоз12. Пальмитиновая кислота (ПА) является наиболее распространенной насыщенной жирной кислотой в плазме кровичеловека 29. Когда клетки в нежировой ткани подвергаются воздействию высоких концентраций ПА в течение длительного времени, это стимулирует выработку активных форм кислорода (АФК) и вызывает окислительный стресс, накопление липидов и даже апоптоз30. Поэтому многие исследователи используют ПА в качестве индуктора для стимуляции клеток печени к выработке АФК и, таким образом, строят модель жировой болезни печени in vitro и оценивают защитные эффекты определенных активных веществ на клетки31,32,33,34. В этом исследовании представлен протокол для изучения защитных эффектов БП на клеточной модели НАЖБП, индуцированной ПА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Клетки AML-12 (нормальная клеточная линия гепатоцитов мыши) используются для клеточных исследований. Ячейки получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Предварительная обработка клеток AML-12 для моделирования НАЖБП in vitro

  1. Поддерживайте клетки в нормальных средах для культивирования клеток (DMEM плюс Ham's F12 [1: 1], содержащем 0,005 мг / мл инсулина, 5 нг / мл селена, 0,005 мг / мл трансферрина, 40 нг / мл дексаметазона и 10% эмбриональной бычьей сыворотки [FBS], см. Таблицу материалов) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.
  2. Засевают клетки в 12-луночные планшеты (1 мл/лунка) плотностью 2,8 х 10,5 клеток/лунка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции по клеточному перевариванию и обмену средой выполняются в шкафу биобезопасности, чтобы избежать загрязнения клеток.
  3. Удаляют питательную среду клеток после ночной инкубации (~10 ч), а затем дважды промывают клетки 1 мл среды, не содержащей сыворотки (на лунку).
  4. Разделите 12-луночную клеточную пластину слева направо на четыре различные группы лечения, включая (1) контрольную группу, (2) группу, получавшую БП, (3) группу, получавшую ПА, и (4) группу, обработанную ПА + ПД.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Три реплики каждой экспериментальной группы лечения расположены сверху вниз на одной и той же 12-луночной клеточной пластине.
  5. Добавьте нормальные среды для культивирования клеток (1 мл / лунка) в контрольную группу и группу, обработанную PD, и добавьте нормальную среду для культивирования клеток (1 мл / лунку) с добавлением 300 мкМ PA в группу, обработанную PA и PA + PD.
  6. Питательную среду из клеток удаляют через 24 ч инкубации, а затем промывают клетки 1 мл среды, не содержащей сыворотки (на лунку) два раза.
  7. Добавьте в контрольную группу нормальные среды для культивирования клеток (1 мл/лунку) с добавлением носителя (диметилсульфоксид, ДМСО, 0,1% об./об.); добавить нормальные среды для культивирования клеток (1 мл/лунка) с добавлением 1 мкМ ПД в группу, обработанную БП; добавить нормальные среды для культивирования клеток (1 мл/лунка) с добавлением 300 мкМ ПА в группу, обработанную ПА; добавить нормальные среды для культивирования клеток (1 мл / лунку) с добавлением 300 мкМ ПА и 1 мкМ ПД в группу, обработанную ПА + ПД.
  8. После инкубации в течение дополнительных 24 ч исследуют защитные эффекты БП на клетки с использованием окрашивания 2',7'-дихлордигидро-флуоресцеина диацетата (DCFH-DA) (этап 2), окрашивания JC-1 (этап 3) и вестерн-блоттинга (этап 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все инкубационные операции выполняются при 37 ° C в увлажненной атмосфере с содержанием 5% CO2.

2. Измерение изменения производства АФК

ПРИМЕЧАНИЕ: Внутриклеточные уровни АФК в клетках оцениваются на основе анализа окрашивания DCFH-DA.

  1. В конце периода обработки (этап 1.8) трижды промойте клетки 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора на лунку (1x PBS, pH 7,4), а затем окрашивайте клетки 100 мкл 10 мкМ dcfh-da на лунку (см. Таблицу материалов). Инкубируйте клетки в темноте в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если после 30 минут инкубации не наблюдается явной зеленой флуоресценции, время инкубации зонда и клеток может быть соответствующим образом увеличено (30-60 минут). Если после 30 минут инкубации наблюдается передержка значения зеленой флуоресценции, время инкубации зонда и клеток может быть соответствующим образом уменьшено (15-30 минут).
  2. Промойте клетки 1x PBS (1 мл / лунка) три раза. Добавьте 1 мл 1x PBS в каждую лунку.
  3. Поместите 12-луночную пластину на столик микроскопа (см. Таблицу материалов), а затем используйте 20-кратный объектив для наблюдения за морфологией клеток (увеличение: 200-кратное).
  4. Захватите три репрезентативных флуоресцентных изображения (увеличение: 200x) для каждой лунки на флуоресцентном микроскопе, используя зеленый флуоресцентный канал с длиной волны возбуждения 480 нм и длиной волны излучения 530 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый флуоресцентный канал с длиной волны возбуждения 480 нм и длиной волны излучения 530 нм рекомендуется для обнаружения DCFH-DA. Кроме того, DCFH-DA может быть обнаружен с настройками параметров для GFP и FITC во флуоресцентном микроскопе35,36.
  5. Наконец, обработайте изображения с помощью программного обеспечения для получения изображений (см. Таблицу материалов), а затем используйте программное обеспечение ImageJ для расчета средней интенсивности флуоресценции каждой группы или соотношений различных групп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Технические детали флуоресцентного микроскопа и программного обеспечения Image J, используемого для работы по визуализации, были описаны ранее37,38.

3. Измерение изменения мембранного потенциала митохондрий

ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения мембранного потенциала митохондрий контролируются с помощью анализа окрашивания JC-1.

  1. В конце периода обработки (этап 1.8) промойте клетки 1 мл 1x PBS на лунку три раза, а затем окрашивайте клетки 100 мкл рабочего раствора JC-1 5 мкг/мл (см. Таблицу материалов) в течение 30 мин при 37 °C в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если после 30 минут инкубации не наблюдается явной зеленой флуоресценции, время инкубации зонда и клеток может быть соответствующим образом увеличено (30-60 минут). Если после 30 минут инкубации наблюдается передержка значения зеленой флуоресценции, время инкубации зонда и клеток может быть соответствующим образом уменьшено (15-30 минут).
  2. Промойте клетки 1x PBS (1 мл / лунка) три раза. Добавьте 1 мл 1x PBS в каждую лунку.
  3. Поместите 12-луночную пластину на столик микроскопа, а затем используйте 20-кратный объектив для наблюдения за морфологией клеток (увеличение: 200x).
  4. Захватите три репрезентативных флуоресцентных изображения (увеличение: 200x) для каждой лунки на флуоресцентном микроскопе, используя зеленый флуоресцентный канал с длинами волн возбуждения и излучения 485 нм и 535 нм соответственно и красный флуоресцентный канал с длинами волн возбуждения и излучения 550 нм и 600 нм соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый флуоресцентный канал с длиной волны возбуждения 485 нм и длиной волны излучения 535 нм используется для детектирования мономера JC-1, который рассматривается как деполяризованные митохондрии 39,40,41, а красный флуоресцентный канал с длиной волны возбуждения 550 нм и длиной волны излучения 600 нм используется для обнаружения димера JC-1, который рассматривается как поляризованные митохондрии 39,40,41.
  5. Наконец, обработайте изображения с помощью программного обеспечения для получения изображений, а затем используйте программное обеспечение Image J для расчета средней интенсивности флуоресценции каждой группы или соотношений различных групп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Технические детали флуоресцентного микроскопа и программного обеспечения Image J, используемого для работы по визуализации, были описаны ранее37,38.

4. Измерение уровней экспрессии белков LC3-II/LC3-I и p62/SQSTM1

  1. После обработки (этап 1.8) промойте клетки три раза 1x PBS (1 мл / лунка), предварительно охладив его до 4 ° C.
  2. Добавьте буфер для лизиса RIPA (100 мкл / лунка) с добавлением протеазы и коктейля ингибитора фосфатазы (1x) (см. Таблицу материалов) в 12-луночную пластину и лизируйте на льду в течение 5 минут.
  3. Соберите клеточный лизат в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 12 000 x g в течение 20 мин при 4 ° C. Определяют концентрацию белка надосадочных продуктов методом BCA в соответствии со стандартными процедурами42.
  4. Добавьте буфер загрузки образца SDS-PAGE (5x, см. Таблицу материалов) к надосадочным выводам лизата клетки (объемное соотношение = 1:4).
  5. Смешивают вихревым путем (на высокой скорости в течение ~ 15 с) и нагревают смешанные образцы при 100 ° C в течение 5 мин, чтобы денатурировать белок.
  6. Поместите 12 хорошо подготовленных 12% гелей SDS-PAGE в резервуар для электрофореза, а затем добавьте буфер для отбора проб SDS (1x), разбавленный сверхчистой водой, в предельное положение по высоте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гель SDS-PAGE готовится с использованием коммерческого набора (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  7. Добавьте белковый маркер (5 мкл/лунка) и образцы (20 мкг/лунка) в разные лунки геля SDS-PAGE.
  8. Установите режим стабильного напряжения на 100 В и выполняйте электрофорез в течение 80 мин.
  9. После электрофореза SDS-PAGE проводят электроперенос белков на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) (0,45 мкМ, см. Таблицу материалов) в соответствии с ранее опубликованными отчетами43,44.
  10. После электропереноса белков промойте мембрану PVDF 10 мл TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) два раза (5 мин/раз) в шейкере при комнатной температуре.
  11. Блокируйте мембрану PVDF 5 мл бычьего сывороточного альбумина (BSA, 5%) в шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа.
  12. Промойте мембрану PVDF 10 мл TBST три раза (10 мин/раз). Затем инкубируют мембрану PVDF в 5 мл специфических первичных антител, разбавленных в блокирующем буфере для LC3 (мышиный mAb, 1:2000), p62/SQSTM1 (далее именуемый p62, мышиный mAb, 1:2000) и β-актин (мышиный mAb, 1:2000) (см. Таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C.
  13. Промойте мембрану PVDF 10 мл TBST три раза (10 мин/раз) при комнатной температуре. Затем инкубируют мембрану PVDF с вторичным антителом кролика против мыши IgG (HRP), разведенным в блокирующем буфере (1:10 000) (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре и защищенным от света в течение 2 часов.
  14. Промойте мембрану PVDF 10 мл TBST три раза (10 мин/раз) при комнатной температуре. Затем поместите мембрану PVDF на полиэтиленовую пленку, добавьте соответствующее количество рабочего раствора ECL (200 мкл / мембрана) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 2 минут.
  15. После инкубации удалите рабочий раствор ECL и обнаживите мембрану PVDF в системе визуализации для проявления изображения. Наконец, используйте программное обеспечение Image J для анализа значений серого каждого канала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Технические детали западного блоттинга и программного обеспечения Image J, используемого для работы с визуализацией, были описаны ранее45,46.

5. Статистический анализ

  1. Представьте данные экспериментов в виде среднего ± стандартного отклонения (SD).
  2. Проведите анализ значимости с помощью статистического программного средства, описанного ранее47.
  3. Рассчитайте статистические различия между двумя группами с помощью t-критерия. Статистически значимым считается значение P ниже 0,05: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Внутриклеточные АФК в клетках
Клетки ОМЛ-12 индуцировали 300 мкМ ПА в течение 24 ч, и была создана модель клеток НАЖБП. В последующем клетки обрабатывали БП в течение 24 ч. Клетки были помечены флуоресцентным зондом DCFH-DA, а образование АФК наблюдалось под флуоресцентным микроскопом. Результаты окрашивания DCFH-DA внутриклеточных АФК в клетках представлены на рисунке 1. Результаты показали, что БП может значительно снизить уровень внутриклеточных АФК в клетках, инкубированных с 300 мкМ ПА (P < 0,01), что указывает на то, что БП может снижать клеточный окислительный стресс.

Митохондриальный мембранный потенциал клеток
Митохондрия является центральной органеллой, управляемой внутренним путем апоптоза48,49,50. Таким образом, митохондриальный мембранный потенциал (ММП) клеток ОМЛ-12, инкубированных с БП в течение 24 ч, наблюдали под флуоресцентным микроскопом после окрашивания JC-1. Как показано на рисунке 2, зеленая флуоресценция (мономеры JC-1, обработанные как деполяризованные митохондрии 39,40,41) в клетках, обработанных PA, была выше, чем в необработанных клетках. С другой стороны, красная флуоресценция (димеры JC-1, обработанные как поляризованные митохондрии 39,40,41) в клетках, обработанных PA, была ниже, чем в необработанных клетках, что указывает на индуцированную PA деполяризацию MMP в клетках. Кроме того, по сравнению с модельной группой соотношение мономеров JC-1 к димерам снизилось в группе лечения БП (P < 0,01), что указывает на то, что БП может улучшать деполяризацию ММР, индуцированную ПА.

Уровни экспрессии белка LC3-II/LC3-I и p62
В этом исследовании также изучалась потенциальная роль БП на пути аутофагии, исследуя уровни экспрессии белков, связанных с аутофагией, белков LC3 и p62 в клетках с помощью вестерн-блоттинга. Как показано на рисунке 3, соотношение LC3-II:LC3-I достоверно снижалось (P < 0,005), а уровень экспрессии белка p62 увеличивался после лечения ПА в течение 48 ч (P < 0,01). С другой стороны, БП может значительно снижать уровень экспрессии белка р62 (P < 0,01) и увеличивать соотношение LC3-II:LC3-I (P < 0,05), что указывает на то, что PD может восстанавливать аутофагический поток, ингибируемый PA.

Figure 1
Рисунок 1: Влияние БП на внутриклеточные АФК в клетках, оцениваемое с помощью окрашивания DCFH-DA . (A) Генерация АФК была обнаружена с помощью флуоресцентной микроскопии, 200x. Масштабная линейка: 20 мкм. (B) Относительные изменения уровней АФК в разных группах. Каждый столбец представляет собой среднее значение ± SD (n = 3). **P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние БП на деполяризацию ММР в клетках, оцененное с помощью окрашивания JC-1. (A) Деполяризация ММР была обнаружена с помощью флуоресцентной микроскопии, 200x. Масштабная линейка: 20 мкм. (B) Относительные изменения в соотношении мономеров JC-1 к димерам в различных группах. Каждый столбец представляет собой среднее значение ± SD (n = 3). **P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние БП на уровни экспрессии белка LC3-II/LC3-I и p62 в клетках, оцениваемое с помощью вестерн-блоттинга. (A) Уровни белка LC3, p62 и β-актина были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга. (B) Относительные изменения в соотношении LC3-II:LC3-I в различных группах. (C) Относительные изменения экспрессии p62 в разных группах. Каждый столбец представляет собой среднее значение ± SD (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследования подчеркнули тот факт, что НАЖБП является клинико-патологическим синдромом, варьирующимся от жировой дистрофии печени до НАСГ, который может прогрессировать до цирроза и рака печени51. Диета с высоким содержанием жиров и малоподвижный образ жизни являются типичными факторами риска развития НАЖБП. Были исследованы как немедикаментозные методы лечения, так и лекарственные препараты для лечения НАЖБП51,52,53. Однако патогенез НАЖБП до конца не выяснен. Описанный здесь метод включает в себя in vitro модель НАЖБП, установленную ПА-стимулированными клетками AML-12. Мы исследовали защитные эффекты БП против НАЖБП в этой модели и обнаружили, что БП ослабляет индуцированное ПА увеличение АФК. Кроме того, БП также улучшал ПА-индуцированную деполяризацию ММР. Кроме того, PD может значительно снизить уровень экспрессии белка p62 и увеличить соотношение LC3-II:LC3-I. Эти экспериментальные результаты могут послужить основой для применения БП в качестве активного фармацевтического ингредиента для лечения НАЖБП.

Как основной путь внутриклеточной деградации, аутофагия реализует физиологический процесс рециркуляции и повторного использования питательного сырья путем разложения избыточных компонентов в клетках19,54. Аутофагия также является ключевым механизмом восстановления организма для поддержания «баланса инь-ян», и это микроскопическое воплощение «трансформации ци» в TCM55,56,57. В настоящем протоколе, в дополнение к выявлению изменений в продукции АФК и деполяризации ММР, потенциальная роль БП на пути аутофагии была исследована путем обнаружения уровней экспрессии белков, связанных с аутофагией, LC-3 и p62 методом вестерн-блоттинга. После лечения ПА-индуцированных клеток БП соотношение LC3-II:LC3-I уменьшилось, а накопление р62 увеличилось, что свидетельствует о снижении уровня аутофагии. Экспериментальные результаты согласуются с другими литературными сообщениями 20,34,58,59. Эта клеточная модель in vitro может помочь улучшить понимание биологической функции БП и помочь изучить использование других активных веществ ТКМ для лечения НАЖБП.

В экспериментальном процессе есть несколько важных этапов. Чтобы определить, успешно ли установлена модель НАЖБП in vitro, отложения липидных капель можно сравнить в нормальных контрольных и обработанных PA групповых клетках с помощью окрашивания Oil Red O, как описано ранее60,61. После окрашивания DCFH-DA или окрашивания JC-1 оставшиеся зонды, которые не попадают в клетки, необходимо смыть; В противном случае это вызовет высокий фон при съемке флуоресцентных изображений. Кроме того, время (за исключением времени инкубации) между загрузкой и измерением флуоресцентных зондов (DCFH-DA или JC-1) должно быть сокращено, чтобы уменьшить вероятность экспериментальных ошибок. Кроме того, рабочие концентрации флуоресцентных зондов (DCFH-DA или JC-1) могут быть скорректированы по мере необходимости, если значение флуоресценции клеток в отрицательной контрольной группе относительно высокое. В качестве альтернативы, время инкубации рабочего раствора JC-1 и клеток может быть соответствующим образом отрегулировано в течение 15-60 минут в соответствии с фактическими условиями эксперимента.

В этой модели клеток in vitro также есть некоторые ограничения. Такие клетки, как паренхиматозные клетки печени, звездчатые клетки печени, клетки Купфера и эндотелиальные клетки сосудов, присутствуют в тканях печени62. Поэтому эксперименты только на паренхиматозных клетках печени могут быть недостаточными для объяснения эффектов лекарств. Другие клеточные модели также должны быть использованы при открытии лекарств против НАЖБП. Кроме того, трехмерные (3D) системы клеточных культур использовались для построения моделей печени и тестирования гепатотоксичности63,64. Будущие исследования будут сосредоточены на разработке моделей in vitro с использованием методов совместного культивирования и 3D-культивирования клеток для потенциального скрининга лекарств против НАЖБП.

Поскольку это мультисистемное заболевание, многие факторы играют роль в развитии и прогрессировании НАЖБП, а это означает, что одна животная модель или клеточная модель не может полностью имитировать все патологические процессы этого заболевания65. Чрезмерная зависимость от использования животных моделей увеличивает бремя разработки терапевтических лекарств. Использование клеточных моделей in vitro на ранних стадиях разработки препаратов против НАЖБП является более практичным и экономически эффективным. В этом исследовании нормальная клеточная линия гепатоцитов мыши AML-12 была использована для построения модели НАЖБП in vitro , и терапевтический эффект БП был подтвержден в этой модели. Примечательно, что результаты этого исследования обеспечивают основу для дальнейших исследований анти-НАЖБП эффектов БП в моделях гепатоцитов мышей и первичных гепатоцитов.

В заключение представлена модель in vitro для изучения защитных эффектов БП против НАЖБП. Это также может быть полезной моделью in vitro для исследования эффективности других активных веществ ТКМ для лечения НАЖБП.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается грантами Комиссии по науке и технологиям Чунцина (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 и jbky20210029) и Китайского фонда постдокторантуры (No 2021MD703919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480 (2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532 (2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71 (2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834 (2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622 (2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973 (2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479 (2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13 (2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128 (2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87 (2012).
  45. Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
  46. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590 (2014).
  47. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  48. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  49. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  50. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  51. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  52. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  53. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  54. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  55. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  56. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359 (2016).
  57. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976 (2021).
  58. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459 (2018).
  59. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  60. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  61. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  62. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  63. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060 (2020).
  64. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  65. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 190 Платикодин D пальмитиновая кислота активные формы кислорода мембранный потенциал митохондрий аутофагия
Исследование защитных эффектов платикодина D на неалкогольную жировую болезнь печени в модели, индуцированной пальмитиновой кислотой <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., … More

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter